Name: Badanie zmian w mikrobiocie kątnicy po urazowym uszkodzeniu mózgu u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 29 s
Description: Poznaj metodę indukcji urazowego uszkodzenia mózgu u myszy i analizę zmian mikrobioty kątnicy. Technika ta pozwala badać oś jelitowo-mózgową oraz jej wpływ na zdrowie po urazie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wszystkie przeprowadzone procedury zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Doświadczalnych Uniwersytetu Zhejiang. Wszystkie narzędzia i materiały używane w chirurgii są sterylne. Proces TBI trwa około 20 minut.
1. Opieka nad zwierzętami
<ol>
	<li>W tym eksperymencie użyj 5- do 6-tygodniowych samców myszy C57BL/6J (20-25 g wagi).</li>
	<li>Utrzymuj myszy w cyklu 12 godzin/12 godzin światła/ciemności i upewnij się, że otrzymują jedzenie i wodę ad libitum. Zapewnij takie same ilości jedzenia i wody zarówno grupie pozorowanej, jak i TBI przez cały czas trwania badania.</li>
	<li>Dołoż wszelkich starań, aby zminimalizować ból i dyskomfort zwierzęcia.</li>
</ol>
2. Indukcja urazowego uszkodzenia mózgu
<ol>
	<li>Wstrzyknąć ketaminę (80-100 mg/kg)/ksylazynę (10 mg/kg) IP do znieczulenia. Przetestuj głębokość znieczulenia za pomocą odruchu wzrokowego lub odruchu bólowego. Używaj sztucznych łez lub nawilżającej maści do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu.</li>
	<li>Po znieczuleniu ułóż mysz w pozycji leżącej. Użyj poduszki grzewczej o kontrolowanej temperaturze, aby utrzymać temperaturę 37 °C podczas zabiegu i przez 30 minut po TBI.</li>
	<li>Ogol włosy w miejscu nacięcia.</li>
	<li>Zdezynfekuj skórę głowy 70% etanolem za pomocą trzech naprzemiennych peelingów, a następnie nacinaj skórę głowy w płaszczyźnie strzałkowej.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby cofnąć nacięcie po obu stronach i lekko oddzielić okostną.</li>
	<li>Za pomocą markera narysuj okrąg (o średnicy 3 mm) w prawej okolicy ciemieniowej czaszki, w odległości 2 mm od linii środkowej.</li>
	<li>Wywierć czaszkę wiertarką elektryczną. Upewnij się, że ten krok jest wykonywany ostrożnie, aby chronić oponę twardą przed uszkodzeniem.</li>
	<li>Usuń płat kostny i odsłoń małe okienko kostne (o średnicy 3 mm).</li>
	<li>Umieść plastikową kaniulę (średnica wewnętrzna = 2,5 mm, długość = 8 mm) nad kraniotomią i przymocuj kaniulę do czaszki za pomocą akrylu dentystycznego.</li>
	<li>Napełnij kaniulę sterylnym 0,9% NaCl (sól fizjologiczna) za pomocą strzykawki (5 ml), aby upewnić się, że w kaniuli nie ma pęcherzyków.</li>
	<li>Włącz oscyloskop i amplifier i upewnij się, że rurka wysokociśnieniowa urządzenia do bocznego uszkodzenia udaru płynem (LFPI) jest wolna od pęcherzyków powietrza. Przetestuj urządzenie, dostarczając około 10 impulsów, aż da stały sygnał. Dostosuj kąt położenia początkowego wahadła, aby osiągnąć intensywność impulsu około 2.0 atm.</li>
	<li>Podłącz kaniulę urazową do urządzenia LFPI. Wywołaj uszkodzenie mózgu, pociągając za spust i zwalniając wahadło. Następnie uzyskaj impuls i prześlij go do opony twardej przez cały zamknięty system rurek wypełnionych płynem.</li>
	<li>Operuj myszy w grupie pozorowanej za pomocą tej samej procedury chirurgicznej. Nie wykonuj LFPI.</li>
</ol>
3. Leczenie pooperacyjne
<ol>
	<li>Po wywołaniu urazu mózgu należy zdjąć plastikową kaniulę i zszyć nacięcie. Podczas zabiegu należy podawać buprenorfinę (2 mg/kg) SQ lub IP, a następnie co 6-12 godzin przez trzy dni.</li>
	<li>Połóż mysz na poduszce grzewczej, aż będzie gotowa do chodzenia. Ustaw temperaturę poduszki grzewczej na 37 °C, aby przyspieszyć resuscytację anestezjologiczną.</li>
	<li>Umieść mysz z powrotem w klatce i podawaj jedzenie i wodę ad libitum.</li>
</ol>
4. Laparotomia i pobranie próbki z kątnicy
<ol>
	<li>Poddaj myszy eutanazji za pomocą CO2 , a następnie zwichnięcia szyjki macicy w odpowiednich punktach czasowych. 
	UWAGA: W tym eksperymencie wybrano punkty czasowe 1 h, 6 h, 1 d, 3 d i 7 d pourazowego uszkodzenia mózgu, aby przeanalizować dynamiczną ewolucję mikrobioty jelitowej.</li>
	<li>Usuń włosy z powierzchni brzucha. Zdezynfekuj brzuch 70% etanolem.</li>
	<li>Umieść sterylną serwetkę na myszy. Wykonaj nacięcie od linii środkowej dolnej części brzucha, tuż nad napletkiem u samców myszy.</li>
	<li>Po odsłonięciu jelit zlokalizuj jelito ślepe i delikatnie oddziel je od innych przewodów jelitowych. Unikaj chwytania jelita ślepego ząbkowanymi lub ostrymi kleszczami. Używaj kleszczy atraumatycznych, takich jak kleszcze Adson z ząbkami.</li>
	<li>Wytnij kątnicę ostrymi nożyczkami.</li>
	<li>Zawartość jelita ślepego należy ręcznie wyekstrahować na sterylny opatrunek i przechowywać w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Zawartość jelita ślepego należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy mikrobiomu.</li>
</ol>
5. Ekstrakcja DNA oraz sekwencjonowanie i analiza danych 16S-rDNA
<ol>
	<li>Izolacja DNA z kału 
	UWAGA: Do tego eksperymentu użyto dostępnego na rynku zestawu do izolacji DNA (Tabela Materiałów).
	<ol>
		<li>Za pomocą skalpela zeskrob 300 mg kału do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml i umieść probówkę na lodzie.</li>
		<li>Dodać 1 ml buforu hamującego do każdej próbki. Wirować w sposób ciągły przez 1 minutę lub do momentu, gdy próbka kału zostanie dokładnie zhomogenizowana.</li>
		<li>Odwirować próbkę z maksymalną prędkością przez 1 minutę w celu osadzenia cząstek kału.</li>
		<li>Pobrać pipetą 2 μl proteinazy K do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml. Odmierzyć pipetą 600 μl supernatantu z kroku 5.1.3 do probówki mikrowirówki o pojemności 2 ml zawierającej proteinazę K. Następnie dodaj 600 μl buforu 1 i wiruj przez 15 s.</li>
		<li>Inkubować próbkę w temperaturze 70 °C przez 10 minut.</li>
		<li>Do lizatu dodać 600 μl 100% etanolu (w stosunku 1:1) i wymieszać przez wirowanie. Odwirować na krótko z maksymalną prędkością, aby usunąć krople z wnętrza pokrywy probówki.</li>
		<li>Nanieść 600 μl lizatu na kolumnę wirową. Wirować z maksymalną prędkością przez 1 min. Odrzuć przepływ. Powtórz ten krok jeszcze raz. Następnie przenieść kolumnę do nowej probówki zbiorczej o pojemności 2 ml.</li>
		<li>Otwórz kolumnę wirowania i dodaj 500 μl buforu 2. Wirować z maksymalną prędkością przez 1 min. Wyjąć kolumnę i umieścić ją w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.</li>
		<li>Dodać 500 μl buforu 3 do kolumny. Wirować z maksymalną prędkością przez 3 minuty. Odrzuć przepływ. Powtórz proces wirowania jeden raz, aby upewnić się, że bufor 3 jest całkowicie wymyty.</li>
		<li>Umieścić kolumnę wirową w nowej probówce o pojemności 2 ml i odpipetować 200 μl buforu 4 bezpośrednio na membranę. Inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (RT), a następnie wirować z maksymalną prędkością przez 1 minutę w celu wymycia DNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sekwencjonowanie i analiza danych 16S-rDNA
	<ol>
		<li>Użyj 20-30 ng DNA do wygenerowania amplikonów.</li>
		<li>Stosować komercyjnie dostępne startery przeznaczone dla stosunkowo konserwatywnych regionów graniczących z hiperzmiennymi regionami V3 i V4 bakterii 16S rDNA. W niniejszej pracy zastosowano startery do przodu zawierające sekwencję "CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT" oraz startery odwrotne zawierające sekwencję "GGACTACNVGGGTWTCTAATCC".</li>
		<li>Przygotuj mieszaninę reakcyjną PCR, dodając 2,5 μl buforu 1, 2 μl dNTP, 1 μl każdego startera, 0,5 μl polimerazy DNA i 20 ng matrycy DNA w probówce. Użyj ddH2O, aby dostosować układ reakcyjny do 25 μL.</li>
		<li>Ustawić parametry reakcji PCR w następujący sposób: przeprowadzić wstępną denaturację w temperaturze 94 °C przez 3 minuty jeden raz. Przeprowadzić denaturację w temperaturze 94 °C przez 5 s, wyżarzanie w temperaturze 57 °C przez 90 s, przedłużyć w temperaturze 72°C przez 10 s i powtórzyć to 24 razy.</li>
		<li>Wykonaj sekwencjonowanie sparowanych końców PE250/300 zgodnie z instrukcją producenta i użyj pakietu do analizy danych QIIME do analizy danych 16S rRNA. 
		UWAGA: W tym eksperymencie sekwencjonowanie DNA i analiza danych zostały wykonane głównie przez profesjonalną firmę zajmującą się sekwencjonowaniem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Cheng, P., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCheng%2C+P+%22Trends+in+traumatic+brain+injury+mortality+in+China%2C+2006-2013%3A+A+population-based+longitudinal+study%22">Trends in traumatic brain injury mortality in China, 2006-2013: A population-based longitudinal study</a>. 14, e1002332(2017).</li>
<li>Maas, A. I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+brain+injury%3A+integrated+approaches+to+improve+prevention%2C+clinical+care%2C+and+research%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research.</a> The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).</li>
<li>Gaddam, S. S., Buell, T., Robertson, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+manifestations+of+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Clinical+Neurology%22%5BJournal%5D)">Systemic manifestations of traumatic brain injury.</a> Handbook of Clinical Neurology. 127, 205-218 (2015).</li>
<li>Kabadi, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid-percussion-induced+traumatic+brain+injury+model+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats.</a> Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).</li>
<li>Fung, T. C., Olson, C. A., Hsiao, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+the+microbiota%2C+immune+and+nervous+systems+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Interactions between the microbiota, immune and nervous systems in health and disease.</a> Nature Neuroscience. 20, 145-155 (2017).</li>
<li>Collins, S. M., Surette, M., Bercik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interplay+between+the+intestinal+microbiota+and+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The interplay between the intestinal microbiota and the brain.</a> Nature Reviews Microbiology. 10, 735-742 (2012).</li>
<li>Cryan, J. F., Dinan, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mind-altering+microorganisms%3A+the+impact+of+the+gut+microbiota+on+brain+and+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mind-altering microorganisms: the impact of the gut microbiota on brain and behaviour.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13, 701-712 (2012).</li>
<li>Nicholson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate+Traumatic+Brain+Injury+Alters+the+Gastrointestinal+Microbiome+in+a+Time-Dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Moderate Traumatic Brain Injury Alters the Gastrointestinal Microbiome in a Time-Dependent.</a> Shock. , (2018).</li>
<li>Houlden, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+injury+induces+specific+changes+in+the+caecal+microbiota+of+mice+via+altered+autonomic+activity+and+mucoprotein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Brain injury induces specific changes in the caecal microbiota of mice via altered autonomic activity and mucoprotein production.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 57, 10-20 (2016).</li>
<li>Treangen, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+Brain+Injury+in+Mice+Induces+Acute+Bacterial+Dysbiosis+Within+the+Fecal+Microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Traumatic Brain Injury in Mice Induces Acute Bacterial Dysbiosis Within the Fecal Microbiome.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2757(2018).</li>
<li>Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+fluid+percussion%3A+model+of+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lateral fluid percussion: model of traumatic brain injury in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2011).</li>
<li>Thompson, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+fluid+percussion+brain+injury%3A+a+15-year+review+and+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Lateral fluid percussion brain injury: a 15-year review and evaluation.</a> Journal of Neurotrauma. 22, 42-75 (2005).</li>
<li>Pang, W., Vogensen, F. K., Nielsen, D. S., Hansen, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faecal+and+caecal+microbiota+profiles+of+mice+do+not+cluster+in+the+same+way%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Faecal and caecal microbiota profiles of mice do not cluster in the same way.</a> Laboratory Animals. 46, 231-236 (2012).</li>
</ol>

Autorzy serdecznie dziękują Baohong Wang za jej wskazówki techniczne.

Przedstawiono prosty i skuteczny protokół określania zmian w mikrobiocie jelita ślepego po TBI u myszy. Indukcja uszkodzenia mózgu i pobranie próbek zawartości kątnicy są kluczowymi elementami protokołu.
Pomimo tego, że naukowcy badali zmiany mikrobioty jelitowej po TBI, uszkodzenie mózgu wykorzystane w tych badaniach to CCI-8 i modele wywołane spadkiem masy ciała/uderzeniem9. Jednak model CCI w większości replikuje stłuczenie mózgu, a model spad...

Urazowe uszkodzenie mózgu (TBI) jest globalnym problemem zdrowia publicznego i główną przyczyną zgonów i niepełnosprawności u młodych dorosłych1,2. TBI powoduje wiele zgonów każdego roku, a osoby, które przeżyły, doświadczają różnych niepełnosprawności fizycznych, psychicznych, emocjonalnych i poznawczych. W związku z tym TBI jest dużym obciążeniem dla rodziny pacjenta i zasobów społecznych. TBI obejmuje zarówno pierwotne uszkodzenie mózgu, które występuje w momencie urazu, jak i wszelkie wtórne uszkodzenia mózgu, które rozwijają się od kilku godzin do miesięcy po początkowym urazie. Wtórne uszkodzenie mózgu jest wywoływane przez kilka kaskad biochemicznych, które są nie tylko szkodliwe dla mózgu, ale także mają znaczący negatywny wpływ na różne układy narządów, w tym układ pokarmowy3.
Obecnie istnieją trzy modele wywoływania TBI w eksperymentach na zwierzętach: płynne uderzenie w korę mózgową, kontrola wpływu kory mózgowej (CCI) i przyspieszenie spadku wagi. Boczne uszkodzenie płynu udarowego (LFPI) jest najczęściej używanym modelem do ustalenia rozlanego uszkodzenia mózgu (DAI)4. Urządzenie powoduje uszkodzenie mózgu poprzez kraniektomię poprzez zastosowanie krótkiego impulsu ciśnienia płynu do nienaruszonej opony twardej. Impuls ten powstaje w wyniku uderzenia wahadła. LFPI to powtarzalna i kontrolowana metoda modelowania do badań TBI. 
Mikrobiom jest zdefiniowany jako zbiorowe genomy wszystkich mikroorganizmów rezydujących w ludzkim ciele. W szczególności mikroorganizmy jelitowe nie tylko odgrywają ważną rolę w homeostazie i funkcjonowaniu jelit, ale także regulują wiele aspektów fizjologii gospodarza i funkcjonowania innych narządów5. W ostatnich latach pojawia się coraz więcej dowodów wskazujących na to, że mikrobiota jelitowa reguluje rozwój i funkcjonowanie mózgu poprzez osie mózgowo-jelitowe6. Zaburzenia mikrobioty jelitowej są powiązane z kilkoma zaburzeniami funkcji mózgu, w tym chorobą Parkinsona, zaburzeniami nastroju i autyzmem7. Niedawne badania przedkliniczne wykazały również, że ostre uszkodzenie mózgu może wywoływać zmiany w mikrobiocie jelitowej8,9. 
Badanie przeprowadzone przez Treangen et al.10 wykazało znaczące spadki u trzech gatunków drobnoustrojów i wzrost u dwóch gatunków drobnoustrojów po TBI wywołanym przez CCI. Dowody te wskazują, że modulacja mikrobioty jelitowej może być metodą terapeutyczną w leczeniu TBI. Jednak mechanizmy leżące u podstaw zmian mikrobioty jelitowej wywołanych uszkodzeniem mózgu pozostają nieznane. Z tego powodu potrzebny jest stosunkowo prosty i skuteczny model badania zmian w mikrobiocie jelitowej po TBI. W związku z tym w niniejszym badaniu przedstawiono protokół badania zmian w mikrobiocie jelitowej po TBI u myszy.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do izolacji DNA&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>51604</td><td>Do szybkiego oczyszczania genomowego DNA z próbek kału</td></tr><tr><td>Usługa analizy genów</td><td>GENEWIZ</td><td></td><td>Usługa analizy genów</td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>Shanghai SAFE Biotech Co.</td><td>Wtryskiwacz poduszki grzewczej</td> <td>TR-200</td></tr><tr><td></td><td>Pierwszy stowarzyszony szpital, Szkoła Medyczna, Wtryskiwacz Uniwersytetu</td><td></td><td></td>Zhejiang</tr><tr><td>Urządzenie LFPI</td><td>Virginia Commonwealth University</td><td>FP302</td><td>Urządzenie LFPI</td></tr><tr><td>Mikro wiertarka czaszkowa</td><td>RWD Life Science</td><td>78061</td><td>Mikro wiertło czaszkowe</td></tr><tr><td>Jod powidonu</td><td>Pierwszy stowarzyszony szpital, Szkoła Medyczna, Uniwersytet</td><td></td> Zhejiang <td>Powidon Jod</td></tr></tbody></table>

badanie zmian w mikrobiocie kątnicy po urazowym uszkodzeniu mózgu u myszy

Investigating Alterations in Caecum Microbiota After Traumatic Brain Injury in Mice

Coraz więcej dowodów pokazuje, że oś mikrobiota-jelito-mózg odgrywa ważną rolę w patogenezie chorób mózgu. Kilka badań wykazało również, że urazowe uszkodzenia mózgu powodują zmiany w mikrobiocie jelitowej. Jednak mechanizmy leżące u podstaw dwukierunkowej regulacji osi mózg-jelito pozostają nieznane. Obecnie istnieje niewiele modeli do badania zmian w mikrobiocie jelitowej po urazowym uszkodzeniu mózgu. W związku z tym prezentowane badanie łączy protokoły indukowania urazowego uszkodzenia mózgu za pomocą urządzenia do bocznego udrażniania płynu oraz analizę próbek kątnicy po urazie w celu zbadania zmian w mikrobiomie jelitowym. Zmiany w składzie mikrobioty jelitowej po urazowym uszkodzeniu mózgu określa się za pomocą sekwencjonowania 16S-rDNA. Protokół ten zapewnia skuteczną metodę badania związków między mikroorganizmami jelitowymi a urazowym uszkodzeniem mózgu.

Ustanowienie TBI przedstawiono na Rysunku 1. Po znieczuleniu i dezynfekcji wykonano cięcie strzałkowe skóry głowy (Rysunek 1A). Za pomocą wiertarki elektrycznej w czaszce, nad prawą korą ciemieniową, wykonano trepanację (kraniotomię o średnicy 3 mm), pozostawiając oponę twardą nienaruszoną (Rysunek 1B,C). Plastikową kaniulę do zadawania urazu umieszczono nad otworem kostnym i przymoc...

Przedstawiono tutaj protokół indukcji rozlanego urazowego uszkodzenia mózgu za pomocą urządzenia do bocznego wkłuwania płynu, a następnie pobierania zawartości kątnicy do analizy mikrobiomu jelitowego.

Badanie zmian w mikrobiocie kątnicy po urazowym uszkodzeniu mózgu u myszy

Increasing evidence shows that the microbiota-gut-brain axis plays an important role in the pathogenesis of brain diseases. Several studies also ...

Równoczesność i linie interakcji między mózgiem a mikrobiotą jelitową pozostają nieznane. Za pomocą tej techniki można zbadać zmiany w mikrobiocie jelitowej po urazowym uszkodzeniu mózgu u myszy. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest stosunkowo prosta i wydajna.Procedurę zademonstruje Wendong You, doktorant z mojego laboratorium. W przypadku indukcji urazowego uszkodzenia mózgu potwierdź brak reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonej myszy i nałóż maść na oczy zwierzęcia. Po goleniu zdezynfekuj odsłoniętą skórę głowy 70% etanolem, a następnie nacinaj skórę głowy w płaszczyźnie strzałkowej.Za pomocą kleszczy cofnij nacięcie po obu stronach i lekko oddziel okostną. Użyj markera, aby narysować okrąg o średnicy trzech milimetrów w prawej okolicy ciemieniowej czaszki, dwa milimetry od linii środkowej. Użyj wiertarki elektrycznej, aby ostrożnie przebić czaszkę, nie uszkadzając opony twardej.Usuń płat kostny, aby odsłonić trzymilimetrowe okienko kostne i umieść plastikową kaniulę na kraniotomii. Po przyklejeniu kaniuli do czaszki akrylowym akrylem dentystycznym, użyj pięciomililitrowej strzykawki, aby napełnić kaniulę sterylną 0,9% solą fizjologiczną normalną, uważając, aby nie powstały pęcherzyki. Włącz oscyloskop i amplifier.Upewnij się, że rurka wysokociśnieniowa bocznego urządzenia do udarowego uszkadzania płynu jest wolna od pęcherzyków powietrza i dostarczaj około 10 impulsów testowych, aż urządzenie wyda stały sygnał. Dostosuj kąt pozycji początkowej wahadła, aby osiągnąć intensywność impulsu około dwóch standardowych atmosfer i podłącz kaniulę do bocznego urządzenia do urazu płynu. Pociągnij za spust, aby zwolnić wahadło, wywołując uszkodzenie mózgu.Następnie uzyskaj i prześlij impuls do opony twardej przez cały zamknięty, wypełniony płynem system rurek. Po indukcji urazu mózgu usuń kaniulę i zszyj nacięcie. Następnie umieść mysz na poduszce grzewczej z monitorowaniem, aż zacznie chodzić, zanim zwierzę wróci do klatki domowej z dostępem ad libitum do jedzenia i wody.We wskazanych punktach czasowych eksperymentu należy odsłonić jelita zgodnie ze standardowymi protokołami i użyć atraumatycznych kleszczy, aby delikatnie oddzielić kątnicę od pozostałych dróg pokarmowych. Po zlokalizowaniu tkanki odetnij kątnicę ostrymi nożyczkami i ręcznie wyekstrahuj zawartość kątnicy na sterylny opatrunek. Następnie przenieś zawartość do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej, do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu analizy mikrobiomu.Sekwencjonowanie rekombinowanego DNA 16S wykazuje zmniejszoną różnorodność mikrobioty kątnicy u myszy trzy dni po urazowym uszkodzeniu mózgu, przy czym najliczniejsze taksony znajdują się w treści kątnicy w grupach pozorowanych i urazowych uszkodzeń mózgu pokazanych na rysunku. Co więcej, niemetryczne, wielowymiarowe skalowanie ujawnia zmiany w składzie mikrobioty kątnicy po urazowym uszkodzeniu mózgu. Pamiętaj, aby zachować oponę twardą w stanie nienaruszonym podczas wiercenia czaszki i zachować ostrożność podczas lokalizowania i oddzielania kątnicy od innych przewodów pokarmowych.Po tej procedurze można przeprowadzić barwienie i analizę hematoksyliny i eozyny w celu zbadania zmiany histologicznej i odpowiedzi zapalnej w przewodzie pokarmowym po urazowym uszkodzeniu mózgu.

investigating-alterations-caecum-microbiota-after-traumatic-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Omówiono wieloaspektowe podejście do badania zmian funkcjonalnych w obwodach hipokampa. Opisano techniki elektrofizjologiczne wraz z protokołem wywoływania urazu, testami behawioralnymi oraz metodą sekcji regionalnej. Kombinację tych technik można zastosować w podobny sposób w odniesieniu do innych obszarów mózgu i innych problemów naukowych.

Badania nad zmianami w funkcjonowaniu obwodów hipokampa po łagodnym urazowym uszkodzeniu mózgu

Film demonstruje metodę generowania mysiego modelu urazowego uszkodzenia mózgu (TBI) za pomocą urządzenia do bocznego płynu perkusyjnego (LFPI). Po znieczuleniu myszy mózg jest odsłaniany, tworząc okno na czaszce. Kaniula wypełniona solą fizjologiczną jest przymocowana do okienka, a następnie jest podłączana do LFPI. Wahadło urządzenia jest zwalniane w celu wytworzenia impulsu ciśnienia, który powoduje urazowe uszkodzenie mózgu.

Generowanie mysiego modelu urazowego uszkodzenia mózgu za pomocą urządzenia do bocznego płynu udarowego

Źródło: Macheda, T., et. al. Elektromagnetycznie sterowany model zamkniętej głowy łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu u myszy. J. Vis. Exp. (2022)Ten film demonstruje procedurę wywoływania urazu głowy w modelu myszy przy użyciu klatki stereotaktycznej. Kontrolowane uderzenie replikuje łagodne urazowe uszkodzenie mózgu, umożliwiając naukowcom badanie skutków neurologicznych i powrotu do zdrowia poprzez pomiar odruchów i zachowań po urazie.

Indukcja łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu w modelu mysim

Źródło: Braeckman, K., et. al. Zaawansowane obrazowanie dyfuzyjne w hipokampie szczurów z łagodnym urazowym uszkodzeniem mózgu. J. Vis. exp. (2019)Ten film demonstruje zastosowanie obrazowania dyfuzyjnego do oceny zmiany mikrostrukturalne w hipokampie szczura po łagodnym urazowym uszkodzeniu mózgu (mTBI), podkreślające uszkodzenie aksonów poprzez precyzyjne skanowanie MRI i analizę dyfuzji.

Obrazowanie dyfuzyjne hipokampa szczura z łagodnym urazowym uszkodzeniem mózgu

Ostra uraz mózgu to poważny uraz, który do tej pory nie doczekał się odpowiedniego leczenia. Mikroskopia wielofotonowa pozwala na badanie podłużne procesu rozwoju ostrego urazu mózgu i sondowanie strategii terapeutycznych u gryzoni. W protokole przedstawiono dwa modele ostrego urazu mózgu badane za pomocą dwufotonowego obrazowania mózgu in vivo.

Ostry uraz mózgu u myszy, po którym następuje podłużne obrazowanie dwufotonowe

Urazowe uszkodzenia mózgu (TBI) pozostają poważnym problemem zdrowotnym. Wykorzystując model chirurgii kontrolowanego wpływu kory mózgowej, można przeprowadzić badania nad skutkami TBI i możliwymi metodami leczenia.

Kontrolowany model uderzenia kory mózgowej w przypadku urazowego uszkodzenia mózgu

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie ilościowych informacji mikrostrukturalnych o hipokampie u szczura z łagodnym urazowym uszkodzeniem mózgu. Odbywa się to za pomocą zaawansowanego protokołu obrazowania rezonansu magnetycznego ważonego dyfuzją oraz analizy parametrycznych map dyfuzji opartej na obszarze zainteresowania.

Zaawansowane obrazowanie dyfuzyjne w hipokampie szczurów z łagodnym urazowym uszkodzeniem mózgu

W tym miejscu przedstawiamy protokół mający na celu ustanowienie indukowanego antybiotykiem, pseudo-wolnego od zarazków modelu zapalenia jelita grubego wywołanego siarczanem dekstranu sodu w celu zbadania roli mikrobioty jelitowej w regulacji pozytywnego wpływu Bacillus cereus na zapalenie jelita grubego.

Badanie łagodzącego wpływu podawania Bacillus cereus na zapalenie jelita grubego poprzez modulację mikrobioty jelitowej

Metabolity mikrobiologiczne pochodzące z jelit mają wieloaspektowe działanie, prowadząc do skomplikowanych zachowań u zwierząt. Naszym celem jest opracowanie metody krok po kroku, która pozwoli określić wpływ metabolitów mikrobiologicznych pochodzenia jelitowego na mózg poprzez dostarczanie domózgowo-komorowe za pomocą kaniuli prowadzącej.

Domózgowo-komorowe dostarczanie metabolitów mikrobiologicznych pochodzenia jelitowego u swobodnie poruszających się myszy

Protokół opisuje łagodne urazowe uszkodzenie mózgu w modelu mysim. W szczególności w pełni wyjaśniony jest protokół krok po kroku mający na celu wywołanie łagodnego urazu głowy w linii środkowej oraz charakterystyka modelu zwierzęcego.

Elektromagnetycznie sterowany model zamkniętej głowy łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu u myszy

Ten protokół przedstawia zmodyfikowany mysi model powtarzalnego łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu (rmTBI) wywołanego metodą zamkniętego urazu głowy (CHI). Podejście to obejmuje cieńsze okienko czaszki i płynną stymulację w celu zmniejszenia stanu zapalnego często spowodowanego ekspozycją opon mózgowych, a także lepszą odtwarzalność i dokładność w modelowaniu rmTBI u gryzoni.

Zmodyfikowany mysi model powtarzającego się łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu z przerzedzonym okienkiem czaszki i płynną stymulacją

Poznaj metodę indukcji urazowego uszkodzenia mózgu u myszy i analizę zmian mikrobioty kątnicy. Technika ta pozwala badać oś jelitowo-mózgową oraz jej wpływ na zdrowie po urazie.

Badanie zmian w mikrobiocie kątnicy po urazowym uszkodzeniu mózgu u myszy

Przeglądaj więcej filmów