Bezenzymatyczna metoda izolacji i namnażania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej
December 16th, 2019
Ten protokół zapewnia bezenzymatyczną metodę izolowania mezenchymalnych komórek macierzystych z próbek abdominoplastyki i lipoaspiratu przy użyciu metody eksplantatu. Brak ostrych enzymów lub etapów wirowania zapewnia klinicznie istotne komórki macierzyste, które można wykorzystać do badań in vitro lub przenieść z powrotem do kliniki.
Protokół ten zapewnia prosty, opłacalny sposób izolowania ASC bez użycia ostrych enzymów lub etapów wirowania, które mogą zmienić fenotyp i zachowanie komórki. Brak ostrych etapów daje mniej zmanipulowanych komórek niż te wyizolowane za pomocą enzymów i wirowania, minimalizując pytania, czy obserwacje eksperymentalne są artefaktem metody izolacji. Ta metoda eksplantacji może generować istotne klinicznie ASC, które można wprowadzić do pacjenta w celu leczenia różnych chorób lub rozszerzenia w ciągu życia, zapewniając zastosowania badawcze.
Trudno jest w pełni wyjaśnić metodę mielenia słowami. Demonstracja wizualna może posłużyć innym naukowcom do kłopotów związanych z nauką samodzielnego rozbijania tkanki. Podobne metody eksplantacji można zastosować do izolacji innych populacji MSC, takich jak te z tkanek pępowinowych.
Aby zmielić próbki tkanek po plastyce brzucha, najpierw przenieś tkankę na pokrywę sterylnej 100-milimetrowej płytki. Następnie użyj sterylnej igły, aby przytrzymać kawałek tkanki na miejscu i użyj sterylnego skalpela, aby pociąć tkankę na mniej niż milimetrowe kawałki. Przenieś tkankę do świeżej probówki i odwróć lub potrząśnij próbką pięć do sześciu razy, aby zapewnić wymieszanie wszystkich warstw.
Następnie za pomocą sterylnej szpatułki przenieś od 2,5 do pięciu mililitrów tkanki na 100-milimetrową płytkę do hodowli tkankowej poddanej działaniu plazmy próżniowej. Zmierzyć objętość próbki, wlewając ją do świeżej probówki wirówkowej. Następnie dodaj równoważną objętość pożywki do hodowli tkankowych do płytki i delikatnie zamieszaj płytkę, aby wymieszać zawartość.
Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w pięcioprocentowym dwutlenku węgla, aż na podstawie płytki pojawi się wystarczająca liczba komórek. Po odnotowaniu wystarczającej liczby komórek na płytce lub po siedmiu dniach, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej, należy usunąć wszystkie pozostałe kawałki tkanki. Następnie hoduj ASC w pożywkach do hodowli tkankowych, aż osiągną 70% zbiegu lub aż klastry staną się gęste, w którym to momencie komórki mają zostać pasażowane.
Delikatnie spłucz płytkę solą fizjologiczną buforowaną 1X fosforanem. Aby wytrypsynizować przylegające komórki, odessać sól fizjologiczną buforowaną fosforanem, dodać jeden mililitr trypsyny uzupełnionej 0,25% EDTA do każdej płytki i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Dodaj niewielką ilość pożywki do płytki, aby dezaktywować trypsynę.
Następnie delikatnie odpipetować pożywkę trypsynę od góry płytki w dół, usuwając wszelkie słabo przyczepione komórki z płytki. Aby zasiać komórki, najpierw dodaj pożywkę do płytki. Następnie dodaj komórki kroplami, a następnie zakręć płytką, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie na płytce.
Po trzech pasażach przejdź do cytometrii przepływowej i testów różnicowania. Po trzech pasażach stwierdzono, że wyizolowane ASC z próbek lipoaspiratu i abdominoplastyki mają morfologię i fenotyp MSC, podobny do izolowanych ASC po trawieniu enzymatycznym. Podobnie jak inne MSC, izolowane eksplantatycznie ASC są ujemne dla CD45 i dodatnie dla CD73, CD90 i CD105.
Podczas mielenia tkanki powierzchnia każdego kawałka musi być wystarczająco duża, aby ASC mogły wydostać się z tkanki. Są to podstawowe komórki macierzyste, które mogą być wykorzystywane do szerokiego zakresu zastosowań. Wyizolowane ASC mogą być używane do dowolnego dalszego zastosowania, in vivo lub in vitro.
Przegląd
Ten protokół opisuje enzymową metodę izolacji komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASCs) z próbek pochodzących z plastyki brzucha i lipoaspirate za pomocą techniki eksplantacji. To podejście minimalizuje manipulację komórkami, zapewniając klinicznie istotne komórki macierzyste odpowiednie do różnych zastosowań.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórek macierzystych
- Medycyna regeneracyjna
- Techniki izolacji komórek
Tło
- Tradycyjne metody izolacji ASC często wymagają użycia mocnych enzymów i wirowania.
- Te metody mogą zmieniać fenotyp i zachowanie komórek.
- Metoda eksplantacji zapewnia delikatniejszą alternatywę.
- Demonstracje wizualne mogą pomóc w zrozumieniu procesu miękkiej tkanki.
Cel badania
- Opracowanie opłacalnej i prostej metody izolacji ASC.
- Zmniejszenie ryzyka powstania artefaktów w obserwacjach eksperymentalnych wynikających z drastycznych technik izolacji.
- Generowanie klinicznie istotnych ASC do zastosowań terapeutycznych.
Zastosowane metody
- Miękka tkanina pochodząca z plastyki brzucha jest hodowana na płytce hodowlania tkanek.
- Komórki są inkubowane w temperaturze 37°C w środowisku CO2.
- Po wystarczająco dużym wzroście komórek, pozostałe kawałki tkanki są usuwane.
- Komórki są przeszczepane i charakteryzowane pod kątem markerów komórek macierzystych.
Główne wyniki
- Izolowane ASC wykazują morfologię i fenotyp podobny do tych uzyskiwanych przez enzymatyczną digestię.
- Izolowane eksplantacyjnie ASC są negatywne dla CD45 i pozytywne dla CD73, CD90 i CD105.
- Metoda daje mniej manipulowanych komórek, co zwiększa wiarygodność eksperymentu.
- ASC mogą być wykorzystywane do różnych dalszych zastosowań, zarówno in vivo jak i in vitro.
Wnioski
- Metoda eksplantacji jest wykonalną alternatywą do izolacji ASC.
- Ta technika lepiej zachowuje cechy komórek niż tradycyjne metody.
- Izolowane ASC mają szeroki potencjał do zastosowań badawczych i klinicznych.
