Badanie zmian w mikrobiocie kątnicy po urazowym uszkodzeniu mózgu u myszy
19 września 2019
Przedstawiono tutaj protokół indukcji rozlanego urazowego uszkodzenia mózgu za pomocą urządzenia do bocznego wkłuwania płynu, a następnie pobierania zawartości kątnicy do analizy mikrobiomu jelitowego.
Równoczesność i linie interakcji między mózgiem a mikrobiotą jelitową pozostają nieznane. Za pomocą tej techniki można zbadać zmiany w mikrobiocie jelitowej po urazowym uszkodzeniu mózgu u myszy. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest stosunkowo prosta i wydajna.
Procedurę zademonstruje Wendong You, doktorant z mojego laboratorium. W przypadku indukcji urazowego uszkodzenia mózgu potwierdź brak reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonej myszy i nałóż maść na oczy zwierzęcia. Po goleniu zdezynfekuj odsłoniętą skórę głowy 70% etanolem, a następnie nacinaj skórę głowy w płaszczyźnie strzałkowej.
Za pomocą kleszczy cofnij nacięcie po obu stronach i lekko oddziel okostną. Użyj markera, aby narysować okrąg o średnicy trzech milimetrów w prawej okolicy ciemieniowej czaszki, dwa milimetry od linii środkowej. Użyj wiertarki elektrycznej, aby ostrożnie przebić czaszkę, nie uszkadzając opony twardej.
Usuń płat kostny, aby odsłonić trzymilimetrowe okienko kostne i umieść plastikową kaniulę na kraniotomii. Po przyklejeniu kaniuli do czaszki akrylowym akrylem dentystycznym, użyj pięciomililitrowej strzykawki, aby napełnić kaniulę sterylną 0,9% solą fizjologiczną normalną, uważając, aby nie powstały pęcherzyki. Włącz oscyloskop i amplifier.
Upewnij się, że rurka wysokociśnieniowa bocznego urządzenia do udarowego uszkadzania płynu jest wolna od pęcherzyków powietrza i dostarczaj około 10 impulsów testowych, aż urządzenie wyda stały sygnał. Dostosuj kąt pozycji początkowej wahadła, aby osiągnąć intensywność impulsu około dwóch standardowych atmosfer i podłącz kaniulę do bocznego urządzenia do urazu płynu. Pociągnij za spust, aby zwolnić wahadło, wywołując uszkodzenie mózgu.
Następnie uzyskaj i prześlij impuls do opony twardej przez cały zamknięty, wypełniony płynem system rurek. Po indukcji urazu mózgu usuń kaniulę i zszyj nacięcie. Następnie umieść mysz na poduszce grzewczej z monitorowaniem, aż zacznie chodzić, zanim zwierzę wróci do klatki domowej z dostępem ad libitum do jedzenia i wody.
We wskazanych punktach czasowych eksperymentu należy odsłonić jelita zgodnie ze standardowymi protokołami i użyć atraumatycznych kleszczy, aby delikatnie oddzielić kątnicę od pozostałych dróg pokarmowych. Po zlokalizowaniu tkanki odetnij kątnicę ostrymi nożyczkami i ręcznie wyekstrahuj zawartość kątnicy na sterylny opatrunek. Następnie przenieś zawartość do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej, do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu analizy mikrobiomu.
Sekwencjonowanie rekombinowanego DNA 16S wykazuje zmniejszoną różnorodność mikrobioty kątnicy u myszy trzy dni po urazowym uszkodzeniu mózgu, przy czym najliczniejsze taksony znajdują się w treści kątnicy w grupach pozorowanych i urazowych uszkodzeń mózgu pokazanych na rysunku. Co więcej, niemetryczne, wielowymiarowe skalowanie ujawnia zmiany w składzie mikrobioty kątnicy po urazowym uszkodzeniu mózgu. Pamiętaj, aby zachować oponę twardą w stanie nienaruszonym podczas wiercenia czaszki i zachować ostrożność podczas lokalizowania i oddzielania kątnicy od innych przewodów pokarmowych.
Po tej procedurze można przeprowadzić barwienie i analizę hematoksyliny i eozyny w celu zbadania zmiany histologicznej i odpowiedzi zapalnej w przewodzie pokarmowym po urazowym uszkodzeniu mózgu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół indukowania rozlanego urazowego uszkodzenia mózgu (TBI) u myszy przy użyciu bocznego urządzenia do perkusji płynowej. Po wystąpieniu urazu w badaniu analizowane są zmiany w mikrobiocie jelitowej poprzez pobieranie zawartości kątnicy do analizy. Podejście to ma na celu wyjaśnienie interakcji między urazem mózgu a składem mikrobioty jelitowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Analiza mikrobiomu
- Badania nad urazami czaszkowo-mózgowymi
Wstęp
- Zrozumienie zależności między mózgiem a mikrobiotą jelitową jest kluczowe w badaniach nad TBI.
- Obecna wiedza na temat tego, jak TBI wpływa na mikrobiotę jelitową, jest ograniczona.
- Wykorzystanie myszy jako organizmu modelowego pozwala na zastosowanie kontrolowanych warunków eksperymentalnych.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnego protokołu indukowania TBI oraz analizy następujących zmian w mikrobiomie jelitowym.
- Zbadanie potencjalnych korelacji między urazem neurologicznym a różnorodnością mikrobioty jelitowej.
- Przedstawienie informacji na temat wpływu TBI na ogólny stan zdrowia oraz interakcje mikrobiomu.
Zastosowane metody
- Do wywołania TBI u znieczulonych myszy wykorzystano urządzenie do bocznego uderzenia płynnego (lateral fluid percussion device).
- Przeprowadzono staranne procedury chirurgiczne, obejmujące penetrację czaszki oraz implantację kaniuli.
- Po urazie zebrano zawartość kątnicy do analizy mikrobiomu i przechowywano ją w odpowiedni sposób.
- W celu określenia zmian w różnorodności i składzie mikrobioty zastosowano sekwencjonowanie 16S rDNA.
Główne wyniki
- Analiza wykazała zmniejszoną różnorodność mikrobioty kątnicy w ciągu trzech dni po TBI.
- Niemetryczne skalowanie wielowymiarowe wykazało istotne przesunięcia w składzie mikrobioty po urazie.
- Badanie podkreśla konieczność zachowania ostrożności podczas manipulacji tkankami oraz utrzymywania warunków sterylnych.
Wnioski
- Niniejsze badanie ustanawia metodologię badania osi jelitowo-mózgowej w kontekście TBI.
- Wyniki sugerują, że TBI może zaburzać mikrobiotę jelitową, co może mieć wpływ na proces rekonwalescencji.
- Poszerzenie wiedzy na temat oddziaływań między jelitami a mózgiem może pomóc w opracowaniu przyszłych strategii terapeutycznych dla TBI.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia mechaniczną redukcję ryzyka w badaniach nad osią mikrobiota-jelita-mózg w kontekście urazowego uszkodzenia mózgu, zapewniając powtarzalny model oceny zmian w mikrobiomie po urazie. Wspiera on walidację celów oraz odkrywanie biomarkerów poprzez powiązanie urazu neurologicznego z mierzalnymi przesunięciami w składzie mikrobioty kąkika. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w badaniach przedklinicznych dzięki standaryzacji procesów indukcji TBI oraz pobierania próbek mikrobiomu.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących osi jelito-mózg poprzez pomiar zmian w różnorodności mikrobioty po kontrolowanej indukcji TBI.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowaną procedurę chirurgiczną i pobierania próbek w celu spójnego gromadzenia mikrobioty kątnicy w różnych grupach eksperymentalnych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe wyniki sekwencjonowania 16S rDNA w celu profilowania zmian w składzie mikrobiomu w próbkach kąkolicznika.
- Wartość operacyjna: Ustanawia odtwarzalny schemat analizy mikrobiomu, który może zostać zintegrowany z potokami przesiewowymi dla terapii celowanych w jelita.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera modelowanie systemów istotnych dla chorób poprzez korelację ciężkości TBI ze zmianami w mikrobiomie w modelu mysim.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużne śledzenie zmian w mikrobiocie w celu podejmowania decyzji o dalszym rozwoju programów przedklinicznych z uwzględnieniem oceny ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta łączy biologię odkrywczą z walidacją przedkliniczną poprzez standaryzację indukcji TBI oraz analizy mikrobiomu jelitowego w celu zmniejszenia ryzyka związanego z doborem celu terapeutycznego.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących interakcji między mikrobiotą, jelitami a mózgiem poprzez kontrolowane uszkodzenia i profilowanie mikrobiomu.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowane próbki mikrobioty kąkremowej, odpowiednie do późniejszego sekwencjonowania 16S i analizy różnorodności.
- Analityka: Umożliwia ilościowe porównanie składu mikrobiologicznego za pomocą niemetrycznego wielowymiarowego skalowania oraz wskaźników różnorodności.
- Badania translacyjne: Łączy modele uszkodzeń neurologicznych z biomarkerami mikrobiomu w celu zapewnienia ciągłości przedklinicznej.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwach: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do badania modulacji osi jelita-mózg w modelach chorób neurologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad osią jelitowo-mózgową, dostarczając mierzalnych odczytów mikrobioty po TBI.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzacji protokołów chirurgicznych, pobierania próbek oraz sekwencjonowania.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez powiązanie modeli TBI z sygnaturami biomarkerów opartymi na mikrobiomie.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację związków ukierunkowanych na interakcje jelitowo-mózgowe w procesie rekonwalescencji po TBI, z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w przeprowadzaniu zabiegów chirurgicznych u myszy oraz sterylnego obchodzenia się z tkankami.
- Zależne od dostępu do urządzeń do indukowania bocznego urazu uderzeniowego (lateral fluid percussion injury) oraz infrastruktury do sekwencjonowania 16S rDNA.
- Wymaga standaryzacji między zespołami zajmującymi się neuronauką a grupami analizującymi mikrobiom.
- Obejmuje kwestie adaptacyjne dotyczące pobierania próbek z kąkiewki w zależności od szczepów myszy lub modeli urazów.
- Ograniczone przez konieczność stosowania technik aseptycznych podczas sekcji tkanek jelitowych w celu zapobiegania kontaminacji.
