Chirurgiczne zmniejszanie rozmiaru danio pręgowanego w celu zbadania skalowania wzorca embrionalnego
May 3rd, 2019
Tutaj opisujemy metodę zmniejszania wielkości zarodków danio pręgowanego bez zakłócania normalnych procesów rozwojowych. Technika ta umożliwia badanie skalowania wzorca i odporności rozwojowej na zmiany rozmiaru.
Chociaż skalowanie jest jednym z uniwersalnych i podstawowych atrybutów systemów rozwojowych, mechanizmy leżące u jego podstaw nie zostały poznane w wielu narządach i tkankach. Technika zmniejszania rozmiaru danio pręgowanego przedstawiona w tym filmie pogłębi Twoje zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw procesów dynamicznego skalowania. Zaletą pracy z danio pręgowanym jest to, że łatwo jest przeprowadzić obrazowanie na żywo, genetykę i analizę ilościową.
Nasza technika jest również bardzo prosta i łatwa do zastosowania bez specjalistycznego sprzętu czy intensywnego treningu. Zdrowie zarodków jest kluczem do sukcesu w tej technice. Użyj młodych ryb jako rodziców i uważaj, aby zminimalizować uszkodzenia, usuwając kosmówkę.
A także pobaw się rozmiarem rany na żółtku i liczbą usuniętych komórek. Ponieważ zarodki, których używamy, są bardzo młode i delikatne, należy obchodzić się z nimi bardzo ostrożnie podczas przenoszenia i siekania. Jednocześnie musi być szybki, aby procedura mogła zostać wykonana we właściwym oknie czasowym rozwoju.
Demonstracja wizualna może dać dobre wyobrażenie o tym, jak skutecznie produkować mniejsze zarodki. Aby zrobić drucianą pętlę do siekania zarodków, przełóż sztywny i niekorozyjny drut ze stali nierdzewnej o długości 20 centymetrów przez szklaną kapilę, tworząc małą, milimetrową pętlę u góry. Umieść małą kropelkę przezroczystego lakieru do paznokci na końcówce kapilary klasy, między kapilarą a drucianą pętlą, aby utrzymać ją na miejscu, uważając, aby nie dostać lakieru do paznokci na część pętelkową, ponieważ może to uszkodzić zarodki.
A potem pozwól mu wyschnąć. Użyj taśmy laboratoryjnej, aby przymocować szklaną kapilarnę z pętlą do drewnianej pałeczki, pozostawiając około dwóch i pół centymetra szklanej kapilary wystającej poza pałeczkę, aby pałeczka nie zanurzyła się później w wodzie. Na 100-milimetrowej szklanej szalce Petriego za pomocą plastikowej szpatułki rozprowadź około 0,5 mililitra 2% metylocelulozy w pobliżu środka dna cienko i równomiernie do grubości około 0,5 milimetra.
Wlej około 30 mililitrów jednej trzeciej roztworu Ringera na bok naczynia i pozwól mu rozprowadzić się na resztę naczynia i przykryj metylocelulozą. Umieść wcześniej pozbawione kosmówki zarodki w stadium 256 komórek do jednego komórki K na 2% metylocelulozie, upewniając się, że zarodki są zorientowane na bok. Aby posiekać blastulę, użyj drucianej pętli, aby przeciąć w pobliżu słupa zwierzęcego, prostopadle do osi roślinnej zwierzęcia i odciąć około 30 do 40% komórek blastodermy.
Następnie delikatnie postukaj końcami o siebie, aby pozostałe komórki skleiły się z powrotem. W przypadku żółtka użyj zamontowanego drutu, aby zrobić małą ranę w pobliżu bieguna roślinnego, nacinając błonę jaja, co spowoduje, że żółtko będzie wyciekać przez kilka minut, a następnie się zagoi. Kiedy żółtko przestanie wyciekać, użyj pipety, aby przesunąć zarodek poza metylocelulozę w tym samym naczyniu w celu odzyskania.
Powtórz siekanie blastuli i żółtka dla wszystkich zarodków, a następnie pozostaw naczynie w spokoju na 30 minut, aż zarodki dojdą do siebie. Następnie za pomocą szklanej pipety przenieś zarodki do wcześniej przygotowanego szklanego naczynia o średnicy 35 milimetrów zawierającego świeżą jedną trzecią roztworu Ringera i umieść je w inkubatorze o temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza, aby umożliwić całkowite wyzdrowienie przed kontynuowaniem obrazowania. Po wykonaniu dwuetapowego siekania z blastulą i żółtkiem, zarodki wykazywały pozornie normalną ogólną morfologię we wszystkich stadiach rozwojowych w porównaniu z zarodkami kontrolnymi, poza różnicą wielkości.
Z drugiej strony, zarodki posiekane tylko przez blastulę wykazywały specyficzną morfologię, zwłaszcza we wcześniejszych stadiach. Podczas epibolii zarodki miały zwężony i wcięty wygląd. Na kolejnym etapie somitowym stwierdzono, że struktury linii środkowej są spłaszczone na wielu poziomach osiowych.
W późniejszych stadiach struktury ciała przylegające do żółtka, takie jak śródmózgowie i tyłomózgowie, nadal wykazywały stosunkowo spłaszczony kształt, prawdopodobnie z powodu zwiększonego napięcia ze strony stosunkowo większego żółtka. Obrazowanie poklatkowe powstawania somitów wykazało, że zarówno w zarodkach kontrolnych, jak i posiekanych rozmiary somitów, które powstały w późniejszych stadiach, były mniejsze w porównaniu z tymi z wcześniejszych etapów. Ponadto, na wszystkich etapach tworzenia somitów, rozdrobnione zarodki miały mniejsze somity niż te w zarodkach kontrolnych.
Kiedy technikę dwuetapowego siekania przeprowadzono na zarodkach, którym wstrzyknięto mCherry do błony, obrazowanie ich rdzenia kręgowego po 20 godzinach od zapłodnienia wykazało zmniejszenie wysokości cewy nerwowej z powodu zmniejszenia rozmiaru. Dwuetapowe siekanie jest bardzo ważne, aby uzyskać mniejsze, ale poza tym normalne zarodki z wysoką wydajnością. Ważne jest, aby pamiętać, aby nie siekać żółtka podczas odcinania komórek z blastuli.
W przypadku żółtka zrób na nim małe zranienie, aby zawartość wypłynęła. A błona żółtkowa zagoi się naturalnie w odpowiednim buforze. Ponieważ rozdrobnione zarodki można szybko odzyskać, wszelkie metody lub analizy można zastosować do normalnych zarodków zgodnie z metodą zmniejszania rozmiaru.
Prostota i wszechstronność tej techniki jest bardzo potężna, ponieważ każdy może wprowadzić tę technikę do badania problemu łuszczenia się w dowolnej tkance lub narządzie u danio pręgowanego. Wierzymy, że dzięki tej technice naukowcy mogą rozwiązać problemy ze skalowaniem w różnych systemach, które wcześniej nie były tknięte. Dokonaliśmy już ważnych odkryć w zakresie skalowania wzorców somitów i cewy neuronalnej.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę zmniejszania wielkości zarodków ryby zebrafish, zachowując normalne procesy rozwojowe. Technika ułatwia badanie skalowania wzorców i odporności rozwojowej w odpowiedzi na zmiany wielkości.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia rozwoju
- Badania nad rybami zebrafish
- Embriologia
Tło
- Skalowanie jest podstawową cechą systemów rozwojowych.
- Zrozumienie mechanizmów skalowania w różnych narządach i tkankach jest kluczowe.
- Ryby zebrafish są korzystne dla obrazowania na żywo i badań genetycznych.
- Zdrowie zarodków jest krytyczne dla pomyślnego zastosowania techniki zmniejszania wielkości.
Cel badania
- Aby poszerzyć zrozumienie dynamicznych procesów skalowania w biologii rozwoju.
- Aby zapewnić prostą metodę zmniejszania wielkości zarodków ryby zebrafish.
- Aby umożliwić ilościową analizę odporności rozwojowej.
Zastosowane metody
- Technika zmniejszania wielkości zarodków ryby zebrafish.
- Obrazowanie na żywo do obserwacji procesów rozwojowych.
- Manipulacje genetyczne dla lepszej analizy.
- Szczególna ostrożność, aby zminimalizować uszkodzenia podczas usuwania chorionu.
Główne wyniki
- Technika pozwala na efektywne zmniejszenie wielkości bez zakłócania rozwoju.
- Zdrowie zarodków jest kluczowe dla sukcesu metody.
- Najlepsze wyniki uzyskuje się, gdy rodzicielami są młode ryby.
- Metoda jest prosta i nie wymaga specjalistycznego sprzętu.
Wnioski
- Technika zmniejszania wielkości jest cennym narzędziem do badania procesów rozwojowych.
- Poprawia zrozumienie mechanizmów skalowania u ryb zebrafish.
- To podejście może być szeroko stosowane w badaniach nad biologią rozwoju.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding embryonic pattern scaling is critical for de-risking target validation in developmental biology and regenerative medicine. The zebrafish size reduction technique enables quantitative assessment of morphogen-mediated patterning robustness, supporting predictive confidence in early discovery. This approach addresses a key inflection point in portfolio triage by linking size perturbation to functional readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by testing whether body patterning scales proportionally with embryo size.
- Operational Value: Provides a simple, equipment-free method to generate smaller embryos for high-throughput phenotypic screening.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by revealing whether morphogen gradients adjust dynamically to tissue size.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates size-matched biological systems for standardized assay conditions across genetic or chemical perturbations.
- Operational Value: Facilitates reproducible live imaging and quantitative analysis of developmental dynamics in scaled systems.
- Scalability: The technique’s simplicity allows adaptation across laboratories without specialized training or infrastructure.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables disease-relevant scaling studies in zebrafish models of congenital disorders involving body plan abnormalities.
- Preclinical Model: Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying patterning fidelity under size stress.
- Biomarker Alignment: Facilitates correlation of morphological readouts with molecular markers in scaled embryos.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification by providing scalable embryonic systems for mechanistic insight.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by testing scaling behavior in mutants or drug-treated embryos.
- Screening: Delivers assay-ready, size-reduced embryos with recovered morphology for compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative dependent variable measurements such as somite size, neural tube height, and midline structure integrity.
- Translational Research: Connects to preclinical work through conserved scaling mechanisms in vertebrate development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying scaling in multiple tissues and organs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in size-dependent patterning mechanisms.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility across labs through a simple, low-cost procedure.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of scaling failures in candidate pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on developmental robustness data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology and microsurgical techniques.
- Needs standard laboratory tools: glass capillaries, stainless steel wire, methyl cellulose, and Ringer’s solution.
- Demands cross-team standardization of embryo staging and wound size for consistent results.
- Involves adaptation considerations when applying to different genetic backgrounds or environmental conditions.
- Limited by embryo fragility and the narrow time window for blastula-stage manipulation.
