Name: Obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości zakażenia wirusem wścieklizny w tkance mózgowej oczyszczonej rozpuszczalnikiem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Poznaj technikę immunobarwienia z oczyszczaniem tkanek do 3D obrazowania zakażenia wirusem wścieklizny w tkance mózgowej myszy. Metoda umożliwia wizualizację warstw zakażonych neuronów i analizę rozprzestrzeniania się antygenu wirusowego na poziomie pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Thomasowi C. Mettenleiterowi i Verenie te Kamp za krytyczną lekturę rękopisu. Prace te były wspierane przez Federalną Inicjatywę Doskonałości Meklemburgii Pomorza Przedniego oraz grant Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS) KoInfekt (ESF/14-BM-A55-0002/16) oraz grant na badania kliniczne nad lyssawirusami w Instytucie Friedricha Loefflera (Ri-0372).

Użyto zarchiwizowanego materiału mózgu zainfekowanego RABV, naprawionego przez PFA. Odpowiednie badania eksperymentalne na zwierzętach zostały ocenione przez komisję ds. opieki, użytkowania i etyki zwierząt Krajowego Urzędu ds. Rolnictwa, Bezpieczeństwa Żywności i Rybołówstwa w Meklemburgii-Pomorzu Przednim (LALFF M-V) i uzyskały zgodę z zezwoleniami 7221.3-2.1-002/11 (myszy) i 7221.3-1-068/16 (fretki). Ogólna opieka i metody stosowane w doświadczeniach na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi.
UWAGA: Ten protokół wykorzystuje różne toksyczne i/lub szkodliwe substancje, w tym PFA, metanol (MeOH), nadtlenek wodoru (H2O2), azydek sodu (NaN3), TBA, BA, BB i DPE. MeOH i TBA są wysoce łatwopalne. Unikaj narażenia, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary ochronne) i przeprowadzając eksperymenty w dygestorium. Odpady należy zbierać oddzielnie do odpowiednich pojemników i utylizować zgodnie z lokalnymi przepisami. Wirus wścieklizny jest klasyfikowany jako patogen o poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL)-2 i dlatego może być zasadniczo traktowany w warunkach BSL-2. Niektóre działania, w tym procedury, które mogą generować aerozole, pracować z wysokimi stężeniami wirusów lub pracować z nowymi lyssawirusami, mogą wymagać klasyfikacji BSL-3. Profilaktyka przedekspozycyjna jest zalecana dla personelu wysokiego ryzyka, w tym opiekunów zwierząt i pracowników laboratoryjnych18,19. Zapoznaj się z przepisami władz lokalnych.
1. Utrwalenie tkanki mózgowej i sekcja
<ol>
	<li>Utrwalić próbki mózgu w odpowiedniej objętości 4% PFA w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS [pH 7,4]) przez co najmniej 48 godzin w temperaturze 4 °C (z przybliżonym stosunkiem tkanki do utrwalacza 1:10 [v/v]).</li>
	<li>Próbki tkanek myć 3 razy w PBS przez co najmniej 30 minut przy każdym płukaniu i przechowywać je w 0,02% NaN3/PBS w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Pokrój tkankę na odcinki o grubości 1 mm za pomocą wibratomu (szybkość posuwu ostrza: 0,3–0,5 mm/s, amplituda: 1 mm, grubość warstwy: 1 000 μm).</li>
	<li>Aby zachować prawidłową sekwencję plastrów, przechowuj każdy fragment tkanki oddzielnie w studzience wielodołkowej płytki do hodowli komórkowej. Dodać 0,02% NaN3/PBS i przechowywać skrawki tkanek w temperaturze 4 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
2. Wstępna obróbka próbki metanolem
UWAGA: Wykonuj wszystkie etapy inkubacji z delikatnymi oscylacjami i, jeśli nie wskazano inaczej, w temperaturze pokojowej. Chronić próbki przed światłem. Wstępna obróbka próbki służy ogólnemu celowi, jakim jest poprawa dyfuzji przeciwciał i zmniejszenie autofluorescencji tkanek poprzez ekspozycję na MeOH i H2O2 odpowiednio14.
<ol>
	<li>Przygotuj 20% (v/v), 40%, 60% i 80% roztwory MeOH w wodzie destylowanej. Na przykład, aby uzyskać 20% MeOH, dodaj 10 ml 100% MeOH do 40 ml wody destylowanej w odpowiednim szczelnym naczyniu i wymieszaj, odwracając je.</li>
	<li>Przenieść próbki do naczyń o odpowiedniej wielkości (np. probówek reakcyjnych o pojemności 5 ml). Zadbaj o to, aby używać materiałów odpornych chemicznie na odczynniki stosowane w tym protokole. Na przykład należy pamiętać, że podczas gdy polipropylen jest odpowiedni, polistyren nie. 
	UWAGA: Specyfikacje objętości w tym protokole odnoszą się do probówek reakcyjnych o pojemności 5 ml. Jeśli używane jest inne naczynie, odpowiednio dostosuj objętość.</li>
	<li>Inkubować próbki w 4 ml każdego stężenia przygotowanej serii roztworów MeOH w porządku rosnącym przez 1 godzinę każda.</li>
	<li>Inkubować próbki 2x przez 1 godzinę każda w czystym (100%) MeOH.</li>
	<li>Schłodzić próbki do temperatury 4 °C (np. w chłodziarce nadającej się do użytku laboratoryjnego).</li>
	<li>Przygotować roztwór wybielający (5%H2O2w MeOH), na przykład rozcieńczając 30% roztwór podstawowy H2O2 w stosunku 1:6 w czystym (100%) MeOH i schłodzić go w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć 100% MeOH ze schłodzonych próbek i dodać 4 ml wstępnie schłodzonego roztworu wybielającego (5% H2O2 w MeOH). Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Roztwór wybielający należy wymienić na 4 ml 80% MeOH i inkubować przez 1 godzinę. Kontynuować stosowanie przygotowanych serii roztworów MeOH w porządku malejącym przez 1 godzinę każdy, aż próbki będą inkubowane przez 1 godzinę w 4 ml 20% MeOH.</li>
	<li>Przemyć próbki 1x przez 1 godzinę 4 ml PBS.</li>
</ol>
3. Barwienie immunologiczne
UWAGA: Wykonuj wszystkie etapy inkubacji z delikatnymi oscylacjami i, jeśli nie wskazano inaczej, w temperaturze pokojowej. Chronić próbki przed światłem. Aby zapobiec rozwojowi drobnoustrojów, dodać NaN3 do końcowego stężenia 0,02% do roztworów w tej sekcji. Próbki tkanek są dodatkowo przepuszczalne przez obróbkę niejonowymi detergentami Triton X-100 i Tween 20. Normalna surowica służy do blokowania niespecyficznego wiązania przeciwciał. Glicyna i heparyna są dodawane w celu zmniejszenia znakowania immunologicznego background14.
<ol>
	<li>Próbki przemyć 2x po 1 h w 4 ml 0,2% Triton X-100/PBS.</li>
	<li>Próbki należy przepuszczać przez 2 dni w temperaturze 37 °C za pomocą 4 ml 0,2% Triton X-100/20% DMSO/0,3 M glicyny/PBS.</li>
	<li>Zablokować niespecyficzne wiązanie przeciwciał przez inkubację próbek przez 2 dni w temperaturze 37 °C w 4 ml 0,2% Triton X-100/10% DMSO/6% normalnej surowicy/PBS. 
	UWAGA: Użyj normalnej surowicy tego samego gatunku, w której wyhodowano przeciwciało drugorzędowe, aby osiągnąć idealne wyniki blokowania.</li>
	<li>Próbki inkubować w 2 ml roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (3% normalna surowica/5% DMSO/PTwH [PBS-Tween 20 z heparyną] + pierwszorzędowe przeciwciało/przeciwciała) przez 5 dni w temperaturze 37 °C. Odświeżyć roztwór przeciwciała pierwszorzędowego po 2,5 dnia.
	<ol>
		<li>W przypadku PTwH rozpuścić sól sodową heparyny w wodzie destylowanej w celu uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 10 mg/ml (roztwór ten należy przechowywać w porcjach w temperaturze 4 °C). Dodać roztwór podstawowy do 0,2% Tween 20/PBS do końcowego stężenia 10 μg/mL. 
		UWAGA: Wybór odpowiedniego rozcieńczenia przeciwciał może wymagać optymalizacji. Ogólnie rzecz biorąc, dobrym punktem wyjścia są standardowe stężenia immunohistochemiczne</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Próbki należy myć przez 1 dzień w 4 ml PTwH, wymieniając bufor do przemywania co najmniej 4–5 razy w ciągu dnia i pozostawiając końcowe płukanie na noc.</li>
	<li>Próbki inkubować w 2 ml roztworu przeciwciał drugorzędowych (3% normalna surowica/PTwH + przeciwciało/przeciwciała drugorzędowe) przez 5 dni w temperaturze 37 °C. Odświeżyć roztwór przeciwciała drugorzędowego po 2,5 dnia.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć drugorzędowe przeciwciało/przeciwciała w stosunku 1:500 w roztworze przeciwciała drugorzędowego (tj. 4 μl w 2 ml).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Myj próbki przez 1 dzień, jak opisano w kroku 3.5, pozostawiając ostatnie mycie na noc.</li>
</ol>
4. Barwienie jądrowe
UWAGA: Wykonuj wszystkie etapy inkubacji z delikatnymi oscylacjami i, jeśli nie wskazano inaczej, w temperaturze pokojowej. Chronić próbki przed światłem. Jeśli barwienie jądrowe nie jest wymagane lub długość fali wzbudzenia/widmo emisyjne TO-PRO-3 jest wymagane do wzbudzenia lub wykrycia innego fluoroforu, pomiń ten krok.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć barwienie kwasem nukleinowym TO-PRO-3 w stosunku 1:1,000 w PTwH i inkubować próbki w 4 ml roztworu do barwienia jądrowego przez 5 godzin.</li>
	<li>Myć próbki przez 1 dzień zgodnie z opisem w kroku 3.5, pozostawiając końcowe płukanie na noc. 
	UWAGA: Po przemyciu próbki można przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C do czasu oczyszczenia optycznego.</li>
</ol>
5. Oczyszczanie tkanek
UWAGA: Wykonuj wszystkie etapy inkubacji z delikatnymi oscylacjami i, jeśli nie wskazano inaczej, w temperaturze pokojowej. Chronić próbki przed światłem. Próbki tkanek są odwadniane w stopniowanej serii roztworów TBA. Ponieważ barwienie immunologiczne wymaga roztworów wodnych, wszystkie procedury barwienia muszą zostać zakończone przed usunięciem tkanek. Dopasowanie klirensu optycznego i współczynnika załamania światła uzyskuje się poprzez leczenie mieszaniną BA, BB i DPE. Roztwór oczyszczający jest uzupełniony o DL-α-tokoferol jako przeciwutleniacz13.
<ol>
	<li>Przygotuj 30% (v/v), 50%, 70%, 80%, 90% i 96% roztwory TBA w wodzie destylowanej. Na przykład, aby uzyskać 30% TBA, dodaj 15 ml 100% TBA do 35 ml wody destylowanej w odpowiednim szczelnym naczyniu i wymieszaj przez odwrócenie. 
	UWAGA: TBA ma temperaturę topnienia 25–26 °C; W związku z tym ma tendencję do bycia stałym w temperaturze pokojowej. W celu przygotowania roztworów TBA należy podgrzać dobrze zamkniętą butelkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze lub łaźni wodnej.</li>
	<li>Odwodnić próbki po 4 ml każdego stężenia z przygotowanej serii roztworów TBA w porządku rosnącym przez 2 godziny każda. Pozostaw 96% TBA włączone na noc.</li>
	<li>Próbki należy dalej odwadniać w czystej (100%) TBA przez 2 godziny.</li>
	<li>Przygotować roztwór czyszczący BABB-D15. 
	UWAGA: BABB-D15 jest kombinacją BA i BB (BABB), która jest mieszana z DPE w stosunku x:1, gdzie x jest określone w nazwie roztworu, w tym przypadku 15.
	<ol>
		<li>W przypadku BABB wymieszaj jedną część BA z dwiema częściami BB.</li>
		<li>Wymieszaj BABB i DPE w proporcji 15:1.</li>
		<li>Dodać 0,4% obj. DL-α-tokoferolu (witamina E). 
		UWAGA: Na przykład w przypadku 20 ml BABB-D15 wymieszaj 6,25 ml BA z 12,5 ml BB. Dodaj 1,25 ml DPE i uzupełnij go 0,08 ml DL-α-tokoferolu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Próbki należy oczyścić w roztworze klarującym, aż staną się optycznie przezroczyste (2–6 godzin).</li>
	<li>Próbki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C w BABB-D15, chronione przed światłem, do czasu montażu i obrazowania.</li>
</ol>
6. Przykładowy montaż
<ol>
	<li>Za pomocą drukarki 3D wydrukuj komorę obrazowania i pokrywę (materiał: kopoliester [CPE], dysza: 0,25 mm, wysokość warstwy: 0,06 mm, grubość ścianki: 0,88 mm, liczba ścianek: 4, wypełnienie: 100%, brak konstrukcji nośnej; odpowiednia . Plik STL można znaleźć w <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59402/3D_ImagingChamber.stl" target="_blank">Materiały uzupełniające</a> tego protokołu).</li>
	<li>Zmontuj komorę obrazowania (rysunek 2).
	<ol>
		<li>Zamontuj okrągłe szkiełko nakrywkowe (średnica: 30 mm) na komorze obrazowania z gumy silikonowej RTV-1 (jednoskładnikowa wulkanizacja w temperaturze pokojowej). Usuń nadmiar gumy silikonowej wacikiem zwilżonym wodą i utwardź przez noc.</li>
		<li>Zamontuj okrągłe szkiełko nakrywkowe (średnica: 22 mm) na wieczku z gumy silikonowej RTV-1. Usuń nadmiar gumy silikonowej wacikiem zwilżonym wodą i utwardź przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść próbkę w komorze obrazowania, dodaj niewielką objętość BABB-D15 i włóż pokrywkę. Napełnij komorę BABB-D15 przez wlot za pomocą igły podskórnej (27 G x 3/4 cala [0,40 mm x 20 mm]).</li>
	<li>Zatkać wlot i uszczelnić komorę obrazowania gumą silikonową RTV-1. Utwardzać przez noc w ciemności.</li>
</ol>
7. Obrazowanie i przetwarzanie obrazów
<ol>
	<li>Skonfiguruj akwizycję obrazu, wybierając odpowiednie linie laserowe, aby dopasować je do użytych fluoroforów. Dostosuj zakresy wykrywania każdego detektora, aby zapobiec nakładaniu się sygnału między kanałami. 
	UWAGA: Przykładowe zakresy wykrywania dla Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 i TO-PRO-3 wynoszą odpowiednio 500–550 nm, 590–620 nm i 645–700 nm.</li>
	<li>Wybierz parametry akwizycji, zdefiniuj górną i dolną granicę stosu z i pobierz stos obrazów. 
	UWAGA: Przykładowe parametry akwizycji to skan sekwencyjny o rozmiarze piksela 60-90 nm, rozmiarze kroku z 0,5 μm, średniej liniowej 1, prędkości skanowania 400 Hz oraz wielkości otworka 1 jednostki Airy.</li>
	<li>Przetwarzaj stos obrazów za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu (np. Fidżi) w celu wygenerowania projekcji 3D lub przeprowadzenia dogłębnych analiz. 
	UWAGA: Ze względu na duży rozmiar pozyskanych plików graficznych zwykle konieczne jest użycie stacji roboczej.
	<ol>
		<li>Otwórz plik pobierania lub obrazu w Fidżi (punkt menu Plik | Otwórz | Wybierz pliki).
		<ol>
			<li>Jeśli używasz, na przykład, . LIF zaznacz lub odznacz żądane opcje w oknie dialogowym Bio-Formats. Wyświetlanie stosu za pomocą programu Hyperstack. Poza tym nie są konieczne żadne konkretne wybory ani znaczniki. Naciśnij przycisk OK.</li>
			<li>Jeśli plik zawiera wiele stosów obrazów, wybierz te, które mają być analizowane i potwierdź, naciskając OK.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wykonaj korekcję wybielania, dzieląc scalony obraz na poszczególne kanały (punkt menu Obraz | Kolor | Narzędzie Kanały, a następnie wybierz Więcej | Podział kanałów). Dla każdego kanału wybierz korekcję wybielania (punkt menu Obraz | Dostosuj | Korekcja wybielacza) i wybierz Prosty współczynnik (intensywność tła: 0.0). 
		UWAGA: W niektórych przypadkach, na przykład, gdy nie ma liniowego zaniku sygnału lub sygnał jest ogólnie zbyt słaby, prosty współczynnik może się nie powieść. Możesz też wypróbować Exponential Fit lub pominąć korekcję wybielacza.</li>
		<li>Dostosuj jasność i kontrast dla każdego kanału za pomocą suwaków (punkt menu Obraz | Dostosuj | Jasność | Kontrast).</li>
		<li>Scalanie kanałów (Obraz | Kolor | Scal kanały), utwórz kompozyt (punkt menu Obraz | Kolor | Narzędzie Kanały, a następnie wybierz Więcej | Utwórz kompozyt) i przekonwertuj go na format RGB (Obraz | Kolor | Narzędzie Kanały, a następnie wybierz Więcej | Konwertuj na RGB).</li>
		<li>W razie potrzeby zmień rozmiar stosu obrazów, aby skrócić czas obliczeń i zmniejszyć rozmiar pliku (punkt menu Obraz | Dostosuj | Rozmiar, zaznaczone obie opcje plus interpolacja dwuliniowa).</li>
		<li>Generowanie rzutu 3D (punkt menu Obraz | Stosy | Projekt 3D). Wybierz Najjaśniejszy punkt jako metodę projekcji i ustaw odstępy między plasterkami tak, aby odpowiadały rozmiarowi kroku z uzyskanego stosu obrazów. Aby uzyskać maksymalną jakość, ustaw przyrost kąta obrotu na 1 i włącz interpolację. W razie potrzeby zmodyfikuj całkowity obrót, progi przezroczystości i krycie.</li>
		<li>W razie potrzeby dostosuj ponownie kontrast i jasność, konwertując projekcję 3D z powrotem na format 8-bitowy (punkt menu Obraz | Rodzaj | 8-bitowy). Użyj odpowiednich suwaków (punkt menu Obraz | Dostosuj | Jasność | Kontrast) i ponownie przekonwertuj stos obrazów na format RGB zgodnie z opisem w kroku 7.3.4.</li>
		<li>Zapisz projekcję 3D jako . Plik TIF (format pliku obrazu) i plik .AVI (format pliku wideo).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Pichat, J., Iglesias, J. E., Yousry, T., Ourselin, S., Modat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Survey+of+Methods+for+3D+Histology+Reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Image+Analysis%22%5BJournal%5D)">A Survey of Methods for 3D Histology Reconstruction.</a> Medical Image Analysis. 46, 73-105 (2018).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScaleS%3A+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearT%3A+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Treweek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).</li>
<li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+the+unsectioned+adult+spinal+cord+to+assess+axon+regeneration+and+glial+responses+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury.</a> Nature Medicine. 18 (1), 166-171 (2011).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
<li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Neuronal cell types.</a> Current Biology. 14 (13), 497-500 (2004).</li>
<li>von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+search+for+true+numbers+of+neurons+and+glial+cells+in+the+human+brain%3A+A+review+of+150+years+of+cell+counting%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting.</a> The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).</li>
<li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Rabies.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17091(2017).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WHO+Expert+Consultation+on+Rabies%2C+Third+Report%5BTitle%5D)+AND+%22WHO+Technical+Report+Series%22%5BJournal%5D)">WHO Expert Consultation on Rabies, Third Report.</a> WHO Technical Report Series. , No. 1012 (2018).</li>
<li>CDC. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biosafety+in+Microbiological+and+Biomedical+Laboratories%2C+5th+Edition.+US+Department+of+Health+and+Human+Services%22">Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5th Edition. US Department of Health and Human Services</a>. , (2009).</li>
<li>Arnold, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fixation+and+tissue+processing+on+immunohistochemical+demonstration+of+specific+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of fixation and tissue processing on immunohistochemical demonstration of specific antigens.</a> Biotechnic & Histochemistry. 71 (5), 224-230 (1996).</li>
<li>Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prolonged+formalin+fixation+on+diagnostic+immunohistochemistry+in+domestic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).</li>
<li>Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+formalin+tissue+fixation+and+processing+on+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 24 (7), 1016-1019 (2000).</li>
<li>Orbanz, J., Finke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+recombinant+European+bat+lyssavirus+type+1+and+inter-genotypic+compatibility+of+lyssavirus+genotype+1+and+5+antigenome+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Generation of recombinant European bat lyssavirus type 1 and inter-genotypic compatibility of lyssavirus genotype 1 and 5 antigenome promoters.</a> Archives of Virology. 155 (10), 1631-1641 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Odrodzenie i dalszy rozwój technik oczyszczania tkanek w ostatnich latach 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 <...

Konwencjonalne techniki histologiczne polegają głównie na cienkich przekrojach tkanek narządów, które z natury rzeczy mogą dostarczyć tylko wglądu 2D w złożone środowisko 3D. Chociaż w zasadzie jest to wykonalne, rekonstrukcja 3D z szeregowych cienkich przekrojów wymaga wymagających technicznych procesów zarówno do krojenia, jak i późniejszego wyrównania in silico pozyskanych obrazów1. Co więcej, bezproblemowa rekonstrukcja objętości Z po pokrojeniu mikrotomu ma kluczowe znaczenie, ponieważ zarówno artefakty mechaniczne, jak i obliczeniowe mogą pozostać z powodu nieoptymalnej rejestracji obrazu spowodowanej nienakładającymi się płaszczyznami obrazu, zmianami barwienia i fizycznym zniszczeniem tkanki, na przykład przez ostrze mikrotomu. W przeciwieństwie do tego, czyste optyczne cięcie nienaruszonych próbek grubych tkanek pozwala na uzyskanie nakładających się płaszczyzn obrazu (nadpróbkowanie), a tym samym ułatwia rekonstrukcję 3D. To z kolei jest bardzo korzystne dla analizy procesów infekcji w złożonych populacjach komórkowych (np. sieci neuronalnych w kontekście otaczających komórek glejowych i odpornościowych). Jednak nieodłącznymi przeszkodami związanymi z grubymi skrawkami tkanek są rozpraszanie światła i ograniczona penetracja przeciwciał w głąb tkanki. W ostatnich latach opracowano i zoptymalizowano różne techniki w celu przezwyciężenia tych problemów2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13. Zasadniczo, tkanki docelowe stają się optycznie przezroczyste przez traktowanie roztworem wodnym2,3,4,5,6,7,8,9 lub rozpuszczalnik organiczny10,11,12,13 rozwiązań. Wprowadzenie 3DISCO (3D imaging of solvent-cleared organs)11,12 i jego następca uDISCO (ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs)13 zapewniło stosunkowo szybkie, proste i niedrogie narzędzie o doskonałych możliwościach czyszczenia. Głównymi składnikami protokołu rozliczenia są rozpuszczalniki organiczne tert-butanol (TBA), alkohol benzylowy (BA), benzoesan benzylu (BB) i eter difenylowy (DPE). Opracowanie i dodanie iDISCO (immunolabeling-enabled 3D imaging of solvent-cleared organs)14, kompatybilnego protokołu barwienia immunologicznego, stanowiło kolejną zaletę w stosunku do istniejących metod i umożliwiło głębokie znakowanie tkanek antygenów będących przedmiotem zainteresowania, a także długoterminowe przechowywanie próbek wybarwionych immunologicznie. W związku z tym połączenie iDISCO14 i uDISCO13 pozwala na obrazowanie w wysokiej rozdzielczości białek znakowanych przeciwciałami w dużych skrawkach tkanek (do 1 mm) przy użyciu konwencjonalnego CLSM.
Zachowanie złożonej struktury organu we wszystkich trzech wymiarach jest szczególnie ważne dla tkanki mózgowej. Neurony stanowią bardzo niejednorodną subpopulację komórkową o bardzo zróżnicowanej morfologii 3D opartej na ich projekcjach neurytów (sprawdzone przez Masland15). Co więcej, mózg składa się z wielu przedziałów i podprzedziałów, z których każdy składa się z różnych subpopulacji komórkowych i ich proporcji, w tym komórek glejowych i neuronów (przejrzane przez von Barthelda i wsp.16). Jako wirus neurotropowy, wirus wścieklizny (RABV, recenzowany przez Fooks et al.17) przede wszystkim infekuje neurony, wykorzystując ich maszynerię transportową do przemieszczania się w kierunku wstecznym wzdłuż aksonów od pierwotnego miejsca infekcji do ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Opisany tutaj protokół (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A) pozwala na wspomagane immunobarwieniem wykrywanie i wizualizację komórek zakażonych RABV i RABV w dużych, spójnych stosach obrazów uzyskanych z zakażonej tkanki mózgowej. Umożliwia to bezstronną, wysokorozdzielczą ocenę środowiska infekcji w 3D. Ma zastosowanie do tkanki mózgowej różnych gatunków, może być wykonywany natychmiast po utrwaleniu lub po długotrwałym przechowywaniu próbek w paraformaldehydzie (PFA) i umożliwia przechowywanie i ponowne obrazowanie barwionych i oczyszczonych próbek przez miesiące.

<table><tbody><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkohol benzylowy</td><td>Alfa Aesar</td><td>41218</td><td>Odczynnik czyszczący</td></tr><tr><td>Benzoesan benzylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BB6630-500ML</td><td>Odczynnik czyszczący</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek Carl</td><td>Roth</td><td>4720.2</td><td>Różne</td></tr><tr><td>Eter difenylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240834-100G</td><td>Odczynnik czyszczący</td></tr><tr><td>DL-&alfa;-Tokoferol</td><td>Alfa</td><td>Aesar A17039</td><td>Przeciwutleniacz</td></tr><tr><td>Serum osła</td><td>Bio-Rad</td><td>C06SBZ</td><td>Odczynnik blokujący</td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Carl Roth</td><td>3908.2</td><td>Redukcja tła</td></tr><tr><td>Kozia surowica</td><td></td><td>Merck S26-100ML</td><td>Odczynnik blokujący</td></tr><tr><td>Heparyna sól sodowa</td><td>Carl Roth</td><td>7692.1</td><td>Informacje ogólne redukcja</td></tr><tr><td>Roztwór nadtlenku wodoru (30 %)</td><td>Carl Roth</td><td>8070.2</td><td>Wybielanie próbki</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carl Roth</td><td>4627.4</td><td>Wstępna obróbka próbki</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Carl Roth</td><td>0335.3</td><td>Krystaliczny proszek do sporządzania roztworu utrwalającego</td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Carl Roth</td><td>K305.1</td><td>Zapobieganie rozwojowi drobnoustrojów w roztworach podstawowych</td></tr><tr><td>tert-Butanol</td><td>Alfa Aesar</td><td>33278</td><td>Odwodnienie próbki do oczyszczania tkanek</td></tr><tr><td>TO-PRO-3</td><td>Thermo Fisher</td><td>T3605</td><td>Barwienie kwasem nukleinowym</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth</td><td>3051.2</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>AppliChem</td><td>A4974,0500</td><td>Detergent</td></tr><tr><td><silny>Różne</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr>5 <tr><td>ml reakcja Probówki</td><td>Eppendorf</td><td>0030119401</td><td>Probówki</td></tr><tr><td>na próbki Szkiełko nakrywkowe, okrągłe (średnica: 22 mm)</td><td>Marienfeld</td><td>0111620</td><td>Część komory obrazowania</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe, okrągłe (średnica: 30 mm)</td><td>Marienfeld</td><td>0111700</td><td>Część komory obrazowania</td></tr><tr><td>Igła podskórna (27 G x &frac34; &rdquo; [0,40 mm x 20 mm])</td><td>B. Braun</td><td>4657705</td><td>Napełnianie komory obrazowania roztworem czyszczącym</td></tr><tr><td>Kauczuk silikonowy RTV-1</td><td>Wacker</td><td>Elastosil E43</td><td>Klej do montażu komory obrazowania</td></tr><tr><td>Ultimaker CPE 2,85 mm przezroczysty</td><td>Ultimaker</td><td>8718836374869</td><td>Filament kopoliestrowy do drukarki 3D do drukowania części komory obrazowania</td></tr><tr><td><silny>Sprzęt techniczny i oprogramowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drukarka 3D</td><td>Ultimaker</td><td>Ultimaker 2+</td><td>Druk komory obrazowania Zautomatyzowany</td></tr><tr><td>system zanurzenia w wodzie</td><td>Leica</td><td>15640019</td><td>Pompa wodna sterowana programowo</td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>stacjonarna Elmi</td><td>DOS-20M</td><td>Inkubacja próbki w temperaturze pokojowej (~ 150 obr./min)</td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna stołowa, podgrzewana</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>G24 Wytrząsarka środowiskowa</td><td>Inkubacja próbki w temperaturze 37 & stopni; C (~ 150 rpm)</td></tr><tr><td>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Leica</td><td>DMI 6000 TCS SP5</td><td>Odwrócony mikroskop konfokalny do obrazowania próbek</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>NIH (ImageJ)</td><td>oprogramowanie open source (v1.52h)</td><td>Pakiet do przetwarzania obrazu oparty na ImageJ</td></tr><tr><td>Obiektyw do zanurzenia w wodzie na dużą odległość roboczą</td><td>Leica</td><td>15506360</td><td>HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td> Stacja robocza do <td>krojenia próbek</td></tr><tr><td></td><td>Dell</td><td>Precision 7920</td><td>Procesor: Intel Xeon Gold 5118 Karta graficzna: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB</td></tr><<tr><td>strong>Primary przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anty-RABV N</td><td>Friedrich-Loeffler-Institut</td><td></td><td>Monospecyficzna poliklonalna surowica N anty-RABV kóz, wytworzona przez immunizację kóz nukleoproteiną N z ekspresją bakulowirusa i oczyszczoną ze znacznika His-Him Rozcieńczenie: 1:400</td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało poliklonalne anty-GFAP</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td>(RRID:AB_10013382) Rozcieńczenie: 1:100</td></tr><tr><td>Królik anty-MAP2</td><td>Abcam</td><td>ab32454</td><td>Przeciwciało poliklonalne (RRID:AB_776174) Rozcieńczenie: 1:250</td></tr><tr><td>Królik anty-RABV P 160-5</td><td>Friedrich-Loeffler-Institut</td><td></td><td>Monospecyficzna poliklonalna królicza surowica anty-RABV P, wytworzona przez immunizację królika fosfoproteiną P z ekspresją bakulowirusa i oczyszczoną przez His-tag RABV (patrz odniesienie 23: Orbanz i wsp., 2010) Rozcieńczenie: 1:1,000</td></tr><tr><td><silne>Przeciwciała drugorzędowe</silne></td><td></td><td></td><td></td>Przeciwkozowe</tr> <tr><td>IgG Thermo</td><td>Fisher Naukowe</td><td>w zależności od sprzężonego fluorofor</td><td>Wysoce wchłaniany krzyżowo Rozcieńczenie: 1:500</td></tr><tr><td>IgG przeciw mysim osiołkom Thermo</td><td>Fisher Naukowe</td><td>w zależności od sprzężonego fluoroforu</td><td>Wysoce wchłaniany krzyżowo Rozcieńczenie: 1:500</td></tr><tr><td>Osioł anty-królik IgG</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>w zależności od sprzężonego fluoroforu</td><td>Wysoce wchłaniany krzyżowo Rozcieńczenie: 1:500</td></tr><tr><td>Kozia anty-mysia IgG</td><td>Thermo Fisher Naukowe</td><td>w zależności od sprzężonego fluoroforu</td><td>Wysoce wchłaniany krzyżowo Rozcieńczenie: 1:500</td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG</td><td>Thermo Fisher Naukowe</td><td>w zależności od sprzężonego fluoroforu</td><td>Wysoce wchłaniany krzyżowo Rozcieńczenie: 1:500</td></tr></tbody></table>

obrazowanie 3d w wysokiej rozdzielczości zakażenia wirusem wścieklizny w tkance mózgowej oczyszczonej rozpuszczalnikiem

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

Wizualizacja procesów infekcji w tkankach i narządach za pomocą immunoznakowania jest kluczową metodą w nowoczesnej biologii infekcji. Możliwość obserwowania i badania rozmieszczenia, tropizmu i liczebności patogenów w tkankach narządów dostarcza kluczowych danych na temat rozwoju i progresji choroby. Przy użyciu konwencjonalnych metod mikroskopowych znakowanie immunologiczne ogranicza się głównie do cienkich skrawków uzyskanych z próbek zatopionych w parafinie lub zamrożonych. Jednak ograniczona płaszczyzna obrazu 2D tych cienkich skrawków może prowadzić do utraty kluczowych informacji na temat złożonej struktury zakażonego narządu i kontekstu komórkowego infekcji. Nowoczesne wielokolorowe, kompatybilne z barwieniem immunologicznym techniki oczyszczania tkanek zapewniają obecnie stosunkowo szybki i niedrogi sposób badania dużych ilości obrazów 3D tkanek narządów zakażonych wirusem. Dzięki wystawieniu tkanki na działanie rozpuszczalników organicznych staje się ona optycznie przezroczysta. Odpowiada to współczynnikom załamania światła próbki i ostatecznie prowadzi do znacznego zmniejszenia rozpraszania światła. W ten sposób, w połączeniu z obiektywami o dużej swobodnej odległości roboczej, duże skrawki tkanek o wielkości do 1 mm mogą być obrazowane za pomocą konwencjonalnej konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM) w wysokiej rozdzielczości. W tym miejscu opisujemy protokół stosowania obrazowania tkanek głębokich po oczyszczeniu tkanek w celu wizualizacji dystrybucji wirusa wścieklizny w zakażonych mózgach w celu zbadania takich tematów, jak patogeneza wirusa, rozprzestrzenianie się, tropizm i neuroinwazja.

Połączenie metod iDISCO14 i uDISCO13 wraz z wysokorozdzielczym CLSM zapewnia głęboki wgląd w rozdzielczość czasoprzestrzenną i plastyczność infekcji RABV w tkance mózgowej oraz w otaczający kontekst komórkowy.
Dzięki zastosowaniu immunobarwienia fosfoproteiny (P) wirusa wścieklizny (RABV) można zwizualizować złożone warstwy zainfekowanych komórek neuronalnych w grubych przekrojach mózgów myszy (Rysunek 3). Następnie ...

Nowatorskie, kompatybilne z barwieniem immunologicznym techniki oczyszczania tkanek, takie jak ostateczne obrazowanie 3D organów oczyszczonych rozpuszczalnikiem, pozwalają na wizualizację 3D infekcji mózgu wirusem wścieklizny i jego złożonego środowiska komórkowego. Grube, znakowane przeciwciałami wycinki tkanki mózgowej są optycznie przezroczyste, aby zwiększyć głębokość obrazowania i umożliwić analizę 3D za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

Obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości zakażenia wirusem wścieklizny w tkance mózgowej oczyszczonej rozpuszczalnikiem

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Protokół ten umożliwia wizualizację infekcji wirusowej i zapewnia głęboki wgląd w czasoprzestrzenną rozdzielczość środowiska infekcji i otaczającego go kontekstu komórkowego. Zastosowanie barwienia immunologicznego do obrazowania tkanek głębokich nie tylko pozwala na wykrywanie wirusów, ale w rzeczywistości umożliwia również różnicowanie różnych subpopulacji komórkowych za pomocą odpowiednich markerów komórkowych. Aby utrwalić tkankę do barwienia immunologicznego, umieść próbki mózgu w stosunku 1 do 10 4% paraformaldehydu w PBS do objętości tkanki próbki przez co najmniej 48 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Pod koniec okresu utrwalania przemyć próbki tkanek trzy razy w PBS przez co najmniej 30 minut na przemycie przed przeniesieniem próbek do 02% azydku sodu w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie użyj wibratomu ustawionego na szybkość posuwu ostrza od 0,3 do 0,5 milimetra na sekundę, aby podzielić tkanki na odcinki o grubości jednego milimetra. Skrawki należy przechowywać w świeżym 02% azydku sodu w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza.W celu wstępnej obróbki metanolem należy zanurzyć próbki w rosnącej serii metanolu, jak wskazano, na jedną godzinę podczas inkubacji w temperaturze pokojowej z delikatnymi oscylacjami. Po ostatniej inkubacji schłodzić próbki do czterech stopni Celsjusza. Zastąp 100% metanol czterema mililitrami wstępnie schłodzonego roztworu wybielającego do inkubacji przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego ranka zastąp roztwór wybielający czterema mililitrami świeżego 80% metanolu na jedną godzinę inkubacji w temperaturze pokojowej. Następnie zanurz próbki w malejącej serii metanolu w odwrotnej kolejności niż właśnie pokazano, myjąc próbki jeden raz przez godzinę w czterech mililitrach PBS po 20% zanurzeniu w metanolu. W celu barwienia immunologicznego skrawków tkanki mózgowej przemyj próbki dwa razy przez godzinę w czterech mililitrach 0,2% Triton X-100 w PBS, a następnie przez dwa dni permeabilizację w temperaturze 37 stopni Celsjusza w czterech mililitrach 0,2% Triton X-100, 20% sultlenku dimetylu i 0,3 molowej glicyny w PBS.Zablokuj wszelkie niespecyficzne wiązania czterema mililitrami 0,2% Triton X-100, 10% dimetylosulfotlenku i 6% normalnej surowicy w PBS przez dwa dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji blokującej znakować próbki dwoma mililitrami roztworu przeciwciała pierwszorzędowego przez pięć dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza, odświeżając roztwór przeciwciała po dwóch i 1/2 dni. Następnie myj próbki przez jeden dzień w czterech mililitrach 0,2% między 20 a 10 mikrogramami na mililitr heparyny w PBS, wymieniając bufor do płukania co najmniej cztery do pięciu razy w ciągu dnia i pozostawiając końcowe płukanie na noc.Następnego dnia inkubuj próbki w dwóch mililitrach roztworu przeciwciał drugorzędowych przez pięć dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie umyj próbki w czterech mililitrach świeżej heparyny 0,2% 20 i 10 mikrogramów na mililitr w PBS, jak pokazano. W celu barwienia jądrowego próbek inkubować próbki w czterech mililitrach barwnika kwasem nukleinowym TO-PRO-3 przez pięć godzin, chroniąc przed światłem.Pod koniec inkubacji przemyć próbki w 0,2% między 20 a 10 mikrogramami na mililitr heparyny w PBS, jak pokazano, a następnie odwodnić w rosnącej serii tert-butanolu przez dwie godziny na zanurzenie. Po 90% zanurzeniu przenieś próbki na noc do 96% roztworu tert-butanolu. Następnego ranka odwadniaj próbki w 100% tert-butanolu przez dwie godziny, a następnie wyczyść skrawki tkanek w świeżo przygotowanym BABB-D15 przez dwie do sześciu godzin, aż staną się optycznie przezroczyste.Próbki mogą być następnie przechowywane w BABB-D15 chronione przed światłem do czasu ich zamontowania i zobrazowania. Do montażu próbki użyj drukarki 3D, aby wydrukować komorę obrazowania i pokrywę. Zamontuj szkiełko nakrywkowe o średnicy 30 milimetrów na komorze obrazowania z jednoskładnikową gumą silikonową wulkanizującą w temperaturze pokojowej.Podobnie zamontuj 22-milimetrowe szkiełko nakrywkowe na pokrywie. Użyj bawełnianego wacika zwilżonego wodą, aby usunąć nadmiar gumy silikonowej z obu pierścieni, zanim pozwolisz gumie utwardzić się przez noc. Następnego dnia umieść próbkę w komorze obrazowania i dodaj niewielką objętość BABB-D15 do komory przed włożeniem pokrywy.Za pomocą igły podskórnej napełnij komorę BABB-D15 przez wlot i zatkaj wlot przed uszczelnieniem komory obrazowania gumą silikonową. Aby skonfigurować akwizycję obrazu, wybierz odpowiednie linie laserowe dla używanych fluoroforów i dostosuj zakresy wykrywania każdego detektora, aby zapobiec nakładaniu się sygnału między kanałami. Następnie ustaw parametry akwizycji, aby znaleźć górną i dolną granicę stosu Z i uzyskać stos obrazów.Aby wygenerować projekcje 3D stosu obrazów, otwórz pliki obrazów w Fidżi i wybierz Kanały kolorów obrazu, Narzędzie, Więcej i Podziel kanały, aby podzielić scalone obrazy na poszczególne kanały. Aby uzyskać korekcję wybielania obrazów, dla każdego kanału wybierz opcję Image Adjust Bleach Correction (Korekcja rozjaśnienia) i wybierz opcję Simple Ratio (Proste proporcje). Użyj suwaków, aby dostosować jasność i kontrast dla każdego kanału, a następnie wybierz Kolor obrazu i Scal kanały.Zaznacz opcję Utwórz kompozyt. Przekonwertuj obraz do formatu RGB i wybierz opcję Stosy obrazów i Projekt 3D, aby wygenerować projekcję 3D. Wybierz Najjaśniejszy punkt jako metodę Projekcja i ustaw odstępy między plasterkami tak, aby odpowiadały rozmiarowi kroku Z uzyskanego stosu obrazów.Aby uzyskać maksymalną jakość, ustaw przyrost kąta obrotu na jeden i włącz interpolację. W razie potrzeby zmodyfikuj całkowity obrót, progi przezroczystości i krycie. Następnie zapisz projekcję 3D w formacie tiff i AVI.Za pomocą barwienia immunologicznego wirusa wścieklizny można wizualizować warstwy kompleksu fosfoprotein zakażonych komórek nerwowych w grubych odcinkach próbek tkanki mózgowej myszy. Następnie można zrekonstruować płynne projekcje 3D pozyskanych stosów obrazów. Ze względu na wysoką rozdzielczość, z jaką rejestrowane są stosy obrazów, infekcję można ocenić do poziomu pojedynczej komórki, co pozwala na stwierdzenie, na przykład, obfitości i rozmieszczenia antygenu w komórce będącej przedmiotem zainteresowania.Oprócz tkanki mózgowej myszy protokół można zastosować do próbek tkanki mózgowej innych gatunków zwierząt. Na przykład skrawki uzyskane z różnych przedziałów zakażonego mózgu fretki ujawniają różny stopień zakażenia wirusem wścieklizny. Astrocyty mogą być różnicowane poprzez ekspresję białka kwasu fibrylarnego glejowego, podczas gdy neuryty mogą być specyficznie barwione pod kątem białka związanego z mikrotubulami II. Jednocześnie białka wirusowe mogą być barwione w celu oceny związku między zakażonymi komórkami a wyróżnioną subpopulacją komórkową.W przypadku barwienia immunologicznego kluczowy ma wybór przeciwciał do wykrywania białek będących przedmiotem zainteresowania. Podczas gdy standardowe stężenia immunohistochemiczne są często dobrym punktem wyjścia, niektóre przeciwciała mogą wymagać dodatkowej korekty. Wiele substancji chemicznych użytych w tym protokole ma szkodliwe właściwości.Przeprowadzić odpowiednie doświadczenie w dygestorium, mając na sobie odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym fartuch laboratoryjny i rękawice.

high-resolution-3d-imaging-rabies-virus-infection-solvent-cleared

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszej pracy opisujemy szybką i prostą metodę obrazowania fluorescencyjnie znakowanych komórek w półgrubych skrawkach mózgu. Poprzez utrwalenie, pocięcie i optyczne klarowanie tkanki mózgowej opisujemy, w jaki sposób standardowe obrazowanie epifluorescencyjne lub konfokalne może być wykorzystane do wizualizacji poszczególnych komórek i sieci neuronalnych w obrębie nienaruszonej tkanki nerwowej.

Szybka metoda obrazowania fluorescencyjnego o wysokiej rozdzielczości w półgrubych przekrojach mózgu

Wirus infekuje neurony piramidowe w korze mózgowej, a ekspresja białek wirusowych lokalizuje się w wewnątrzcytoplazmatycznych strukturach ziarnistych znanych jako ciała inkluzyjne.

Wykrywanie białek wirusowych w tkance mózgowej myszy zakażonej wirusem wścieklizny

Ten film demonstruje barwienie immunohistochemiczne do wykrywania antygenu wirusa wścieklizny w zakażonej tkance mózgowej myszy. Proces ten obejmuje deparatynizację i leczenie alkoholem, a następnie leczenie proteolityczne w celu zwiększenia dostępności antygenu. Barwienie immunohistochemiczne ujawnia czerwone osady, potwierdzające obecność antygenów wścieklizny w skrawku tkankowym.

Barwienie immunohistochemiczne do wykrywania antygenów wirusa wścieklizny

Źródło: Zaeck, L., et al. Obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości zakażenia wirusem wścieklizny w tkance mózgowej oczyszczonej rozpuszczalnikiem. J. Vis. exp. (2019).  Ten film pokazuje proces przygotowania i obrazowania tkanki mózgowej myszy zakażonej wirusem wścieklizny (RABV) w celu oceny postępu infekcji. Przedstawiono w nim kluczowe etapy, w tym barwienie tkanek za pomocą markerów fluorescencyjnych, odwodnienie, oczyszczanie i montaż do konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej,...

Trójwymiarowa wizualizacja zakażenia wirusem wścieklizny w tkance mózgowej myszy

Bezpośredni szybki test immunohistochemiczny (DRIT) stanowi uznaną przez Światową Organizację Zdrowia Zwierząt i Światową Organizację Zdrowia (OIE/WHO) alternatywę dla testu na przeciwciała fluorescencyjne (DFA) do diagnozowania wścieklizny. Test ten pozwala na zastosowania w terenie, które można wykonać w ciągu około 1 godziny po pobraniu wycisków mózgu za pomocą mikroskopii świetlnej.

Wzmocniony nadzór nad wścieklizną za pomocą bezpośredniego szybkiego testu immunohistochemicznego

Tutaj prezentujemy protokół testu immunohistochemicznego do wykrywania antygenu wirusa wścieklizny jako alternatywny test diagnostyczny dla tkanek utrwalonych w formalinie.

Test immunohistochemiczny do wykrywania antygenu wirusa Lyssa z tkanek utrwalonych formaliną

Ten protokół przedstawia oparte na qRT-PCR podejście do określania liczby kopii genu nukleoproteiny (N) wirusa wścieklizny w różnych strukturach anatomicznych mózgu bydlęcego za pomocą transkrypcji in vitro.

Kwantyfikacja wirusa wścieklizny w różnych strukturach mózgu bydła

Tutaj prezentujemy protokół do stworzenia nowego szczurzego modelu aktywnego zakażenia wirusem HIV za pomocą chimerycznego HIV (EcoHIV), który jest kluczowy dla zwiększenia naszego zrozumienia rezerwuarów wirusa HIV-1 w mózgu i oferuje system do badania zaburzeń neurokognitywnych związanych z HIV i związanych z nimi chorób współistniejących (np. nadużywania narkotyków).

Szczurzy model infekcji mózgu EcoHIV

Protokół dostarcza szczegółową metodę obrazowania neuronów w wycinku mózgu za pomocą metody oczyszczania tkanki, ScaleSF. Protokół obejmuje przygotowanie tkanki mózgowej, klarowanie tkanek, postępowanie z oczyszczonymi wycinkami oraz konfokalne obrazowanie struktur neuronalnych za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej od poziomu mezoskopowego do mikroskopowego.

Metoda oczyszczania tkanek do obrazowania neuronów ze skal mezoskopowych do mikroskopowych

Protokół ten demonstruje test reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji i polimerazy (RT-PCR) pan-lizawirusa LN34 w czasie rzeczywistym od pobierania tkanek do interpretacji wyników, w tym aktualizacje sekwencji primerów i formuł poprawiających wydajność testu dla niektórych lizawirusów i zalegowców niezwiązanych z wścieklizną. Demonstrujemy także konfigurację testu dla multipleksowanego formatu LN34 z pojedynczym dołkiem (LN34M).

Diagnostyka pośmiertna wścieklizny u zwierząt za pomocą zaktualizowanego, multipleksowanego testu LN34 w czasie rzeczywistym reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji i polimerazy

Poznaj technikę immunobarwienia z oczyszczaniem tkanek do 3D obrazowania zakażenia wirusem wścieklizny w tkance mózgowej myszy. Metoda umożliwia wizualizację warstw zakażonych neuronów i analizę rozprzestrzeniania się antygenu wirusowego na poziomie pojedynczych komórek.

Obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości zakażenia wirusem wścieklizny w tkance mózgowej oczyszczonej rozpuszczalnikiem

Przeglądaj więcej filmów