Wykonywanie spektroskopii nanocząstek plazmonicznych za pomocą transmisyjnej mikroskopii kontrastowej interferencyjnej typu Nomarskiego

Mikroskopia DIC jest lepsza od ciemnego pola w obrazowaniu nanocząstek plazmonicznych w złożonych środowiskach. Jednak DIC wymaga również większej wiedzy i umiejętności, aby uzyskać powtarzalne wyniki. Mikroskopia DIC zapewnia zarówno wysoką rozdzielczość poprzeczną, jak i płytką głębię ostrości.

Obie te cechy są niezwykle ważne podczas monitorowania nanocząstek w komórkach lub w złożonych środowiskach. Na początek użyj pisaka do pisania, aby umieścić płytki i krótki ślad zadrapania na środku każdego szklanego szkiełka nakrywkowego, a następnie wyczyść szkło zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Następnie za pomocą mikropipety usuń 100 mikrolitrów roztworu nanocząstek złota o stężeniu 05 miligramów na mililitr z oryginalnego pojemnika do przechowywania i wyrzuć roztwór do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej.

Odwirować próbkę przez 10 minut przy 6 000 razy większej grawitacji. Po zakończeniu usuń supernatant za pomocą mikropipety, aby pozbyć się nadmiaru środka powierzchniowo czynnego z roztworu nanocząstek. Następnie dodaj 100 mikrolitrów ultraczystej wody do probówki wirówkowej.

Krótko zawirować próbkę, aby rozbić osad, a następnie poddać ją sonikacji przez 20 minut bezpośrednio po tym, aby całkowicie zawiesić agregaty nanocząstek. Za pomocą mikropipety rozlej sześć mikrolitrów roztworu nanocząstek na oczyszczone i porysowane szklane szkiełko nakrywkowe. Następnie ostrożnie odwróć szkiełko nakrywkowe i umieść je na drugim większym kawałku szkła mikroskopowego.

Kropla powinna szybko rozprowadzić się równomiernie między dwoma kawałkami szkła. Uważaj, aby pęcherzyki powietrza nie zostały uwięzione między dwoma kawałkami szkła. Użyj wąskiej linii lakieru do paznokci, aby uszczelnić krawędzie szkiełka nakrywkowego, aby zapobiec parowaniu płynu.

Umieść próbkę na stoliku mikroskopu i wyrównaj obiektyw i kondensator mikroskopu. Dostosuj ostrość, aby znaleźć płaszczyznę ogniskowej, na której znajduje się próbka, i zlokalizuj utworzony wcześniej ślad zadrapania. Skoncentruj się na nim i dostosuj ostrość, aż nanocząsteczki pojawią się w polu widzenia.

Aby określić dokładne umiejscowienie kondensatora, użyj metody oświetlenia Kohlera, zaczynając od obiektywu 20x, a następnie przechodząc do dużych powiększeń, takich jak 80 lub 100x. Następnie wybierz obszar zainteresowania w próbce do obrazowania. Wyśrodkuj obszar w polu widzenia aparatu i w razie potrzeby dostosuj ostrość.

Jeśli mikroskop ma konstrukcję de Senarmont, zacznij od polaryzatora ustawionego na bliskie maksymalnego wygaszania tła i stopniowo obracaj polaryzator w kierunku zmniejszającego się wygaszania tła. Intensywność tła będzie stopniowo rosła. Idealne ustawienie osiąga się, gdy nanocząstki osiągają największą różnicę intensywności w porównaniu z lokalną średnią tła.

W przypadku nanocząstek plazmonicznych największy kontrast uzyskuje się zwykle przy stosunkowo ciemnym tle na poziomie lub w pobliżu maksymalnego wygaszenia tła. Wyłącz oświetlenie w pomieszczeniu, aby zapobiec interakcji rozproszonego oświetlenia z procesem. Umieść 10-nanometrowy filtr pasmowo-przepustowy o pełnej szerokości i połowie maksymalnego poziomu, którego centralna długość fali jest umieszczona równolegle z główną zlokalizowaną powierzchnią fali rezonansu plazmonowego, aby zobaczyć obszar zainteresowania.

Następnie dostosuj intensywność lampy lub czas ekspozycji, aż poziom tła osiągnie od 5% do 40% maksymalnego poziomu pojemności aparatu. Żadne obiekty w obszarze zainteresowania nie powinny wykazywać intensywności sygnału przekraczającej 90% maksymalnego poziomu intensywności kamery. Zobrazuj próbkę za pomocą szeregu filtrów pasmowo-przepustowych, z których każdy ma pełną szerokość przy połowie maksimum 10 nanometrów, i które jako całość umożliwiają obrazowanie w całym zakresie długości fali.

Upewnij się, że intensywność tła na obrazach nie przekracza 5% odstępu czasu, dostosowując czas ekspozycji, a nie moc lampy. Po przełączeniu filtrów ponownie ustaw ostrość próbki przed zrobieniem zdjęć. Zapisz obrazy jako nieskompresowane pliki TIFF i/lub w natywnym formacie oprogramowania, aby zachować wszystkie istotne informacje.

Aby rozpocząć analizę, otwórz obraz za pomocą ImageJ. Użyj narzędzia Prostokąt, aby narysować prostokąt wokół głównego obszaru zainteresowania. Następnie na pasku narzędzi wybierz obraz, przejdź do powiększenia i wybierz wybór.

Okno obrazowania zostanie powiększone na wybranym obszarze. Następnie wybierz obraz, przejdź do regulacji i wybierz jasność/kontrast. Aby poprawić widok obszaru próbki, dostosuj minimalną, maksymalną, jasność i kontrast obrazu.

Korekty te nie zmieniają danych naukowych, a jedynie umożliwiają lepszą widoczność obszaru próbki. Teraz ponownie użyj narzędzia prostokąta i narysuj ramkę wokół pierwszej nanocząstki, która ma być zmierzona. Pudełko powinno być tylko nieznacznie większe niż przewiewny dysk nanocząstki.

Po wybraniu przejdź do sekcji Analizuj i wybierz pozycję Zmierz. Pojawi się nowe okno, w którym podane są minimalne, maksymalne i średnie natężenia pikseli znajdujących się w zaznaczonym polu. Zachowując oryginalny rozmiar pola, przeciągnij je do obszaru bezpośrednio przylegającego do cząstki, w którym kontrast tła jest względnie równy i nie ma w nim żadnych cząstek ani zanieczyszczeń.

Użyj ponownie narzędzia do mierzenia, aby określić średnią intensywność obszaru tła. Powtórz ten proces dla każdej cząstki na wszystkich obrazach w serii. Następnie wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć kontrast lub intensywność każdej cząstki we wszystkich długościach fal i pod wszystkimi kątami.

Wprowadź poniższe równanie, aby obliczyć kontrast każdej cząstki. Na koniec narysuj wykres profilu widmowego w danej pozycji nanocząstki, wykreślając dane z długością fali wzdłuż osi X i kontrastem lub intensywnością wzdłuż osi Y. Aby określić optymalne ustawienia obrazowania, te złote nanosfery zostały zobrazowane przy kilku ustawieniach polaryzatora.

W temperaturze zera stopni cząstki wydają się w większości białe z ciemnym paskiem biegnącym przez ich środek. Wskazuje to na polaryzację krzyżową próbek nanosfery. Gdy polaryzator jest obracany pod różnymi kątami, cząsteczki rzucają ciemne cienie w kierunku jednego rogu.

Jednak wartości kontrastu cząstek zmieniają się dramatycznie. W przypadku tej próbki optymalnym ustawieniem obrazowania jest przesunięcie polaryzatora o 10 stopni. Tutaj długość fali jest wykreślana w stosunku do kontrastu złotych nanosfer.

Każdy punkt danych reprezentuje średnio 20 nanosfer dla każdej średnicy cząstek. Szczytowy kontrast dla każdej cząstki zmienia się nieznacznie w zależności od jej rozmiaru. Intensywność i rotacja są jeszcze ważniejsze w przypadku anizotropowych kształtów, takich jak ten złoty nanopręt.

Tutaj długość fali jest wykreślana w zależności od intensywności przy dwóch różnych ustawieniach polaryzatora. W każdym przypadku intensywność jasnej strony jest znacznie silniejsza niż ciemnej strony. Profil intensywności pojedynczego złotego nanopręta przy jego zlokalizowanej powierzchniowej długości fali rezonansu plazmonowego podczas obrotu stolika pokazuje dużą różnicę intensywności między ciemną i jasną stroną, gdy próbka jest obracana o 180 stopni.

Obrazowanie próbek jest niezwykle ważne. Wymaga to zarówno staranności, jak i cierpliwości ze strony mikroskopisty. Jeśli wykonujesz eksperyment, który wymaga ponownego obrazowania próbki w ciągu kilku dni, punkty orientacyjne, takie jak zadrapania, mają kluczowe znaczenie dla przeniesienia interesującego Cię regionu.

Mikroskopia DIC cieszy się coraz większym zainteresowaniem naukowców, którzy badają nanocząstki, zwłaszcza w środowiskach dynamicznych i komórkowych. Ponieważ DIC oferuje optymalną rozdzielczość przestrzenną, szczególnie w złożonych środowiskach próbkowania.