Name: Wzmocniony nadzór nad wścieklizną za pomocą bezpośredniego szybkiego testu immunohistochemicznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Poznaj bezpośredni szybki test immunohistochemiczny (DRIT) do diagnostyki wścieklizny w warunkach polowych. Ta metoda wykorzystuje zwykłą mikroskopię świetlną i dostarcza wyniki w około godzinę.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wszystkim pracownikom USDA Wildlife Services, którzy obecnie lub wcześniej pobierali próbki do zwiększonego nadzoru nad wścieklizną i przeprowadzili DRIT w celu diagnozy wścieklizny. Dziękujemy również wielu współpracownikom, którzy pomagają nam w zbieraniu danych w ramach wzmocnionego nadzoru nad wścieklizną. Dziękujemy również Centrom Kontroli i Prewencji Chorób oraz Instytutowi Wistar za dostęp do krytycznych odczynników wymaganych do przeprowadzenia DRIT oraz za zapewnienie możliwości szkoleniowych. Ponadto doceniamy diagnostykę potwierdzającą i pomoc techniczną świadczoną przez Centra Kontroli i Prewencji Chorób oraz przez Wadsworth Center wraz z Departamentem Zdrowia Stanu Nowy Jork. Korzystanie z jakichkolwiek produktów komercyjnych służy wyłącznie celom porównawczym i nie stanowi poparcia.

Każda osoba przeprowadzająca testy diagnostyczne przeciwko wściekliźnie powinna otrzymać standardową serię szczepień przedekspozycyjnych przeciwko wściekliźnie i być poddawana regularnej ocenie serologicznej przeciwciał, w razie potrzeby z szczepieniami przypominającymi. Osoby nieobjęte taką pracą nie powinny wchodzić do laboratoriów ani obszarów, w których prowadzone są takie prace. Wszelkie manipulacje tkankami i szkiełkami powinny być przeprowadzane tak, aby nie rozpylać cieczy ani nie wytwarzać cząstek unoszących się w powietrzu. Wyciągi nie są wymagane, ale jeśli jest to możliwe, mogą zapewnić dodatkową ochronę przed zapachami, ektopasożytami i fragmentami kości. Podczas pobierania próbek i badania należy nosić minimalne środki ochrony osobistej, w tym rękawice i okulary ochronne.
1. Kolekcja pnia mózgu
<ol>
	<li>Próbki pnia mózgu należy pobrać natychmiast po pobraniu tusz lub upewnić się, że tusze są umieszczane w zamrażarkach w celu przechowywania do czasu późniejszych badań. Jeśli tusze zwierzęce są zamrożone, rozmrozić je w temperaturze otoczenia przed pobraniem pnia mózgu, aby ułatwić zbieranie. W niektórych okolicznościach próbki pobiera się bezpośrednio z zamrożonego zwierzęcia.</li>
	<li>W przypadku zwierząt, które są świeżo zebrane lub zostały rozmrożone do temperatury otoczenia, należy ułożyć zwierzę na wznak na płaskiej powierzchni z lekko obróconym kręgosłupem szyjnym w kierunku badającego. Badanie palpacyjne w celu identyfikacji stawu atlantyczno-potylicznego po stronie bocznej kręgosłupa szyjnego.
	<ol>
		<li>W przypadku tusz, które są jeszcze całkowicie zamrożone, jeśli jest to możliwe, ułóż zwierzę na wznak w sposób opisany powyżej. Użyj pił, noży, nożyc do kości lub podobnego sprzętu, aby całkowicie oddzielić głowę od ciała. 
		nuta: Cały używany sprzęt, który nie jest jednorazowym użyciem, powinien być dokładnie czyszczony między próbkami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą ostrza skalpela wykonaj nacięcie na poziomie stawu szczytowo-potylicznego w aspekcie brzusznym, przecinając wszystkie warstwy mięśni i tkanek miękkich, w tym tchawicę i przełyk. Kontynuuj aż do zbliżenia przedniej części kręgów kręgosłupa szyjnego. W przypadku zamrożonej tkanki użyj ostrza skalpela, aby usunąć wszelkie pozostałe warstwy mięśni i tkanek miękkich, aby odsłonić otwór wielki.</li>
	<li>Przesuń głowę zwierzęcia do wyprostowania na końcu zakresu, aż pień mózgu będzie widoczny. Użyj ostrza skalpela, aby usunąć wszystkie widoczne tkanki pnia mózgu/ośrodkowego układu nerwowego (OUN) do pobrania próbki. W przypadku zamrożonej próbki użyj ostrza skalpela, aby usunąć jak najwięcej zamrożonej tkanki pnia mózgu/OUN z wnętrza czaszki.</li>
	<li>Umieść próbki pnia mózgu w nietłukącym się pojemniku (np. metalowej puszce na maść, kriofiolce itp.) i odpowiednio oznacz.</li>
	<li>Należy upewnić się, że próbki pnia mózgu są badane natychmiast po pobraniu za pomocą testu DRIT, przechowywane w lodówce (4 °C) do 24 godzin przed badaniem lub zamrażane (-20 °C) do czasu badania, jeśli badanie odbędzie się później niż 24 godziny po pobraniu próbki.</li>
</ol>
2. Przygotowanie materiałów do DRIT
<ol>
	<li>Ustawienie 10 naczyń do barwienia szkiełek (Rysunek 1) 
	nuta: Naczynia do barwienia są na tyle głębokie, że pozwalają na całkowite zanurzenie szkiełka (średnica 96 mm, wysokość 72 mm, głębokość 42 mm, objętość 250 ml). 6
	<ol>
		<li>Napełnij naczynie 1 10% formaliną buforowaną fosforanem. Wymień formalinę po 2 testach lub co tydzień.</li>
		<li>Napełnij naczynia 2, 4 i 5 solą fizjologiczną buforowaną fosforanami z 1% tween-80 (TPBS). Wymień na świeży TPBS przed każdym testem.</li>
		<li>Napełnij naczynie 3 3% nadtlenkiem wodoru. Wymienić nadtlenek wodoru przed każdym badaniem.</li>
		<li>Napełnij naczynia 6, 8, 9 i 10 wodą destylowaną lub dejonizowaną. Wymień wodę przed każdym testem.</li>
		<li>Napełnij naczynie 7 preparatem hematoksyliny Gills #2 rozcieńczonym w stosunku 1:1 w wodzie destylowanej6. Wymień hematoksylinę po 2 testach lub co tydzień. 
		nuta: Zgodnie z oryginalnym protokołem DRIT opracowanym przez CDC12, można zastosować stosunek 1:2 hematoksyliny Gills do wody, jeśli barwienie przeciwstawne jest zbyt ciemne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu podstawowego aminoetylokarbazolu (AEC)
	<ol>
		<li>Za pomocą szklanej pipety umieścić 5 ml N,N-dimetyloformamidu w szklanym pojemniku.</li>
		<li>Dodać jedną tabletkę 20 mg 3-amino-9-etylokarbazolu i wstrząsać aż do całkowitego rozpuszczenia. Oznacz słoik napisem "AEC stock" i datą wyprodukowania zapasu. 
		nuta: Roztwór podstawowy AEC może być przechowywany w lodówce (4 °C) i używany przez 1-2 miesiące.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie rozcieńczenia roboczego AEC
	<ol>
		<li>Dodać 7 ml buforu octanowego do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Za pomocą szklanej pipety dodać 0,5 ml roztworu podstawowego AEC do probówki wirówkowej.</li>
		<li>Dodać 0,075 ml 3% nadtlenku wodoru do probówki.</li>
		<li>Przefiltrować roztwór za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 μm. 
		nuta: Rozcieńczenie robocze AEC powinno być wytwarzane tuż przed każdym testem DRIT, ponieważ jest stabilne tylko przez 2-3 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Bezpośredni szybki test immunohistochemiczny
<ol>
	<li>Oznacz szklane szkiełka mikroskopowe unikalnym numerem dla każdej próbki za pomocą odpornego na rozmazywanie, wodoodpornego, trwałego markera atramentowego.
	<ol>
		<li>Za pomocą ostrza skalpela wyjmij pień mózgu z pojemnika i połóż na ręczniku papierowym. Delikatnie zetrzyj nadmiar płynu, krwi lub sierści drugim ręcznikiem papierowym, aby odsłonić tylko tkankę pnia mózgu13. W razie potrzeby przekrój tkankę pnia mózgu, aby odsłonić przekrój poprzeczny.</li>
		<li>Bardzo delikatnie przyłóż szkiełko mikroskopowe do przekroju poprzecznego tkanki pnia mózgu. Przyłóż szkiełko do pnia mózgu w kilku punktach bez ruchu bocznego, aby umożliwić przeniesienie wielu obszarów pnia mózgu do slide13. Upewnij się, że tylko 1 lub 2 warstwy komórek są przenoszone z tkanki mózgowej na szkiełko za pomocą delikatnego dotyku. Do przymocowania tkanki pnia mózgu do szkiełek nie jest potrzebny żaden środek montażowy. Uwzględnij zarówno kontrolę pozytywną, jak i negatywną w każdym przebiegu DRIT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przez około 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zanurz szkiełka w 10% buforowanej formalinie na 10 minut (danie 1).</li>
	<li>Wyjmij szkiełka z formaliny i zanurz je w roztworze TPBS (naczynie 2).</li>
	<li>Zanurz szkiełka w 3% nadtlenku wodoru na 10 minut (danie 3).</li>
	<li>Wyjmij szkiełka z nadtlenku wodoru i zanurz je w świeżym TPBS (naczynie 4). Po usunięciu nadmiaru nadtlenku wodoru umieść szkiełka w świeżym TPBS (naczynie 5) i pracuj z jednym szkiełkiem na raz, podczas gdy pozostałe szkiełka pozostaną zanurzone w TPBS.</li>
	<li>Weź szkiełka z TPBS (danie 5) pojedynczo, strząśnij i osusz nadmiar buforu, a następnie ułóż na zwilżonym ręczniku papierowym na stole laboratoryjnym, jako podstawę "komory wilgotnościowej". Za pomocą pipety upuść na każde szkiełko ilość pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko wirusowi wścieklizny, aby pokryć tkankę OUN. Inkubuj szkiełka przez 10 minut w komorze wilgotnościowej (tj. przykrywaj szkiełka płytkami studzienkowymi lub inną prostą pokrywą, gdy leżą na zwilżonym ręczniku papierowym) w temperaturze pokojowej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Wyjmij szkiełka z komory wilgotnościowej, strząśnij i zetrzyj nadmiar koniugatu, a następnie zanurz szkiełka w TPBS (użyj ponownie tego samego TPBS w naczyniu 5).</li>
	<li>Pracując z jednym szkiełkiem na raz, podczas gdy inne pozostają zanurzone w TPBS - użyj pipety, aby upuścić wystarczającą ilość kompleksu streptawidyna-peroksydazyna, aby pokryć tkankę OUN. Inkubować w komorze wilgotnościowej przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wyjmij szkiełka z komory wilgotnościowej, strząśnij i zetrzyj nadmiar kompleksu, a następnie zanurz je w TPBS (naczynie 5).</li>
	<li>Pracując z jednym szkiełkiem na raz, strząśnij i osusz nadmiar buforu, podczas gdy inne pozostają zanurzone w TPBS - użyj pipety, aby upuścić wystarczającą ilość AEC (przygotowanie wyjaśniono powyżej i należy je wykonać bezpośrednio przed użyciem), aby pokryć tkankę OUN. Inkubować w komorze wilgotnościowej przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Opłucz szkiełka w wodzie destylowanej (naczynie 6).</li>
	<li>Umieść szkiełka w przeciwbarwieniu z hematoksyliny Gills (rozcieńczonej 1:1 wodą destylowaną) na 2 minuty (danie 7).</li>
	<li>Natychmiast zanurz wszystkie szkiełka w wodzie destylowanej (naczynie 8). Powtórzyć dwa razy ze świeżą wodą za każdym razem (potrawy 9 i 10).</li>
	<li>Pracując z jednym szkiełkiem na raz, podczas gdy inne pozostają zanurzone w wodzie destylowanej (naczynie 10) — strząśnij i zetrzyj nadmiar wody, a następnie użyj rozpuszczalnego w wodzie środka montażowego, aby przymocować szkiełko nakrywkowe.</li>
	<li>Użyj mikroskopu świetlnego z obiektywem 20x, aby wyświetlić szkiełka i obiektywem 40x, jeśli potrzebna jest dokładniejsza kontrola.</li>
</ol>

<ol><li>Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDean%2C+DJ+%22Laboratory+techniques+in+rabies%22">Laboratory techniques in rabies</a>. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. 23, World Health Organization. eds 88-89 (1996).</li>
<li>Durr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+diagnosis+for+developing+countries%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Rabies diagnosis for developing countries.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 2 (3), e206(2008).</li>
<li>Rupprecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRupprecht%2C+C+%22Progress+in+the+development+of+a+direct+rapid+immunohistochemical+test+for+diagnosing+rabies%22">Progress in the development of a direct rapid immunohistochemical test for diagnosing rabies</a>. , (2014).</li>
<li>Rupprecht, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additional+Progress+in+the+Development+and+Application+of+a+Direct%2C+Rapid+Immunohistochemical+Test+for+Rabies+Diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Additional Progress in the Development and Application of a Direct, Rapid Immunohistochemical Test for Rabies Diagnosis.</a> Journal of Veterinary Science. 5 (2), (2018).</li>
<li>Coleman, P. G., Fevre, E. M., Cleaveland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+public+health+impact+of+rabies%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Estimating the public health impact of rabies.</a> Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 140-142 (2004).</li>
<li> <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Standard+Operating+Procedure+for+the+Direct+Rapid+Immunohistochemistry+Test+%28DRIT%29+for+the+detection+of+rabies+virus+antigens%22">Standard Operating Procedure for the Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) for the detection of rabies virus antigens</a>. , Centers for Disease Control and Prevention. (2016).</li>
<li>Lembo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+direct%2C+rapid+immunohistochemical+test+for+rabies+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).</li>
<li>Middel, K., Fehlner-Gardiner, C., Pulham, N., Buchanan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+Direct+Rapid+Immunohistochemical+Testing+into+Large-Scale+Wildlife+Rabies+Surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+Medicine+and+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Incorporating Direct Rapid Immunohistochemical Testing into Large-Scale Wildlife Rabies Surveillance.</a> Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 21(2017).</li>
<li>Coetzer, A., Sabeta, C. T., Markotter, W., Rupprecht, C. E., Nel, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+biotinylated+monoclonal+and+polyclonal+antibodies+in+an+evaluation+of+a+direct+rapid+immunohistochemical+test+for+the+routine+diagnosis+of+rabies+in+southern+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Comparison of biotinylated monoclonal and polyclonal antibodies in an evaluation of a direct rapid immunohistochemical test for the routine diagnosis of rabies in southern Africa.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (9), e3189(2014).</li>
<li>Kirby, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Rabies+Surveillance+to+Support+Effective+Oral+Rabies+Vaccination+of+Raccoons+in+the+Eastern+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+Medicine+and+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Enhanced Rabies Surveillance to Support Effective Oral Rabies Vaccination of Raccoons in the Eastern United States.</a> Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 34(2017).</li>
<li>Slate, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+rabies+vaccination+in+north+america%3A+opportunities%2C+complexities%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Oral rabies vaccination in north america: opportunities, complexities, and challenges.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (12), e549(2009).</li>
<li> Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) protocols. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr">https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr</a> (2019).</li>
<li>Khalid, A., Haque, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKhalid%2C+A+%22Touch+Impression+Cytology+Versus+Frozen+Section+as+Intraoperative+Consultation+Diagnosis%22">Touch Impression Cytology Versus Frozen Section as Intraoperative Consultation Diagnosis</a>. 2, (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

DRIT jest elastyczną metodą odpowiednią do nadzoru w terenie w celu wykrywania obecności wirusa wścieklizny, która może być stosowana w zdecentralizowanych obszarach laboratoryjnych. Chociaż możliwe jest przeprowadzenie całego testu w terenie, na przykład na tylnej klapie ciężarówki, idealnym rozwiązaniem jest posiadanie małej, wewnętrznej przestrzeni przeznaczonej na DRIT ze względu na problemy z chemikaliami, sprzętem i magazynowaniem zapasów. Ponadto należy wziąć pod uwagę przestrzeganie wszystkich obowiązujących federalnych, stanowych i lokalnych przepisów i regulacji dotyczących stosowania i utylizacji chemikaliów. Obecnie USDA WS posiada 15 obiektów DRIT do badania próbek z 17 stanów. Obiekty USDA WS DRIT są tworzone we współpracy z uniwersyteckimi i stanowymi laboratoriami zdrowia publicznego, w wyznaczonych pomieszczeniach w większych obiektach oraz w zamkniętych przyczepach, które zostały zmodernizowane i przystosowane do pełnienia funkcji mobilnych jednostek testowych w przypadku wystąpienia sytuacji kryzysowej, w której kluczowe znaczenie ma wzmocnione testy nadzoru nad wścieklizną z natychmiastowym czasem realizacji (Rysunek 5).
Podczas gdy test zakończył się sukcesem przy użyciu materiału pnia mózgu o różnej jakości, optymalna jest świeża tkanka pnia mózgu bez rozkładu tkanki. W miarę jak dochodzi do rozkładu, wysuszenia lub upłynnienia, jakość próbki spada, a test może wykryć więcej niespecyficznych barwień, które mogą zmylić wyniki. Ta obserwacja jest podobna w przypadku DFA i DRIT2. Pień mózgu/OUN należy pobrać tak szybko, jak to możliwe, a następnie przechowywać w stanie zamrożonym (-20 °C) do czasu badania.
Zazwyczaj większość obiektów USDA WS przetwarza od 12 do 24 szkiełek jednocześnie podczas sesji DRIT, w tym jedną kontrolę pozytywną i jedną kontrolę ujemną, które zostały potwierdzone przez DFA. Kontrole dodatnie i ujemne stanowią punkt odniesienia dla każdej serii DRIT w celu zapewnienia, że test zakończył się sukcesem i potwierdzenia, czy na szkiełkach testowych pojawiają się pytania interpretacyjne. Jeśli próbka nie zostanie uznana za jednoznacznie dodatnią lub negatywną, jest oznaczana jako nieokreślona i badana po raz drugi przez DRIT. Jeśli próbka ta nie jest jednoznacznie dodatnia lub ujemna po dwóch testach DRIT, jest wysyłana do laboratorium referencyjnego w celu przeprowadzenia badań DFA lub pokrewnych.
Podobnie jak w przypadku każdego testu diagnostycznego, "rozwiązywanie problemów" jest przydatne w przypadku nieoczekiwanych wyników. Na przykład, jeśli próba DRIT zakończy się niepowodzeniem (tj. kontrola pozytywna nie wykazuje intensywności barwienia +3 lub +4 i rozkładu antygenu), upewnij się, że wszystkie chemikalia i odczynniki nie straciły ważności. Odkryliśmy, że używanie nowo otwartej butelki z nadtlenkiem wodoru co najmniej raz w tygodniu jest pomocne w zapobieganiu niespecyficznemu barwieniu przez utlenianie tkanki mózgowej. Dodatkowo zalecamy wymianę buforu octanowego co najmniej raz w roku, niezależnie od daty ważności podanej na etykiecie.
Istnieje wiele zalet DRIT w porównaniu z DFA, w tym niższe koszty, możliwość wykonania testu poza scentralizowanym laboratorium, potrzeba tylko mikroskopii świetlnej zamiast mikroskopu fluorescencyjnego oraz stosunkowo prosty proces szkolenia dla osób podających i odczytujących test 2,3,4. Te zalety, w połączeniu z czułością i swoistością DRIT, które są porównywalne z DFA 2,7,8,9, dowiodły już, że test służy jako ważne narzędzie w szeroko zakrojonych programach wzmocnionego nadzoru nad wścieklizną 8,10 w Ameryce Północnej. Ponadto DRIT ma potencjał, aby umożliwić zwiększony nadzór i szybsze testowanie w krajach rozwijających się lub innych obszarach o ograniczonych zasobach, zwłaszcza po ostatnich wytycznych OIE/WHO jako zalecany test.

Chociaż DFA jest najczęściej używanym testem do rutynowej diagnostyki wścieklizny1, koszt zakupu i utrzymania mikroskopu fluorescencyjnego może być ograniczony dla krajów rozwijających się2,3,4 oraz dla szerokich, dużych programów wzmocnionego nadzoru nad wścieklizną3,4. Ponadto DFA wymaga możliwości schładzania próbek podczas utrwalania oraz inkubacji próbek powyżej temperatury otoczenia podczas reakcji przeciwciało-antygen, co może stanowić istotną przeszkodę w krajach bez odpowiedniej infrastruktury. Częściowo ze względu na ograniczenia związane z nowoczesnymi testami DFA, globalny wpływ wścieklizny był długo niedoceniany5.
W związku z tym, istnieje potrzeba walidacji dodatkowych technik diagnostycznych w celu poprawy nadzoru nad wścieklizną na całym świecie, szczególnie w krajach rozwijających się. Przedstawiony tutaj protokół DRIT oferuje laboratoryjną lub terenową alternatywę dla DFA, która wykorzystuje mikroskopię świetlną i nie wymaga chłodzenia ani inkubacji laboratoryjnej podczas testu6. DRIT i DFA są podobne pod tym względem, że obie techniki wykorzystują wyciski dotykowe próbek mózgu pobranych od potencjalnie wściekłych zwierząt. Jednak pierwszy etap DRIT wykorzystuje formalinę jako historyczny utrwalacz dla próbek, który dezaktywuje wirusa wścieklizny. Zapewnia to znaczną poprawę bezpieczeństwa biologicznego w porównaniu z acetonem używanym do mocowania próbek w protokole DFA3, co jest ważne nie tylko w laboratorium, ale być może nawet bardziej w środowiskach laboratoryjnych działających w terenie lub zdecentralizowanych. Do tej pory DRIT wykazuje czułość i swoistość równą DFA2,7,8,9.
Od 2005 roku, program USDA WS przeprowadził na dużą skalę wzmożone działania w zakresie nadzoru nad wścieklizną w Ameryce Północnej, używając DRIT jako część kompleksowego programu zarządzania wścieklizną dzikich zwierząt10. Wzmocniony nadzór nad wścieklizną jest stosowany jako uzupełnienie nadzoru i testów w zakresie zdrowia publicznego opartego na narażeniu i testuje przede wszystkim dzikie gatunki mezomięsożerców, w tym szopy pracze (Procyon lotor), pasiaste (Mephitis mephitis), lisy szare (Urocyon cinereoargenteus), lisy rude (Vulpes vulpes) i kojoty (Canis latrans), które nie były narażone na działanie promieniowania obcego u ludzi lub zwierząt domowych. Tusze zwierzęce użyte w testach zostały przekazane do USDA WS w ramach wzmożonego nadzoru nad wścieklizną i obejmowały gatunki wektorów wścieklizny, które: są chore lub dziwnie się zachowują; znalezione martwe, zabite na drodze lub uciążliwe; i nie są związane z narażeniem ludzi lub zwierząt domowych. DRIT zapewnia test diagnostyczny na wściekliznę, który może być stosowany przez wyszkolonych biologów terenowych z niewielkim lub żadnym doświadczeniem laboratoryjnym w celu poprawy nadzoru nad wścieklizną i zmniejszenia obciążenia finansowego i obciążenia laboratoriów diagnostycznych zdrowia publicznego10. Podstawowe szkolenie DRIT dla pracowników terenowych USDA WS trwa zazwyczaj od 1,5 do 2 dni, co obejmuje około 4 godzin zajęć w klasie obejmujących podstawowe zasady bezpieczeństwa biologicznego, metody pobierania próbek i procesy DRIT, a także >8 godzin czasu laboratoryjnego na przeprowadzenie testu. Możliwości szkoleniowe były dostępne dla USDA WS i współpracowników programu za pośrednictwem Centrów Kontroli i Prewencji Chorób (CDC), Lyssa LLC i The Wistar Institute.
W obszarach zarządzania strategicznego, USDA WS przetestował ponad 94 000 próbek dzikich zwierząt za pomocą DRIT i wykrył ponad 1 850 wściekłych próbek, które prawdopodobnie pozostałyby niewykryte, opierając się jedynie na testach zdrowia publicznego podejrzanych zwierząt. Ulepszone dane dotyczące nadzoru nad wścieklizną dostarczone przez wyniki DRIT mają kluczowe znaczenie dla zapewnienia pełniejszej czasowej i przestrzennej reprezentacji wścieklizny w krajobrazie w celu wsparcia programów doustnych szczepień przeciwko wściekliźnie dla dzikich zwierząt w całych Stanach Zjednoczonych10,11. Podobnie, prowincjonalne agencje ochrony przyrody w Kanadzie włączyły DRIT do zakrojonych na szeroką skalę działań związanych z nadzorem wścieklizny dzikich zwierząt w połączeniu ze swoimi programami zdrowia publicznego z sukcesem8. Zarówno USDA WS, jak i kanadyjskie programy nadzoru DRIT wykorzystały krajowe laboratoria referencyjne do potwierdzenia wścieklizny przez DFA i przeprowadzenia odpowiedniego typowania wariantu wirusa8. Co więcej, biolodzy terenowi USDA WS wysyłają 10% negatywnych próbek do potwierdzenia DFA do laboratoriów referencyjnych, a od 2008 r. uczestniczą w odbywających się dwa razy w roku testach biegłości DRIT przeprowadzanych przez Laboratorium Higieny Stanu Wisconsin w ramach standardowych środków zapewnienia jakości.
Celem tej metody jest zaoferowanie alternatywnego podejścia do testów diagnostycznych wścieklizny, które można wykonać w zdecentralizowanych laboratoriach, w terenie lub w obszarach bez rutynowego dostępu do mikroskopii elektronowej.

<table><tbody><tr><td>3-amino-9-etylokarbazol (tabletki AEC; 50 sztuk)</td><td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td><td>A6926</td><td></td></tr><tr><td>Bufor octanowy, 0.1M, 5.2 pH, 32 uncje</td><td>Poly Scientific R& D Corp. (https://www.polyrnd.com/)</td><td>s140</td><td></td></tr><tr><td>Ag Tek MiniScalpel, PN110, Niesterylny #10, 40 za opakowanie</td><td>Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/)</td><td>PN110</td><td>Wyposażenie uzupełniające do pobierania próbek wycisków dotykowych; Dostępne również za pośrednictwem jednorazowej strzykawki Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/)</td></tr><tr><td>BD Luer-Lok bez igły, 10 cc</td><td>Fisher Scientific (część Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td><td>14-823-2A</td><td>Numer producenta BD 309604</td></tr><tr><td>Lornetka z głowicą Seidentopf lub odpowiednikiem</td><td>Wielu dostawców</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Niebieska prostokątna utylizacja z oceną UN Kontener, 5G</td><td>Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)</td><td>1147T01BLU</td><td>Dodatkowe wyposażenie do przechowywania/utylizacji odpadów chemicznych (hematoksylina skrzelowa i roztwór AEC)</td></tr><tr><td>Corning Square i prostokątne szkło osłonowe, 24x60</td><td>Fisher Scientific (część Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td><td>12-553-465</td><td>Corning Numer producenta 2975246</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet Corning Universal Fit: stelażowe, niesterylne (1-200ul)</td><td>Fisher Scientific (część Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td><td>07-200-300</td><td>Numer producenta Corning 4863</td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 15 ml, polipropylen</td><td>Fisher Scientific (część Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td><td>14-959-70C</td><td>Numer producenta Corning 352097</td></tr><tr><td>Falcon 96-Well Assay Plates (pokrywki płytek do hodowli tkankowych)</td><td>Fisher Scientific (część Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td><td>08-772-5</td><td>Corning Numer producenta 353910</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy 25 mm marki Fisher, nylon, 0,45 i mu; m, Sterile</td><td>Fisher Scientific (część Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td><td>09-719D</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4L</td><td>Fisher Scientific (część Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td><td>CS401-1D</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Sharps-A-Gator Pojemniki na ostre przedmioty w miejscu użycia, 5 qt</td><td>Fisher Scientific (część Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td><td>14-827-122</td><td>Wyposażenie uzupełniające do prawidłowego przygotowania laboratorium BSL-2</td></tr><tr><td>Fluoro-Gel z buforem Tris (Gel/Mount Media), 20 ml</td><td>VWR, część Avantor (https://vwr.com)</td><td>102092-122</td><td>Substytut fluorożelu dla BioMeda&trade; Gel-Mount, Mikroskopia elektronowa Sciences</td></tr><tr><td>Formalina, Buforowana, 10%, 4L</td><td>Fisher Scientific (część Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td><td>SF100-4</td><td>Dostępne każdy lub w przypadku 4</td></tr><tr><td>Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200 &mu; L</td><td>Daigger Scientific (https://www.daigger.com)</td><td>EF9930E</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem hyklonu, 1x Roztwór, 1 l (PBS)</td><td>Fisher Scientific (część Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td><td>SH30256LS</td><td>Można użyć alternatywnego produktu w postaci suchego proszku</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru, 3%</td><td>Wielu dostawców</td><td></td><td>Wszelkie dostępne na rynku źródło, takie jak marki apteczne lub sklepowe itp. </td></tr><tr><td>Obiektyw mikroskopu soczewkowego 20x i 40x</td><td>Wielu dostawców</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lysol IC Quarternary Disinfecting Cleaner, 1G</td><td>Daigger Scientific (https://www.daigger.com)</td><td>EF8481</td><td>Materiały uzupełniające do prawidłowej dezynfekcji laboratoryjnej BSL-2 Marka</td></tr><tr><td>Miltex Jednorazowy skalpel Rozmiar 22 (rozmiar alternatywny dla MiniScalpela)</td><td>AMD Next (www.amdnext.com)</td><td>999112314</td><td>Wyposażenie uzupełniające do pobierania próbek wycisków dotykowych; Rozmiar alternatywny dla Ag Tek MiniScalpel</td></tr><tr><td>N,N-dimetyloformamidu, opakowanie ze szkła bursztynowego, 500 ml</td><td>Fisher Scientific (część Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td><td>D119-500</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna znakowana peroksydazą, 50 ml</td><td>SeraCare (https://www.seracare.com/)</td><td>5550-0001</td><td>Test immunologiczny i zestawy KPL Numer referencyjny 71-00-38</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna w proszku buforowana fosforanami (alternatywa dla Fisher liquid PBS)</td><td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td><td>P3813</td><td>Musi być przygotowany w 1 l wody destylowanej; Dostępne w ilościach 1, 10 i 50 opakowań</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe: Antynukleoproteina poliklonalna lub koktajl biotynylowanych przeciwciał</td><td></td><td></td> anty-lizsywirusa <td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni C</td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety serologiczne PYREX, szklane, sterylne, zatkane, Corning, 1.0 ml</td><td>VWR, część Avantor (https://vwr.com)</td><td>7078D-1</td><td>VWR Numer producenta 89091-220</td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety serologiczne PYREX, szklane, sterylne, zatkane, Corning, 10.0 ml</td><td>VWR, część Avantor (https://vwr.com)</td><td>7078D-10</td><td>VWR Numer producenta 89091-106</td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety serologiczne PYREX, szklane, sterylne, zatkane, Corning, 5,0 ml</td><td>VWR, część Avantor (https://vwr.com)</td><td>7078D-5</td><td>VWR Numer producenta 89091-484</td></tr><tr><td>Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (alternatywa dla powyższego)</td><td>Fisher Scientific (część Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td><td>22-050-201</td><td>Thermo Scientific Numer producenta 72504</td></tr><tr><td>Uchwyty do prowadnic, 24-miejscowe</td><td>VWR, część Avantor (https://vwr.com)</td><td>25608-868</td><td>Sakura&reg; Numer dostawcy Finetek: 4465; Dostępne u wielu dostawców</td></tr><tr><td>Blaszane pudełka na próbki, 1/2 uncji</td><td>VWR, część Avantor (https://vwr.com)</td><td>101412-452</td><td>Dodatkowy sprzęt do przechowywania próbek tkanki mózgowej</td></tr><tr><td>Taylor 2-Event Digital Timer/Clock</td><td>Wielu dostawców</td><td></td><td>Wyposażenie uzupełniające</td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia szkiełek Tissue-Tek</td><td>VWR, część Avantor (https://vwr.com)</td><td>25608-902</td><td>Sakura&reg; Numer dostawcy Finetek: 4551; Dostępne u wielu dostawców</td></tr><tr><td>TWEEN 80, glikol polietylenowy, 500 ml</td><td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td><td>P1754</td><td>Dostępne również w pojemnościach 25 mL, 1 L i 1 G Napełniacz</td></tr><tr><td>do pipet VWR FLIP (0,05-100 ml)</td><td>VWR, część Avantor (https://vwr.com)</td><td>53497-055</td><td></td></tr><tr><td>Miękkie nitrylowe rękawice diagnostyczne VWR, L (100 sztuk w opakowaniu)</td><td>VWR, część Avantor (https://vwr.com)</td><td>89038-272</td><td>Wyposażenie dodatkowe do odpowiednich środków ochrony indywidualnej</td></tr><tr><td>Woda, dejonizowana (20 l)</td><td>VWR, część Avantor (https://vwr.com)</td><td>10806-022</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki na próbki z przezroczystego szkła Wheaton, 8 ml</td><td>Fisher Scientific (część Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td><td>06-408C</td><td>DWK Nauki przyrodnicze Numer producenta 224884</td></tr><tr><td>Powlekane na biało, dwudołkowe szkiełka mikroskopowe, 14 mm</td><td>Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html)</td><td>2-140</td><td></td></tr><tr><td>Biały prostokątny pojemnik na odpady UN, 5G</td><td>Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)</td><td>1147T01WHT</td><td>Dodatkowe wyposażenie do przechowywania/utylizacji odpadów chemicznych (Formalina)</td></tr></tbody></table>

wzmocniony nadzór nad wścieklizną za pomocą bezpośredniego szybkiego testu immunohistochemicznego

Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test

Nadzór laboratoryjny jest integralną częścią działań związanych z zapobieganiem, kontrolą i zarządzaniem wścieklizną. Chociaż DFA jest złotym standardem w diagnostyce wścieklizny, istnieje potrzeba walidacji dodatkowych technik diagnostycznych w celu poprawy nadzoru nad wścieklizną, szczególnie w krajach rozwijających się. W tym miejscu przedstawiamy standardowy protokół dla DRIT jako alternatywnej, laboratoryjnej lub terenowej opcji testowania, która wykorzystuje mikroskopię świetlną w porównaniu z DFA. Wyciski dotykowe tkanki mózgowej pobranej od podejrzanych zwierząt są utrwalane w 10% buforowanej formalinie. DRIT wykorzystuje przeciwciała monoklonalne lub poliklonalne specyficzne dla wirusa wścieklizny (sprzężone z biotyną), enzym peroksydazę streptawidyny i reporter chromogenu (taki jak acetylo-3-amino-9-etylokarbazol) do wykrywania inkluzji wirusa w zakażonej tkance. W ciągu około 1 godziny próbka tkanki mózgowej może zostać przetestowana i zinterpretowana przez DRIT. Ocena podejrzanych mózgów zwierząt testowanych z różnych gatunków w Ameryce Północnej, Azji, Afryce i Europie wykazała wysoką czułość i swoistość DRIT zbliżającą się do 100% z wynikami w porównaniu z DFA. Od 2005 r. program Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych ds. Dzikiej Przyrody (USDA WS) prowadzi na dużą skalę wzmocnione działania w zakresie nadzoru nad wścieklizną przy użyciu DRIT do przetestowania >94 000 próbek pobranych od dzikich zwierząt w strategicznych obszarach zarządzania wścieklizną. DRIT zapewnia potężne, ekonomiczne narzędzie do diagnozowania wścieklizny, które może być wykorzystywane przez laborantów i biologów terenowych w celu poprawy obecnych programów nadzoru, zapobiegania i kontroli wścieklizny na całym świecie.

Pozytywne wyniki testu DRIT wykazują czerwone wewnątrzcytoplazmatyczne inkluzje wirusowe o zmiennym kształcie i wielkości (Rysunek 3) w cytoplazmie błękitnych ciał komórkowych. Inkluzje są gładkie, mają bardzo jasne brzegi i mniej intensywnie wybarwiony obszar centralny. W przypadku wykrycia inkluzji odnotowuje się intensywność oraz rozkład antygenu. Intensywność oceniana jest w skali od +4 do +1. Preparat kontrolny dodatni powinien wykazywać intensywny, rażący purpurowy blask, który określa się jako intensywność +4. Może wystąpić niewielka utrata koloru, szczególnie gdy obchodzenie się z próbką nie było optymalne (np. tkanka próbki uległa niewielkiemu rozkładowi), co powinno być oceniane jako +3. Wyraźnie matowe barwienie ocenia się jako +2 do +1; nie uznaje się go za diagnostyczne dla zakażenia wirusem wścieklizny i oznacza jako wynik nieoznaczony.
Dodatkowo, rozkład antygenu ocenia się w skali od +4 do +1, gdzie +4 oznacza rozkład antygenu składający się z licznych dużych i małych inkluzji o różnej wielkości i kształcie, występujących w każdym (lub prawie każdym) polu widzenia w preparacie z odbitki tkanki OUN. Kontrola dodatnia zazwyczaj wykazuje rozkład antygenu +4. Rozkład antygenu +3 przypisuje się w przypadku obecności inkluzji o różnych rozmiarach w większości, ale nie we wszystkich polach widzenia. Jeśli inkluzje znajdują się w 10%–50% pól mikroskopowych, przypisuje się rozkład antygenu +2. Gdy inkluzje występują w &lt;10% pól mikroskopowych, przypisuje się rozkład antygenu +1.
Większość tkanek OUN z obecnym wirusem wścieklizny wykazuje typowe inkluzje wirusowe oceniane na natężenie i rozkład antygenu +3 lub +4. Jeśli wyniki wskazują na natężenie +2 lub +1 lub rozkład antygenu +2 lub +1, próbkę uznaje się za „niejednoznaczną” i wymagane jest powtórne badanie. Jeśli ta sama próbka ponownie wykaże niejednoznaczny wynik testu, powinna zostać wysłana do laboratorium referencyjnego w celu wykonania DFA lub pokrewnych testów potwierdzających.
Próbkę testową z zastosowaniem metody DRIT uznaje się za negatywną pod kątem antygenów wirusa wścieklizny, jeśli po przeskanowaniu preparatu zawierającego tkankę OUN przy powiększeniu 20X lub większym nie zostanie wykrytych typowych inkluzji wirusowych (Rycina 4). Próbki negatywne wykazują niebieskawe ciała komórkowe z niewielkim lub brakiem nieswoistego barwienia.
<img alt="Proces barwienia histologicznego z wykorzystaniem wielu odczynników, przygotowanie tkanek, sprzęt eksperymentalny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przygotowanie 10 kuwet do barwienia preparatów z odczynnikami do badań. Naczynia są oznakowane nazwami odczynników w kolejności wymaganej do realizacji protokołu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Przygotowanie płytek hodowlanych do testów leków w eksperymencie laboratoryjnym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Prosta komora wilgotnościowa wykonana z mokrego ręcznika papierowego i płytek do hodowli komórkowej.  Prosta komora wilgotności z wykorzystaniem mokrego ręcznika papierowego i płytek do hodowli komórkowych umożliwia zastosowanie w warunkach terenowych.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy barwionych przekrojów tkanki komórkowej wykazujący zróżnicowaną gęstość do analizy histologicznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Reprezentatywne preparaty wykazujące wclusions wirusa wścieklizny z natężeniem +4 i rozkładem antygenu +4. (A i B) wykazują obecność inkluzji wirusa wścieklizny przy powiększeniu 20x. (C i D) wykazują obecność wtrącek wirusa wścieklizny przy powiększeniu 40x. Paski skali = 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy, analiza tkanki nerwowej, pokazuje rozkład komórkowy, czteropanelowe preparaty histologiczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rycina 4: Reprezentatywne preparaty próbek negatywnych bez wtrąceń wirusa wścieklizny. (A i B) przedstawiają próbki ujemne pod kątem wtrąceń wirusa wścieklizny przy powiększeniu 20x. (C i D) pokazują próbki negatywne pod kątem inkluzji wirusa wścieklizny przy powiększeniu 40x. Paski skali = 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig4large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Konfiguracje mobilnych laboratoriów do badań środowiskowych w warunkach terenowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Reprezentatywne fotografie urządzeń do testów DRIT wykorzystywanych przez USDA WS. (A) Mobilny punkt testowy w zamkniętej przyczepie transportowej. (B) Pojazd kempingowy przystosowany do testów DRIT. (C) placówka badawcza DRIT we współpracy z laboratorium uniwersyteckim. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig5large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Bezpośredni szybki test immunohistochemiczny (DRIT) stanowi uznaną przez Światową Organizację Zdrowia Zwierząt i Światową Organizację Zdrowia (OIE/WHO) alternatywę dla testu na przeciwciała fluorescencyjne (DFA) do diagnozowania wścieklizny. Test ten pozwala na zastosowania w terenie, które można wykonać w ciągu około 1 godziny po pobraniu wycisków mózgu za pomocą mikroskopii świetlnej.

Wzmocniony nadzór nad wścieklizną za pomocą bezpośredniego szybkiego testu immunohistochemicznego

Laboratory-based surveillance is integral for rabies prevention, control and management efforts. While the DFA is the gold standard for rabies diagnosis, ...

DRIT jest istotny, ponieważ zapewnia test diagnostyczny wścieklizny, który można wykonać w zdecentralizowanych laboratoriach w terenie lub w obszarach bez rutynowego dostępu do mikroskopii elektronowej. Główną zaletą DRIT jest to, że wykorzystuje tylko prostą mikroskopię świetlną, a wyniki można uzyskać w ciągu około godziny. DRIT zapewnia potężne, ekonomiczne narzędzie do diagnozowania wścieklizny, które może być wykorzystywane przez laboratoriów i biologów terenowych do poprawy programów nadzoru, zapobiegania i kontroli wścieklizny na całym świecie.W przypadku zwierząt, które są świeżo zebrane lub zostały rozmrożone do temperatury otoczenia, należy ułożyć zwierzę na wznak na płaskiej powierzchni z lekko obróconym kręgosłupem szyjnym w kierunku badającego. Badanie palpacyjne w celu identyfikacji stawu atlantyczno-potylicznego po stronie bocznej kręgosłupa szyjnego. Za pomocą ostrza skalpela wykonaj nacięcie na poziomie stawu szczytowo-potylicznego w części brzusznej, przecinając wszystkie warstwy mięśni i tkanek miękkich, w tym tchawicę i przełyk.Kontynuuj, aż do zbliżenia przedniej części kręgów kręgosłupa szyjnego. Następnie przesuń głowę zwierzęcia do przedłużenia zakresu końcowego, aż pień mózgu będzie widoczny. Użyj ostrza skalpela, aby usunąć wszystkie widoczne tkanki pnia mózgu i ośrodkowego układu nerwowego do pobranej próbki.Umieść próbki pnia mózgu w nietłukącym się pojemniku i odpowiednio oznacz. Najpierw należy ustawić naczynia do barwienia, które są wystarczająco głębokie, aby umożliwić całkowite zanurzenie szkiełka z próbką. Napełnij naczynie 10% formaliną buforowaną fosforanem.Napełnij naczynia drugie, cztery i pięć TPBS. Napełnij naczynie trzecie 3% nadtlenkiem wodoru. Następnie napełnij naczynia szóste, ósme, dziewiąte i dziesiąte wodą destylowaną lub dejonizowaną.Napełnij naczynie siódme preparatem hematoksyliny Gilla numer dwa, rozcieńczonym w stosunku 1:1 wodą destylowaną. Aby przygotować roztwór podstawowy amino-etylo-karbazolu, za pomocą szklanej pipety umieścić pięć mililitrów N, N-dimetyloformamidu w szklanym pojemniku. Dodać 120 mg tabletki 3-amino-9-etylokarbazolu do szklanego pojemnika i wstrząsać aż do całkowitego rozpuszczenia.Aby przygotować robocze rozcieńczenie AEC, dodaj siedem mililitrów buforu octanowego do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Za pomocą szklanej pipety dodaj 0,5 mililitra roztworu podstawowego AEC do probówki wirówkowej. Dodaj 0,75 mililitra 3% roztworu nadtlenku wodoru.Użyj 10-mililitrowej strzykawki z filtrem strzykawkowym 0,45 mikrometra, aby przefiltrować roztwór. Na początek użyj wodoodpornego markera permanentnego, odpornego na rozmazywanie, aby oznaczyć szklane szkiełka mikroskopowe unikalnym numerem dla każdej próbki. Użyj ostrza skalpela, aby usunąć pień mózgu z pojemnika i umieść go na ręczniku papierowym.Użyj drugiego ręcznika papierowego, aby delikatnie zetrzeć nadmiar płynu, krwi lub sierści, aby odsłonić tylko tkankę pnia mózgu. W razie potrzeby przekrój tkankę pnia mózgu, aby odsłonić przekrój. Bardzo delikatnie dotykaj szkiełka mikroskopowego w kilku punktach pnia mózgu bez ruchu bocznego, aby umożliwić przeniesienie wielu obszarów pnia mózgu na szkiełko, upewniając się, że tylko jedna lub dwie warstwy komórek są przenoszone z tkanki mózgowej na szkiełko.Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przez około pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie zanurz szkiełka w 10% buforowanej formalinie w naczyniu pierwszym na 10 minut. Wyjmij szkiełka z formaliny i zanurz je w roztworze TPBS w drugim naczyniu.Zanurz wypłukane szkiełka w roztworze nadtlenku wodoru zawartym w naczyniu trzecim na 10 minut. Następnie wyjmij szkiełka z nadtlenku wodoru i zanurz je w świeżym TPBS zawartym w naczyniu czwartym. Po usunięciu nadmiaru nadtlenku wodoru umieść szkiełka w świeżym TPBS zawartym w naczyniu piątym.Weź szkiełka pojedynczo z talerza piątego, strząśnij i osusz nadmiar buforu, a następnie umieść szkiełko na zwilżonym ręczniku papierowym na stole laboratoryjnym. Po przeniesieniu wszystkich szkiełek należy użyć zakraplacza lub pipety, aby na każde szkiełko wrzucić wystarczającą ilość pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko wirusowi wścieklizny, aby pokryć tkankę OUN. Przykryj szkiełka płytkami studzienkowymi lub inną prostą pokrywą, aby utworzyć komorę wilgotnościową i inkubuj szkiełka w temperaturze pokojowej w komorze przez 10 minut.Następnie wyjmij szkiełka z komory wilgotnościowej, strząśnij i osusz nadmiar koniugatu i zanurz je w TPBS w naczyniu piątym. Pracując z jednym szkiełkiem na raz, wyjmij szkiełko z TPBS i użyj zakraplacza lub pipety, aby upuścić wystarczającą ilość kompleksu peroksydazy streptawidyny, aby pokryć tkankę OUN. Po przykryciu wszystkich szkiełek inkubuj je w komorze wilgotnościowej przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Następnie wyjmij szkiełka z komory wilgotnościowej, strząśnij i zetrzyj nadmiar kompleksu, a następnie zanurz je w TPBS znajdującym się w naczyniu piątym. Pracując z jednym szkiełkiem na raz, wyjmij szkiełko z TPBS i użyj pipety, aby upuścić wystarczającą ilość roztworu roboczego AEC, aby pokryć tkankę OUN. Inkubować szkiełka w komorze wilgotnościowej przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Następnie zanurz szkiełka w wodzie destylowanej znajdującej się w naczyniu szóstym i umieść je w przeciwbarwieniu hematoksyliny Gilla w naczyniu siódmym na dwie minuty. Natychmiast zanurz wszystkie szkiełka w wodzie destylowanej w naczyniu ósmym. Powtórz to dwukrotnie, używając słodkiej wody w naczyniach 9 i 10 na każde mycie.Pracując pojedynczo, wyjmij szkiełko z wody, strząśnij i zetrzyj nadmiar wody. Użyj rozpuszczalnego w wodzie medium montażowego, aby przymocować szkiełko nakrywkowe do szkiełka. Następnie użyj mikroskopu świetlnego z obiektywem 20X, aby wyświetlić slajdy.Pozytywne wyniki DRIT wskazują na czerwone wewnątrzcytoplazmatyczne inkluzje wirusowe, które mogą różnić się kształtem i rozmiarem w cytoplazmie niebieskawych ciał komórkowych. Inkluzje wydają się gładkie, z bardzo jasnymi marginesami i mniej intensywnie zabarwionym obszarem centralnym. Rozkład antygenu jest stopniowany od plus cztery do plus jeden, gdzie plus cztery reprezentuje rozkład antygenu składający się z obfitości dużych i małych inkluzji różniących się wielkością i kształtem i obecnych w każdym polu widzenia w wycisku dotyku tkanki OUN.Rozkład plus trzy jest przypisywany, gdy w większości, ale nie we wszystkich polach widzenia, występują inkluzje o różnych rozmiarach. Jeśli inkluzje zostaną znalezione w 10 do 50% pól mikroskopowych, przypisywana jest dystrybucja antygenu plus dwa, podczas gdy plus jeden jest przypisywany, gdy inkluzje zostaną znalezione w mniej niż 10% pól. Większość tkanek OUN z obecnym wirusem wścieklizny wykazuje typowe inkluzje wirusowe ocenione jako plus trzy lub plus cztery intensywność i rozkład antygenu.Jeśli wyniki wskazują na plus jeden lub plus dwa w intensywności lub rozkładzie antygenu, próbkę uznaje się za nieokreśloną i uzasadnione jest powtórzenie badania. Próbkę testową przy użyciu DRIT uznaje się za ujemną na obecność antygenów wirusa wścieklizny po zeskanowaniu szkiełka zawierającego tkankę OUN w powiększeniu 200X lub większym i nie wykryciu typowych inkluzji wirusa. Próbki ujemne wykazują niebieskawe ciała komórkowe z niewielkim lub żadnym znanym specyficznym zabarwieniem.Każda osoba przeprowadzająca badania diagnostyczne w kierunku wścieklizny powinna otrzymać standardowe szczepienia przedekspozycyjne przeciwko wściekliźnie oraz poddawać się regularnej ocenie serologicznej przeciwciał. Osoby nieobjęte zakazem wstępu na tereny, w których prowadzone są takie prace. Oprócz środków ostrożności podjętych podczas pracy z żywym wirusem wścieklizny, kilka odczynników używanych w teście jest niebezpiecznych.Zapoznaj się z kartami charakterystyki dla każdego odczynnika.

enhanced-rabies-surveillance-using-direct-rapid-immunohistochemical

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje barwienie immunohistochemiczne do wykrywania antygenu wirusa wścieklizny w zakażonej tkance mózgowej myszy. Proces ten obejmuje deparatynizację i leczenie alkoholem, a następnie leczenie proteolityczne w celu zwiększenia dostępności antygenu. Barwienie immunohistochemiczne ujawnia czerwone osady, potwierdzające obecność antygenów wścieklizny w skrawku tkankowym.

Barwienie immunohistochemiczne do wykrywania antygenów wirusa wścieklizny

Tutaj opisujemy pośrednie wychwytywanie immunologiczne metodą ELISA w celu określenia zawartości immunogennej glikoproteiny w szczepionkach przeciwko wściekliźnie. Ten test wykorzystuje neutralizujące przeciwciało monoklonalne (mAb-D1) rozpoznające trimery glikoproteiny. Jest to alternatywa dla testu NIH in vivo w celu śledzenia spójności siły działania szczepionki podczas produkcji.

Test ELISA in vitro do oceny siły działania szczepionki przeciwko wściekliźnie

Przedstawiamy kompletny protokół do pośmiertnej diagnozy wścieklizny zwierząt w warunkach polowych przy użyciu szybkiego immunochromatograficznego testu diagnostycznego (RIDT), od pobrania próbki z biopsji mózgu do ostatecznej interpretacji. Opisujemy również dalsze zastosowania urządzenia do analizy molekularnej i genotypowania wirusów.

Terenowy pośmiertny szybki immunochromatograficzny test diagnostyczny wścieklizny do zastosowań o ograniczonych zasobach z dalszymi zastosowaniami molekularnymi

Tutaj prezentujemy protokół testu immunohistochemicznego do wykrywania antygenu wirusa wścieklizny jako alternatywny test diagnostyczny dla tkanek utrwalonych w formalinie.

Test immunohistochemiczny do wykrywania antygenu wirusa Lyssa z tkanek utrwalonych formaliną

Ten protokół przedstawia oparte na qRT-PCR podejście do określania liczby kopii genu nukleoproteiny (N) wirusa wścieklizny w różnych strukturach anatomicznych mózgu bydlęcego za pomocą transkrypcji in vitro.

Kwantyfikacja wirusa wścieklizny w różnych strukturach mózgu bydła

Celem tego manuskryptu jest zbadanie zastosowania testu na pośrednie przeciwciała fluorescencyjne przeciwko wściekliźnie do wykrywania przeciwciał IgG i IgM specyficznych dla wścieklizny.

Wykrywanie przeciwciał IgG i IgM przeciwko wściekliźnie za pomocą pośredniego testu fluorescencyjnego na przeciwciała przeciwko wściekliźnie

Protokół ten demonstruje test reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji i polimerazy (RT-PCR) pan-lizawirusa LN34 w czasie rzeczywistym od pobierania tkanek do interpretacji wyników, w tym aktualizacje sekwencji primerów i formuł poprawiających wydajność testu dla niektórych lizawirusów i zalegowców niezwiązanych z wścieklizną. Demonstrujemy także konfigurację testu dla multipleksowanego formatu LN34 z pojedynczym dołkiem (LN34M).

Diagnostyka pośmiertna wścieklizny u zwierząt za pomocą zaktualizowanego, multipleksowanego testu LN34 w czasie rzeczywistym reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji i polimerazy

Niniejszy protokół opisuje prostą metodę opartą na zastosowaniu taśmy klejącej do pobierania próbek z powierzchni pomidorów oraz innych świeżych produktów rolnych, a następnie szybką detekcję całych komórek Salmonella przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Połączenie pobierania próbek za pomocą taśmy klejącej i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu szybkiego wykrywania Salmonella na świeżych produktach rolnych

Zwalidowano i rozszerzono metodę konserwacji, detekcji i sekwencjonowania RNA wirusów grypy ptasiej, wykorzystując naturalne próbki odchodów ptaków. Technika ta eliminuje konieczność zachowania łańcucha chłodniczego oraz obchodzenia się z zakaźnymi wirusami i może być zastosowana w wysokoprzepustowym układzie 96-dołkowym.

Nadzór nad grypą ptaków z wykorzystaniem kart FTA: rozwiązanie problemów związanych z metodami terenowymi, bezpieczeństwem biologicznym i transportem

Wykonywanie testów hodowli komórkowych w celu zbadania adhezji i inwazji bakterii w warunkach tlenowych jest zazwyczaj niereprezentatywne dla środowiska in vivo. Model pionowej komory dyfuzyjnej umożliwia badanie interakcji ludzkiego patogenu Campylobacter jejuni z komórkami nabłonka jelitowego w warunkach bardziej zbliżonych do in vivo, co skutkuje zwiększoną inwazją bakterii.

Inwazja bakterii jelitowych na komórki nabłonka jelitowego in vitro jest znacznie zwiększona dzięki pionowemu modelowi komory dyfuzyjnej

Poznaj bezpośredni szybki test immunohistochemiczny (DRIT) do diagnostyki wścieklizny w warunkach polowych. Ta metoda wykorzystuje zwykłą mikroskopię świetlną i dostarcza wyniki w około godzinę.

Wzmocniony nadzór nad wścieklizną za pomocą bezpośredniego szybkiego testu immunohistochemicznego

Przeglądaj więcej filmów