Name: Przetwarzanie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i dopasowanej krwi do makrofagów pęcherzykowych i immunofenotypowania limfocytów T CD4+ oraz oceny rezerwuaru HIV (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Poznaj metodę izolacji makrofagów pęcherzykowych i limfocytów T CD4+ z płynu BAL oraz krwi do oceny rezerwuaru HIV w płucach. Technika ta umożliwia badanie komórek odpornościowych w kontekście infekcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować swoim fundatorom: Kanadyjskim Instytutom Badań nad Zdrowiem (CIHR) (grant #153082 dla CC, MAJ, NC); Réseau SIDA et maladies infectieuses du Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S), którzy przyznali fundusze CC i MAJ oraz Wydziałowi Medycyny Uniwersytetu McGill, który przyznał fundusze CC. Badanie to było również częściowo wspierane przez Canadian Institutes of Health Research (CIHR) finansowany przez Canadian HIV Cure Enterprise (CanCURE) Team Grant HB2 – 164064 dla MAJ, CC i NC. MAJ posiada CIHR Canada Research Chair poziom 2 w dziedzinie immunowirusologii, a CC i NC posiadają odpowiednio wynagrodzenie badawcze FRQ-S Junior 1 i Junior 2. ET posiada tytuł magistra stypendium RI-MUHC.
Ponadto, autorzy pragną podziękować Josée Girouard i całemu personelowi klinicznemu zaangażowanemu w koordynację i pobieranie próbek, a także terapeutom oddechowym; Ekaterina Iourtchenko, Hélène Pagé-Veillette i Marie-Hélène Lacombe na platformie immunofenotypowania RI-MUHC; oraz dr Mariannie Orlovej za udostępnienie zdjęć mikroskopowych. Co najważniejsze, autorzy pragną podziękować wielu wolontariuszom, bez których te badania nie byłyby możliwe.

<ol><li>Chun, T. W., Fauci, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latent+reservoirs+of+HIV%3A+obstacles+to+the+eradication+of+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Latent reservoirs of HIV: obstacles to the eradication of virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 10958-10961 (1999).</li>
<li>Finzi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latent+infection+of+CD4%2B+T+cells+provides+a+mechanism+for+lifelong+persistence+of+HIV-1%2C+even+in+patients+on+effective+combination+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Latent infection of CD4+ T cells provides a mechanism for lifelong persistence of HIV-1, even in patients on effective combination therapy.</a> Nature Medicine. 5, 512-517 (1999).</li>
<li>Costiniuk, C. T., Jenabian, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lungs+as+anatomical+reservoirs+of+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">The lungs as anatomical reservoirs of HIV infection.</a> Reviews in Medical Virology. 24, 35-54 (2014).</li>
<li>Center for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cluster+of+Kaposi%27s+sarcoma+and+Pneumocystis+carinii+pneumonia+among+homosexual+male+residents+of+Los+Angeles+and+Orange+Counties%2C+California%5BTitle%5D)+AND+%22Morbidity+and+Mortality+Weekly+Report%22%5BJournal%5D)">A cluster of Kaposi's sarcoma and Pneumocystis carinii pneumonia among homosexual male residents of Los Angeles and Orange Counties, California.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 31, 305-307 (1982).</li>
<li>Fitzpatrick, M., Crothers, K., Morris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Future+directions%3A+lung+aging%2C+inflammation%2C+and+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Chest+Medicine%22%5BJournal%5D)">Future directions: lung aging, inflammation, and human immunodeficiency virus.</a> Clinics in Chest Medicine. 34, 325-331 (2013).</li>
<li>Kunisaki, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Will+expanded+ART+use+reduce+the+burden+of+HIV-associated+chronic+lung+disease%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+HIV+and+AIDS%22%5BJournal%5D)">Will expanded ART use reduce the burden of HIV-associated chronic lung disease?</a> Current Opinion in HIV and AIDS. 9, 27-33 (2014).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22WHO+%7C+Tuberculosis+and+HIV%22">WHO | Tuberculosis and HIV</a>. , https://www.who.int/hiv/topics/tb/en (2018).</li>
<li>Jambo, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+alveolar+macrophages+are+infected+preferentially+by+HIV+and+exhibit+impaired+phagocytic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Small alveolar macrophages are infected preferentially by HIV and exhibit impaired phagocytic function.</a> Mucosal Immunology. 7, 1116-1126 (2014).</li>
<li>Yeligar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+Alveolar+Macrophage+PPAR%CE%B3%2C+NADPH+Oxidases%2C+and+TGF%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Research+and+Human+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of Alveolar Macrophage PPARγ, NADPH Oxidases, and TGFβ.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 33, 1018-1026 (2017).</li>
<li>Cribbs, S. K., Lennox, J., Caliendo, A. M., Brown, L. A., Guidot, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healthy+HIV-1-infected+individuals+on+highly+active+antiretroviral+therapy+harbor+HIV-1+in+their+alveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Research+and+Human+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Healthy HIV-1-infected individuals on highly active antiretroviral therapy harbor HIV-1 in their alveolar macrophages.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 31, 64-70 (2015).</li>
<li>Holt, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+immune+and+inflammatory+cells+from+human+lung+parenchyma%3A+evaluation+of+an+enzymatic+digestion+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Extraction of immune and inflammatory cells from human lung parenchyma: evaluation of an enzymatic digestion procedure.</a> Clinical & Experimental Immunology. 66, 188-200 (1986).</li>
<li>Brenchley, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequencies+of+polyfunctional+HIV-specific+T+cells+are+associated+with+preservation+of+mucosal+CD4+T+cells+in+bronchoalveolar+lavage%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">High frequencies of polyfunctional HIV-specific T cells are associated with preservation of mucosal CD4 T cells in bronchoalveolar lavage.</a> Mucosal Immunology. 1, 49(2007).</li>
<li>Mwandumba, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis%3B+Resides+in+Nonacidified+Vacuoles+in+Endocytically+Competent+Alveolar+Macrophages+from+Patients+with+Tuberculosis+and+HIV+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis; Resides in Nonacidified Vacuoles in Endocytically Competent Alveolar Macrophages from Patients with Tuberculosis and HIV Infection.</a> The Journal of Immunology. 172, 4592(2004).</li>
<li>Gordon, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhaled+delivery+of+23-valent+pneumococcal+polysaccharide+vaccine+does+not+result+in+enhanced+pulmonary+mucosal+immunoglobulin+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Inhaled delivery of 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine does not result in enhanced pulmonary mucosal immunoglobulin responses.</a> Vaccine. 26, 5400-5406 (2008).</li>
<li>Costiniuk, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+persistence+in+mucosal+CD4%2B+T+cells+within+the+lungs+of+adults+receiving+long-term+suppressive+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">HIV persistence in mucosal CD4+ T cells within the lungs of adults receiving long-term suppressive antiretroviral therapy.</a> AIDS. 32, 2279-2289 (2018).</li>
<li>American Thoracic Society. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22American+Thoracic+Society+-+Bronchoalveolar+Lavage%22">American Thoracic Society - Bronchoalveolar Lavage</a>. , https://www.thoracic.org/professionals/clinical-resources/critical-care/clinical-education/critical-care-procedures/bronchoalveolar-lavage.php (2004).</li>
<li>King, T. E. Jr <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKing%2C+TE+%22Basic+principles+and+technique+of+bronchoalveolar+lavage+-+UpToDate%22">Basic principles and technique of bronchoalveolar lavage - UpToDate</a>. , https://www.uptodate.com/contents/basic-principles-and-technique-of-bronchoalveolar-lavage?topicRef=105799&source=see_link (2018).</li>
<li>Lea, S., Dungwa, J., Ravi, A., Singh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophage+size+is+increased+in+COPD+patients+compared+to+controls%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophage size is increased in COPD patients compared to controls.</a> European Respiratory Journal. 50, (2017).</li>
<li>Kuse, R., Schuster, S., Schübbe, H., Dix, S., Hausmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+lymphocyte+volumes+and+diameters+in+patients+with+chronic+lymphocytic+leukemia+and+normal+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Blut%22%5BJournal%5D)">Blood lymphocyte volumes and diameters in patients with chronic lymphocytic leukemia and normal controls.</a> Blut. 50, 243-248 (1985).</li>
<li>Heron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+lavage+cell+pattern+from+healthy+human+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar lavage cell pattern from healthy human lung.</a> Clinical & Experimental Immunology. 167, 523-531 (2012).</li>
<li>Rheinländer, A., Schraven, B., Bommhardt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD45+in+human+physiology+and+clinical+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">CD45 in human physiology and clinical medicine.</a> Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).</li>
<li>Yu, Y. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometric+Analysis+of+Myeloid+Cells+in+Human+Blood%2C+Bronchoalveolar+Lavage%2C+and+Lung+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54, 13-24 (2015).</li>
<li>Geiser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+Macrophage+Clearance+of+Inhaled+Micro-+and+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Aerosol+Medicine+and+Pulmonary+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Update on Macrophage Clearance of Inhaled Micro- and Nanoparticles.</a> Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23, 207-217 (2010).</li>
<li>Costiniuk, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+predictors+of+airflow+obstruction+in+an+HIV+tertiary+care+clinic+in+Montreal%2C+Canada%3A+A+cross+sectional+study%5BTitle%5D)+AND+%22HIV+Medicine%22%5BJournal%5D)">Prevalence and predictors of airflow obstruction in an HIV tertiary care clinic in Montreal, Canada: A cross sectional study.</a> HIV Medicine. , (2019).</li>
<li>Balfour, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altruism+motivates+participation+in+a+therapeutic+HIV+vaccine+trial+%28CTN+173%29%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Care%22%5BJournal%5D)">Altruism motivates participation in a therapeutic HIV vaccine trial (CTN 173).</a> AIDS Care. 22, 1403-1409 (2010).</li>
<li>Vandergeeten, C., Fromentin, R., Chomont, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cytokines+in+the+establishment%2C+persistence+and+eradication+of+the+HIV+reservoir%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+%26+Growth+Factor+Reviews%22%5BJournal%5D)">The role of cytokines in the establishment, persistence and eradication of the HIV reservoir.</a> Cytokine & Growth Factor Reviews. 23, 143-149 (2012).</li>
<li>Rennard, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+volume+of+epithelial+lining+fluid+recovered+by+lavage+using+urea+as+marker+of+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Estimation of volume of epithelial lining fluid recovered by lavage using urea as marker of dilution.</a> Journal of Applied Physiology (1985). 60, 532-538 (1986).</li>
<li>Twigg, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+highly+active+antiretroviral+therapy+on+viral+burden+in+the+lungs+of+HIV-infected+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Effect of highly active antiretroviral therapy on viral burden in the lungs of HIV-infected subjects.</a> The Journal of Infectious Diseases. 197, 109-116 (2008).</li>
<li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Macrophage+Subpopulations+Characterize+Acute+Infection+and+Chronic+Inflammatory+Lung+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Distinct Macrophage Subpopulations Characterize Acute Infection and Chronic Inflammatory Lung Disease.</a> The Journal of Immunology. 189, 946(2012).</li>
<li>Garn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+aspects+of+flow+cytometric+analysis+of+cells+from+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Specific aspects of flow cytometric analysis of cells from the lung.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 57, 21-24 (2006).</li>
<li>Szaniawski, M. A., Spivak, A. M., Bosque, A., Planelles, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+influences+SAMHD1+activity+and+susceptibility+to+HIV-1+in+primary+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Sex influences SAMHD1 activity and susceptibility to HIV-1 in primary human macrophages.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li>
<li>Avalos, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+Productively+Infected+Monocytes+and+Macrophages+of+Simian+Immunodeficiency+Virus-Infected+Macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Quantitation of Productively Infected Monocytes and Macrophages of Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques.</a> Journal of Virology. 90, 5643-5656 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule opisaliśmy metodę przetwarzania płynu BAL w celu uzyskania limfocytów T CD4 i AM, wraz z dopasowanymi PBMC, które można badać w celu zbadania rezerwuaru HIV w płucach. Niedawno informowaliśmy o kwantyfikacji DNA HIV w limfocytach T CD4 z dopasowanych próbek krwi obwodowej i BAL, a nasza grupa wykazała, że HIV jest 13 razy bardziej obfity w limfocytach T CD4 w płucach niż w tych z krwi obwodowej15. Jednak poziomy DNA HIV w AM są zależne od dawcy, a więc do tej pory nie było spójnej korelacji między poziomami DNA HIV w limfocytach w porównaniu z makrofagami15. Dostęp do tych pierwotnych podzbiorów komórek makrofagów będzie jednak istotnym narzędziem do zbadania tego pytania i lepszego zrozumienia wiremii w płucach w kontekście rezerwuaru HIV.
W erze pre-ART i w kilku innych badaniach z wykorzystaniem płynu BAL uczestnicy przeszli bronchoskopię w celu zdiagnozowania podejrzenia patologii lub uzyskania diagnozy mikrobiologicznej objawów ze strony układu oddechowego3. Udało nam się jednak zrekrutować uczestników bez żadnych aktywnych objawów lub patologii płucnych, a wszyscy uczestnicy podpisali formularz zgody etycznej15. Udało nam się zrekrutować uczestników z naszego centrum, którzy brali udział w innych badaniach, takich jak badanie przesiewowe spirometryczne w kierunku obturacyjnej choroby płuc24, a także tych, którzy byli poddawani innym procedurom badawczym, takim jak leukafereza i kolonoskopia. Wcześniejsze badania przeprowadzone wśród osób żyjących z HIV wykazały, że altruizm jest kluczowym czynnikiem motywującym do udziału w badaniach naukowych25. Podobnie jak w przypadku wielu ludzkich okazów, zauważyliśmy dużą zmienność między osobami. Nie było sposobu, aby "przewidzieć", od których uczestników otrzymamy BAL z dobrą i słabą wydajnością komórek. W przeciwieństwie do krwi obwodowej, która daje dość stałą liczbę limfocytów, liczba komórek w płynie BAL jest bardzo zmienna. Wstrzyknięcie większej objętości soli fizjologicznej do płuc (z nadzieją na uzyskanie większego zwrotu płynu BAL) nie zawsze jest możliwe, ponieważ większe objętości soli fizjologicznej często wiążą się z częstszym kaszlem i wyższym ryzykiem gorączki po bronchoskopii. Zauważyliśmy, że użycie bronchoskopu o mniejszej (a nie większej) średnicy umożliwiło respirologowi dotarcie głębiej w oskrzela i uzyskanie płynu zawierającego większą ilość komórek. Spójnym odkryciem było to, że palacze tytoniu mieli znacznie większy odsetek AM niż limfocytów w płynie BAL, czego można się spodziewać, ponieważ AM pochłaniają szczątki i cząstki stałe. Ponadto zaobserwowaliśmy, że płyn BAL od palaczy zawierał zanieczyszczenia, które mogą blokować używany sprzęt, taki jak maszyny do PCR i cytometry przepływowe. Podobne problemy można zaobserwować na obszarach o dużym zanieczyszczeniu lub osobach częściej narażonych na złą jakość powietrza.
Jeśli chodzi o ich rolę w tworzeniu rezerwuarów wirusa HIV i trwałości wirusa, kluczową kwestią jest czystość limfocytów T CD4 i AM. Z tego powodu zdecydowaliśmy się na użycie sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) w celu uzyskania wysoce czystych populacji komórek. Możliwe jest również, że pobrany płyn BAL może być zanieczyszczony krwią, ponieważ podczas bronchoskopii spodziewane jest niewielkie krwawienie; obecność naiwnych limfocytów B wskazywałaby na to, a komórki można myć w buforze do lizy czerwonych krwinek, aby obejść ten problem. Innym wyzwaniem związanym z badaniem płynu BAL jest ilościowe określenie markerów stanu zapalnego i cytokin, które są ważne dla zrozumienia trwałości wirusa HIV26. Ponieważ wkroplona sól fizjologiczna rozcieńcza płyn BAL, poziomy mediatorów stanu zapalnego i cytokin mogą być trudne do zmierzenia. Chociaż zaproponowano współczynnik korygujący mocznik w celu uwzględnienia rozcieńczenia, istnieje stosunkowo niewiele literatury opisującej jego stosowanie27,28.
AM są wysoce autofluorescencyjne, co stanowi problem podczas sortowania komórek i analizy fenotypowej cytometrii przepływowej. W szczególności efekt ten jest bardziej wyraźny u palaczy, u których AM mogą być całkowicie czarne, co znacząco wpływa na ich autofluorescencję. Po wzbudzeniu przez standardowy niebieski laser o długości fali 488 nm, autofluorescencja AM osiąga szczyt przy około 540 nm, co pokrywa się z widmami fluorescencji powszechnie stosowanych koniugatów, takich jak FITC i PE29,30. Warto zauważyć, że do wzbudzenia FITC i PE można użyć dwóch oddzielnych laserów (np. PE przez żółty/zielony laser, a FITC przez niebieski laser 488). Aby przezwyciężyć nieodłączną autofluorescencję za pomocą FITC, użyliśmy niebarwionych AM do określenia tła autofluorescencji. Ponadto stosowanie kontroli fluorescencji minus jeden (FMO) może być bardzo przydatne w zwalczaniu tych problemów technicznych. Można stosować większe kulki (np. 7,5 μm), które są bliższe rozmiarem do kompensacji populacji makrofagów, w porównaniu z mniejszymi kulkami (np. 3,0 μm), które można wykorzystać do kompensacji populacji limfocytów. Jeszcze bardziej odpowiednim podejściem byłoby użycie niewielkiej frakcji komórek jako kontroli pojedynczego barwienia, przy użyciu znanego, wysoce eksprymowanego markera na podzbiorze, takiego jak HLA-DR lub CD45, sprzężonego z każdym z pożądanych fluorochromów, co pozwoliłoby na znacznie dokładniejszą kompensację niż można osiągnąć za pomocą koralików. W przypadku próbek palaczy taktyka ta jest szczególnie przydatna, ponieważ makrofagi są znacznie większe i bardziej autofluorescencyjne. Ponadto, począwszy od etapu przygotowania, cała próbka BAL może być hodowana na płytce przed sortowaniem zgodnie z opisem w sekcji 3 protokołu, aby umożliwić rozdzielenie populacji przez przestrzeganie zaleceń. W ten sposób przylegające makrofagi można wyizolować z innych nieprzylegających komórek, takich jak limfocyty. Kompensacja jest znacznie mniej trudna, jeśli populacje limfocytów i AM są rozdzielane, a nie badane razem; Jednak poleganie na przestrzeganiu zaleceń spowoduje utratę makrofagów, co jest ważnym czynnikiem, gdy liczba komórek już się ogranicza. Ponadto etap adherencji może spowodować niepożądaną aktywację przylegających monocytów, co może wpłynąć na dalsze wyniki generowane przy użyciu tych komórek. Wartość efektywnego sortowania komórek w czystsze populacje musi być porównana z ograniczeniem polegającym na posiadaniu mniejszej liczby takich komórek w kolejnych eksperymentach.
Inne modele, w szczególności modele mysie, zostały wykorzystane do badania cech immunologicznych i biologii makrofagów. Chociaż modele te są niezwykle przydatne i pozwalają na doskonały wgląd w typ komórki, który jest trudny do manipulowania, mają ograniczenia. Wiele markerów powierzchni komórek różni się między myszami a ludźmi, tak że immunofenotyp ludzkich AM nie jest w pełni poznany. Jednak ten system modelowy wymaga połączenia kilku myszy do testów ze względu na niską liczbę komórek dostępnych od każdego zwierzęcia. Ponadto konieczność łączenia okazów wyklucza rozważania na temat predyspozycji genetycznych i płci. Ostatnio wykazano, że płeć odgrywa rolę w zakaźności makrofagów przez HIV-1 ze względu na zróżnicowaną ekspresję czynnika restrykcyjnego SAMHD-131. Naczelne inne niż ludzie (NHP) reprezentują model najbardziej zbliżony do człowieka i ułatwiły badanie zakażenia małpim wirusem niedoboru odporności (SIV) i jego wpływu na układ odpornościowy, dostarczając informacji na temat roli makrofagów rezydujących w tkankach w porównaniu z makrofagami pochodzącymi z monocytów. U makaków rezusów wykazano również, że makrofagi płucne izolowane z BAL są siedliskiem wirusa kompetentnego do replikacji; Test wzrostu wirusa (VOA) zastosowano do analizy zachowania SIV w komórkach rezydujących w tkance32. Takie odkrycie ma istotną wartość badawczą, ale musi jeszcze zostać zweryfikowane na ludziach, zanim będzie można je zastosować, a wysoki koszt stosowania NHP wyklucza wykorzystanie dużych populacji próbek. Ponadto ludzkie AM będą przydatne w wielu innych zastosowaniach, takich jak testy in vitro zakażeń wirusowych/mikrobiologicznych oraz w badaniach innych patogenów, takich jak gruźlica/koinfekcja HIV.

Jednym z najważniejszych wyzwań stojących przed wyleczeniem zakażenia wirusem HIV jest obecność utajonego rezerwuaru wirusa HIV, który powoduje odbicie wiremii osocza po przerwaniu terapii antyretrowirusowej (ART)1,2. Podczas gdy rezerwuar wirusa HIV podczas długotrwałej ART jest dobrze udokumentowany w kilku przedziałach tkankowych, w tym w wtórnych narządach limfatycznych, tkance limfatycznej związanej z jelitami (GALT) i ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), płuca były pomijane jako obszar badań od czasów przed ART3. Jednak płuca odgrywają kluczową rolę w patogenezie HIV. Rzeczywiście, objawy płucne były jednym z pierwszych wskaźników zakażeń oportunistycznych związanych z AIDS4. Nawet we współczesnej erze ART osoby zakażone wirusem HIV są bardziej narażone na rozwój zarówno zakaźnych, jak i niezakaźnych chorób płuc niż osoby bez wirusa HIV. Na przykład osoby zakażone wirusem HIV są narażone na podwyższone ryzyko inwazyjnego zakażenia paciorkowcowym zapaleniem płuc, a także przewlekłą obturacyjną chorobą płuc (POChP)5,6. Co więcej, koinfekcja gruźlicy (TB) i HIV jest poważnym wyzwaniem dla zdrowia publicznego w niektórych regionach świata, zwłaszcza w Afryce Subsaharyjskiej, ponieważ osoby zakażone wirusem HIV są od 16 do 27 razy bardziej narażone na gruźlicę niż osoby bez HIV7. Chociaż zaproponowano pewne wyjaśnienia tej podatności na infekcje płuc i choroby przewlekłe8,9,10, dokładne mechanizmy komórkowe, dzięki którym osoby z obniżonym mianem wirusa HIV w osoczu pozostają bardziej narażone na powikłania płucne, nie zostały w pełni wyjaśnione. Co ważne, HIV jest bardzo silnym czynnikiem ryzyka infekcji płuc i chorób przewlekłych, niezależnie od statusu palenia6.
Analiza środowiska immunologicznego płuc jest zatem kluczowa dla zrozumienia jego roli w zdrowiu i chorobie. Chociaż nieinwazyjne, indukowane próbki plwociny zwykle zawierają duże ilości komórek nabłonkowych i szczątków z rzadkimi limfocytami płucnymi i bez AM, co ogranicza ich rolę do określonych zastosowań. I odwrotnie, nie można uzyskać dużych biopsji tkanek przy braku podejrzenia choroby ze względu na związane z tym ryzyko znacznego krwawienia i odmy opłucnowej (zapadnięcia się płuca). Ponadto większość komórek odpornościowych płuc znajduje się głównie na poziomie błony śluzowej, gdzie płuca są stale stymulowane przez antygeny podczas oddychania. W tym celu bronchoskopia w celu uzyskania płynu BAL ma tę zaletę, że zapewnia stosunkowo bezpieczny dostęp do limfocytów i AM (patrz ryc. 1). Makrofagi stanowią największą część komórek w płynie BAL, a następnie limfocyty11. Przydatne jest zatem ustalenie metody, za pomocą której płyn BAL może być przetwarzany w celu wykorzystania w kolejnych zastosowaniach, takich jak immunofenotypowanie, hodowla komórkowa, transkryptomika lub jakiekolwiek inne zastosowania. Przedstawiony tutaj protokół przetwarzania płynu BAL został zaadaptowany z wcześniej opisanych ogólnych procedur i zoptymalizowany pod kątem różnych stosowanych dalszych testów. Metodologia ta pozwala na izolację zarówno limfoidalnych, jak i szpikowych komórek odpornościowych błony śluzowej płuc w celu ich charakterystyki fenotypowej i funkcjonalnej, a także oceny rezerwuaru wirusa HIV u osób dorosłych żyjących z HIV.
Aby ustalić ten protokół, użyliśmy następujących kryteriów rekrutacji uczestników badania15. Aby uczestnicy kwalifikowali się do udziału w tym badaniu, musieli być osobami zakażonymi wirusem HIV, które spełniały następujące kryteria: (1) na ART przez co najmniej 3 lata; (2) obniżona wiremia (VL) przez co najmniej 3 lata; (3) Liczba limfocytów T CD4 ≥200 / mm3; (4) chętnych do poddania się badaniom naukowym w zakresie spirometrii i bronchoskopii. Z badania wykluczono pacjentów z następującymi kryteriami: (1) przeciwwskazania do bronchoskopii; (2) wysokie ryzyko krwawienia: koagulopatia lub terapia warfaryną lub klopidogrelem; (3) małopłytkowość (niskie płytki krwi); (4) czynne zakażenie płuc lub inny ostry proces płucny; (5) ciąża/próba zajścia w ciążę.

<table><tbody><tr><td>70 &mikro; m Sterylne sitko komórkowe</td><td>Fisher Scientific 22363548</td><td></td><td>Nylonowe filtry siatkowe z 70 i mikro; m pory w celu usunięcia zanieczyszczeń z próbki BAL przed sortowaniem</td></tr><tr><td>Komórki ACH-2</td><td>NIH</td><td>349</td><td>HIV-1 utajony klon limfocytów T z jedną zintegrowaną kopią wirusową, które nie wykazują ekspresji CD4</td></tr><tr><td>BD FACSAria</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>Sorter komórek (skonfigurowany do jednoczesnego wykrywania 16 kolorów)</td></tr><tr><td>BD LSRFortessa X-20</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A&nbsp;</td><td>Cytometr przepływowy (skonfigurowany do jednoczesnego wykrywania 14 kolorów)</td></tr><tr><td>Bronchoskop</td><td>Olympus</td><td>BF-1TH190&nbsp;</td><td>Bronchoskop terapeutyczny EEIII HD; szerokość kanału 2,8 mm; średnica zewnętrzna 6,0 mm</td></tr><tr><td>Roztwór do dysocjacji komórek</td><td>Sigma</td><td>C5914&nbsp;</td><td>Nieenzymatyczny preparat do delikatnego usuwania przylegających typów komórek z powierzchni plastikowych lub szklanych.</td></tr><tr><td>CD169&nbsp; BB515</td><td>BD Biosciences</td><td>565353</td><td>Przeciwciało cząsteczkowe wiążące kwas sjalowy stosowane w cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>CD14&nbsp; BV786</td><td>BD Biosciences</td><td>563698</td><td>Przeciwciało przeciwko receptorowi endotoksyny stosowane w cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>CD206&nbsp; PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555954</td><td>Przeciwciało przeciwko receptorowi mannozy stosowane w cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>CD3&nbsp; Alexa700</td><td>BD Biosciences</td><td>557943</td><td>przeciwciało koreceptorowe limfocytów T stosowane w cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>CD4&nbsp; PE-Cy5</td><td>BD Biosciences</td><td>555348</td><td>przeciwciało koreceptorowe limfocytów T stosowane w cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>CD45&nbsp; PE Cy-7</td><td>BD Biosciences</td><td>557748</td><td>Białkowe przeciwciało fosfatazy tyrozynowej sprzężone z receptorem stosowane w cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>CD8&nbsp; BV605</td><td>BD Biosciences</td><td>564116</td><td>przeciwciało koreceptorowe limfocytów T stosowane w cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>CompBead Plus</td><td>BD</td><td>560497</td><td>Anty-mysz&nbsp; Ig, &kappa; &nbsp; i kontroli ujemnej mikrocząstki polistyrenu stosowane do optymalizacji kompensacji fluorescencji w cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Invitrogen</td><td>18068015</td><td>Trawi jedno- i dwuniciowe DNA do oligodeksyrybonuleotydów zawierających fosforan 5' w celu usunięcia zanieczyszczeń z RNA</td></tr><tr><td>dNTP Zestaw 100 mM</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; 10297-018</td><td>Składa się z czterech deoksynukleotydów (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) do stosowania w PCR</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>&nbsp; Niepolarny, protowy rozpuszczalnik stosowany do produkcji pożywki do kriokonserwacji żywych komórek</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9912</td><td>Stosowany do zatrzymywania aktywności enzymu Dnazy I</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Bisent Bioproducts</td><td>080-150</td><td>Wysokiej jakości płodowa surowica bydlęca do uzupełnienia pożywki</td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący FcR, Human</td><td>Miltenyi</td><td>130-059-901</td><td>Wiąże się z receptorem Fc na powierzchni komórki, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał</td></tr> <tr><td>przepływowychFlowJo v10</td><td>FlowJo LLC Nie</td><td>dotyczy</td><td>Oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej używane do wszystkich analiz</td></tr><tr><td>HLA-DR&nbsp; BV650</td><td>BD Biosciences</td><td>564231</td><td>MHC klasa II przeciwciało receptora powierzchniowego komórki stosowane do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>HyClone HEPES roztwór</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3023701</td><td>Bufor zapewniający utrzymanie fizjologicznego pH&nbsp;</td></tr><tr><td>Żywy/Martwy&nbsp; APC-H7</td><td>Invitrogen</td><td>L34975</td><td>Marker żywotności stosowany do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Pożywka do separacji limfocytów (LSM)</td><td>Bioprodukty żubra</td><td>350-000-CL</td><td>Polisacharoza do izolacji PBMC z krwi pełnej</td></tr> Mr<tr><td>. Frosty Pojemnik do zamrażania</td><td>ThermoFisher</td><td>5100-0001</td><td>Pojemnik do zamrażania zapewniający szybkość chłodzenia bardzo bliską -1 &deg; C/min, optymalna szybkość dla zachowania komórek</td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>Invitrogen</td><td>01-1111-41</td><td>Przeciwciała przeciwko myszom, szczurom i chomikom do kompensacji próbek PBMC</td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Bisent Bioproducts</td><td>311-010-CL</td><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem do mycia i barwienia komórek</td></tr><tr><td>Probówki PCR Corbett Rotor-Gene</td><td>Axygen</td><td>PCR-0104-C</td><td>4-paskowe probówki PCR o pojemności 0,1 ml do stosowania z Corbett Rotor-Gene</td></tr><tr><td>PerfeCTa qPCR ToughMix</td><td>Quantabio</td><td>95112</td><td>2x skoncentrowany gotowy do użycia koktajl reakcyjny do amplifikacji PCR matryc DNA&nbsp;</td></tr><tr><td>QiaAmp DNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td>Zestaw do izolacji genomowego, mitochondrialnego, bakteryjnego, pasożytniczego lub wirusowego DNA. Zawiera kolumny wirujące QIAamp Mini, proteinazę K QIAGEN, odczynniki,, probówki zbiorcze</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Kit do oczyszczania do 100 i mikro; g całkowite RNA z komórek, tkanek i drożdży. Zawiera kolumny RNeasy Mini Spin, probówki zbiorcze, odczynniki i wolne od RNaz</td></tr><tr><td>Rotor-Gene Q</td><td>Qiagen</td><td>9001550</td><td>Cykler do PCR w czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>RPMI 1640 1x</td><td>Bisent Bioproducts</td><td>350-000-CL</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Sterylna woda</td><td>Bioprodukty</td><td>żubra 809-115-CL</td><td>DNazy, RNazy i proteazy wolne</td></tr><tr><td>od indeksu górnego&handel; III Jednoetapowy system RT-PCR&nbsp;</td><td>Zestaw Invitrogen</td><td>12574018</td><td>RT-PCR, który wykonuje zarówno syntezę cDNA, jak i amplifikację PCR w jednej probówce. Zawiera SuperScript III RT/Platinum Taq Mix, 2x Reaction Mix (zawierający 0,4 mM każdego dNTP, 3,2 mM MgSO4), polimerazę Taq DNA z siarczanem magnezu</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18038-042</td><td>Termostabilny enzym, który syntetyzuje DNA z jednoniciowych matryc w obecności dNTP i startera. Zawiera polimerazę DNA Taq, 10x bufor PCR,</td></tr><tr><td>zestaw czynnika transkrypcyjnego</td> chlorku magnezu <td>562725 BD Biosciences</td><td>do</td><td>barwienia wewnątrzkomórkowego do cytometrii przepływowej. Zawiera bufor do utrwalania/przepuszczalności, bufor rozcieńczalniczy, bufor do trwałej ondulacji/płukania</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>Barwnik żywotności do zliczania komórek za pomocą hemacytometru&nbsp;</td></tr></tbody></table>

przetwarzanie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i dopasowanej krwi do makrofagów pęcherzykowych i immunofenotypowania limfocytów t cd4+ oraz oceny rezerwuaru hiv

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

Bronchoskopia to procedura medyczna, w której zwykła sól fizjologiczna jest wstrzykiwana do płuc za pomocą bronchoskopu, a następnie zasysana jest zasysana, usuwając płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL). Płyn BAL jest bogaty w komórki, dzięki czemu może zapewnić "migawkę" środowiska immunologicznego płuc. Limfocyty T CD4 są najlepiej scharakteryzowanymi rezerwuarami wirusa HIV, chociaż istnieją mocne dowody sugerujące, że makrofagi tkankowe, w tym makrofagi pęcherzykowe (AM), służą również jako rezerwuary wirusa. Jednak nadal wiele nie wiadomo na temat roli AM w kontekście tworzenia i utrzymywania rezerwuarów HIV. Dlatego opracowanie protokołu przetwarzania płynu BAL w celu uzyskania komórek, które mogą być wykorzystane w testach wirusologicznych i immunologicznych w celu scharakteryzowania i oceny populacji i podzbiorów komórek w płucach, jest istotne dla zrozumienia roli płuc jako rezerwuarów wirusa HIV. W niniejszym artykule opisujemy taki protokół, wykorzystujący standardowe techniki, takie jak proste wirowanie i cytometria przepływowa. Limfocyty T CD4 i AM mogą być następnie wykorzystane do kolejnych zastosowań, w tym immunofenotypowania i kwantyfikacji DNA i RNA HIV.

U większości osób niepalących płyn BAL otrzymuje się w sterylnym pojemniku i jest on lekko mętną cieczą o żółto-pomarańczowym kolorze. Płyn może mieć bardziej różowy odcień, jeśli podczas bronchoskopii u dawcy wykonano biopsje wewnątrzoskrzelowe i wystąpiło niewielkie krwawienie. W przypadku dawców palących płyn może mieć ciemniejszy kolor. Po wirowaniu nadsącz BAL będzie niemal przejrzysty i lekko pomarańczowy, natomiast osad komórkowy może mieć kolor od złamanej bieli do ciemnobrązowego, w zależności od stanu próbki oraz tego, czy dawca był palaczem.
Podczas zliczania całej próbki BAL można zaobserwować różne typy komórek, w tym większe, okrągłe makrofagi o średnicy około 17 µm oraz mniejsze okrągłe limfocyty o średnicy około 7,3 µm18,19 (patrz Rysunek 2). U palaczy makrofagi są powiększone o około 40%18. Rozróżnienie między typami komórek pozwala na oddzielne zliczanie makrofagów i limfocytów. W polu widzenia mogą być również widoczne fragmenty debris, zwłaszcza w próbkach pobranych od palaczy. Makrofagi są najliczniejszym typem komórek w BAL, stanowiąc około 85% komórek u osób niepalących20, a u palaczy ich liczba jest zwiększona, przez co mogą wydawać się niemal jedynym obecnym typem komórek.
Komórki BAL mają tendencję do agregacji, dlatego należy je dokładnie mieszać podczas wszystkich manipulacji. Osad może wydawać się ciemny nawet po kilku etapach płukania. Jeśli po barwieniu do sortowania komórek w frakcji widoczne są włókniste zanieczyszczenia, przed podaniem do sortera należy przepuścić komórki przez filtr 70 µm.
Sortowanie komórek BAL musi być przeprowadzone przy niskim ciśnieniu, aby zapewnić odpowiednio duży rozmiar kropli, umożliwiający zmieszczenie makrofagów. W pierwszej kolejności wyznacza się bramkę obejmującą wszystkie komórki CD45+21, a następnie, na podstawie żywotności, wyklucza się wszystkie martwe komórki (patrz Rysunek 3). Następnie wybiera się komórki pojedyncze (singlety), a w obrębie tej grupy wyznacza się dwie populacje na podstawie wielkości i morfologii, mianowicie większe komórki mieloidalne oraz mniejsze limfocyty (patrz Rysunek 3). Wśród większych komórek wyznacza się bramkę dla CD20622,23 oraz CD16922, a komórki podwójnie dodatnie są sortowane jako AM, natomiast wśród mniejszych komórek wybiera się komórki CD3+ i wyznacza bramki dla CD4 i CD8; sortuje się komórki pojedynczo dodatnie dla CD4 oraz pojedynczo dodatnie dla CD8 (patrz Rysunek 3). Wykorzystane markery dobrano na podstawie wcześniej opisanych fenotypów AM, takich jak receptor mannozowy CD206, występujący w komórkach fagocytarnych23, oraz receptor sialoadhezyny CD16922.
Podczas sortowania PBMC komórki są najpierw bramkowane na podstawie rozproszenia światła w przód (FSC) i prostopadle (SSC), co powinno wykazać homogeniczną populację limfocytów; wszystkie te komórki są wybierane, z wyłączeniem szumów blisko osi zerowej (dane nie pokazano). Populacja jest bramkowana pod kątem żywotności oraz CD45, a do dalszych analiz wykorzystuje się żywe komórki CD45+. Następnie populacja ta jest bramkowana na CD3; w celu wyizolowania monocytów, populacja CD3- jest następnie bramkowana na CD14 i sortowane są wszystkie komórki pojedynczo dodatnie. Aby wyizolować subpopulacje limfocytów, komórki CD3+ są bramkowane na CD4 i CD8, a następnie sortowane są zarówno populacje pojedynczo dodatnie, jak i podwójnie dodatnie.
<img alt="Schemat izolacji komórek płucnych i krwinek do analizy PCR rezerwuaru HIV i cytometrii przepływowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przegląd protokołu. Schemat przedstawiający przebieg protokołu, w tym potencjalne dalsze zastosowania otrzymanych próbek. PBMC = mononuklearne komórki krwi obwodowej; BAL = płukanie pęcherzykowo-oskrzelowe; LSM = medium do separacji limfocytów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy mikroskopowe, analiza komórek krwi, limfocyty (L), monocyty (M), erytrocyty (RBC)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Obraz pola widzenia mikroskopu dla całej cieczy z BAL. Obrazy mikroskopowe od (A) osoby niepalącej i (B) osoby palącej z widocznymi limfocytami (L), makrofagami (M) oraz erytrocytami (RBC). Powiększenie wynosi 1,000x (okular 10x i obiektyw 100x z imersją olejową). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schematy cytometrii przepływowej, wykresy FSC/SSC dla żywotności komórek i identyfikacji limfocytów T w immunofenotypowaniu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Reprezentatywna strategia bramkowania dla sortowania komórek z całkowitego BAL. Strategia bramkowania wykorzystana do sortowania makrofagów pęcherzykowych (AM) oraz limfocytów T CD4 i CD8 z próbek całkowitego BAL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Próbka</td>
			<td >Przeciwciało</td>
			<td >Fluorochrom</td>
			<td >Klon</td>
			<td >Objętość na test (µL)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="5">BAL i PBMC</td>
			<td >Live/Dead</td>
			<td >APC-H7</td>
			<td >-</td>
			<td >1</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >CD45</td>
			<td >PE-Cy7</td>
			<td >HI30</td>
			<td >5</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >CD3</td>
			<td >Alexa700</td>
			<td >UCHT1</td>
			<td >2</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >CD4</td>
			<td >PE-cy5</td>
			<td >RPA-T4</td>
			<td >4</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >CD8</td>
			<td >BV605</td>
			<td >SK1</td>
			<td >3</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Tylko BAL</td>
			<td >CD206</td>
			<td >PE</td>
			<td >19.2</td>
			<td >10</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >CD169</td>
			<td >BB515</td>
			<td >7-239</td>
			<td >5</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Tylko PBMC</td>
			<td >CD14</td>
			<td >BV786</td>
			<td >M5E2</td>
			<td >5</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Panel przepływowy do sortowania całych komórek BAL oraz izolowanych PBMC.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cel</td>
			<td>Krok</td>
			<td>Nazwa startera</td>
			<td colspan="4">Sekwencja startera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Całkowite DNA HIV lub RNA HIV LTR-Gag</td>
			<td>PCR w etapie preamplifikacji</td>
			<td>UR1</td>
			<td colspan="4">5'-CCA TCT CTC TCC TTC TAG C-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>ULF1</td>
			<td colspan="4">5'-ATG CCA CGT AAG CGA AAC TCT GGG TCT CTC TGG TTA GAC-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PCR w czasie rzeczywistym</td>
			<td>UR2</td>
			<td colspan="4">5'-CTG AGG GAT CTC TAG TTA CC-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>LambdaT</td>
			<td colspan="4">5'-ATG CCA CGT AAG CGA AAC T-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>UHIV FamZen: </td>
			<td colspan="4">5'-/56-FAM/CA CTC AAG G/ZEN/C AAG CTT TAT TGA GGC/3IABkFQ/-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA CD3</td>
			<td>PCR w etapie preamplifikacji</td>
			<td>HCD3 wyjście 5'</td>
			<td colspan="4">5'-ACT GAC ATG GAA CAG GGG AAG-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HCD3 wyjście 3'</td>
			<td colspan="4">5'-CCA GCT CTG AAG TAG GGA ACA TAT-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PCR w czasie rzeczywistym</td>
			<td>HCD3 w pozycji 5'</td>
			<td colspan="4">5'-GGC TAT CAT TCT TCT TCA AGG T-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HCD 3 w 3'</td>
			<td colspan="4">5'-CCT CTC TTC AGC CAT TTA AGT A-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CD3 FamZen:</td>
			<td colspan="4">5'-/56-FAM/AG CAG AGA A/ZEN/C AGT TAA GAG CCT CCA T/3IABkFQ/-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA GUSB</td>
			<td>Preamplifikacja PCR</td>
			<td>GUSB Forward 1: </td>
			<td colspan="4">5’-ACC TAG AAT CTG CTG GCT ACT A-3’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GUSB Reverse 1: </td>
			<td colspan="4">5’- GTT CAA ACA GAT CAC ATC CAC ATA C-3’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PCR w czasie rzeczywistym</td>
			<td>GUSB Forward 2: </td>
			<td colspan="4">5'-TGC TGG CTA CTA CTT GAA GAT G-3’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GUSB Reverse 2:</td>
			<td colspan="4"> 5'- CCT TGT CTG CTG CAT AGT TAG A-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GUSB-HEX:</td>
			<td colspan="4">5'-/5HEX/TCGCTCACA/ZEN/CCAAATCCTTGGACC/3IABkFQ/-3'</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Sekwencje starterów i sond do ilościowego oznaczania DNA i RNA HIV.

Opisujemy metodę przetwarzania płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i dopasowanej krwi obwodowej od osób przewlekle zakażonych wirusem HIV na terapii antyretrowirusowej w celu oceny rezerwuarów HIV w płucach. Metody te prowadzą do pozyskania wysoce czystych limfocytów T CD4 i makrofagów pęcherzykowych, które można następnie wykorzystać do immunofenotypowania i kwantyfikacji HIV DNA/RNA za pomocą ultraczułej reakcji łańcuchowej polimerazy.

Przetwarzanie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i dopasowanej krwi do makrofagów pęcherzykowych i immunofenotypowania limfocytów T CD4+ oraz oceny rezerwuaru HIV

Bronchoscopy is a medical procedure whereby normal saline is injected into the lungs via a bronchoscope and then suction is applied, removing ...

Wirus HIV jest nieuleczalny ze względu na jego utrzymywanie się w rezerwuarach komórkowych i anatomicznych. Metoda ta pozwala na ocenę rezerwuaru HIV komórek odpornościowych wyizolowanych z płuc. Technika ta pozwala na izolację limfocytów T błony śluzowej płuc i makrofagów pęcherzykowych z płynu BAL w celu dalszej oceny fenotypowej lub wirusologicznej jako rezerwuarów komórkowych wirusa HIV.Zrozumienie biologii makrofagów pęcherzykowych i limfocytów T CD4-dodatnich oraz ich udziału w rezerwuarze wirusa HIV może dostarczyć ważnych informacji na temat wyzwań stojących przed wyleczeniem wirusa HIV. Izolacja pierwotnych makrofagów z BAL może być stosowana w różnych innych obszarach badawczych, w tym w zapalnych lub zakaźnych chorobach płuc, takich jak astma i gruźlica. Po uzyskaniu płynu BAL od pacjenta zgodnie ze standardowymi protokołami, należy wymieszać płyn w oryginalnej probówce zbiorczej przed przeniesieniem próbki do 50-mililitrowej probówki w komorze bezpieczeństwa biologicznego.Jeśli płyn wydaje się bardzo mętny lub zanieczyszczony tkanką nitkowatą, przefiltruj próbkę przez 70-mikrometrowy nylonowy filtr siatkowy do nowej 50-mililitrowej probówki. Po odwirowaniu przenieś supernatant do nowej 50-mililitrowej probówki i za pomocą końcówki pipety delikatnie rozdrobnij osad zawierający całe komórki BAL. Zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki RPMI 1640 i dodać jeden mililitr zarezerwowanego supernatantu z każdej z 10 1,5-mililitrowych probówek do mikrowirówek.Dodaj 10-mililitrowe porcje pozostałego supernatantu do 15-mililitrowych stożkowych probówek i umieść wszystkie próbki supernatantu w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Rozcieńczyć zawiesinę ogniw osadu w 10 mililitrach pożywki na każde 25 mililitrów oryginalnej próbki i zebrać komórki BAL przez odwirowanie. Następnie ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą lub FBS w celu policzenia.Do sortowania całych komórek jednojądrzastych BAL i krwi obwodowej, dodać pięć razy 10 do pięciu komórek do każdej z dwóch pięciomililitrowych okrągłodennych probówek z polistyrenu na podzestaw dla niebarwionych i barwionych kompensacji żywotności kontroli i dodać resztę każdej próbki podzbioru do jednej pięciomililitrowej probówki na próbkę. Zbierz komórki przez odwirowanie i ponownie zawieś granulki kontrolne w 100 mikrolitrach PBS na probówkę na lodzie, aż zostaną zużyte. Zawiesić osady komórek do sortowania w 250 mikrolitrach buforu blokującego receptor Fc w rozcieńczeniu jeden do 20 na jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zablokować wszelkie niespecyficzne wiązania.Pod koniec inkubacji blokującej dodać odpowiedni koktajl przeciwciał do dodatkowej godzinnej inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji przeciwciał pierwotnych dodać jeden mililitr PBS do każdej probówki do odwirowania i ponownie zawiesić granulki w 250 mikrolitrach buforu sortującego na lodzie chronionym przed światłem do czasu sortowania. Aby przygotować kontrole kompensacyjne, dodać po trzy krople koralików kompensacyjnych immunoglobuliny przeciw myszom kappa i kulki kompensacyjne kontroli ujemnej na jeden mililitr PBS do probówki mikrowirówki i przenieść 100 mikrolitrów roztworu kulek do każdej próbki, która ma być użyta do kompensacji.Dodać jeden mikrolitr każdego przeciwciała w koktajlu do każdej oddzielnej probówki zawierającej kulki i dodać jeden mikrolitr barwienia żywotności do każdej probówki kontrolnej kompensacji barwienia żywotności. Po 20 minutach w temperaturze czterech stopni Celsjusza chronionych przed światłem, umyj próbki jednym mililitrem PBS na probówkę i ponownie zawieś granulki w 250 mikrolitrach świeżego PBS na probówkę. Załaduj niebarwioną próbkę kontrolną z całej komórki BAL do cytometru przepływowego i ustaw matrycę kompensacyjną.Następnie załaduj probówkę z próbką i posortuj komórki pod niskim ciśnieniem, bramkując w celu wykluczenia szumu, uwzględnienia żywych komórek i komórek CD45-dodatnich oraz wykluczenia dubletów. W większej populacji szpikowej posortuj podwójnie dodatnie komórki CD206 i CD169 jako makrofagi pęcherzykowe. W mniejszej populacji limfocytów wyizoluj komórki CD3-dodatnie i posortuj populacje jedno-dodatnie CD4 i CD8.Aby posortować próbkę komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, należy zastosować bramkę, aby wykluczyć szum i dublety oraz uwzględnić żywe komórki CD45-dodatnie, jak pokazano. Po bramkowaniu na CD3 bramkować komórki CD3-ujemne, CD14-dodatnie w celu sortowania monocytów jednododatnich i bramki komórek CD3-dodatnich, CD4 i CD8-dodatnich w celu sortowania obu populacji jedno-dodatnich. Podczas liczenia całej próbki BAL można uwidocznić różne typy komórek, w tym większe, okrągłe makrofagi i mniejsze, okrągłe limfocyty.Makrofagi są najliczniejszym typem komórek w płynie BAL, stanowiąc około 85% komórek w płucach osób niepalących. Komórki te są wzbogacone u palaczy do tego stopnia, że wydają się prawie wyłączne i mają tendencję do powiększania się o około 40% w porównaniu z makrofagami obserwowanymi u osób niepalących. Markery używane do sortowania makrofagów pęcherzykowych z próbek płynu BAL zostały wybrane na podstawie wcześniej opisanych fenotypów makrofagów pęcherzykowych, takich jak receptor mannozy CD206, który jest obecny na komórkach fagocytarnych i receptor sialoadhezyny CD169.Po ich izolacji, makrofagi pęcherzykowe i inne typy komórek można wykorzystać do immunofenotypowania za pomocą cytometrii przepływowej, immunologicznych testów funkcjonalnych lub kwantyfikacji rezerwuaru za pomocą ultraczułego PCR. Technika ta zapewnia dostęp do makrofagów rezydujących w tkankach o wysokiej czystości, które w przeszłości były trudne do osiągnięcia, co pozwala na wcześniej nieosiągalne badanie znaczącej populacji komórek odpornościowych.

processing-bronchoalveolar-lavage-fluid-matched-blood-for-alveolar

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Komórki Treg są potężnymi supresorami układu odpornościowego. Brakuje unikalnych markerów powierzchniowych pozwalających na ich zdefiniowanie, dlatego definicje Treg opierają się przede wszystkim na ich funkcji. W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany test in vitro, który umożliwia identyfikację zaburzeń równowagi immunologicznej u osób zagrożonych rozwojem cukrzycy typu 1 (T1D).

Supresja ludzkich komórek in vitro jako narzędzie przesiewowe do rozpoznawania wczesnego stanu niezrównoważenia immunologicznego

Opisujemy technikę badawczą bronchoskopii światłowodowej i płukania oskrzelowo-pęcherzykowego za pomocą odsysania niskociśnieniowego. Technika ta służy do pobierania komórek odpornościowych z powierzchni oskrzelowo-pęcherzykowych płuc. Stosuje się znieczulenie miejscowe i łagodną świadomą sedację (midazolam). Badani dobrze tolerują zabieg i odczuwają minimalne skutki uboczne.

płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL) do badań; Uzyskanie odpowiedniej wydajności próbki

Ten film demonstruje użycie cytometrii przepływowej do identyfikacji i liczenia różnych komórek odpornościowych w płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego. Początkowo pojedyncze komórki odpornościowe są identyfikowane za pomocą barwnika żywotności, a następnie następuje różnicowe barwienie powierzchniowych białek markerowych, co umożliwia precyzyjne wyliczenie każdego typu komórek.

Identyfikacja i liczenie komórek odpornościowych w płynie płucnym oskrzelowo-pęcherzykowym metodą cytometrii przepływowej

Opracowaliśmy test in vitro, aby zbadać rolę szlaków immunoregulacyjnych w regulacji wydzielania cytokin przez limfocyty T CD4 specyficzne dla HIV.

In vitro Test do oceny wpływu szlaków immunoregulacyjnych na funkcję efektora limfocytów T CD4 specyficznych dla HIV

Odpowiedź immunologiczna gospodarza na infekcję patogenem jest ściśle regulowanym procesem. Wykorzystując model ekspozycji płuc na lipopolisacharydy u myszy, możliwe jest przeprowadzenie oceny w wysokiej rozdzielczości złożonych mechanizmów związanych z patogenezą choroby.

Wykorzystanie dotchawczego podawania PAMP w jamie ustnej i gardłowej oraz płukania oskrzeli i pęcherzyków płucnych w celu oceny odpowiedzi immunologicznej gospodarza u myszy

Metoda oceny zdolności izolowanych makrofagów pęcherzykowych myszy do kontrolowania wzrostu fagocytozowanych zarodników Aspergillus za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Ocena aktywności przeciwgrzybiczej izolowanych makrofagów pęcherzykowych za pomocą mikroskopii konfokalnej

Tutaj opisujemy model i podejście do badania funkcji makrofagów pęcherzyków płucnych w przerzutach raka. Aby zademonstrować rolę tych komórek w przerzutach, wykorzystano syngeniczny (4T1) model raka piersi w połączeniu z wyczerpaniem makrofagów pęcherzykowych za pomocą liposomów klodronianowych.

Badanie roli makrofagów pęcherzykowych w przerzutach raka piersi

Stan zdrowia płuc jest odzwierciedlony przez typ i liczbę komórek odpornościowych, które są obecne w oskrzelikach płuc. Opisujemy technikę płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, która umożliwia izolację i badanie nieprzylegających komórek i rozpuszczalnych czynników z dolnych dróg oddechowych myszy.

Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe płuc myszy w celu analizy nacieku komórek zapalnych

Ta komunikacja opisuje metodologie izolacji i hodowli makrofagów pęcherzykowych od ludzi oraz modeli mysich do celów eksperymentalnych.

Izolacja i hodowla in vitro mysich i ludzkich makrofagów pęcherzykowych

Mleko matki przenosi ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV), chociaż tylko ~15% niemowląt karmionych piersią przez matki zakażone wirusem HIV ulega zakażeniu. Niemowlęta karmione piersią spożywają ~105−108 leukocytów matki dziennie, chociaż komórki te są niedostatecznie zbadane. Tutaj opisujemy izolację leukocytów mleka matki i analizę ich zdolności fagocytarnej.

Izolacja leukocytów z mleka matki do stosowania w zależnym od przeciwciał teście fagocytozy komórkowej celów HIV

Poznaj metodę izolacji makrofagów pęcherzykowych i limfocytów T CD4+ z płynu BAL oraz krwi do oceny rezerwuaru HIV w płucach. Technika ta umożliwia badanie komórek odpornościowych w kontekście infekcji.

Przetwarzanie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i dopasowanej krwi do makrofagów pęcherzykowych i immunofenotypowania limfocytów T CD4+ oraz oceny rezerwuaru HIV (Wideo) | JoVE Journal

Przetwarzanie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i dopasowanej krwi do makrofagów pęcherzykowych i immunofenotypowania limfocytów T CD4⁺ oraz oceny rezerwuaru HIV

Przeglądaj więcej filmów