Obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości zakażenia wirusem wścieklizny w tkance mózgowej oczyszczonej rozpuszczalnikiem

Protokół ten umożliwia wizualizację infekcji wirusowej i zapewnia głęboki wgląd w czasoprzestrzenną rozdzielczość środowiska infekcji i otaczającego go kontekstu komórkowego. Zastosowanie barwienia immunologicznego do obrazowania tkanek głębokich nie tylko pozwala na wykrywanie wirusów, ale w rzeczywistości umożliwia również różnicowanie różnych subpopulacji komórkowych za pomocą odpowiednich markerów komórkowych. Aby utrwalić tkankę do barwienia immunologicznego, umieść próbki mózgu w stosunku 1 do 10 4% paraformaldehydu w PBS do objętości tkanki próbki przez co najmniej 48 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Pod koniec okresu utrwalania przemyć próbki tkanek trzy razy w PBS przez co najmniej 30 minut na przemycie przed przeniesieniem próbek do 02% azydku sodu w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie użyj wibratomu ustawionego na szybkość posuwu ostrza od 0,3 do 0,5 milimetra na sekundę, aby podzielić tkanki na odcinki o grubości jednego milimetra. Skrawki należy przechowywać w świeżym 02% azydku sodu w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

W celu wstępnej obróbki metanolem należy zanurzyć próbki w rosnącej serii metanolu, jak wskazano, na jedną godzinę podczas inkubacji w temperaturze pokojowej z delikatnymi oscylacjami. Po ostatniej inkubacji schłodzić próbki do czterech stopni Celsjusza. Zastąp 100% metanol czterema mililitrami wstępnie schłodzonego roztworu wybielającego do inkubacji przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego ranka zastąp roztwór wybielający czterema mililitrami świeżego 80% metanolu na jedną godzinę inkubacji w temperaturze pokojowej. Następnie zanurz próbki w malejącej serii metanolu w odwrotnej kolejności niż właśnie pokazano, myjąc próbki jeden raz przez godzinę w czterech mililitrach PBS po 20% zanurzeniu w metanolu. W celu barwienia immunologicznego skrawków tkanki mózgowej przemyj próbki dwa razy przez godzinę w czterech mililitrach 0,2% Triton X-100 w PBS, a następnie przez dwa dni permeabilizację w temperaturze 37 stopni Celsjusza w czterech mililitrach 0,2% Triton X-100, 20% sultlenku dimetylu i 0,3 molowej glicyny w PBS.

Zablokuj wszelkie niespecyficzne wiązania czterema mililitrami 0,2% Triton X-100, 10% dimetylosulfotlenku i 6% normalnej surowicy w PBS przez dwa dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji blokującej znakować próbki dwoma mililitrami roztworu przeciwciała pierwszorzędowego przez pięć dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza, odświeżając roztwór przeciwciała po dwóch i 1/2 dni. Następnie myj próbki przez jeden dzień w czterech mililitrach 0,2% między 20 a 10 mikrogramami na mililitr heparyny w PBS, wymieniając bufor do płukania co najmniej cztery do pięciu razy w ciągu dnia i pozostawiając końcowe płukanie na noc.

Następnego dnia inkubuj próbki w dwóch mililitrach roztworu przeciwciał drugorzędowych przez pięć dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie umyj próbki w czterech mililitrach świeżej heparyny 0,2% 20 i 10 mikrogramów na mililitr w PBS, jak pokazano. W celu barwienia jądrowego próbek inkubować próbki w czterech mililitrach barwnika kwasem nukleinowym TO-PRO-3 przez pięć godzin, chroniąc przed światłem.

Pod koniec inkubacji przemyć próbki w 0,2% między 20 a 10 mikrogramami na mililitr heparyny w PBS, jak pokazano, a następnie odwodnić w rosnącej serii tert-butanolu przez dwie godziny na zanurzenie. Po 90% zanurzeniu przenieś próbki na noc do 96% roztworu tert-butanolu. Następnego ranka odwadniaj próbki w 100% tert-butanolu przez dwie godziny, a następnie wyczyść skrawki tkanek w świeżo przygotowanym BABB-D15 przez dwie do sześciu godzin, aż staną się optycznie przezroczyste.

Próbki mogą być następnie przechowywane w BABB-D15 chronione przed światłem do czasu ich zamontowania i zobrazowania. Do montażu próbki użyj drukarki 3D, aby wydrukować komorę obrazowania i pokrywę. Zamontuj szkiełko nakrywkowe o średnicy 30 milimetrów na komorze obrazowania z jednoskładnikową gumą silikonową wulkanizującą w temperaturze pokojowej.

Podobnie zamontuj 22-milimetrowe szkiełko nakrywkowe na pokrywie. Użyj bawełnianego wacika zwilżonego wodą, aby usunąć nadmiar gumy silikonowej z obu pierścieni, zanim pozwolisz gumie utwardzić się przez noc. Następnego dnia umieść próbkę w komorze obrazowania i dodaj niewielką objętość BABB-D15 do komory przed włożeniem pokrywy.

Za pomocą igły podskórnej napełnij komorę BABB-D15 przez wlot i zatkaj wlot przed uszczelnieniem komory obrazowania gumą silikonową. Aby skonfigurować akwizycję obrazu, wybierz odpowiednie linie laserowe dla używanych fluoroforów i dostosuj zakresy wykrywania każdego detektora, aby zapobiec nakładaniu się sygnału między kanałami. Następnie ustaw parametry akwizycji, aby znaleźć górną i dolną granicę stosu Z i uzyskać stos obrazów.

Aby wygenerować projekcje 3D stosu obrazów, otwórz pliki obrazów w Fidżi i wybierz Kanały kolorów obrazu, Narzędzie, Więcej i Podziel kanały, aby podzielić scalone obrazy na poszczególne kanały. Aby uzyskać korekcję wybielania obrazów, dla każdego kanału wybierz opcję Image Adjust Bleach Correction (Korekcja rozjaśnienia) i wybierz opcję Simple Ratio (Proste proporcje). Użyj suwaków, aby dostosować jasność i kontrast dla każdego kanału, a następnie wybierz Kolor obrazu i Scal kanały.

Zaznacz opcję Utwórz kompozyt. Przekonwertuj obraz do formatu RGB i wybierz opcję Stosy obrazów i Projekt 3D, aby wygenerować projekcję 3D. Wybierz Najjaśniejszy punkt jako metodę Projekcja i ustaw odstępy między plasterkami tak, aby odpowiadały rozmiarowi kroku Z uzyskanego stosu obrazów.

Aby uzyskać maksymalną jakość, ustaw przyrost kąta obrotu na jeden i włącz interpolację. W razie potrzeby zmodyfikuj całkowity obrót, progi przezroczystości i krycie. Następnie zapisz projekcję 3D w formacie tiff i AVI.

Za pomocą barwienia immunologicznego wirusa wścieklizny można wizualizować warstwy kompleksu fosfoprotein zakażonych komórek nerwowych w grubych odcinkach próbek tkanki mózgowej myszy. Następnie można zrekonstruować płynne projekcje 3D pozyskanych stosów obrazów. Ze względu na wysoką rozdzielczość, z jaką rejestrowane są stosy obrazów, infekcję można ocenić do poziomu pojedynczej komórki, co pozwala na stwierdzenie, na przykład, obfitości i rozmieszczenia antygenu w komórce będącej przedmiotem zainteresowania.

Oprócz tkanki mózgowej myszy protokół można zastosować do próbek tkanki mózgowej innych gatunków zwierząt. Na przykład skrawki uzyskane z różnych przedziałów zakażonego mózgu fretki ujawniają różny stopień zakażenia wirusem wścieklizny. Astrocyty mogą być różnicowane poprzez ekspresję białka kwasu fibrylarnego glejowego, podczas gdy neuryty mogą być specyficznie barwione pod kątem białka związanego z mikrotubulami II. Jednocześnie białka wirusowe mogą być barwione w celu oceny związku między zakażonymi komórkami a wyróżnioną subpopulacją komórkową.

W przypadku barwienia immunologicznego kluczowy ma wybór przeciwciał do wykrywania białek będących przedmiotem zainteresowania. Podczas gdy standardowe stężenia immunohistochemiczne są często dobrym punktem wyjścia, niektóre przeciwciała mogą wymagać dodatkowej korekty. Wiele substancji chemicznych użytych w tym protokole ma szkodliwe właściwości.

Przeprowadzić odpowiednie doświadczenie w dygestorium, mając na sobie odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym fartuch laboratoryjny i rękawice.