Name: Wykonywanie spektroskopii nanocząstek plazmonicznych za pomocą transmisyjnej mikroskopii kontrastowej interferencyjnej typu Nomarskiego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Poznaj spektroskopię pojedynczych nanocząstek plazmonicznych przy użyciu mikroskopii DIC. Ta metoda zapewnia wysoką rozdzielczość przestrzenną do obserwacji nanocząstek w złożonych środowiskach biologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr Anthony S. Stender pragnie podziękować za wsparcie techniczne ze strony Instytutu Nanoskali i Zjawisk Kwantowych (NQPI) na Uniwersytecie Ohio. Ten artykuł był możliwy dzięki funduszom na rozpoczęcie działalności udzielonym dr Stenderowi przez Uniwersytet Ohio.

1. Przygotowanie próbek przy użyciu standardowych szkiełek przedmiotowych
<ol>
	<li>Przygotowanie szkiełek przedmiotowych do nanoszenia próbek. 
	UWAGA: W niektórych przypadkach bardziej odpowiednie może być przechowywanie szkła w wodzie ultrapurej zamiast w etanolu. Jednak przechowywanie w wodzie lub powietrzu sprawia, że szkło z czasem staje się hydrofobowe.
	<ol>
		<li>Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy zakupić szklane lub kwarcowe szkiełka przedmiotowe oraz szkiełka nakrywkowe.</li>
		<li>Za pomocą rylca należy wykonać płytką i krótką rysę w centrum każdego szkiełka nakrywkowego.</li>
		<li>Należy oczyścić całe szkło mikroskopowe, nawet jeśli zostało zakupione jako „wstępnie oczyszczone”, aby usunąć odłamki szkła, kurz, pył, pozostałości organiczne i wszelkie inne zanieczyszczenia wpływające na jakość obrazowania lub nanoszenie próbek. 
		UWAGA: Poniższa metoda czyszczenia sprawdza się w przypadku rodzajów próbek opisanych w niniejszym protokole i pozwala uniknąć stosowania agresywnych chemikaliów. Silniejsze odczynniki chemiczne mogą trawić szkło i wymagają większej ostrożności podczas obchodzenia się z nimi i ich utylizacji.
		<ol>
			<li>Umieścić szkło mikroskopowe w statywach, a następnie w zlewce lub naczyniu do barwienia. Nie należy kłaść szkła mikroskopowego na dnie zlewek i innych naczyń laboratoryjnych bez użycia statywów, ponieważ każdy element i powierzchnia szkła powinny być w pełni wystawione na działanie środków czyszczących.</li>
			<li>Wlać ~1 mL detergentu w płynie (Tabela materiałów) do naczynia i uzupełnić naczynie wodą. Sonicować przez 30 min. 
			UWAGA: Po rozpoczęciu procesu czyszczenia szkło należy dotykać wyłącznie w rękawiczkach, aby uniknąć pozostawienia śladów odcisków palców na szkle.</li>
			<li>Wylać zawartość płynną naczynia do czyszczenia do zlewu. Przepłukać naczynie kilka razy wodą ultrapurej, aby usunąć wszelkie ślady detergentu. Napełnić naczynie wodą ultrapurej. Sonicować naczynie ze szkłem mikroskopowym przez kolejne 30 min.</li>
			<li>Powtórzyć poprzedni krok co najmniej raz. Wykonywać kolejne cykle sonikacji w wodzie do momentu, gdy stanie się oczywiste, że wszystkie ślady detergentu zostały usunięte.</li>
			<li>Wylać zawartość naczynia do czyszczenia. Przepłukać naczynie wodą ultrapurej. Napełnić naczynie etanolem. Sonicować szkło mikroskopowe przez 30 min.</li>
			<li>Wylać zawartość naczynia do czyszczenia do pojemnika na odpady. Napełnić ponownie etanolem. Przykryć naczynie, aby zapobiec utracie etanolu w wyniku odparowania. Przechowywać szkło mikroskopowe w tym naczyniu do czasu przeprowadzenia eksperymentu. Szkiełka pozostają czyste i zdatne do użycia tak długo, jak pozostają zanurzone w etanolu w zamkniętym naczyniu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu nanocząsteczek
	<ol>
		<li>Za pomocą mikropipety pobrać 100 µL aliquoty roztworu nanocząsteczek złota o stężeniu 0,05 mg/mL z oryginalnego pojemnika do przechowywania i przenieść roztwór do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mL.</li>
		<li>Wirować próbkę przez 10 min przy 6 000 x g.</li>
		<li>Usunąć nadsącz za pomocą mikropipety, aby usunąć nadmiar surfaktantu.</li>
		<li>Za pomocą mikropipety dodać 100 µL wody ultrapurej do probówki wirówkowej. 
		UWAGA: Jeśli nie uda się usunąć całego nadsączu przy pierwszej próbie, należy powtórzyć etapy wirowania i resuspensji.</li>
		<li>Krótko wymieszać próbkę w wstrząsarku typu vortex, aby zresuspender osad. Bezpośrednio po tym sonicować przez 20 min, aby w pełni zresuspender i rozbić agregaty nanocząsteczek. 
		UWAGA: Jeśli próbka nie zostanie użyta natychmiast, należy ją ponownie sonicować przez 20 min przed naniesieniem roztworu na szkło mikroskopowe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nanoszenie próbki
	<ol>
		<li>Wyjąć oczyszczone szkiełka nakrywkowe i przedmiotowe z pojemników do przechowywania. Osuszyć szkło strumieniem sprężonego azotu lub argonu.</li>
		<li>Za pomocą mikropipety nanieść metodą drop-casting 6 µL roztworu nanocząsteczek z kroku 1.2.5 na szkiełko nakrywkowe. Aby równomiernie rozprowadzić kroplę, ostrożnie położyć na wierzchu szkiełka nakrywkowego drugi, większy element szkła mikroskopowego, np. drugie szkiełko nakrywkowe lub szkiełko przedmiotowe. Unikać uwięzienia pęcherzyków powietrza między dwiema warstwami szkła.
		<ol>
			<li>Odwrócić podłoże z próbką i uszczelnić krawędzie szkiełka nakrywkowego wąską linią lakieru do paznokci, aby zapobiec odparowaniu roztworu medium.</li>
			<li>Alternatywnie, aby obrazować próbkę „na sucho”, pozostawić roztwór na szkiełku nakrywkowym na 5–15 min, a następnie usunąć zbędny element szkła. Delikatnie osuszyć szkiełko nakrywkowe strumieniem sprężonego azotu lub argonu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Jeśli to możliwe, obrazować próbki natychmiast po przygotowaniu. Jeśli nie jest to możliwe, przechowywać próbki w zamkniętym naczyniu, np. w szalce Petriego, do czasu obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Obrazowanie DIC
<ol>
	<li>Ustawienie obiektywu i kondensora.
	<ol>
		<li>Po umieszczeniu próbki na mikroskopie należy znaleźć płaszczyznę ogniskowania przechodzącą przez próbkę. Najpierw zlokalizuj i ustaw ostrość na wcześniej wykonanym nacięciu. Następnie precyzyjnie dostrój ostrość, aż w polu widzenia pojawią się nanocząstki.</li>
		<li>Aby precyzyjnie ustawić kondensor, zastosuj metodę oświetlenia Köhlera.5 Oświetlenie Köhlera przy dużym powiększeniu (80x, 100x) łatwiej uzyskać, ustawiając je najpierw przy mniejszym powiększeniu, np. 20x. 
		UWAGA: Zazwyczaj oświetlenie Köhlera nie wymaga ponownej regulacji podczas obrazowania pojedynczej próbki. Dobrą praktyką jest jednak weryfikacja poprawności ustawienia oświetlenia Köhlera przy zmianie preparatu na nowy slajd mikroskopowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Optymalizacja ustawień kontrastu.
	<ol>
		<li>Wybierz w próbce obszar zainteresowania do obrazowania. Wycentruj ten obszar w polu widzenia kamery i w razie potrzeby skoryguj ostrość.
		<ol>
			<li>Jeśli mikroskop posiada konstrukcję de Senarmonta, zacznij od ustawienia polaryzatora blisko maksymalnego wygaszenia tła, a następnie stopniowo obracaj polaryzator w kierunku zmniejszania wygaszenia tła. Intensywność tła będzie stopniowo wzrastać.</li>
			<li>Jeśli mikroskop nie posiada konstrukcji de Senarmonta, zacznij od ustawienia toru optycznego przy maksymalnym wygaszeniu tła. W tym przypadku stopniowo reguluj pozycję pryzmatu obiektywu w kierunku zmniejszania wygaszenia tła. 
			UWAGA: Optymalne ustawienie uzyskuje się, gdy nanocząstki osiągają największą różnicę intensywności (tj. kontrast) w stosunku do uśrednionej lokalnej wartości tła. W przypadku nanocząstek plazmonicznych optymalny kontrast jest zazwyczaj osiągany przy stosunkowo ciemnym tle, czyli przy ustawieniach bliskich maksymalnemu wygaszeniu tła.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie próbki.
	<ol>
		<li>Wyłącz oświetlenie pomieszczenia, aby zapobiec oddziaływaniu światła rozproszonego na proces.</li>
		<li>Podczas obserwacji nanocząstek za pomocą naukowej kamery obrazującej określ poziom tła. Używając filtra przepustowego o szerokości połówkowej (FWHM) 10 nm, którego długość fali centralnej pokrywa się z główną długością fali LSPR, obejrzyj obszar zainteresowania. Reguluj intensywność lampy lub czas ekspozycji, aż poziom tła znajdzie się w zakresie 15%–40% maksymalnej pojemności kamery, a żadne obiekty w obszarze zainteresowania nie będą wykazywać intensywności sygnału przekraczającej 90% maksymalnej intensywności kamery. 
		UWAGA: Celem kroku 2.3.2 jest zapobieganie nasyceniu sensora podczas przełączania filtrów. Idealny poziom tła będzie różnić się w zależności od próbek i kamer. Po zakończeniu tego kroku można regulować czas ekspozycji, ale nie intensywność lampy.</li>
		<li>Wykonaj obrazowanie próbki za pomocą serii filtrów przepustowych, z których każdy ma FWHM 10 nm i które łącznie umożliwiają obrazowanie w całym interesującym zakresie długości fal. Upewnij się, że intensywność tła pozostaje spójna między poszczególnymi obrazami (z dokładnością do ~5%), regulując czas ekspozycji. Po zmianie filtra ponownie ustaw ostrość próbki przed przechwyceniem obrazu.</li>
		<li>Zapisz obrazy jako nieskompresowane pliki TIFF i/lub w natywnym formacie plików oprogramowania, aby zachować wszystkie informacje.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obracanie próbki.
	<ol>
		<li>Po zebraniu obrazów próbki w jej pierwotnej pozycji można ją teraz obrócić i obrazować w dodatkowych orientacjach w torze świetlnym. Wykonuj obroty w regularnych odstępach (np. 10° lub 15°) w zakresie 180° lub 360°. 
		UWAGA: Obracanie wymaga obrotowego stolika mikroskopowego.</li>
		<li>Podobnie jak w sekcjach 2.1-2.3, dostosuj ustawienia kamery, aby zapewnić spójny poziom tła między obrazami. 
		UWAGA: Nie należy wprowadzać żadnych korekt w oświetleniu Köhlera.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza danych przy użyciu programu ImageJ
UWAGA: Poniższe obliczenia można przeprowadzić w różnych pakietach oprogramowania, a czasami w programie natywnym używanym do pozyskiwania obrazów. ImageJ jest bezpłatnie dostępnym oprogramowaniem z National Institutes of Health (NIH).
<ol>
	<li>Oblicz kontrast lub intensywność cząstek.
	<ol>
		<li>Otwórz obraz w programie ImageJ.</li>
		<li>Wybierz narzędzie Rectangle (prostokąt) i obrysuj prostokątem główny obszar zainteresowania.</li>
		<li>Na pasku narzędzi wybierz Image, następnie Zoom, a potem To Selection. Okno obrazu zostanie przybliżone do wybranego obszaru.</li>
		<li>Na pasku narzędzi wybierz Image, następnie Adjust, a potem Brightness/Contrast. Pojawi się nowe okno. Aby umożliwić lepszy podgląd obszaru próbki, dostosuj cztery ustawienia: Minimum, Maximum, Brightness oraz Contrast. Regulacje te nie zmieniają danych naukowych, a jedynie poprawiają widoczność obszaru próbki. 
		UWAGA: Kroki 3.1.3 i 3.1.4 można wykonywać wielokrotnie i w odwrotnej kolejności.</li>
		<li>Korzystając ponownie z narzędzia prostokąta, obrysuj ramką pierwszą nanocząstkę do pomiaru. Ramka powinna być tylko nieco większa niż krążek Airy’ego nanocząstki.</li>
		<li>Na pasku narzędzi wybierz Analyze, następnie Measure. Pojawi się nowe okno podające wartości Minimum, Maximum oraz Mean Intensity (intensywność średnią) dla pikseli znajdujących się wewnątrz wybranej ramki.</li>
		<li>Przesuń ramkę używaną do pomiaru nanocząstki na obszar bezpośrednio sąsiadujący z cząstką, gdzie kontrast tła jest stosunkowo jednorodny i nie występują żadne cząstki ani zanieczyszczenia. Zachowaj oryginalny rozmiar ramki.</li>
		<li>Użyj narzędzia Measure, aby wyznaczyć Mean Intensity dla obszaru tła.</li>
		<li>Zmierz pozostałe cząstki oraz sąsiadujący z każdą z nich obszar tła.</li>
		<li>Powtórz ten proces dla każdej cząstki na wszystkich obrazach w serii.</li>
		<li>Wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć kontrast lub intensywność każdej cząstki dla wszystkich długości fal i kątów.</li>
		<li>Oblicz kontrast każdej cząstki, korzystając z następującego równania13,14,15: 
		<img alt="Wzór na kontrast cząstki: (Maksimum cząstki - Minimum cząstki) / Średnia tła, równanie." src="/files/ftp_upload/59411/59411eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie"> 
		UWAGA: Zgodnie z tym równaniem, kontrast cząstki powinien być zawsze &gt; 0.</li>
		<li>Oblicz maksymalną wartość cząstki skorygowaną o tło, dzieląc zmierzoną maksymalną intensywność cząstki przez średnią tła: 
		<img alt="Równanie korekcji pomiaru cząstki; wzór przedstawiający maksimum skorygowane i średnią tła." src="/files/ftp_upload/59411/59411eq2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie"></li>
		<li>Analogicznie oblicz minimalną wartość skorygowaną o tło, dzieląc zmierzoną minimalną intensywność cząstki przez średnią tła: 
		<img alt="Wzór równowagi statycznej, Minimum cząstki skorygowane przy użyciu wartości zmierzonych i średniej tła, równanie." src="/files/ftp_upload/59411/59411eq3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie"> 
		UWAGA: Z obliczeń wynika, że wartość maksymalna powinna być większa od jeden, natomiast minimalna mniejsza od jeden. Dopuszczalne jest odjęcie od każdej wartości „1”, tak aby średnie tło wynosiło w zasadzie zero, wartość maksymalna była reprezentowana jako wartość dodatnia, a minimalna jako ujemna16. To drugie podejście pozwala analitykowi na oddzielne rozważenie zjawisk zachodzących wzdłuż każdego z pól polaryzacji, co jest przydatne podczas badania cząstek anizotropowych.</li>
		<li>Aby wykreślić profil spektralny w określonej pozycji nanocząstki, nanieś dane z długością fali na osi x oraz kontrastem lub intensywnością na osi y.</li>
		<li>Aby wykreślić profil rotacyjny przy danej długości fali, nanieś kąt obrotu na osi x oraz kontrast lub intensywność na osi y.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Pluta, M. Ch 7: Differential Interference Contrast in. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPluta%2C+M+%22Advanced+Light+Microscopy%22">Advanced Light Microscopy</a>. 2, Elsevier. 146-197 (1989).</li>
<li>Stender, A. S., Wang, G., Sun, W., Fang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Gold+Nanorod+Geometry+on+Optical+Response%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Influence of Gold Nanorod Geometry on Optical Response.</a> ACS Nano. 4 (12), 7667-7675 (2010).</li>
<li>Stender, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Cell+Optical+Imaging+and+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Single Cell Optical Imaging and Spectroscopy.</a> Chemical Reviews. 113 (4), 2469-2527 (2013).</li>
<li>Mehta, S. B., Sheppard, C. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partially+coherent+image+formation+in+differential+interference+contrast+%28DIC%29+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Partially coherent image formation in differential interference contrast (DIC) microscope.</a> Optics Express. 16 (24), 19462-19479 (2008).</li>
<li>Murphy, D. B., Davidson, M. W. Ch 1: Fundamentals of Light Microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurphy%2C+DB+%22Fundamentals+of+Light+Microscopy+and+Electronic+Imaging%2C+Second+edition%22">Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging, Second edition</a>. , Wiley. 1-20 (2012).</li>
<li>Stender, A. S., Augspurger, A. E., Wang, G., Fang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Polarization+Setting+on+Gold+Nanorod+Signal+at+Nonplasmonic+Wavelengths+Under+Differential+Interference+Contrast+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Influence of Polarization Setting on Gold Nanorod Signal at Nonplasmonic Wavelengths Under Differential Interference Contrast Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 84 (12), 5210-5215 (2012).</li>
<li>Wang, G., Sun, W., Luo, Y., Fang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+Rotational+Motions+of+Nano-objects+in+Engineered+Environments+and+Live+Cells+with+Gold+Nanorods+and+Differential+Interference+Contrast+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Resolving Rotational Motions of Nano-objects in Engineered Environments and Live Cells with Gold Nanorods and Differential Interference Contrast Microscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (46), 16417-16422 (2010).</li>
<li>Kelly, K. L., Coronado, E., Zhao, L. L., Schatz, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Optical+Properties+of+Metal+Nanoparticles%3A+The+Influence+of+Size%2C+Shape%2C+and+Dielectric+Environment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">The Optical Properties of Metal Nanoparticles: The Influence of Size, Shape, and Dielectric Environment.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 107 (3), 668-677 (2003).</li>
<li>Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+All+That%27s+Gold+Does+Glitter%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Not All That's Gold Does Glitter.</a> MRS Bulletin. 26 (12), 1009-1014 (2012).</li>
<li>Maier, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMaier%2C+SA+%22Plasmonics%3A+Fundamentals+and+Applications%22">Plasmonics: Fundamentals and Applications</a>. , Springer US. (2007).</li>
<li>Sun, W., Wang, G., Fang, N., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength-Dependent+Differential+Interference+Contrast+Microscopy%3A+Selectively+Imaging+Nanoparticle+Probes+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Wavelength-Dependent Differential Interference Contrast Microscopy: Selectively Imaging Nanoparticle Probes in Live Cells.</a> Analytical Chemistry. 81 (22), 9203-9208 (2009).</li>
<li>Cras, J. J., Rowe-Taitt, C. A., Nivens, D. A., Ligler, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+chemical+cleaning+methods+of+glass+in+preparation+for+silanization%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Comparison of chemical cleaning methods of glass in preparation for silanization.</a> Biosensors and Bioelectronics. 14 (8), 683-688 (1999).</li>
<li>Augspurger, A. E., Sun, X., Trewyn, B. G., Fang, N., Stender, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+Stimulated+Uncapping+Process+of+Gold-Capped+Mesoporous+Silica+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Monitoring the Stimulated Uncapping Process of Gold-Capped Mesoporous Silica Nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 90 (5), 3183-3188 (2018).</li>
<li>Murphy, D. B., Davidson, M. W. Ch 2: Light and Color. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurphy%2C+DB+%22Fundamentals+of+Light+Microscopy+and+Electronic+Imaging%2C+Second+Edition%22">Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging, Second Edition</a>. , Wiley. 21-33 (2012).</li>
<li>Wayne, R. Ch 3: The Dependence of Image Formation on the Nature of Light. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWayne%2C+R+%22Light+and+Video+Microscopy+%28Second+Edition%29%22">Light and Video Microscopy (Second Edition)</a>. , Academic Press. 43-78 (2014).</li>
<li>Stender, A. S., Wei, X., Augspurger, A. E., Fang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmonic+Behavior+of+Single+Gold+Dumbbells+and+Simple+Dumbbell+Geometries%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+C%22%5BJournal%5D)">Plasmonic Behavior of Single Gold Dumbbells and Simple Dumbbell Geometries.</a> The Journal of Physical Chemistry C. 117 (31), 16195-16202 (2013).</li>
<li>Hu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dark-field+microscopy+studies+of+single+metal+nanoparticles%3A+understanding+the+factors+that+influence+the+linewidth+of+the+localized+surface+plasmon+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dark-field microscopy studies of single metal nanoparticles: understanding the factors that influence the linewidth of the localized surface plasmon resonance.</a> Journal of Materials Chemistry. 18 (17), 1949-1960 (2008).</li>
<li>Choo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength-Dependent+Differential+Interference+Contrast+Inversion+of+Anisotropic+Gold+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+C%22%5BJournal%5D)">Wavelength-Dependent Differential Interference Contrast Inversion of Anisotropic Gold Nanoparticles.</a> The Journal of Physical Chemistry C. 122 (47), 27024-27031 (2018).</li>
<li>Funston, A. M., Novo, C., Davis, T. J., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmon+Coupling+of+Gold+Nanorods+at+Short+Distances+and+in+Different+Geometries%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Plasmon Coupling of Gold Nanorods at Short Distances and in Different Geometries.</a> Nano Letters. 9 (4), 1651-1658 (2009).</li>
</ol>

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Podczas obrazowania za pomocą mikroskopii DIC bardzo ważne jest zoptymalizowanie komponentów optycznych przed zebraniem danych. Nawet niewielkie korekty polaryzatora w trakcie eksperymentu mogą mieć znaczący wpływ na dane końcowe6. Co więcej, różne materiały wymagają różnych ustawień polaryzatora. Chociaż zastosowano tutaj duże rozmiary kroków, aby zademonstrować wpływ kąta polaryzacji, w rzeczywistym eksperymencie konieczne jest zoptymalizowanie ustawienia polaryzatora w zakresie 1°–2° od optymal...

Od lat 80. mikroskopia kontrastowo-interferencyjna (DIC) była postrzegana głównie jako istotna metoda obrazowania zarezerwowana dla obiektów w skali mikro w naukach biologicznych. Jednak podczas jej opracowywania w latach 50. i 60. XX wieku była ona przeznaczona jako technika dla inżynierii materiałowej1. Wraz z ostatnimi postępami w naukach o materiałach związanymi z nanocząsteczkami plazmonicznymi, wzrosło zainteresowanie charakterystyką materiałów za pomocą mikroskopii optycznej.
Do charakterystyki nanomateriałów dostępnych jest wiele technik optycznych (np. ciemne pole, jasne pole, światło spolaryzowane, fluorescencja itp.). Metoda ciemnego pola jest szeroko stosowana w badaniach nad nanocząsteczkami, jednak opiera się ona wyłącznie na zbieraniu światła rozproszonego i dostarcza ograniczonych informacji o złożonych próbkach2. Fluorescencja może być przydatna, ale tylko w przypadku próbek luminescencyjnych lub takich, które można odpowiednio zabarwić. Mikroskopia DIC posiada kilka cech, które czynią ją cennym narzędziem do analizy nanocząsteczek. Najczęściej wymieniane zalety DIC w porównaniu z innymi metodami, w odniesieniu do plazmonicznych nanocząsteczek, to: brak konieczności barwienia próbek, brak efektów halo, mała głębia ostrości oraz wysoka rozdzielczość boczna3. DIC posiada dodatkowe atuty, które są wartościowe w badaniach nad plazmonicznymi nanocząsteczkami. Po pierwsze, występują dwa immanentne i ortogonalne pola polaryzacyjne, które mogą być mierzone jednocześnie do celów spektroskopowych2. Po drugie, zdepolaryzowany sygnał nanocząsteczek nie jest rejestrowany w końcowym obrazie2, co może być istotnym problemem w pomiarach spektroskopowych w ciemnym polu.
Celem niniejszego artykułu jest przedstawienie przejrzystej metodologii wykorzystania mikroskopii DIC Nomarskiego w świetle przechodzącym do przeprowadzania spektroskopii plazmonicznych nanocząstek. Chociaż DIC jest potężną techniką, którą można zastosować do bardzo zróżnicowanych materiałów, jest to również metoda wymagająca dużych umiejętności i wiedzy w celu jej prawidłowego zastosowania podczas obrazowania nanocząstek. Mikroskopia DIC Nomarskiego w świetle przechodzącym posiada złożoną drogę optyczną1, która zostanie tutaj omówiona jedynie krótko. Tor optyczny DIC przedstawiono na Rysunku 1. Światło przechodzi przez mikroskop, najpierw przechodząc przez polaryzator i pryzmat Nomarskiego rozdzielający wiązkę, a następnie będąc ogniskowane przez kondensor na płaszczyznę próbki. Po przejściu przez obiektyw światło napotyka pryzmat Nomarskiego łączący wiązki oraz analizator, zanim trafi do detektora. Dwa polaryzatory i pryzmaty Nomarskiego są kluczowe dla powstania obrazu DIC i odpowiadają za wytworzenie dwóch ortogonalnych pól polaryzacji w metodzie DIC1. Czytelnicy zainteresowani zgłębieniem zasad działania i drogi optycznej mikroskopów DIC Nomarskiego lub różnic między DIC Nomarskiego a innymi rodzajami DIC proszeni są o zapoznanie się z innymi rzetelnymi opracowaniami na te tematy1,4,5,6,7.
Równie ważne jest zrozumienie podstawowej natury nanocząsteczek plazmonicznych przed podjęciem prób przeprowadzenia ich spektroskopii, niezależnie od tego, czy odbywa się to za pomocą DIC Nomarskiego, ciemnego pola czy jakiejkolwiek innej techniki mikroskopowej. W dziedzinie plazmoniki nanocząsteczki definiuje się jako cząstki o rozmiarach rzędu 10-100 nm8,9. Nanocząsteczki mogą przyjmować wiele kształtów (np. sfery, pręty, gwiazdy, hantle itp.), a większość ich istotnych właściwości wynika z oddziaływań ze światłem w zakresie ultrafioletu, światła widzialnego i bliskiej podczerwieni widma elektromagnetycznego. Termin „plazmoniczny” nie ogranicza się wyłącznie do nanocząsteczek10; jednak w kontekście nanocząsteczek jest on używany w odniesieniu do lokalnego powierzchniowego rezonansu plazmonowego (LSPR). LSPR to zjawisko, w którym elektrony przewodnictwa w nanocząsteczce oscylują wskutek oddziaływania kulombowskiego z promieniowaniem elektromagnetycznym o bardzo specyficznym i stosunkowo wąskim pasmie częstotliwości8. Przy tych samych częstotliwościach nanocząsteczki plazmoniczne wykazują zwiększone pochłanianie i rozpraszanie światła, co czyni je widocznymi w mikroskopii optycznej. W wielu przypadkach preferowane jest obserwowanie nanocząsteczek przy zastosowaniu filtrów pasmowych przed kondensorem2, aby poprawić kontrast obrazowania i wyeliminować światło, które nie wywołuje efektu LSPR. Stosowanie filtrów umożliwia również przeprowadzenie eksperymentów spektroskopowych na pojedynczych cząstkach.
Zachowanie optyczne związane z LSPR jest silnie zależne od rozmiaru i kształtu nanocząstek i może być badane za pomocą wielu technik mikroskopii optycznej. Jednak w celu odczytania informacji o orientacji nanocząstek plazmonicznych o kształcie anizotropowym (tj. niesferycznym), konieczne jest wykorzystanie polaryzacji pola świetlnego. Poprzez ostrożne obracanie pola polaryzacji lub podłoża z próbką w małych przyrostach, możliwe jest monitorowanie zależnych od orientacji właściwości spektroskopowych poszczególnych nanocząstek. Rotacja i polaryzacja mogą również pomóc w ustaleniu, czy dana cecha widmowa wynika z oscylacji dipolowych czy z oscylacji wyższego rzędu elektronów powierzchniowych nanocząstki. Jednak w przypadku nanocząstek izotropowych (tj. sferycznych), profil widmowy pozostaje w zasadzie niezmienny podczas obracania próbki w świetle spolaryzowanym.
Pod obserwacją w mikroskopie DIC (Rycina 2), nanocząstki posiadają tarczę Airy o biało-czarnym wyglądzie z rzucanym cieniem na szarym tle. Sferyczne nanocząstki zachowują taki wygląd podczas obrotu oraz przy zmianie filtrów pasmowych; jednakże cząstki będą stopniowo znikać z pola widzenia w miarę jak centralna długość fali filtra będzie coraz bardziej oddalać się od jedynej dipolarnej długości fali LSPR sfery11Wygląd nanopyłków może ulec dość gwałtownej zmianie podczas ich obracania2Nanopręty posiadają dwa pasma LSPR o charakterze dipolowym, których położenie zależy od wymiarów fizycznych nanoprętów. Gdy oś podłużna nanopręta jest zorientowana równolegle do jednego z pól polaryzacji DIC, plamka Airy’ego będzie całkowicie biała lub całkowicie czarna, jeśli jest obserwowana przy użyciu filtra pasmowo-przepustowego odpowiadającego danej długości fali LSPR. Po obróceniu próbki 90°przybierze ona kolor przeciwny. Alternatywnie, ponieważ oś poprzeczna nanopręta jest prostopadła do osi podłużnej, pręt przybierze kolor przeciwny podczas przełączania między filtrami odpowiadającymi długościom fal LSPR dla obu osi. Przy innych orientacjach i ustawieniach filtrów nanopręty będą przypominać bardziej sfery, wykazując różnorodne wzory krążków Airy’ego z rzucanym cieniem. W przypadku nanoprętów z osią poprzeczną &lt; Przy 25 nm może być trudne wykrycie sygnału przy tej długości fali LSPR z użyciem mikroskopii DIC.
Aby przeprowadzić spektroskopię pojedynczych cząstek, ważne jest zastosowanie odpowiednich komponentów optycznych i ich właściwe wyrównanie. Należy użyć obiektywu umożliwiającego mikroskopię DIC. W eksperymentach z pojedynczymi cząstkami idealne są obiektywy olejowe 80x lub 100x. Pryzmaty Nomarskiego DIC występują zazwyczaj w trzech odmianach: standardowej, o wysokim kontraście i o wysokiej rozdzielczości. Wybór optymalnego typu zależy w dużym stopniu od celu eksperymentu oraz rozmiaru nanocząstek. Pryzmaty standardowe są odpowiednie do wielu doświadczeń, jednak w przypadku pracy z mniejszymi nanocząstkami (&lt; 50 nm) korzystne mogą być pryzmaty o wysokim kontraście, ponieważ kontrast cząstek maleje wraz ze zmniejszaniem się ich rozmiaru11. Regulacja kontrastu DIC odbywa się poprzez obrót polaryzatora lub przesuwanie jednego z pryzmatów DIC, w zależności od marki lub modelu mikroskopu6.
Po ustawieniu oświetlenia Kohlera oraz polaryzatora, krytyczne jest, aby nie zmieniać tych ustawień podczas gromadzenia danych spektroskopowych. Ponadto, podczas zbierania danych należy przez cały czas utrzymywać stały średni sygnał tła, nawet przy zmianie filtrów i ustawień kątowych. Rzeczywista idealna wartość tła zależy od zakresu dynamicznego kamery naukowej, ale ogólnie tło powinno mieścić się w zakresie 15%–40% maksymalnego poziomu detekcji kamery. Zmniejsza to prawdopodobieństwo nasycenia matrycy kamery, umożliwiając jednocześnie optymalny kontrast cząstek. Do gromadzenia danych spektroskopowych niezbędne jest korzystanie z kamery naukowej rejestrującej obrazy w czerni i bieli, w przeciwieństwie do kamery kolorowej.
Przygotowanie próbki jest kolejnym krytycznym aspektem obrazowania nanocząstek plazmonicznych. Operatorzy mikroskopii DIC muszą posiadać wiedzę na temat właściwości optycznych próbki oraz zastosowanego podłoża. Szkło mikroskopowe określane jako „wstępnie oczyszczone” nie jest wystarczająco przygotowane do obrazowania nanocząstek i musi zostać odpowiednio oczyszczone przed naniesieniem próbki, aby zapewnić niezakłóconą obserwację. Wiele protokołów czyszczenia szkiełek mikroskopowych zostało wcześniej opisanych12, jednak etap ten zazwyczaj nie jest raportowany w badaniach eksperymentalnych.
Ostatnim elementem spektroskopii pojedynczych cząstek są metody analizy danych. Należy zmierzyć maksymalną i minimalną intensywność dla każdej nanocząstki, a także średnią wartość lokalnego tła. Analizowane cząstki powinny znajdować się w obszarach wolnych od zanieczyszczeń tła, defektów podłoża lub nierównomiernego oświetlenia. Jedną z metod określania profilu spektralnego nanocząstki jest obliczenie kontrastu cząstki dla każdej długości fali przy użyciu poniższego równania11,13,14,15:
<img alt="Wzór na kontrast cząsteczki: (Wartość maksymalna cząsteczki - Wartość minimalna cząsteczki) / Średnia tła, równanie." src="/files/ftp_upload/59411/59411eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie">
Alternatywnie, widmo pojedynczej cząstki można rozdzielić na poszczególne komponenty sygnału maksymalnego i minimalnego, które reprezentują dwa pola polaryzacji DIC, wyświetlając w ten sposób dwa jednocześnie zebrane widma zależne od kierunku, zgodnie z dwoma równaniami:
<img alt="Równanie korekcji pomiaru cząstek; wzór przedstawiający skorygowane maksimum i średnią tła." src="/files/ftp_upload/59411/59411eq2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie">
<img alt="Wzór na równowagę statyczną, minimalna wartość cząsteczki skorygowana o wartości zmierzone i średnią tła, równanie." src="/files/ftp_upload/59411/59411eq3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie">

<table><tbody><tr><td>Contrad 70</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>1002</td><td>Do czyszczenia szkła mikroskopu, Dostępne u wielu dostawców chemikaliów</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A962-4</td><td>Do czyszczenia i przechowywania szkła mikroskopu</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe do</td><td>mikroskopu Ted Pella</td><td>260148</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe szklane</td><td>Ted Pella</td><td>26007</td><td></td></tr><tr><td>Złote nanopręty</td><td>Nanopartz</td><td>DIAM-SPR-25-650</td><td></td></tr><tr><td>Złote nanosfery (80 nm)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>742023-25ML</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>N/A</td><td>Darmowe oprogramowanie dostępne do analizy danych z NIJ</td></tr><tr><td>Lakier do paznokci</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Nikon Ti-E</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Azot</td> gazowy <td>Airgas</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ORCA Flash 4.0 V2+ cyfrowa kamera sCMOS</td><td>Pióro do pisania Hamamatsu</td><td>77054098</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Amazon</td><td>N/A</td><td>Wiele opcji dostępnych online za mniej niż 10 USD. Nie trzeba kupować drogiej wersji.</td></tr><tr>Woda <td></td><td></td><td>ultraczysta</td><td>18 megaomów</td></tr></tbody></table>

wykonywanie spektroskopii nanocząstek plazmonicznych za pomocą transmisyjnej mikroskopii kontrastowej interferencyjnej typu nomarskiego

Performing Spectroscopy on Plasmonic Nanoparticles with Transmission-Based Nomarski-Type Differential Interference Contrast Microscopy

Mikroskopia kontrastu interferencyjnego różnicowego (DIC) to potężne narzędzie do obrazowania, które jest najczęściej używane do obrazowania obiektów w mikroskali za pomocą światła widzialnego. Celem tego protokołu jest uszczegółowienie sprawdzonej metody przygotowywania próbek nanocząstek plazmonicznych i wykonywania na nich spektroskopii pojedynczych cząstek za pomocą mikroskopii DIC. Aby przeprowadzić powtarzalne eksperymenty spektroskopowe, należy dokładnie wykonać kilka ważnych kroków. Po pierwsze, punkty orientacyjne mogą być wytrawione w podłożu próbki, co pomaga w zlokalizowaniu powierzchni próbki i śledzeniu obszaru zainteresowania podczas eksperymentów. Następnie podłoże musi zostać odpowiednio oczyszczone z zanieczyszczeń i zanieczyszczeń, które w inny sposób mogłyby utrudnić lub zasłonąć badanie próbki. Po prawidłowym przygotowaniu próbki należy wyrównać ścieżkę optyczną mikroskopu za pomocą oświetlenia Kohlera. W przypadku standardowego mikroskopu DIC typu Nomarskiego może być konieczna rotacja próbki, szczególnie gdy nanocząstki plazmoniczne wykazują właściwości optyczne zależne od orientacji. Ponieważ mikroskopia DIC ma dwa nieodłączne ortogonalne pola polaryzacji, zależny od długości fali wzór kontrastu DIC ujawnia orientację plazmonicznych nanocząstek w kształcie prętów. Wreszcie, akwizycja i analiza danych muszą być starannie przeprowadzone. Często przedstawia się dane ze spektroskopii opartej na DIC jako wartość kontrastu, ale możliwe jest również przedstawienie ich jako danych dotyczących intensywności. W tej demonstracji DIC do spektroskopii pojedynczych cząstek nacisk kładziony jest na sferyczne i pręcikowe nanocząstki złota.

W przypadku pracy z próbkami na tyle dużymi, że są widoczne gołym okiem, zazwyczaj nie ma potrzeby nanoszenia punktów orientacyjnych na podłożu szklanym. Jednak przy pracy z nanomateriałami lub gdy wymagana jest rotacja próbki, punkty orientacyjne mogą stanowić prostą metodę lokalizacji, rozróżniania i śledzenia orientacji próbki. Chociaż do nanoszenia punktów orientacyjnych na podłożach szklanych można wykorzystać bardziej zaawansowane techniki17, zarysowanie szkł...

Celem tego protokołu jest szczegółowe przedstawienie sprawdzonego podejścia do przygotowania próbek plazmonicznych nanocząstek i przeprowadzenia na nich spektroskopii pojedynczych cząstek za pomocą mikroskopii z kontrastem różnicowym interferencyjnym (DIC).

Wykonywanie spektroskopii nanocząstek plazmonicznych za pomocą transmisyjnej mikroskopii kontrastowej interferencyjnej typu Nomarskiego

Differential interference contrast (DIC) microscopy is a powerful imaging tool that is most commonly employed for imaging microscale objects using ...

Mikroskopia DIC jest lepsza od ciemnego pola w obrazowaniu nanocząstek plazmonicznych w złożonych środowiskach. Jednak DIC wymaga również większej wiedzy i umiejętności, aby uzyskać powtarzalne wyniki. Mikroskopia DIC zapewnia zarówno wysoką rozdzielczość poprzeczną, jak i płytką głębię ostrości.Obie te cechy są niezwykle ważne podczas monitorowania nanocząstek w komórkach lub w złożonych środowiskach. Na początek użyj pisaka do pisania, aby umieścić płytki i krótki ślad zadrapania na środku każdego szklanego szkiełka nakrywkowego, a następnie wyczyść szkło zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Następnie za pomocą mikropipety usuń 100 mikrolitrów roztworu nanocząstek złota o stężeniu 05 miligramów na mililitr z oryginalnego pojemnika do przechowywania i wyrzuć roztwór do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej.Odwirować próbkę przez 10 minut przy 6 000 razy większej grawitacji. Po zakończeniu usuń supernatant za pomocą mikropipety, aby pozbyć się nadmiaru środka powierzchniowo czynnego z roztworu nanocząstek. Następnie dodaj 100 mikrolitrów ultraczystej wody do probówki wirówkowej.Krótko zawirować próbkę, aby rozbić osad, a następnie poddać ją sonikacji przez 20 minut bezpośrednio po tym, aby całkowicie zawiesić agregaty nanocząstek. Za pomocą mikropipety rozlej sześć mikrolitrów roztworu nanocząstek na oczyszczone i porysowane szklane szkiełko nakrywkowe. Następnie ostrożnie odwróć szkiełko nakrywkowe i umieść je na drugim większym kawałku szkła mikroskopowego.Kropla powinna szybko rozprowadzić się równomiernie między dwoma kawałkami szkła. Uważaj, aby pęcherzyki powietrza nie zostały uwięzione między dwoma kawałkami szkła. Użyj wąskiej linii lakieru do paznokci, aby uszczelnić krawędzie szkiełka nakrywkowego, aby zapobiec parowaniu płynu.Umieść próbkę na stoliku mikroskopu i wyrównaj obiektyw i kondensator mikroskopu. Dostosuj ostrość, aby znaleźć płaszczyznę ogniskowej, na której znajduje się próbka, i zlokalizuj utworzony wcześniej ślad zadrapania. Skoncentruj się na nim i dostosuj ostrość, aż nanocząsteczki pojawią się w polu widzenia.Aby określić dokładne umiejscowienie kondensatora, użyj metody oświetlenia Kohlera, zaczynając od obiektywu 20x, a następnie przechodząc do dużych powiększeń, takich jak 80 lub 100x. Następnie wybierz obszar zainteresowania w próbce do obrazowania. Wyśrodkuj obszar w polu widzenia aparatu i w razie potrzeby dostosuj ostrość.Jeśli mikroskop ma konstrukcję de Senarmont, zacznij od polaryzatora ustawionego na bliskie maksymalnego wygaszania tła i stopniowo obracaj polaryzator w kierunku zmniejszającego się wygaszania tła. Intensywność tła będzie stopniowo rosła. Idealne ustawienie osiąga się, gdy nanocząstki osiągają największą różnicę intensywności w porównaniu z lokalną średnią tła.W przypadku nanocząstek plazmonicznych największy kontrast uzyskuje się zwykle przy stosunkowo ciemnym tle na poziomie lub w pobliżu maksymalnego wygaszenia tła. Wyłącz oświetlenie w pomieszczeniu, aby zapobiec interakcji rozproszonego oświetlenia z procesem. Umieść 10-nanometrowy filtr pasmowo-przepustowy o pełnej szerokości i połowie maksymalnego poziomu, którego centralna długość fali jest umieszczona równolegle z główną zlokalizowaną powierzchnią fali rezonansu plazmonowego, aby zobaczyć obszar zainteresowania.Następnie dostosuj intensywność lampy lub czas ekspozycji, aż poziom tła osiągnie od 5% do 40% maksymalnego poziomu pojemności aparatu. Żadne obiekty w obszarze zainteresowania nie powinny wykazywać intensywności sygnału przekraczającej 90% maksymalnego poziomu intensywności kamery. Zobrazuj próbkę za pomocą szeregu filtrów pasmowo-przepustowych, z których każdy ma pełną szerokość przy połowie maksimum 10 nanometrów, i które jako całość umożliwiają obrazowanie w całym zakresie długości fali.Upewnij się, że intensywność tła na obrazach nie przekracza 5% odstępu czasu, dostosowując czas ekspozycji, a nie moc lampy. Po przełączeniu filtrów ponownie ustaw ostrość próbki przed zrobieniem zdjęć. Zapisz obrazy jako nieskompresowane pliki TIFF i/lub w natywnym formacie oprogramowania, aby zachować wszystkie istotne informacje.Aby rozpocząć analizę, otwórz obraz za pomocą ImageJ. Użyj narzędzia Prostokąt, aby narysować prostokąt wokół głównego obszaru zainteresowania. Następnie na pasku narzędzi wybierz obraz, przejdź do powiększenia i wybierz wybór.Okno obrazowania zostanie powiększone na wybranym obszarze. Następnie wybierz obraz, przejdź do regulacji i wybierz jasność/kontrast. Aby poprawić widok obszaru próbki, dostosuj minimalną, maksymalną, jasność i kontrast obrazu.Korekty te nie zmieniają danych naukowych, a jedynie umożliwiają lepszą widoczność obszaru próbki. Teraz ponownie użyj narzędzia prostokąta i narysuj ramkę wokół pierwszej nanocząstki, która ma być zmierzona. Pudełko powinno być tylko nieznacznie większe niż przewiewny dysk nanocząstki.Po wybraniu przejdź do sekcji Analizuj i wybierz pozycję Zmierz. Pojawi się nowe okno, w którym podane są minimalne, maksymalne i średnie natężenia pikseli znajdujących się w zaznaczonym polu. Zachowując oryginalny rozmiar pola, przeciągnij je do obszaru bezpośrednio przylegającego do cząstki, w którym kontrast tła jest względnie równy i nie ma w nim żadnych cząstek ani zanieczyszczeń.Użyj ponownie narzędzia do mierzenia, aby określić średnią intensywność obszaru tła. Powtórz ten proces dla każdej cząstki na wszystkich obrazach w serii. Następnie wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć kontrast lub intensywność każdej cząstki we wszystkich długościach fal i pod wszystkimi kątami.Wprowadź poniższe równanie, aby obliczyć kontrast każdej cząstki. Na koniec narysuj wykres profilu widmowego w danej pozycji nanocząstki, wykreślając dane z długością fali wzdłuż osi X i kontrastem lub intensywnością wzdłuż osi Y. Aby określić optymalne ustawienia obrazowania, te złote nanosfery zostały zobrazowane przy kilku ustawieniach polaryzatora.W temperaturze zera stopni cząstki wydają się w większości białe z ciemnym paskiem biegnącym przez ich środek. Wskazuje to na polaryzację krzyżową próbek nanosfery. Gdy polaryzator jest obracany pod różnymi kątami, cząsteczki rzucają ciemne cienie w kierunku jednego rogu.Jednak wartości kontrastu cząstek zmieniają się dramatycznie. W przypadku tej próbki optymalnym ustawieniem obrazowania jest przesunięcie polaryzatora o 10 stopni. Tutaj długość fali jest wykreślana w stosunku do kontrastu złotych nanosfer.Każdy punkt danych reprezentuje średnio 20 nanosfer dla każdej średnicy cząstek. Szczytowy kontrast dla każdej cząstki zmienia się nieznacznie w zależności od jej rozmiaru. Intensywność i rotacja są jeszcze ważniejsze w przypadku anizotropowych kształtów, takich jak ten złoty nanopręt.Tutaj długość fali jest wykreślana w zależności od intensywności przy dwóch różnych ustawieniach polaryzatora. W każdym przypadku intensywność jasnej strony jest znacznie silniejsza niż ciemnej strony. Profil intensywności pojedynczego złotego nanopręta przy jego zlokalizowanej powierzchniowej długości fali rezonansu plazmonowego podczas obrotu stolika pokazuje dużą różnicę intensywności między ciemną i jasną stroną, gdy próbka jest obracana o 180 stopni.Obrazowanie próbek jest niezwykle ważne. Wymaga to zarówno staranności, jak i cierpliwości ze strony mikroskopisty. Jeśli wykonujesz eksperyment, który wymaga ponownego obrazowania próbki w ciągu kilku dni, punkty orientacyjne, takie jak zadrapania, mają kluczowe znaczenie dla przeniesienia interesującego Cię regionu.Mikroskopia DIC cieszy się coraz większym zainteresowaniem naukowców, którzy badają nanocząstki, zwłaszcza w środowiskach dynamicznych i komórkowych. Ponieważ DIC oferuje optymalną rozdzielczość przestrzenną, szczególnie w złożonych środowiskach próbkowania.

performing-spectroscopy-on-plasmonic-nanoparticles-with-transmission

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Wykazano, że pęsety plazmoniczne oraz nanostruktury kryształów fotonicznych zapewniają istotną poprawę wydajności i kontroli orientacji w optycznym chwytaniu mikro- i nanocząstek.

Wykorzystanie plazmonicznych i fotonicznych nanostruktur krystalicznych do usprawnionej manipulacji mikro- i nanocząsteczkami

Ten film pokazuje zlokalizowane obrazowanie powierzchniowego rezonansu plazmonów w celu wykrycia wydzielin białkowych z pojedynczej komórki. Wykorzystując układ mikroprzepływowy i plazmoniczny chip nanostrukturalny związany z peptydami, zmiany natężenia światła odbitego pod kątem rezonansu ujawniają interakcje z wydzielanymi białkami z pojedynczej komórki.

Zlokalizowane obrazowanie powierzchniowego rezonansu plazmonowego w celu wykrycia wydzielin białkowych z pojedynczej komórki

Srebrne nanodruty mogą jednocześnie transportować elektrony i informacje optyczne w postaci plazmonów powierzchniowych. Opisano tutaj procedurę realizacji takiego wspólnego obwodu i oceniane są ograniczenia w propagacji obu nośników informacji.

Ocena transportu plazmonicznego w przewodzących prąd nanodrutach srebra

Nasycone i odwrócone saturable rozpraszanie zostały odkryte w izolowanych cząstkach plazmonicznych i przyjęte jako nowatorska metoda kontrastu bez wybielania w mikroskopii superrozdzielczej. Tutaj szczegółowo wyjaśniono eksperymentalne procedury wykrywania i ekstrakcji rozpraszania nieliniowego, a także sposoby zwiększenia rozdzielczości za pomocą nasyconej mikroskopii wzbudzenia.

Pomiar nieliniowości rozpraszania od pojedynczej nanocząstki plazmonicznej

Przedstawiono protokół koloidalnej syntezy nanokostek srebra i wytwarzania plazmonicznych nanoskalowych anten krosowych z przerwami poniżej 10 nm.

Synteza koloidalna anten nanopatchowych do zastosowań w plazmonice i nanofotonice

Opisujemy procedurę optycznego uwięzienia mikrocząsteczek w nanoplazmonicznej sieci optycznej.

Uwięzienie mikrocząstek w nanoplazmonicznej sieci optycznej

Ten protokół opisuje oprzyrządowanie do określania szybkości wzbudzenia i sprzężenia między emiterami światła a polarytonami plazmonów powierzchniowych podobnych do Blocha, powstających z układów okresowych.

Wyznaczanie współczynników wzbudzenia i sprzężenia między emiterami światła a polarytonami plazmonów powierzchniowych

Struktura pasma fotonicznego umożliwia zrozumienie, w jaki sposób ograniczone mody elektromagnetyczne rozchodzą się w krysztale fotonicznym. W kryształach fotonicznych, które zawierają elementy magnetyczne, takim ograniczonym i rezonansowym modom optycznym towarzyszy zwiększona i zmodyfikowana aktywność magnetooptyczna. Opisujemy procedurę pomiarową mającą na celu wyodrębnienie magnetooptycznej struktury pasmowej za pomocą mikroskopii przestrzeni Fouriera.

Spektralna i kątowo-optyczna charakterystyka nanostruktur fotonicznych

Ten artykuł przedstawia integrację modułu spektralnego ogniskowania i lasera impulsowego o podwójnym wyjściu, umożliwiającego szybkie obrazowanie hiperspektralne nanocząsteczek złota i komórek rakowych. Praca ta ma na celu zademonstrowanie szczegółów multimodalnych nieliniowych technik optycznych na standardowym laserowym mikroskopie skaningowym.

Obrazowanie biomolekularne wychwytu komórkowego nanocząstek przy użyciu multimodalnej nieliniowej mikroskopii optycznej

Obecny protokół opisuje wygodne podejście do integracji optycznego pułapkowania i powierzchniowo wzmocnionej spektroskopii Ramana (SERS) do manipulowania plazmonicznymi nanocząstkami w celu czułego wykrywania molekularnego. Bez środków agregujących, laser pułapkujący gromadzi plazmoniczne nanocząstki w celu wzmocnienia sygnałów SERS docelowych analitów do pomiarów spektroskopowych in situ.

Optyczne pułapkowanie nanocząstek plazmonicznych do charakterystyki spektroskopii Ramana wzmocnionej powierzchniowo in situ

Plazmoniczne pęsety wykorzystują zlokalizowany powierzchniowy rezonans plazmonów w nanostrukturach złota, aby uwięzić pojedyncze nanocząsteczki, w tym białka, w polu optycznym o skali nanometrowej. Zmiany w rozproszonym sygnale ujawniają obecność białka i dynamikę konformacyjną, umożliwiając monitorowanie bez modyfikacji fluoroforu lub wiązania powierzchni.

Monitorowanie dynamiki konformacyjnej pojedynczych niemodyfikowanych białek za pomocą plazmonicznej pęsety

Poznaj spektroskopię pojedynczych nanocząstek plazmonicznych przy użyciu mikroskopii DIC. Ta metoda zapewnia wysoką rozdzielczość przestrzenną do obserwacji nanocząstek w złożonych środowiskach biologicznych.

Wykonywanie spektroskopii nanocząstek plazmonicznych za pomocą transmisyjnej mikroskopii kontrastowej interferencyjnej typu Nomarskiego (Wideo) | JoVE Journal

Wykonywanie spektroskopii nanocząstek plazmonicznych za pomocą transmisyjnej mikroskopii kontrastowej interferencyjnej typu Nomarskiego

Przeglądaj więcej filmów