Technologia CRISPR/Cas9 w przywracaniu ekspresji dystrofiny w prekursorach mięśni pochodzących z iPSC

Choroba Duchenne'a jest dystrofią mięśniową powodującą przedwczesne wyczerpanie komórek progenitorowych mięśni. Jest to jedna z najcięższych dystrofii mięśniowych. Aby wspomóc funkcjonalną regenerację mięśni, używamy edycji genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9, aby przywrócić ekspresję dystrofiny w indukowanych pluripotencjalnych komórkach progenitorowych mięśni pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Edycja genu CRISPR-Cas9 ma potencjał do przywrócenia ekspresji genu dystrofiny. Autologiczne komórki progenitorowe mięśni pochodzące z iPSC mogą uzupełniać pory komórek macierzystych, naprawiać uszkodzenia i zapobiegać dalszym powikłaniom DMD bez wywoływania odpowiedzi immunologicznej. Różne czynniki komórek iPS w miogennych komórkach progenitorowych zmniejszyły ryzyko regenezy guza w komórkach iPS.

Kilka terapii, które łączą autologiczne indukowane pluripotencjalne komórki progenitorowe mięśni pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych z korekcją genetyczną za pośrednictwem CRISPR-Cas9, jest obiecującymi strategiami leczenia dystrofii mięśniowej Duchenne'a. Technologia ta może być stosowana w leczeniu wielu chorób wrodzonych poprzez genetyczną edycję autologicznych komórek macierzystych, w tym chorób serca, mózgu i krwi. Pokazaliśmy, że demonstracja tego podejścia może zapewnić czytelnikom doświadczenie w radzeniu sobie z przeprogramowywaniem komórek i edycją genów, co pozostaje wyzwaniem.

Pod odwróconym mikroskopem zbadaj kolonie zakażonych embrionalnych komórek macierzystych myszy. Zaznacz kolonie na dnie naczynia za pomocą markera do samotuszowania. Zastosuj natłuszczone pierścienie klonujące, aby przykryć zaznaczone kolonie komórek.

Dodaj 100 mikrolitrów 0,05% trypsyny-EDTA do każdego pierścienia klonującego i umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na pięć minut. Następnie przenieś strawione komórki za pomocą końcówek pipet o pojemności 100 mikrolitrów na 48-dołkowe płytki hodowlane zawierające 250 mililitrów pożywki wzrostowej MES. Inkubuj komórki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i wilgotnością 85%.

Kiedy odczytają 70% konfluencji, wybierz studzienki z dobrze wyrośniętymi komórkami i dodaj 250 mililitrów roztworu TVP do trawienia przez 30 minut. Następnie przenieś kulturę komórkową z każdej studzienki do sześciocentymetrowego naczynia. Powtórz stosowanie pierścieni klonujących i inkubację kilka razy, aż do uzyskania jednolitych klonów w kształcie akademika.

Teraz strawij przygotowane iPSC myszy, dodając jeden mililitr roztworu TVP. Przenieś hodowlę komórkową na 24-dołkową płytkę pokrytą fibronektyną i żelatyną i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Gdy komórki osiągną 50% konfluencji, przełącz się na 500 mikrolitrów świeżej pożywki hodowlanej zawierającej osiem mikrogramów na mililitr Polybrene.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu cząstek lentiwirusa do mysich iPSC. Inkubuj komórki przez trzy dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Następnie określ minimalne stężenie blastycydyny i higromycyny B, które w ciągu 24 godzin wynosi połowę wskaźnika zabijania.

Dodaj pożywkę 2,5 mikrograma na mililitr blastycydyny i 100 mikrogramów na mililitr higromycyny B do komórek, odczekaj trzy dni i wybierz komórki, które pozostają przylegające, jako stabilizujące zainfekowane komórki. Trawić wybrane iPSC myszy za pomocą 0,5 mililitra roztworu TVP, każdy dołek na nowej 24-dołkowej płytce i inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Następnie pipetować iPSC do pojedynczych komórek i policzyć komórki za pomocą komory do liczenia komórek.

Wybierz około 150 strawionych pojedynczych komórek i rozcieńcz pożywką MES w 10-centymetrowym naczyniu, hoduj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Po około 10 dniach, pod odwróconym mikroskopem, użyj sterylnych końcówek pipet o pojemności 10 mikrolitrów, aby wybrać pojedyncze kolonie i przenieść każdą kolonię do 50 mikrolitrów roztworu TVP na 96-dołkowej płytce. Trawić w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Niezawodne ręczne klonowanie ma kluczowe znaczenie dla powodzenia pozyskiwania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych edytowanych przez CRISPR/Cas9. Następnie przenieś i podziel strawione komórki z każdej studzienki na kolejne dwie 96-dołkowe płytki hodowlane. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza do uzyskania 70% zlewnego nalewania się.

Gdy kolonie komórkowe znajdują się w 70% konfluencji, usuń pożywkę z 96-dołkowej płytki. Dodaj 25 mikrolitrów odczynnika do lizy zawierającego 1% roztwór proteinazy K do każdej studzienki i przenieś lizat na inną 96-dołkową płytkę PCR. Uszczelnij płytkę PCR uszczelkami samoprzylepnymi i inkubuj płytkę w termocyklerze w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez 30 minut, a następnie w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 45 minut, aby zlizować komórki i zdenaturować proteinazę K. Następnie w probówce do PCR dodać dwa mikrolitry lizatu, 10 mikrolitrów 2x premiksu polimerazy DNA, 7 mikrolitrów wody wolnej od DNaz i jeden mikrolitr starterów DMD Exon23.

Rozpocznij reakcję PCR zgodnie z manuskryptem. Następnie załaduj reakcję PCR dostarczoną z 2,2 mikrolitra buforu ładującego na 2% żel agarozowy. Uruchom żel pod napięciem od 100 do 150 V przez 30 minut i sprawdź żel w świetle UV.

W tym protokole zaprojektowano dwa przewodnikowe RNA, które otaczają zmutowany Exon23. Po dwuniciowych pęknięciach za pośrednictwem Cas9 i niehomologicznym łączeniu końców, zmutowany Exon23 został usunięty, co pozwoliło na skróconą, ale funkcjonalną produkcję dystrofiny. Aby uniknąć wycieku roztworu trypsyny, musimy równomiernie nałożyć smar na spód pierścieni.

Połączenie edycji genomu CRISPR/Cas9 z dołączonym systemem aktywacji MyoD zapewnia bezpieczną, wykonalną i skuteczną strategię autologicznego przeszczepu u pacjentów z dystrofią mięśniową Duchenne'a z podstawnymi komórkami progenitorowymi odzyskiwania genów.