Bezenzymatyczna metoda izolacji i namnażania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej
16 grudnia 2019
Ten protokół zapewnia bezenzymatyczną metodę izolowania mezenchymalnych komórek macierzystych z próbek abdominoplastyki i lipoaspiratu przy użyciu metody eksplantatu. Brak ostrych enzymów lub etapów wirowania zapewnia klinicznie istotne komórki macierzyste, które można wykorzystać do badań in vitro lub przenieść z powrotem do kliniki.
Protokół ten zapewnia prosty, opłacalny sposób izolowania ASC bez użycia ostrych enzymów lub etapów wirowania, które mogą zmienić fenotyp i zachowanie komórki. Brak ostrych etapów daje mniej zmanipulowanych komórek niż te wyizolowane za pomocą enzymów i wirowania, minimalizując pytania, czy obserwacje eksperymentalne są artefaktem metody izolacji. Ta metoda eksplantacji może generować istotne klinicznie ASC, które można wprowadzić do pacjenta w celu leczenia różnych chorób lub rozszerzenia w ciągu życia, zapewniając zastosowania badawcze.
Trudno jest w pełni wyjaśnić metodę mielenia słowami. Demonstracja wizualna może posłużyć innym naukowcom do kłopotów związanych z nauką samodzielnego rozbijania tkanki. Podobne metody eksplantacji można zastosować do izolacji innych populacji MSC, takich jak te z tkanek pępowinowych.
Aby zmielić próbki tkanek po plastyce brzucha, najpierw przenieś tkankę na pokrywę sterylnej 100-milimetrowej płytki. Następnie użyj sterylnej igły, aby przytrzymać kawałek tkanki na miejscu i użyj sterylnego skalpela, aby pociąć tkankę na mniej niż milimetrowe kawałki. Przenieś tkankę do świeżej probówki i odwróć lub potrząśnij próbką pięć do sześciu razy, aby zapewnić wymieszanie wszystkich warstw.
Następnie za pomocą sterylnej szpatułki przenieś od 2,5 do pięciu mililitrów tkanki na 100-milimetrową płytkę do hodowli tkankowej poddanej działaniu plazmy próżniowej. Zmierzyć objętość próbki, wlewając ją do świeżej probówki wirówkowej. Następnie dodaj równoważną objętość pożywki do hodowli tkankowych do płytki i delikatnie zamieszaj płytkę, aby wymieszać zawartość.
Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w pięcioprocentowym dwutlenku węgla, aż na podstawie płytki pojawi się wystarczająca liczba komórek. Po odnotowaniu wystarczającej liczby komórek na płytce lub po siedmiu dniach, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej, należy usunąć wszystkie pozostałe kawałki tkanki. Następnie hoduj ASC w pożywkach do hodowli tkankowych, aż osiągną 70% zbiegu lub aż klastry staną się gęste, w którym to momencie komórki mają zostać pasażowane.
Delikatnie spłucz płytkę solą fizjologiczną buforowaną 1X fosforanem. Aby wytrypsynizować przylegające komórki, odessać sól fizjologiczną buforowaną fosforanem, dodać jeden mililitr trypsyny uzupełnionej 0,25% EDTA do każdej płytki i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Dodaj niewielką ilość pożywki do płytki, aby dezaktywować trypsynę.
Następnie delikatnie odpipetować pożywkę trypsynę od góry płytki w dół, usuwając wszelkie słabo przyczepione komórki z płytki. Aby zasiać komórki, najpierw dodaj pożywkę do płytki. Następnie dodaj komórki kroplami, a następnie zakręć płytką, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie na płytce.
Po trzech pasażach przejdź do cytometrii przepływowej i testów różnicowania. Po trzech pasażach stwierdzono, że wyizolowane ASC z próbek lipoaspiratu i abdominoplastyki mają morfologię i fenotyp MSC, podobny do izolowanych ASC po trawieniu enzymatycznym. Podobnie jak inne MSC, izolowane eksplantatycznie ASC są ujemne dla CD45 i dodatnie dla CD73, CD90 i CD105.
Podczas mielenia tkanki powierzchnia każdego kawałka musi być wystarczająco duża, aby ASC mogły wydostać się z tkanki. Są to podstawowe komórki macierzyste, które mogą być wykorzystywane do szerokiego zakresu zastosowań. Wyizolowane ASC mogą być używane do dowolnego dalszego zastosowania, in vivo lub in vitro.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę bezużycia enzymów do izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzenia tłuszczowego (ASCs) z próbek pobranych podczas abdominoplastyki i liposukcji z wykorzystaniem techniki eksplantacji. Podejście to minimalizuje manipulację komórkami, zapewniając uzyskanie klinicznie istotnych komórek macierzystych odpowiednich do różnorodnych zastosowań.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórek macierzystych
- Medycyna regeneracyjna
- Techniki izolacji komórek
Wstęp
- Tradycyjne metody izolacji ASC często wymagają stosowania agresywnych enzymów i wirowania.
- Metody te mogą zmieniać fenotyp i zachowanie komórek.
- Metoda eksplantacyjna stanowi łagodniejszą alternatywę.
- Demonstracje wizualne mogą pomóc w zrozumieniu procesu rozdrabniania tkanki.
Cel badania
- Opracowanie kosztownej i prostej metody izolacji ASC.
- Zmniejszenie ryzyka wystąpienia artefaktów w obserwacjach eksperymentalnych spowodowanych drastycznymi technikami izolacji.
- Pozyskanie klinicznie istotnych ASC do zastosowań terapeutycznych.
Zastosowane metody
- Posiekane tkanki z abdominoplastyki hoduje się na płytce do hodowli tkanek.
- Komórki inkubuje się w temperaturze 37°C w atmosferze CO2.
- Po osiągnięciu wystarczającego wzrostu komórek usuwa się pozostałe fragmenty tkanki.
- Komórki poddawane są pasażowaniu oraz charakterystyce pod kątem markerów komórek macierzystych.
Główne wyniki
- Wyizolowane ASC wykazują morfologię i fenotyp podobne do komórek uzyskanych za pomocą trawienia enzymatycznego.
- ASCs wyizolowane metodą eksplantacyjną są negatywne pod kątem CD45 i pozytywne pod kątem CD73, CD90 oraz CD105.
- Metoda ta pozwala na uzyskanie komórek poddanych mniejszej liczbie manipulacji, co zwiększa wiarygodność eksperymentalną.
- ASCs mogą być wykorzystane w różnorodnych zastosowaniach analitycznych, zarówno in vivo, jak i in vitro.
Wnioski
- Metoda eksplantacyjna stanowi skuteczna alternatywę dla izolacji ASC.
- Technika ta lepiej zachowuje charakterystykę komórek niż metody tradycyjne.
- Izolowane ASC mają szeroki potencjał w zastosowaniach badawczych i klinicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Ta metoda izolacji bez użycia enzymów rozwiązuje kluczowy problem w medycynie regeneracyjnej: pozyskiwanie klinicznie istotnych mezenchymalnych komórek macierzystych bez wprowadzania artefaktów wynikających z agresywnej obróbki enzymatycznej lub mechanicznej. Dzięki zachowaniu natywnego fenotypu i funkcji komórek, podejście to zwiększa wiarygodność prognostyczną w późniejszych zastosowaniach, takich jak modelowanie chorób i przesiew terapeutyczny. Metoda ta wspiera procesy wczesnego odkrywania, w których minimalizacja ryzyka biologicznego i walidacja celów zależą od wiarygodnych, poddanych minimalnej manipulacji źródeł komórkowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych przy użyciu mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej z zachowaną wielopotencjalnością i profilami markerów powierzchniowych.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza zmienność wyników eksperymentalnych poprzez wyeliminowanie zmian fenotypowych indukowanych przez enzymy.
- Wartość prognostyczna: Wspiera biologiczne ograniczanie ryzyka poprzez generowanie komórek poddanych mniejszej manipulacji do testów walidacji celu.
Przesiewanie i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na otrzymanie mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej, odpowiednich do standaryzowanych testów in vitro wymagających spójnych fenotypów mezenchymalnych.
- Wartość operacyjna: Ułatwia przygotowanie testów poprzez ekspansję opartą na eksplantach, która pozwala zachować pozytywną ekspresję markerów CD73, CD90 i CD105.
- Skalowalność: Umożliwia reprodukowalną produkcję komórek do badań przesiewowych związków oraz analiz mechanistycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Zapewnia klinicznie istotne źródło komórek zgodne z zastosowaniami w medycynie regeneracyjnej.
- Model przedkliniczny: Umożliwia generowanie mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzenia tłuszczowego do systemów związanych z chorobami bez narażania ich na działanie enzymów ksenogenicznych.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Ogranicza obawy dotyczące artefaktów izolacji wpływających na ocenę różnicowania lub funkcji immunomodulacyjnych.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania – od wczesnej izolacji komórek macierzystych po walidację przedkliniczną, wspierając przepływy pracy, w których integralność źródła komórek wpływa na wiarygodność danych oraz decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez, dostarczając mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzenia tłuszczowego o morfologii i fenotypie zbliżonym do naturalnego.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowanych, gotowych do ekspansji komórek dla platform analitycznych wymagających charakterystyki mezenchymalnych komórek zrębowych.
- Analityka: Umożliwia przeprowadzenie cytometrii przepływowej oraz testów różnicowania po trzech pasażach w celu potwierdzenia tożsamości komórek macierzystych.
- Badania translacyjne: Łączy proces izolacji z potencjałem terapeutycznym poprzez zachowanie klinicznie istotnych właściwości komórek.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku, bezenzymową platformę do produkcji mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzenia tłuszczowego w różnych projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez minimalizację artefaktów indukowanych izolacją w eksperymentach z komórkami macierzystymi.
- Wartość operacyjna: Oferuje kostu-efektywny, prosty protokół, który nie wymaga stosowania drogich enzymów ani wirowania.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji o kontynuacji lub zaprzestaniu badań (go/no-go) dzięki zwiększonej wiarygodności wyników testów komórkowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera rozwój projektów z uwzględnieniem ryzyka poprzez dostarczanie wiarygodnych mezenchymalnych komórek macierzystych do oceny przedklinicznej.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga zastosowania techniki aseptycznej oraz podstawowego sprzętu do hodowli tkanek w celu mechanicznego rozdrobnienia i hodowli eksplantów.
- Wymaga użycia sterylnych narzędzi, w tym skalpeli, igieł i szpatułek, do przygotowania tkanki.
- Konieczne jest zapewnienie standaryzowanych warunków inkubacji w temperaturze 37°C przy 5% CO2 dla optymalnego wzrostu komórek.
- Obejmuje manualne pasażowanie w zależności od stopnia konfluencji lub gęstości skupisk po początkowym usunięciu tkanki.
- Opiera się na cytometrii przepływowej i testach różnicowania w celu potwierdzenia fenotypu po izolacji.
