Name: Technologia CRISPR/Cas9 w przywracaniu ekspresji dystrofiny w prekursorach mięśni pochodzących z iPSC (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Poznaj edycję genów CRISPR/Cas9 w celu przywrócenia ekspresji dystrofiny w prekursorach mięśni pochodzących z iPSC. Ta metoda oferuje obiecującą strategię terapii autologicznej w leczeniu dystrofii mięśniowej Duchenne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tang i Weintraub byli częściowo wspierani przez NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.

<ol><li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence-based+path+to+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).</li>
<li>Batchelor, C. L., Winder, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sparks%2C+signals+and+shock+absorbers%3A+how+dystrophin+loss+causes+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy.</a> Trends Cell Biology. 16 (4), 198-205 (2006).</li>
<li>Gregorevic, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+delivery+of+genes+to+striated+muscles+using+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors.</a> Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).</li>
<li>Bengtsson, N. E., Seto, J. T., Hall, J. K., Chamberlain, J. S., Odom, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+prospects+of+gene+therapy+clinical+trials+for+the+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Progress and prospects of gene therapy clinical trials for the muscular dystrophies.</a> Human Molecular Genetics. 25 (R1), R9-R17 (2016).</li>
<li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+editing+in+dystrophic+mouse+muscle+and+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells.</a> Science. 351 (6271), 407-411 (2016).</li>
<li>Long, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+genome+editing+partially+restores+dystrophin+expression+in+a+mouse+model+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy.</a> Science. 351 (6271), 400-403 (2016).</li>
<li>Nelson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+improves+muscle+function+in+a+mouse+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 351 (6271), 403-407 (2016).</li>
<li>Long, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+muscular+dystrophy+in+mice+by+CRISPR%2FCas9-mediated+editing+of+germline+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA.</a> Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).</li>
<li>El Refaey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Genome+Editing+Restores+Dystrophin+Expression+and+Cardiac+Function+in+Dystrophic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice.</a> Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).</li>
<li>Amoasii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+editing+restores+dystrophin+expression+in+a+canine+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 362 (6410), 86-91 (2018).</li>
<li>Eisen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+abnormalities+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+generated+from+Duchenne+muscular+dystrophy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).</li>
<li>Marion, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+acquire+embryonic+stem+cell+characteristics+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).</li>
<li>Dumont, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+expression+in+muscle+stem+cells+regulates+their+polarity+and+asymmetric+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).</li>
<li>Sacco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+telomeres+and+stem+cell+exhaustion+model+Duchenne+muscular+dystrophy+in+mdx%2FmTR+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice.</a> Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).</li>
<li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+Transplantation+of+Myogenic+Progenitor+Cell+Derived+Exosomes+to+Improve+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).</li>
<li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-Derived+Dystrophin+from+Allograft+Myogenic+Progenitors+Improves+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).</li>
<li>Ousterout, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+CRISPR%2FCas9-based+genome+editing+for+correction+of+dystrophin+mutations+that+cause+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Communications. 6, 6244(2015).</li>
<li>Barde, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+control+of+gene+expression+in+the+hematopoietic+system+using+a+single+Tet-on+inducible+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector.</a> Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).</li>
<li>Glass, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+cartilage+with+inducible+and+tunable+immunomodulatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties.</a> Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD) jest destrukcyjną i ostatecznie śmiertelną chorobą dziedziczną charakteryzującą się brakiem dystrofiny, prowadzącą do postępującego zaniku mięśni 1,2. Nasze wyniki pokazują przywróconą ekspresję genu dystrofiny w miogennych komórkach progenitorowych pochodzących zDmd mdx iPSC przez podejście delecji egzonu23 za pośrednictwem CRISPR / Cas9. Takie podejście ma trzy zalety.
Po pierwsze, wyge...

Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD) jest jedną z najczęstszych dystrofii mięśniowych i charakteryzuje się brakiem dystrofiny, dotykając 1 z około 5 000 nowonarodzonych chłopców na całym świecie1. Utrata funkcji genu dystrofiny powoduje strukturalne defekty mięśni prowadzące do postępującej degeneracji włókien mięśniowych1,2. System terapii genowej za pośrednictwem rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) został przetestowany w celu przywrócenia ekspresji dystrofiny i poprawy funkcji mięśni, takich jak wymiana genów za pomocą mikrodystrofiny (μ-Dys). Jednak podejście rAAV wymaga wielokrotnych wstrzyknięć w celu podtrzymania ekspresji funkcjonalnego białka3,4. Dlatego potrzebujemy strategii, która może skutecznie i trwale przywrócić ekspresję genu dystrofiny u pacjentów z DMD. Mysz Dmdmdx, mysi model DMD, ma mutację punktową w eksonie 23 genu dystrofiny, która wprowadza przedwczesny kodon terminacji i powoduje powstanie niefunkcjonalnego skróconego białka pozbawionego C-końcowej domeny wiążącej dystroglikan. Ostatnie badania wykazały zastosowanie technologii CRISPR/Cas9 do przywrócenia ekspresji genu dystrofiny poprzez dokładną korektę genów lub delecję zmutowanego eksonu u małych i dużych zwierząt5,6,7. Long et al.8 opisali metodę korygowania mutacji genu dystrofiny w linii zarodkowej myszy Dmdmdx za pomocą naprawy kierowanej homologią (HDR) opartej na edycji genomu CRISPR/Cas9. El Refaey et al.9 poinformowali, że rAAV może skutecznie wyciąć zmutowany ekson 23 u myszy dystroficznych. W tych badaniach gRNA zostały zaprojektowane w intronach 20 i 23 tak, aby powodować dwuniciowe pęknięcia DNA, które częściowo przywróciły ekspresję dystrofiny po naprawie DNA poprzez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ). Jeszcze bardziej ekscytujące jest to, że Amoasii et al.10 niedawno poinformowali o skuteczności i wykonalności edycji genu CRISPR za pośrednictwem rAAV w przywracaniu ekspresji dystrofiny w modelach psów, co jest niezbędnym krokiem w przyszłym zastosowaniu klinicznym.
DMD powoduje również zaburzenia komórek macierzystych11. W przypadku uszkodzenia mięśni, mieszkaniowe komórki macierzyste mięśni uzupełniają umierające komórki mięśniowe po różnicowaniu mięśni. Jednak następujące po sobie cykle uszkodzeń i napraw prowadzą do skrócenia telomerów w komórkach macierzystych mięśni12 i przedwczesnego wyczerpania puli komórek macierzystych13,14. Dlatego połączenie terapii autologicznymi komórkami macierzystymi z edycją genomu w celu przywrócenia ekspresji dystrofiny może być praktycznym podejściem do leczenia DMD. Technologia CRISPR/Cas9 zapewnia możliwość generowania autologicznych, genetycznie skorygowanych indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w celu funkcjonalnej regeneracji mięśni i zapobiegania dalszym powikłaniom DMD bez powodowania odrzucenia immunologicznego. Jednak iPSC wiążą się z ryzykiem powstania nowotworu, które można złagodzić poprzez różnicowanie iPSC w miogenne komórki progenitorowe.
W tym protokole opisujemy użycie nieintegrującego wirusa Sendai do przeprogramowania fibroblastów skórnych myszy Dmdmdx na iPSC, a następnie odzyskania ekspresji dystrofiny poprzez delecję genomu CRISPR/Cas9. Po walidacji delecji Exon23 w iPSC za pomocą genotypowania, zróżnicowaliśmy skorygowane genomem iPSC w miogenne progenitory (MPC) poprzez różnicowanie miogenne indukowane przez MyoD.

<table><tbody><tr><td>Instrumenty</td><td></td><td></td><td></td>chirurgiczne</tr><tr><td>Igła o rozmiarze 31 Różne</td><td>&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ostre nacięcie</td><td>różne&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylne skalpele</td><td>różne&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pęsety</td><td>różne&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pożywka fibroblastowa (na 100 ml kompletnej pożywki)</td><td>Numer katalogowy</td> <td>firmy</td><td>Objętość</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol (55 mM)</td><td>Gibco</td><td>21-985-023</td><td>0,1 ml</td></tr><tr><td>antybiotyk przeciwgrzybiczy Slution 100x</td><td>CORNING</td><td>MT30004CI</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium - wysoki poziom glukozy</td><td>SIGMA</td><td>D6429</td><td>87 mL</td></tr><tr><td>Płód Surowica bydlęca Charakterystyka</td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td>10 ml</td></tr><tr><td>roztworu L-glutaminy</td><td>SIGMA</td><td>G7513</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>roztworu TVP (na 500 ml kompletnego roztworu)</td><td>Numer katalogowy</td> <td>firmy</td><td>Objętość</td></tr><tr><td>Surowica kurczaka</td><td>Gibco</td><td>16110-082</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>186 mg</td></tr><tr><td>soli fizjologicznej</td><td></td><td></td><td>buforowanej fosforanami do 500 ml</td></tr><tr><td>trypsyny (2,5%)</td><td>Thermo</td><td>15090046</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Pożywka wzrostowa mES (na 500 ml kompletnego roztworu)</td><td>Numer katalogowy</td> <td>firmy</td><td>Objętość</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol (55 mM)</td><td>Gibco</td><td>21-985-023</td><td>0,5 ml</td></tr><tr><td>antybiotyku przeciwgrzybiczego Slution 100x</td><td>CORNING</td><td>MT30004CI</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium - wysoki poziom glukozy</td><td>SIGMA</td><td>D6429</td><td>408,5 ml</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca Scharakteryzowany</td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td>75 ml</td></tr><tr><td>roztworu L-glutaminy</td><td>SIGMA</td><td>G7513</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>rekombinowany mysi czynnik hamujący białaczkę (LIF), 0,5 x 106 U/ml</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>CS210511</td><td>500 &mu; L</td></tr><tr><td>Suplement inhibitora MEK/GS3 EMD</td><td>Millipore Corp</td><td>CS210510-500UL</td><td>500 &mu; </td></tr><tr><td>Roztwór aminokwasów endogennych L MEM (100x)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Pożywki z komórek ES nie powinny być przechowywane dłużej niż 4 tygodnie, a z inhibitorami nie dłużej niż 2 tygodnie.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><mocne>mES mrożone podłoże (na 50 ml kompletnego roztworu)</mocny></td><td><silny>Firma</mocny></td><td><silny>Numer katalogowy</td><td>Objętość</td></tr><tr><td>sulfoxide dimetylu (DMSO)</td><td>SIGMA</td><td>D2650</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium - wysoka zawartość glukozy</td><td>SIGMA</td><td>D6429</td><td>24,9 ml</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca Charakteryzujący</td><td>się Hyklon</td><td>SH30396.03</td><td>25 ml</td></tr><tr><td>rekombinowany czynnik hamujący białaczkę myszy (LIF), 0,5 x 106 U / ml</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>CS210511</td><td>50 &mu; L</td></tr><tr><td>Nazwa firmy zajmującej się materiałem / sprzętem</td><td></td><td>Numer katalogowy</td><td>RRID</td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna / 0,53 mM EDTA</td><td>CORNING</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>Thermo scientific</td><td>J19943-k2</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Accutase</td><td>SIGMA</td><td>A6964</td><td>Roztwór do odłączania komórek</td></tr><tr><td>AgeI-HF</td><td>NEB</td><td>R3552L</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488-sprzężone kozie przeciwciało anty-mysie</td><td>Invitrogen</td><td>A32723</td><td>AB_2633275</td></tr><tr><td>Alexa488-sprzężone kozie przeciwciało anty-królicze</td><td>Invitrogen</td><td>A32731</td><td>AB_2633280</td></tr><tr><td>Alexa555-sprzężone kozie przeciwciało anty-królicze</td><td>Invitrogen</td><td>A32732</td><td>AB_2633281</td></tr><tr><td>anty-AFP</td><td>Thermo scientific</td><td>RB-365-A1</td><td>AB_59574</td></tr><tr><td>anty-&alfa;-Gładki Aktyna mięśniowa (D4K9N) XP</td><td>CST</td><td>19245S</td><td>AB_2734735</td></tr><tr><td>anty-Dystrofina</td><td>Thermo</td><td>PA5-32388</td><td>AB_2549858</td></tr><tr><td>anty-LIN28A (D1A1A) XP&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>CST</td><td>8641S</td><td>AB_10997528</td></tr><tr><td>anty-MYH2</td><td>DSHB</td><td>mAb2F7</td><td>AB_1157865</td></tr><tr><td>anty-Nanog-XP</td><td>CST</td><td>8822S</td><td>AB_11217637</td></tr><tr><td>anty-Oct-4A (D6C8T)</td><td>CST</td><td>83932S</td><td>AB_2721046</td></tr><tr><td>anty-Sox2</td><td>abcam</td><td>ab97959</td><td>AB_2341193</td></tr><tr><td>anty-SSEA1(MC480)&nbsp;</td><td>CST</td><td>4744s</td><td>AB_1264258</td></tr><tr><td>anty-TH (H-196)</td><td>SANTA CRUZ&nbsp;</td><td>sc-14007</td><td>AB_671397</td></tr><tr><td>Fosfataza alkaliczna Live Stain (500x)</td><td>Thermo</td><td>A14353</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>203350</td><td></td></tr><tr><td>BsmBI/Esp3I</td><td>NEB</td><td>R0580L/R0734L</td><td></td></tr><tr><td>Milipor karbenicyliny</td><td></td><td>205805-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza IV&nbsp;</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004189</td><td></td></tr><tr><td>Kompetentne komórki</td><td>TakaRa</td><td>636763</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune-iPS 2.0 Zestaw do przeprogramowania Sendai</td><td>Thermo</td><td>A16517</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do lizy DirectPCR (komórka)</td><td>VIAGEN BIOTECH</td><td>302-C</td><td></td></tr><tr><td>Dispaza (1 U/mL)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek doksycykliny</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP26535</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td>R3101L</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna osocze bydlęce</td><td>SIGMA</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Zestaw do ekstrakcji żelu QIAEX II (500)</td><td>QIAGEN</td><td>20051</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry świni, typ A</td><td>SIGMA</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>HardSet AntiFade Podłoże montażowe z DAPI</td><td>Vector</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycyna B (50 mg / ml)</td> <td>Invitrogen</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina HCL do wstrzykiwań</td><td>HENRY SCHEIN ZDROWIE ZWIERZĄT</td><td>45822</td><td></td></tr><tr><td>KpnI-HF</td><td>NEB</td><td>R3142L</td><td></td></tr><tr><td>CRISPRv2-blast</td><td>Addgene</td><td>83480</td><td></td></tr><tr><td>lenti-Guide-Hygro-iRFP670</td><td>Addgene</td><td>99377</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000 Transfekcja Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>LV-TRE-VP64-mysz MyoD-T2A-dsRedExpress2&nbsp; &nbsp;</td><td>Mysz Addgene</td><td>60625</td><td></td></tr><tr><td>LV-TRE-VP16 MyoD-T2A-dsRedExpress2</td><td>Addgene</td><td>60626</td><td></td></tr><tr><td>Mysz na myszy (M.O.M.) Zestaw podstawowy</td><td>Vector</td><td>BMK-2202</td><td></td></tr><tr><td>NotI-HF</td><td>NEB</td><td>R3189L</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Zredukowane podłoże surowicowe</td><td>ThermoFisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy 4,000</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAA161510B</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>SIGMA</td><td>TR1003</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; BioCoat Preparat do hodowli poli-D-lizyny/laminy</td><td>CORNING</td><td>CB354688</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR Max Premix</td><td>TakaRa</td><td>R045</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>VIAGEN BIOTECH</td><td>507-PKP</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorowodorek puromycyny</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN19453980</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Lentivirus Zestaw do miareczkowania</td><td>abm</td><td>LV900</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do szybkiej ligacji</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100)</td><td>QIAGEN</td><td>12945</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji RevertAid RT</td><td>Thermo scientific</td><td>K1691</td><td></td></tr><tr><td>RNAzol RT</td><td>Centrum Badań Molekularnych, INC</td><td>RN 190</td><td></td></tr><tr><td>T4 Bufor reakcyjny ligazy DNA</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Kinaza polinukleotydowa</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Wspaniały bulion Zmodyfikowany</td><td>bioodczynniki Fishera</td><td>BP9729-600</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik ViralBoost (500x)</td> <td>ALSTEM</td><td>VB100</td><td></td></tr></tbody></table>

technologia crispr/cas9 w przywracaniu ekspresji dystrofiny w prekursorach mięśni pochodzących z ipsc

CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors

Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD) jest poważną postępującą chorobą mięśni spowodowaną mutacjami w genie dystrofiny, co ostatecznie prowadzi do wyczerpania komórek progenitorowych mięśni. Zgrupowana, regularnie rozmieszczona edycja genów 9 (CRISPR/Cas9) z krótkimi powtórzeniami palindromicznymi/CRISPR-associated 9 może przywrócić ekspresję genu dystrofiny. Autologiczne indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) pochodzące z komórek progenitorowych mięśni (MPC) mogą uzupełniać pulę komórek macierzystych/progenitorowych, naprawiać uszkodzenia i zapobiegać dalszym powikłaniom DMD bez powodowania odpowiedzi immunologicznej. W tym badaniu wprowadzamy kombinację CRISPR/Cas9 i niezintegrowanych technologii iPSC w celu uzyskania komórek progenitorowych mięśni z odzyskaną ekspresją białka dystrofiny. Krótko mówiąc, używamy nieintegrującego wektora Sendai do ustanowienia linii iPSC z fibroblastów skóry myszy Dmdmdx. Następnie używamy strategii delecji CRISPR/Cas9, aby przywrócić ekspresję dystrofiny poprzez niehomologiczne połączenie końcowe przeformułowanego genu dystrofiny. Po walidacji PCR zubożenia eksonu23 w trzech koloniach z 94 wybranych kolonii iPSC, różnicujemy iPSC w MPC poprzez indukowaną doksycykliną (Dox) ekspresję MyoD, kluczowego czynnika transkrypcyjnego odgrywającego znaczącą rolę w regulacji różnicowania mięśni. Nasze wyniki wskazują na możliwość zastosowania strategii delecji CRISPR/Cas9 w celu przywrócenia ekspresji dystrofiny w MPC pochodzącym z iPSC, co ma znaczny potencjał dla opracowania przyszłych terapii leczenia DMD.

Ustanowienie iPSC pochodzących z fibroblastów skóry Dmdmdx. Wykazaliśmy skuteczność generowania mysich iPSC z fibroblastów skóry pochodzących z myszyDmd mdx przy użyciu wektorów przeprogramowania bez integracji. <silna klasa="xfig">Rysunek 1A wykazał, że pojawienie się kolonii podobnych do embrionalnych komórek macierzystych (ESC) po trzech tygodniach od zakażenia. Oceniamy skuteczność indukcji iPSC za pomocą barwienia żywą fosfatazą alkaliczną (AP); Ry...

Tutaj prezentujemy protokół delecji exon23 oparty na Cas9, który przywraca ekspresję dystrofiny w iPSC z mysich fibroblastów skóry Dmdmdx i bezpośrednio różnicuje iPSC w miogenne komórki progenitorowe (MPC) za pomocą systemu aktywacji Tet-on MyoD.

Technologia CRISPR/Cas9 w przywracaniu ekspresji dystrofiny w prekursorach mięśni pochodzących z iPSC

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe progressive muscle disease caused by mutations in the dystrophin gene, which ultimately leads to the ...

Choroba Duchenne'a jest dystrofią mięśniową powodującą przedwczesne wyczerpanie komórek progenitorowych mięśni. Jest to jedna z najcięższych dystrofii mięśniowych. Aby wspomóc funkcjonalną regenerację mięśni, używamy edycji genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9, aby przywrócić ekspresję dystrofiny w indukowanych pluripotencjalnych komórkach progenitorowych mięśni pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych.Edycja genu CRISPR-Cas9 ma potencjał do przywrócenia ekspresji genu dystrofiny. Autologiczne komórki progenitorowe mięśni pochodzące z iPSC mogą uzupełniać pory komórek macierzystych, naprawiać uszkodzenia i zapobiegać dalszym powikłaniom DMD bez wywoływania odpowiedzi immunologicznej. Różne czynniki komórek iPS w miogennych komórkach progenitorowych zmniejszyły ryzyko regenezy guza w komórkach iPS.Kilka terapii, które łączą autologiczne indukowane pluripotencjalne komórki progenitorowe mięśni pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych z korekcją genetyczną za pośrednictwem CRISPR-Cas9, jest obiecującymi strategiami leczenia dystrofii mięśniowej Duchenne'a. Technologia ta może być stosowana w leczeniu wielu chorób wrodzonych poprzez genetyczną edycję autologicznych komórek macierzystych, w tym chorób serca, mózgu i krwi. Pokazaliśmy, że demonstracja tego podejścia może zapewnić czytelnikom doświadczenie w radzeniu sobie z przeprogramowywaniem komórek i edycją genów, co pozostaje wyzwaniem.Pod odwróconym mikroskopem zbadaj kolonie zakażonych embrionalnych komórek macierzystych myszy. Zaznacz kolonie na dnie naczynia za pomocą markera do samotuszowania. Zastosuj natłuszczone pierścienie klonujące, aby przykryć zaznaczone kolonie komórek.Dodaj 100 mikrolitrów 0,05% trypsyny-EDTA do każdego pierścienia klonującego i umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na pięć minut. Następnie przenieś strawione komórki za pomocą końcówek pipet o pojemności 100 mikrolitrów na 48-dołkowe płytki hodowlane zawierające 250 mililitrów pożywki wzrostowej MES. Inkubuj komórki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i wilgotnością 85%.Kiedy odczytają 70% konfluencji, wybierz studzienki z dobrze wyrośniętymi komórkami i dodaj 250 mililitrów roztworu TVP do trawienia przez 30 minut. Następnie przenieś kulturę komórkową z każdej studzienki do sześciocentymetrowego naczynia. Powtórz stosowanie pierścieni klonujących i inkubację kilka razy, aż do uzyskania jednolitych klonów w kształcie akademika.Teraz strawij przygotowane iPSC myszy, dodając jeden mililitr roztworu TVP. Przenieś hodowlę komórkową na 24-dołkową płytkę pokrytą fibronektyną i żelatyną i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Gdy komórki osiągną 50% konfluencji, przełącz się na 500 mikrolitrów świeżej pożywki hodowlanej zawierającej osiem mikrogramów na mililitr Polybrene.Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu cząstek lentiwirusa do mysich iPSC. Inkubuj komórki przez trzy dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Następnie określ minimalne stężenie blastycydyny i higromycyny B, które w ciągu 24 godzin wynosi połowę wskaźnika zabijania.Dodaj pożywkę 2,5 mikrograma na mililitr blastycydyny i 100 mikrogramów na mililitr higromycyny B do komórek, odczekaj trzy dni i wybierz komórki, które pozostają przylegające, jako stabilizujące zainfekowane komórki. Trawić wybrane iPSC myszy za pomocą 0,5 mililitra roztworu TVP, każdy dołek na nowej 24-dołkowej płytce i inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Następnie pipetować iPSC do pojedynczych komórek i policzyć komórki za pomocą komory do liczenia komórek.Wybierz około 150 strawionych pojedynczych komórek i rozcieńcz pożywką MES w 10-centymetrowym naczyniu, hoduj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Po około 10 dniach, pod odwróconym mikroskopem, użyj sterylnych końcówek pipet o pojemności 10 mikrolitrów, aby wybrać pojedyncze kolonie i przenieść każdą kolonię do 50 mikrolitrów roztworu TVP na 96-dołkowej płytce. Trawić w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.Niezawodne ręczne klonowanie ma kluczowe znaczenie dla powodzenia pozyskiwania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych edytowanych przez CRISPR/Cas9. Następnie przenieś i podziel strawione komórki z każdej studzienki na kolejne dwie 96-dołkowe płytki hodowlane. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza do uzyskania 70% zlewnego nalewania się.Gdy kolonie komórkowe znajdują się w 70% konfluencji, usuń pożywkę z 96-dołkowej płytki. Dodaj 25 mikrolitrów odczynnika do lizy zawierającego 1% roztwór proteinazy K do każdej studzienki i przenieś lizat na inną 96-dołkową płytkę PCR. Uszczelnij płytkę PCR uszczelkami samoprzylepnymi i inkubuj płytkę w termocyklerze w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez 30 minut, a następnie w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 45 minut, aby zlizować komórki i zdenaturować proteinazę K. Następnie w probówce do PCR dodać dwa mikrolitry lizatu, 10 mikrolitrów 2x premiksu polimerazy DNA, 7 mikrolitrów wody wolnej od DNaz i jeden mikrolitr starterów DMD Exon23.Rozpocznij reakcję PCR zgodnie z manuskryptem. Następnie załaduj reakcję PCR dostarczoną z 2,2 mikrolitra buforu ładującego na 2% żel agarozowy. Uruchom żel pod napięciem od 100 do 150 V przez 30 minut i sprawdź żel w świetle UV.W tym protokole zaprojektowano dwa przewodnikowe RNA, które otaczają zmutowany Exon23. Po dwuniciowych pęknięciach za pośrednictwem Cas9 i niehomologicznym łączeniu końców, zmutowany Exon23 został usunięty, co pozwoliło na skróconą, ale funkcjonalną produkcję dystrofiny. Aby uniknąć wycieku roztworu trypsyny, musimy równomiernie nałożyć smar na spód pierścieni.Połączenie edycji genomu CRISPR/Cas9 z dołączonym systemem aktywacji MyoD zapewnia bezpieczną, wykonalną i skuteczną strategię autologicznego przeszczepu u pacjentów z dystrofią mięśniową Duchenne'a z podstawnymi komórkami progenitorowymi odzyskiwania genów.

crisprcas9-technology-restoring-dystrophin-expression-ipsc-derived

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) pochodzące z miogennych komórek macierzystych są obiecującymi kandydatami na strategie terapii komórkowej w leczeniu dystrofii mięśniowych. Protokół ten opisuje przeszczep i pomiary funkcjonalne wymagane do oceny wszczepienia i różnicowania mezoangioblastów pochodzących z iPSC (rodzaj komórek progenitorowych mięśni) w mysich modelach ostrej i przewlekłej regeneracji mięśni.

Przeszczep indukowanych pluripotencjalnych progenitorów miogennych podobnych do mezoangioblastów pochodzących z mezoangioblastów w mysich modelach regeneracji mięśni

Ten protokół zawiera szczegółowe procedury izolacji komórek pochodzących z moczu od pacjentów z dystrofią mięśniową; ich skuteczne i szybkie przeprogramowanie poprzez transdukcję wirusa Sendai.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych od pacjentów z dystrofią mięśniową: skuteczne przeprogramowanie komórek pochodzących z moczu bez integracji

Opisano protokoły do generowania linii mutantów hPSC za pomocą platformy iCRISPR i różnicowania hPSC na komórki podobne do β reagujące na glukozę. Połączenie technologii edycji genomu z różnicowaniem ukierunkowanym na hPSC stanowi potężną platformę do systematycznej analizy roli determinantów linii w rozwoju człowieka i postępie choroby.

Edycja genomu i ukierunkowane różnicowanie hPSC w celu badania determinantów linii w rozwoju trzustki człowieka

Ten protokół szczegółowo opisuje generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) bez śladu z ludzkich komórek trzustki w warunkach wolnych od karmienia, a następnie edycję za pomocą rybonukleoprotein CRISPR/Cas9 i charakterystykę zmodyfikowanych klonów pojedynczych komórek.

Wydajne generowanie i edycja IPSC bez zasilania z ludzkich komórek trzustki przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół do przeprowadzenia in vivo edycji genów serca u myszy przy użyciu rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) za pośrednictwem CRISPR. Protokół ten oferuje obiecującą strategię terapeutyczną w leczeniu kardiomiopatii dystroficznej w dystrofii mięśniowej Duchenne'a i może być stosowany do generowania specyficznego dla serca nokautu u myszy po urodzeniu.

Dostarczanie CRISPR za pośrednictwem wirusa za pośrednictwem adenowirusa do edycji genów serca u myszy

Ukierunkowana edycja epigenomu DNA reprezentuje potężne podejście terapeutyczne. Protokół ten opisuje produkcję, oczyszczanie i koncentrację wektorów lentiwirusowych typu "wszystko w jednym" zawierających transgen CRISPR-dCas9-DNMT3A do zastosowań w edycji epigenomu w neuronach pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC).

Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy protokół przejściowej poprawy funkcji serca u myszy z dystrofią mięśniową Duchenne'a poprzez przeszczepienie egzosomów pochodzących z normalnych miogennych komórek progenitorowych.

Oczyszczanie i przeszczepianie miogennych egzosomów pochodzących z komórek progenitorowych w celu poprawy funkcji serca u myszy z dystroficznym zapłonem mięśniowym Duchenne'a

Tutaj opisujemy szczegółową metodę bezproblemowej edycji genów w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu plazmidu dawcy opartego na piggyBac i mutanta nickazy Cas9. Do eksonu 8 locus czynnika jądrowego hepatocytów 4 alfa (HNF4α) w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (hESC) wprowadzono dwie mutacje punktowe.

Wprowadzenie mutacji punktowych do ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu płynnej edycji genomu

Ten protokół opisuje konwersję fibroblastów skóry w mioblasty i ich różnicowanie w miotuby. Linie komórkowe pochodzą od pacjentów z zaburzeniami nerwowo-mięśniowymi i mogą być wykorzystywane do badania mechanizmów patologicznych i testowania strategii terapeutycznych.

Bezpośrednie przeprogramowanie ludzkich fibroblastów w mioblasty w celu zbadania terapii zaburzeń nerwowo-mięśniowych

Protokół opisuje, jak generować nokautujące mioblasty za pomocą CRISPR/Cas9, zaczynając od projektowania przewodników RNA, aż po klonowanie komórkowe i charakterystykę klonów nokautujących.

Rozwój nokautujących linii komórkowych mięśni przy użyciu edycji genów CRISPR/Cas9 za pośrednictwem lentiwirusa

Przedstawiona metoda opisuje generowanie nokautu genu za pośrednictwem CRISPR w linii H9 ludzkiej embrionalnej komórki macierzystej (hESC), która stabilnie wyraża sgRNA ukierunkowane na gen L2HGDH za pomocą wysoce wydajnego systemu dostarczania genów za pośrednictwem lentiwirusa.

Delecja genu za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych hodowanych w warunkach wolnych od karmowego

Poznaj edycję genów CRISPR/Cas9 w celu przywrócenia ekspresji dystrofiny w prekursorach mięśni pochodzących z iPSC. Ta metoda oferuje obiecującą strategię terapii autologicznej w leczeniu dystrofii mięśniowej Duchenne.

Technologia CRISPR/Cas9 w przywracaniu ekspresji dystrofiny w prekursorach mięśni pochodzących z iPSC

Przeglądaj więcej filmów