Ocena uniwersalnej zagnieżdżonej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w celu wykrycia lyssawirusów

Zagnieżdżony RT-PCR został opracowany do wykrywania wszystkich wirusów Lyssa, w tym wszystkich 16 zatwierdzonych przez ICTV i dwóch nowych gatunków Lyssawirusa. Walidacja tej metody została udowodniona przy użyciu ponad 9000 próbek mózgu zwierząt w ciągu 10 lat klinicznej diagnostyki i nadzoru nad wścieklizną w Chinach. Zagnieżdżony RT-PCR może nie tylko dać wiarygodny wynik na świeżych próbkach tkanki mózgowej, ale także na próbkach zdegradowanych.

Zalewanie tą metodą można wykorzystać do oznaczania próbek płynów biologicznych, takich jak płyn mózgowo-rdzeniowy, ślina i mocz, dzięki czemu metoda ta może być stosowana w diagnozach ultimatum. Aby zminimalizować zanieczyszczenie przenoszone metodą PCR, ważne jest, aby przygotować kontrole ujemne i dodatnie. Na przykład, dla każdej ekstrakcji RNA należy przygotować, ustawić PCR, a elektroforeza żelowa powinna być przeprowadzana w fizycznie oddzielonych obszarach.

Zaleca się również stosowanie taśm spiralnych w ekstrakcji RNA i odwrotnej transkrypcji, aby zapobiec zanieczyszczeniu łańcucha peptydowego wścieklizną. Właściwe obchodzenie się z nimi, takie jak przygotowywanie środków na lodzie, regularna zmiana rękawiczek i stosowanie materiałów niezawierających rybonukleazy, zapobiegnie wprowadzeniu rybonukleazy i wyeliminuje degradację RNA. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyekstrahować RNA z tkanki podejrzanej o wściekliznę, biopsji skóry, śliny, płynu mózgowo-rdzeniowego lub hodowli komórek zakażonych RABV, jak opisano w protokole tekstowym.

Gdy będziesz gotowy do kontynuowania, wyjmij potrzebne odczynniki z zamrażarki i trzymaj je na lodzie. Pamiętaj, aby rozmrozić i zwirować każdy odczynnik przed użyciem. W celu odwrotnej transkrypcji wirusowego RNA do cDNA należy przygotować 12 mikrolitrów mieszanki reakcyjnej dla każdej próbki na lodzie i 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej, jak opisano w tabeli 1 protokołu tekstowego w pomieszczeniu czystym.

Aby uwzględnić różnice w pipetowaniu, należy przygotować objętość mieszaniny wzorcowej o co najmniej jedną wielkość reakcji większą niż wymagana, a następnie podzielić mieszaninę reakcyjną na 0,2 mililitra probówki do PCR. Na stacji roboczej PCR w pomieszczeniu z szablonami dodaj osiem mikrolitrów próbki lub jednej z kontroli do mieszaniny reakcyjnej. Kontrola pozytywna to RNA wyekstrahowane z hodowli komórkowej zakażonej szczepem CVS11 o stałym RAPV, podczas gdy kontrola ujemna zawiera wodę podwójnie destylowaną bez rnazy.

Wymieszaj zawartość każdej probówki, najpierw wirując, a następnie krótko odwirowując. Następnie załaduj probówki reakcyjne do termocyklera. Zainstaluj i uruchom program syntezy cDNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Najpierw weź niezbędne odczynniki i przechowuj je na lodzie w pomieszczeniu czystym, aż będą gotowe do użycia. Gdy będą gotowe, rozmrozić i zwirować odczynniki. Następnie przygotuj 48 mikrolitrów pierwszej rundy mieszanki PCR dla każdej próbki w 1,5 mililitrowej probówce wirówkowej, jak opisano w tabeli 2 protokołu tekstowego i podziel mieszaninę reakcyjną na 0,2 mililitra probówki PCR.

Na stacji roboczej PCR w pomieszczeniu z szablonami dodaj dwulitrową próbkę cDNA do pierwszej rundy mieszanki PCR. Uwzględnij dwa mikrolitry cDNA CVS11 jako kontrolę pozytywną i dwa mikrolitry podwójnie destylowanej wody jako kontrolę negatywną. Następnie przenieś uszczelnione probówki do termocyklera PCR i poddaj cyklowi zgodnie z parametrami wymienionymi w tabeli 3 protokołu tekstowego.

Na początek przygotuj 48 mikrolitrów mieszanki PCR drugiej rundy dla każdej próbki w 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej, jak opisano w tabeli 4 protokołu tekstowego i podziel mieszaninę reakcyjną na 0,2 mililitra probówki PCR. Dodaj dwa mikrolitry produktu PCR w pierwszej rundzie do mieszanki PCR w drugiej rundzie. Uwzględnij wodę podwójnie destylowaną jako kontrolę ujemną dla tej rundy PCR.

Następnie należy przeprowadzić termocykl PCR przy użyciu parametrów wymienionych w tabeli 3 protokołu tekstowego. Najpierw dodaj 1,5 grama agarozy do 100 mililitrów octanu trisu EDTA i podgrzej go w kuchence mikrofalowej, aby dokładnie się rozpuścił. Następnie dodaj bromek etydyny o końcowym stężeniu 0,01%Wlej żel do formy i pozostaw do zestalenia się w temperaturze otoczenia na co najmniej 30 minut.

Przygotuj próbki ładujące, mieszając pięć mikrolitrów każdego produktu PCR z jednym mikrolitrem buforu ładującego o pojemności 6x. Oddzielnie załaduj próbki i odpowiedni marker DNA do studzienek i uruchom żel na około 30 do 45 minut pod napięciem 120 woltów, aż linia barwnika znajdzie się około 75 do 80% w dół żelu. Po zakończeniu pracy wyłącz zasilanie i odłącz elektrody od źródła zasilania.

Następnie ostrożnie wyjmij żel z pudełka na żel. Użyj urządzenia dokumentującego żel UV, aby zwizualizować i sfotografować fragmenty DNA. Scharakteryzuj zagnieżdżony PCR z odwrotną transkrypcją zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Wyniki reprezentatywnego zagnieżdżonego testu RT-PCR w celu wykrycia 18 gatunków Lyssavirus przedstawiono tutaj. Kontrole dodatnie PCR pokazują oczekiwane pasmo na poziomie 845 par zasad w pierwszej rundzie amplifikacji i na poziomie 371 par zasad w drugiej. Nie obserwuje się żadnego pasma dla kontroli ujemnych.

Obserwuje się, że wszystkie 18 Lyssawirusów wytwarza te same dwa prążki, co kontrola pozytywna, co wskazuje, że zagnieżdżony RT-PCR wykrył wszystkie 18 Lyssawirusów. Podczas gdy 16 plazmidów ma wydajną amplifikację w dwóch rundach PCR, dwa z nich, wirus Aravan i wirus Ikoma, są amplifikowane tylko odpowiednio w pierwszej lub drugiej rundzie. Czułość metody różni się w wykrywaniu różnych plazmidów Lyssavirus, od wartości od 2,24 do 2 240 cząsteczek na mikrolitr.

Różnice te można przypisać niedopasowaniom między starterami a matrycami wynikającymi z różnorodności sekwencji wirusów. Porównanie 9 624 tkanek mózgowych z próbek klinicznych, które są testowane za pomocą zagnieżdżonego PCR, z tymi testowanymi za pomocą FAT pokazuje, że zagnieżdżony RT-PCR jako czułość 100% i swoistość 99,97%Zgodność między tymi dwiema metodami wynosi 99,07%Dziesięć innych laboratoriów wścieklizny zostało zaproszonych do przeprowadzenia testu w celu dalszej walidacji zagnieżdżonego RT-PCR. Wszystkie dziesięć laboratoriów uzyskało zagnieżdżone wyniki RT-PCR, które są w 100% zgodne z FAT, bez wyników fałszywie ujemnych lub fałszywie dodatnich, co wskazuje, że zagnieżdżony RT-PCR ma wysoką specyficzność i odtwarzalność.

RT-PCR jest obecnie zalecany przez OIE do stosowania technologii wścieklizny. A nasz zagnieżdżony RT-PCR został udowodniony jako krajowy standard technologii wścieklizny w Chinach w 2018 roku.