Zastosowanie jednocząsteczkowej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (SM-FISH) do ilościowego oznaczania i lokalizacji mRNA w mysich oocytach
24 kwietnia 2019
Aby w sposób powtarzalny zliczyć liczbę mRNA w poszczególnych oocytach, zoptymalizowano jednocząsteczkową fluorescencję RNA in situ (RNA-FISH) dla komórek nieprzylegających. Oocyty zebrano, zhybrydyzowano z sondami specyficznymi dla transkryptu i oznaczono ilościowo za pomocą oprogramowania do kwantyfikacji obrazu.
Technika ta pozwala nie tylko na lokalizację, ale także na ilościowe określenie kandydujących mRNA w poszczególnych oocytach i zarodkach. W porównaniu z innymi testami, w tym PCR, ukończenie tej techniki skutkuje odtwarzalnymi danymi o niewielkiej zmienności. Procedurę zademonstruje Kelsey Timme, doktorantka w moim laboratorium.
Rozpocznij tę procedurę od przygotowania wymaganego materiału i samic myszy w wieku od pięciu do ośmiu tygodni, jak opisano w protokole tekstowym. Wyczyść mysz za pomocą 70% etanolu. Odsłoń jamę brzuszną i uwidocznij żeński układ rozrodczy.
Przytrzymaj jajnik kleszczami i usuń więzadła macicy oraz nadmiar tkanki tłuszczowej z okolic jajnika. Wytnij jajowód od macicy. Następnie umieść parę jajników w ciepłym podłożu w 35-milimetrowym naczyniu.
Usuń jajnik i otaczającą go tkankę tłuszczową. Rozerwij spuchnięte bańki jajowodu za pomocą półcalowej igły o rozmiarze 27. Popchnij jajowód w miejsce rozdarcia, a kompleksy oocytów z komórek wzgórka zostaną wydalone.
Za pomocą pipety doustnej przenieś owulowane oocyty do kropli o pojemności 100 mikrolitrów zawierającej pożywkę z hialuronidazą. Aby usunąć komórki wzgórka, pipetuj metafazę dwóch kompleksów komórek wzgórka oocytu w górę iw dół w pożywce zawierającej hialuronidazę za pomocą pipety doustnej. Gdy są one pozbawione komórek wzgórka, użyj pipety doustnej, aby przenieść każdy oocyt do kropli płuczącej zawierającej tylko podłoże podtrzymujące.
Powtórz to dla każdej kropli prania. Nie należy przenosić rozdrobnionych lub przezroczystych komórek jajowych. Aby przeprowadzić barwienie SM-FISH, należy najpierw umieścić oocyty w pojedynczym dołku na sześciodołkowej płytce zawierającej 500 mikrolitrów buforu utrwalającego.
Zanurz 20 oocytów lub mniej w studzience. Inkubować oocyty w buforze utrwalającym przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po umyciu oocytów zgodnie z opisem w protokole tekstowym, jajocyty inkubować w buforze permeablacyjnym przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
Po kolejnym przemyciu przenieś oocyty do 80 mikrolitrów wstępnie rozcieńczonego buforu proteazy trzy na 30 minut w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć podgrzane zestawy sond dla Nanog, Pou5f1 i DapB od jednego do 50 w rozcieńczalniku sondy. Inkubuj oocyty w 80 mikrolitrach sondy swoistej dla transkryptu przez dwie godziny w temperaturze 40 stopni Celsjusza.
Kiedy oocyty znajdują się w sondzie i AMP, mają tendencję do unoszenia się na wodzie. Istotne jest, aby zanurzyć oocyty, delikatnie wpychając je do bufora. Przenieś oocyty do 500 mikrolitrów buforu do przemywania i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Teraz inkubuj oocyty sekwencyjnie w amplifikacyjnych. Najpierw inkubuj oocyty w 80 mikrolitrach AMP1 przez 30 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza. Następnie przenieś oocyty do 500 mikrolitrów buforu do przemywania przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie inkubuj oocyty w 80 mikrolitrach AMP2 przez 15 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza. Po umyciu oocytów jak poprzednio, inkubować oocyty w 80 mikrolitrach AMP3 przez 30 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza, a następnie przepłukać końcowo. Na koniec dodaj oocyty do 80 mikrolitrów AMP4FL przez 15 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza.
Odpipetować 12 mikrolitrów środka montażowego zapobiegającego blaknięciu na środku szkiełka bez dodawania pęcherzyków do odczynnika. Przenieś oocyty z jak najmniejszą ilością buforu płuczącego do podłoża montażowego. Na koniec nałóż szkiełko nakrywkowe.
Zobrazuj trójwymiarowe oocyty za pomocą mikroskopii konfokalnej Z-step i zapisz obrazy zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przeciągnij pliki ND2 na Fidżi i wybierz Hyperstack. Kliknij kartę Obraz, wybierz opcję Kolor, a następnie kliknij opcję Podziel kanały, aby oddzielić kanały fluorescencyjne pliku ND2.
Wygeneruj indywidualne pliki TIFF dla każdego wycinka Z oocytów w każdym kanale fluorescencyjnym. Aby to zrobić, kliknij kartę Obraz, wybierz opcję Stosy, a następnie kliknij opcję Ułóż w stos z obrazami. Następnie kliknij kartę Obraz, wybierz opcję Typ i kliknij opcję Kolor RGB, aby przekonwertować każdy plasterek Z na pojedynczy obraz w kolorze RGB.
Zapisz każdy przekonwertowany obraz jako plik TIFF. Umieść obrazy z pojedynczego oocytu dla każdego kanału fluorescencyjnego w nowym folderze, aby uniknąć pomyłek podczas zszywania. Po znormalizowaniu plików zgodnie z opisem w protokole tekstowym kliknij kartę Wtyczki, wybierz Łączenie i kliknij Kolekcja siatki.
Wybierz Obrazy sekwencyjne z menu rozwijanego i kliknij OK. Przejrzyj katalog i wybierz folder zawierający wszystkie obrazy plasterka Z dla pojedynczego oocytu na jednej długości fali. Kliknij przycisk OK.
Przesuń suwak u dołu zszytego obrazu do odpowiedniego kanału koloru dla używanej długości fali. Utwórz ostateczny obraz zszyty RGB, klikając pozycję Obraz, wybierając opcję Typ i klikając pozycję Kolor RGB. Przekonwertuj zszyty obraz na maksymalny wyświetlany obraz 32-bitowy.
Aby to zrobić, kliknij pozycję Obraz, wybierz opcję Typ i kliknij opcję 32-bitowy. Zapisz ten obraz jako nowy plik TIFF. Otwórz 32-bitowy zszyty obraz w programie do wyszukiwania i śledzenia miejsc.
Wybierz listę rozwijaną Lokalizacja i kliknij przycisk Lokalizuj, co spowoduje obliczenie liczby miejsc znalezionych na obrazie. Pokazano tutaj kwantyfikację mRNA za pomocą wyszukiwarki punktowej i śledzenia. Niebieska strzałka wskazuje dodatni sygnał powyżej progu.
Biała strzałka pokazuje fluorescencyjną plamkę poniżej progu i dlatego nie jest liczona. Liczba mRNA została następnie przeanalizowana przy użyciu standardowego narzędzia do analizy danych. Reprezentatywne obrazy środkowego obrazu serii Z są pokazane dla Pouf51 i Nanog.
Barwienie DAPI chromosomów ustawionych na wrzecionie metafazy drugiej jest pokazane na biało. Dane zebrane w tym protokole wykazały 775 transkryptów Pouf51 i 113 transkryptów Nanog w oocytach metafazy drugiej. Co ważne, nie wykryto plamek w oocytach znakowanych sondą DapB, która pełniła funkcję kontroli ujemnej.
W przypadku stosowania komórek nieprzylegających ważne jest, aby empirycznie zidentyfikować najlepsze rozcieńczenie buforu proteazy z zestawu SM-FISH. Wykrywanie mRNA testowano przy użyciu krzywej miareczkowania nierozcieńczonych i kilku rozcieńczonych stężeń buforu proteazy w 1xPBS. Rozcieńczenie proteazy zastosowane w tym protokole wynosiło od jednego do ośmiu, ponieważ wykazało najniższą zmienność średniej fluorescencyjnej ekspresji mRNA Pouf51 w oocytach metafazy drugiej.
Można przeprowadzić jednoczesną immunofluorescencję białka docelowego w celu kolokalizacji mRNA z białkiem wiążącym RNA. Kolokalizacja mRNA z białkami wiążącymi RNA pozwala badaczom określić mechanizmy regulujące przechowywanie, translację i degradację mRNA w oocycie lub zarodku.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje zoptymalizowaną technikę hybrydyzacji in situ RNA (RNA-FISH) pojedynczych cząsteczek, służącą do ilościowego oznaczania mRNA w poszczególnych oocytach. Metoda ta umożliwia zarówno lokalizację, jak i kwantyfikację, dostarczając powtarzalnych danych o niskiej zmienności.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia komórki
- Ekspresja genów
Wstęp
- Metoda single molecule RNA-FISH jest potężną techniką badania mRNA w komórkach.
- Jest ona szczególnie użyteczna w przypadku komórek nieprzywierających, takich jak oocyty.
- Powtarzalność i niska zmienność są kluczowe dla uzyskania wiarygodnych danych.
- Zrozumienie lokalizacji i ilości mRNA może dostarczyć cennych informacji w dziedzinie biologii rozwoju.
Cel badania
- Optymalizacja metody RNA-FISH w celu zliczania cząsteczek mRNA w poszczególnych oocytach.
- Wykazanie skuteczności procedury w porównaniu z innymi analizami.
- Przedstawienie szczegółowego protokołu dla badaczy zajmujących się tą tematyką.
Zastosowane metody
- Pozyskiwanie oocytów od samic myszy.
- Hybrydyzacja ze specyficznymi dla transkryptów sondami.
- Kwantyfikacja obrazów przy użyciu specjalistycznego oprogramowania.
- Przygotowanie materiałów i oczyszczanie próbek.
Główne wyniki
- Zoptymalizowana technika RNA-FISH umożliwia dokładną kwantyfikację mRNA.
- Uzyskane dane wykazują niską zmienność w porównaniu z tradycyjnymi metodami, takimi jak PCR.
- Zaprezentowanie procedury przez studenta studiów magisterskich zwiększa powtarzalność metody.
- Wyniki przyczyniają się do lepszego zrozumienia ekspresji genów w oocytach.
Wnioski
- Metoda RNA-FISH jest niezawodnym sposobem badania mRNA w poszczególnych oocytach.
- Technikę tę można dostosować do różnych zastosowań badawczych w biologii rozwoju.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodologii w celu pogłębienia wiedzy na temat regulacji genów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe oznaczanie pojedynczych cząsteczek mRNA w oocytach wypełnia istotną lukę w biologii wczesnego rozwoju, w której transkrypty o niskiej liczności wymykają się detekcji w analizach populacyjnych lub zbiorczych. Dzięki umożliwieniu powtarzalnego zliczania transkryptów w pojedynczych komórkach przy minimalnej zmienności, metoda ta zwiększa pewność walidacji celów w badaniach nad linią zarodkową i embriogenezą. Wspiera ona redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie przestrzennych wzorców mRNA z efektami funkcjonalnymi w dojrzewaniu oocytów i wczesnej embriogenezie.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe oznaczanie niskokopiowych mRNA w pojedynczych oocytach, co ogranicza liczbę wyników fałszywie ujemnych w profilowaniu ekspresji docelowej.
- Wartość operacyjna: Eliminuje konieczność łączenia oocytów w pule, co zmniejsza zmienność próbek i poprawia powtarzalność wyników pomiędzy grupami eksperymentalnymi.
- Wartość prognostyczna: Wspiera priorytetyzację celów poprzez dostarczanie ilościowych, rozdzielonych przestrzennie danych o mRNA, które korelują z fenotypami funkcjonalnymi w oocytach w metafazie II.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość analizy: Generuje zestandaryzowane, ilościowe zliczenia mRNA na oocyt z wykorzystaniem oprogramowania do wykrywania punktów, co umożliwia wiarygodne porównanie pomiędzy różnymi warunkami traktowania lub genetycznymi.
- Skalowalność: Protokół wykorzystuje płytki 6-dołkowe i media montażowe, co pozwala na przetwarzanie oocytów w partiach w zastosowaniach przesiewowych o średniej przepustowości.
- Powtarzalność: Zoptymalizowane rozcieńczenie proteazy (1:8) oraz zamienniki buforów minimalizują lizę oocytów i zmienność techniczną, zwiększając odporność analizy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Ułatwia dopasowanie biomarkerów poprzez wykrywanie transkrypty specyficznych dla oocytów, takich jak Nanog i Pou5f1, które są istotne dla pluripotencji i wczesnego rozwoju zarodkowego.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia kokalokalizację z białkami wiążącymi RNA poprzez jednoczesną immunofluorescencję, co pozwala na badania mechanistyczne magazynowania, translacji i degradacji mRNA.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Kontrola negatywna (sonda DapB) potwierdza specyficzność, redukując ryzyko wyników fałszywie dodatnich w procesach walidacji celów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od testowania hipotez dotyczących celów terapeutycznych po optymalizację związków wiodących, szczególnie w programach ukierunkowanych na linię zarodkową lub w badaniach z zakresu embriotoksykologii, gdzie niezbędna jest rozdzielczość na poziomie pojedynczych komórek.
- Biologia odkryć: Wspiera weryfikację hipotez poprzez kwantyfikację zmian w ekspresji mRNA w poszczególnych oocytach pod wpływem zaburzeń eksperymentalnych.
- Screening: Dostarcza ilościowe wyniki z rozdzielczością przestrzenną, które umożliwiają wiarygodny screening związków lub modyfikacji genetycznych w modelach opartych na oocytach.
- Analityka: Oprogramowanie do wykrywania i śledzenia plamek (spot-finding) zapewnia cyfrowe przeliczenie cząsteczek mRNA na komórkę, umożliwiając statystyczne porównanie liczby transkryptów w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Odnosi się do znaczenia przedklinicznego poprzez detekcję markerów pluripotencji (Pou5f1, Nanog) oraz ich mechanizmów regulacyjnych.
- Zastosowania przemysłowe: Zoptymalizowane warunki buforowe i protokół montażu tworzą platformę wielokrotnego użytku, którą można dostosować do innych typów komórek nieprzywierających.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez wykrywanie niskonapiętościowych mRNA, które zostały pominięte podczas PCR lub sekwencjonowania w pojedynczych oocytach.
- Wartość operacyjna: Redukuje zmienność techniczną i wymagania dotyczące próbek, zwiększając przepustowość i efektywność kosztową w analizach opartych na oocytach.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), dostarczając ilościowe dane mRNA o rozdzielczości przestrzennej, powiązane z wynikami fenotypowymi.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów w biologii rozwoju i zdrowiu reprodukcyjnym z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagane jest doświadczenie w manipulowaniu oocytami, ich fiksacji i permeabilizacji, aby zapobiec lizie oraz zapewnić penetrację odczynników.
- Niezbędny jest dostęp do mikroskopii konfokalnej oraz oprogramowania do wyszukiwania i śledzenia punktów (np. Fiji z wtyczką Grid Collection) w celu obrazowania 3D i kwantyfikacji.
- Standaryzacja rozcieńczeń proteaz oraz buforów piorących pomiędzy zespołami jest kluczowa dla uzyskania powtarzalnych wyników w komórkach nieadherentnych.
- Adaptacja do innych systemów modelowych może wymagać ponownej optymalizacji warunków permeabilizacji, hybrydyzacji i płukania.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wrażliwość na jakość oocytów oraz konieczność ostrożnego przenoszenia do medium montażowego, aby uniknąć stresu ścinającego.
