Przetwarzanie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i dopasowanej krwi do makrofagów pęcherzykowych i immunofenotypowania limfocytów T CD4+ oraz oceny rezerwuaru HIV

Wirus HIV jest nieuleczalny ze względu na jego utrzymywanie się w rezerwuarach komórkowych i anatomicznych. Metoda ta pozwala na ocenę rezerwuaru HIV komórek odpornościowych wyizolowanych z płuc. Technika ta pozwala na izolację limfocytów T błony śluzowej płuc i makrofagów pęcherzykowych z płynu BAL w celu dalszej oceny fenotypowej lub wirusologicznej jako rezerwuarów komórkowych wirusa HIV.

Zrozumienie biologii makrofagów pęcherzykowych i limfocytów T CD4-dodatnich oraz ich udziału w rezerwuarze wirusa HIV może dostarczyć ważnych informacji na temat wyzwań stojących przed wyleczeniem wirusa HIV. Izolacja pierwotnych makrofagów z BAL może być stosowana w różnych innych obszarach badawczych, w tym w zapalnych lub zakaźnych chorobach płuc, takich jak astma i gruźlica. Po uzyskaniu płynu BAL od pacjenta zgodnie ze standardowymi protokołami, należy wymieszać płyn w oryginalnej probówce zbiorczej przed przeniesieniem próbki do 50-mililitrowej probówki w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

Jeśli płyn wydaje się bardzo mętny lub zanieczyszczony tkanką nitkowatą, przefiltruj próbkę przez 70-mikrometrowy nylonowy filtr siatkowy do nowej 50-mililitrowej probówki. Po odwirowaniu przenieś supernatant do nowej 50-mililitrowej probówki i za pomocą końcówki pipety delikatnie rozdrobnij osad zawierający całe komórki BAL. Zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki RPMI 1640 i dodać jeden mililitr zarezerwowanego supernatantu z każdej z 10 1,5-mililitrowych probówek do mikrowirówek

Dodaj 10-mililitrowe porcje pozostałego supernatantu do 15-mililitrowych stożkowych probówek i umieść wszystkie próbki supernatantu w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Rozcieńczyć zawiesinę ogniw osadu w 10 mililitrach pożywki na każde 25 mililitrów oryginalnej próbki i zebrać komórki BAL przez odwirowanie. Następnie ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą lub FBS w celu policzenia.

Do sortowania całych komórek jednojądrzastych BAL i krwi obwodowej, dodać pięć razy 10 do pięciu komórek do każdej z dwóch pięciomililitrowych okrągłodennych probówek z polistyrenu na podzestaw dla niebarwionych i barwionych kompensacji żywotności kontroli i dodać resztę każdej próbki podzbioru do jednej pięciomililitrowej probówki na próbkę. Zbierz komórki przez odwirowanie i ponownie zawieś granulki kontrolne w 100 mikrolitrach PBS na probówkę na lodzie, aż zostaną zużyte. Zawiesić osady komórek do sortowania w 250 mikrolitrach buforu blokującego receptor Fc w rozcieńczeniu jeden do 20 na jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zablokować wszelkie niespecyficzne wiązania.

Pod koniec inkubacji blokującej dodać odpowiedni koktajl przeciwciał do dodatkowej godzinnej inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji przeciwciał pierwotnych dodać jeden mililitr PBS do każdej probówki do odwirowania i ponownie zawiesić granulki w 250 mikrolitrach buforu sortującego na lodzie chronionym przed światłem do czasu sortowania. Aby przygotować kontrole kompensacyjne, dodać po trzy krople koralików kompensacyjnych immunoglobuliny przeciw myszom kappa i kulki kompensacyjne kontroli ujemnej na jeden mililitr PBS do probówki mikrowirówki i przenieść 100 mikrolitrów roztworu kulek do każdej próbki, która ma być użyta do kompensacji.

Dodać jeden mikrolitr każdego przeciwciała w koktajlu do każdej oddzielnej probówki zawierającej kulki i dodać jeden mikrolitr barwienia żywotności do każdej probówki kontrolnej kompensacji barwienia żywotności. Po 20 minutach w temperaturze czterech stopni Celsjusza chronionych przed światłem, umyj próbki jednym mililitrem PBS na probówkę i ponownie zawieś granulki w 250 mikrolitrach świeżego PBS na probówkę. Załaduj niebarwioną próbkę kontrolną z całej komórki BAL do cytometru przepływowego i ustaw matrycę kompensacyjną.

Następnie załaduj probówkę z próbką i posortuj komórki pod niskim ciśnieniem, bramkując w celu wykluczenia szumu, uwzględnienia żywych komórek i komórek CD45-dodatnich oraz wykluczenia dubletów. W większej populacji szpikowej posortuj podwójnie dodatnie komórki CD206 i CD169 jako makrofagi pęcherzykowe. W mniejszej populacji limfocytów wyizoluj komórki CD3-dodatnie i posortuj populacje jedno-dodatnie CD4 i CD8

Aby posortować próbkę komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, należy zastosować bramkę, aby wykluczyć szum i dublety oraz uwzględnić żywe komórki CD45-dodatnie, jak pokazano. Po bramkowaniu na CD3 bramkować komórki CD3-ujemne, CD14-dodatnie w celu sortowania monocytów jednododatnich i bramki komórek CD3-dodatnich, CD4 i CD8-dodatnich w celu sortowania obu populacji jedno-dodatnich. Podczas liczenia całej próbki BAL można uwidocznić różne typy komórek, w tym większe, okrągłe makrofagi i mniejsze, okrągłe limfocyty.

Makrofagi są najliczniejszym typem komórek w płynie BAL, stanowiąc około 85% komórek w płucach osób niepalących. Komórki te są wzbogacone u palaczy do tego stopnia, że wydają się prawie wyłączne i mają tendencję do powiększania się o około 40% w porównaniu z makrofagami obserwowanymi u osób niepalących. Markery używane do sortowania makrofagów pęcherzykowych z próbek płynu BAL zostały wybrane na podstawie wcześniej opisanych fenotypów makrofagów pęcherzykowych, takich jak receptor mannozy CD206, który jest obecny na komórkach fagocytarnych i receptor sialoadhezyny CD169.

Po ich izolacji, makrofagi pęcherzykowe i inne typy komórek można wykorzystać do immunofenotypowania za pomocą cytometrii przepływowej, immunologicznych testów funkcjonalnych lub kwantyfikacji rezerwuaru za pomocą ultraczułego PCR. Technika ta zapewnia dostęp do makrofagów rezydujących w tkankach o wysokiej czystości, które w przeszłości były trudne do osiągnięcia, co pozwala na wcześniej nieosiągalne badanie znaczącej populacji komórek odpornościowych.