Wzmocniony nadzór nad wścieklizną za pomocą bezpośredniego szybkiego testu immunohistochemicznego

DRIT jest istotny, ponieważ zapewnia test diagnostyczny wścieklizny, który można wykonać w zdecentralizowanych laboratoriach w terenie lub w obszarach bez rutynowego dostępu do mikroskopii elektronowej. Główną zaletą DRIT jest to, że wykorzystuje tylko prostą mikroskopię świetlną, a wyniki można uzyskać w ciągu około godziny. DRIT zapewnia potężne, ekonomiczne narzędzie do diagnozowania wścieklizny, które może być wykorzystywane przez laboratoriów i biologów terenowych do poprawy programów nadzoru, zapobiegania i kontroli wścieklizny na całym świecie.

W przypadku zwierząt, które są świeżo zebrane lub zostały rozmrożone do temperatury otoczenia, należy ułożyć zwierzę na wznak na płaskiej powierzchni z lekko obróconym kręgosłupem szyjnym w kierunku badającego. Badanie palpacyjne w celu identyfikacji stawu atlantyczno-potylicznego po stronie bocznej kręgosłupa szyjnego. Za pomocą ostrza skalpela wykonaj nacięcie na poziomie stawu szczytowo-potylicznego w części brzusznej, przecinając wszystkie warstwy mięśni i tkanek miękkich, w tym tchawicę i przełyk.

Kontynuuj, aż do zbliżenia przedniej części kręgów kręgosłupa szyjnego. Następnie przesuń głowę zwierzęcia do przedłużenia zakresu końcowego, aż pień mózgu będzie widoczny. Użyj ostrza skalpela, aby usunąć wszystkie widoczne tkanki pnia mózgu i ośrodkowego układu nerwowego do pobranej próbki.

Umieść próbki pnia mózgu w nietłukącym się pojemniku i odpowiednio oznacz. Najpierw należy ustawić naczynia do barwienia, które są wystarczająco głębokie, aby umożliwić całkowite zanurzenie szkiełka z próbką. Napełnij naczynie 10% formaliną buforowaną fosforanem.

Napełnij naczynia drugie, cztery i pięć TPBS. Napełnij naczynie trzecie 3% nadtlenkiem wodoru. Następnie napełnij naczynia szóste, ósme, dziewiąte i dziesiąte wodą destylowaną lub dejonizowaną.

Napełnij naczynie siódme preparatem hematoksyliny Gilla numer dwa, rozcieńczonym w stosunku 1:1 wodą destylowaną. Aby przygotować roztwór podstawowy amino-etylo-karbazolu, za pomocą szklanej pipety umieścić pięć mililitrów N, N-dimetyloformamidu w szklanym pojemniku. Dodać 120 mg tabletki 3-amino-9-etylokarbazolu do szklanego pojemnika i wstrząsać aż do całkowitego rozpuszczenia.

Aby przygotować robocze rozcieńczenie AEC, dodaj siedem mililitrów buforu octanowego do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Za pomocą szklanej pipety dodaj 0,5 mililitra roztworu podstawowego AEC do probówki wirówkowej. Dodaj 0,75 mililitra 3% roztworu nadtlenku wodoru.

Użyj 10-mililitrowej strzykawki z filtrem strzykawkowym 0,45 mikrometra, aby przefiltrować roztwór. Na początek użyj wodoodpornego markera permanentnego, odpornego na rozmazywanie, aby oznaczyć szklane szkiełka mikroskopowe unikalnym numerem dla każdej próbki. Użyj ostrza skalpela, aby usunąć pień mózgu z pojemnika i umieść go na ręczniku papierowym.

Użyj drugiego ręcznika papierowego, aby delikatnie zetrzeć nadmiar płynu, krwi lub sierści, aby odsłonić tylko tkankę pnia mózgu. W razie potrzeby przekrój tkankę pnia mózgu, aby odsłonić przekrój. Bardzo delikatnie dotykaj szkiełka mikroskopowego w kilku punktach pnia mózgu bez ruchu bocznego, aby umożliwić przeniesienie wielu obszarów pnia mózgu na szkiełko, upewniając się, że tylko jedna lub dwie warstwy komórek są przenoszone z tkanki mózgowej na szkiełko.

Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przez około pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie zanurz szkiełka w 10% buforowanej formalinie w naczyniu pierwszym na 10 minut. Wyjmij szkiełka z formaliny i zanurz je w roztworze TPBS w drugim naczyniu.

Zanurz wypłukane szkiełka w roztworze nadtlenku wodoru zawartym w naczyniu trzecim na 10 minut. Następnie wyjmij szkiełka z nadtlenku wodoru i zanurz je w świeżym TPBS zawartym w naczyniu czwartym. Po usunięciu nadmiaru nadtlenku wodoru umieść szkiełka w świeżym TPBS zawartym w naczyniu piątym.

Weź szkiełka pojedynczo z talerza piątego, strząśnij i osusz nadmiar buforu, a następnie umieść szkiełko na zwilżonym ręczniku papierowym na stole laboratoryjnym. Po przeniesieniu wszystkich szkiełek należy użyć zakraplacza lub pipety, aby na każde szkiełko wrzucić wystarczającą ilość pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko wirusowi wścieklizny, aby pokryć tkankę OUN. Przykryj szkiełka płytkami studzienkowymi lub inną prostą pokrywą, aby utworzyć komorę wilgotnościową i inkubuj szkiełka w temperaturze pokojowej w komorze przez 10 minut.

Następnie wyjmij szkiełka z komory wilgotnościowej, strząśnij i osusz nadmiar koniugatu i zanurz je w TPBS w naczyniu piątym. Pracując z jednym szkiełkiem na raz, wyjmij szkiełko z TPBS i użyj zakraplacza lub pipety, aby upuścić wystarczającą ilość kompleksu peroksydazy streptawidyny, aby pokryć tkankę OUN. Po przykryciu wszystkich szkiełek inkubuj je w komorze wilgotnościowej przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie wyjmij szkiełka z komory wilgotnościowej, strząśnij i zetrzyj nadmiar kompleksu, a następnie zanurz je w TPBS znajdującym się w naczyniu piątym. Pracując z jednym szkiełkiem na raz, wyjmij szkiełko z TPBS i użyj pipety, aby upuścić wystarczającą ilość roztworu roboczego AEC, aby pokryć tkankę OUN. Inkubować szkiełka w komorze wilgotnościowej przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie zanurz szkiełka w wodzie destylowanej znajdującej się w naczyniu szóstym i umieść je w przeciwbarwieniu hematoksyliny Gilla w naczyniu siódmym na dwie minuty. Natychmiast zanurz wszystkie szkiełka w wodzie destylowanej w naczyniu ósmym. Powtórz to dwukrotnie, używając słodkiej wody w naczyniach 9 i 10 na każde mycie.

Pracując pojedynczo, wyjmij szkiełko z wody, strząśnij i zetrzyj nadmiar wody. Użyj rozpuszczalnego w wodzie medium montażowego, aby przymocować szkiełko nakrywkowe do szkiełka. Następnie użyj mikroskopu świetlnego z obiektywem 20X, aby wyświetlić slajdy.

Pozytywne wyniki DRIT wskazują na czerwone wewnątrzcytoplazmatyczne inkluzje wirusowe, które mogą różnić się kształtem i rozmiarem w cytoplazmie niebieskawych ciał komórkowych. Inkluzje wydają się gładkie, z bardzo jasnymi marginesami i mniej intensywnie zabarwionym obszarem centralnym. Rozkład antygenu jest stopniowany od plus cztery do plus jeden, gdzie plus cztery reprezentuje rozkład antygenu składający się z obfitości dużych i małych inkluzji różniących się wielkością i kształtem i obecnych w każdym polu widzenia w wycisku dotyku tkanki OUN.

Rozkład plus trzy jest przypisywany, gdy w większości, ale nie we wszystkich polach widzenia, występują inkluzje o różnych rozmiarach. Jeśli inkluzje zostaną znalezione w 10 do 50% pól mikroskopowych, przypisywana jest dystrybucja antygenu plus dwa, podczas gdy plus jeden jest przypisywany, gdy inkluzje zostaną znalezione w mniej niż 10% pól. Większość tkanek OUN z obecnym wirusem wścieklizny wykazuje typowe inkluzje wirusowe ocenione jako plus trzy lub plus cztery intensywność i rozkład antygenu.

Jeśli wyniki wskazują na plus jeden lub plus dwa w intensywności lub rozkładzie antygenu, próbkę uznaje się za nieokreśloną i uzasadnione jest powtórzenie badania. Próbkę testową przy użyciu DRIT uznaje się za ujemną na obecność antygenów wirusa wścieklizny po zeskanowaniu szkiełka zawierającego tkankę OUN w powiększeniu 200X lub większym i nie wykryciu typowych inkluzji wirusa. Próbki ujemne wykazują niebieskawe ciała komórkowe z niewielkim lub żadnym znanym specyficznym zabarwieniem.

Każda osoba przeprowadzająca badania diagnostyczne w kierunku wścieklizny powinna otrzymać standardowe szczepienia przedekspozycyjne przeciwko wściekliźnie oraz poddawać się regularnej ocenie serologicznej przeciwciał. Osoby nieobjęte zakazem wstępu na tereny, w których prowadzone są takie prace. Oprócz środków ostrożności podjętych podczas pracy z żywym wirusem wścieklizny, kilka odczynników używanych w teście jest niebezpiecznych.

Zapoznaj się z kartami charakterystyki dla każdego odczynnika.