Chirurgiczne zmniejszanie rozmiaru danio pręgowanego w celu zbadania skalowania wzorca embrionalnego

Chociaż skalowanie jest jednym z uniwersalnych i podstawowych atrybutów systemów rozwojowych, mechanizmy leżące u jego podstaw nie zostały poznane w wielu narządach i tkankach. Technika zmniejszania rozmiaru danio pręgowanego przedstawiona w tym filmie pogłębi Twoje zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw procesów dynamicznego skalowania. Zaletą pracy z danio pręgowanym jest to, że łatwo jest przeprowadzić obrazowanie na żywo, genetykę i analizę ilościową.

Nasza technika jest również bardzo prosta i łatwa do zastosowania bez specjalistycznego sprzętu czy intensywnego treningu. Zdrowie zarodków jest kluczem do sukcesu w tej technice. Użyj młodych ryb jako rodziców i uważaj, aby zminimalizować uszkodzenia, usuwając kosmówkę.

A także pobaw się rozmiarem rany na żółtku i liczbą usuniętych komórek. Ponieważ zarodki, których używamy, są bardzo młode i delikatne, należy obchodzić się z nimi bardzo ostrożnie podczas przenoszenia i siekania. Jednocześnie musi być szybki, aby procedura mogła zostać wykonana we właściwym oknie czasowym rozwoju.

Demonstracja wizualna może dać dobre wyobrażenie o tym, jak skutecznie produkować mniejsze zarodki. Aby zrobić drucianą pętlę do siekania zarodków, przełóż sztywny i niekorozyjny drut ze stali nierdzewnej o długości 20 centymetrów przez szklaną kapilę, tworząc małą, milimetrową pętlę u góry. Umieść małą kropelkę przezroczystego lakieru do paznokci na końcówce kapilary klasy, między kapilarą a drucianą pętlą, aby utrzymać ją na miejscu, uważając, aby nie dostać lakieru do paznokci na część pętelkową, ponieważ może to uszkodzić zarodki.

A potem pozwól mu wyschnąć. Użyj taśmy laboratoryjnej, aby przymocować szklaną kapilarnę z pętlą do drewnianej pałeczki, pozostawiając około dwóch i pół centymetra szklanej kapilary wystającej poza pałeczkę, aby pałeczka nie zanurzyła się później w wodzie. Na 100-milimetrowej szklanej szalce Petriego za pomocą plastikowej szpatułki rozprowadź około 0,5 mililitra 2% metylocelulozy w pobliżu środka dna cienko i równomiernie do grubości około 0,5 milimetra.

Wlej około 30 mililitrów jednej trzeciej roztworu Ringera na bok naczynia i pozwól mu rozprowadzić się na resztę naczynia i przykryj metylocelulozą. Umieść wcześniej pozbawione kosmówki zarodki w stadium 256 komórek do jednego komórki K na 2% metylocelulozie, upewniając się, że zarodki są zorientowane na bok. Aby posiekać blastulę, użyj drucianej pętli, aby przeciąć w pobliżu słupa zwierzęcego, prostopadle do osi roślinnej zwierzęcia i odciąć około 30 do 40% komórek blastodermy.

Następnie delikatnie postukaj końcami o siebie, aby pozostałe komórki skleiły się z powrotem. W przypadku żółtka użyj zamontowanego drutu, aby zrobić małą ranę w pobliżu bieguna roślinnego, nacinając błonę jaja, co spowoduje, że żółtko będzie wyciekać przez kilka minut, a następnie się zagoi. Kiedy żółtko przestanie wyciekać, użyj pipety, aby przesunąć zarodek poza metylocelulozę w tym samym naczyniu w celu odzyskania.

Powtórz siekanie blastuli i żółtka dla wszystkich zarodków, a następnie pozostaw naczynie w spokoju na 30 minut, aż zarodki dojdą do siebie. Następnie za pomocą szklanej pipety przenieś zarodki do wcześniej przygotowanego szklanego naczynia o średnicy 35 milimetrów zawierającego świeżą jedną trzecią roztworu Ringera i umieść je w inkubatorze o temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza, aby umożliwić całkowite wyzdrowienie przed kontynuowaniem obrazowania. Po wykonaniu dwuetapowego siekania z blastulą i żółtkiem, zarodki wykazywały pozornie normalną ogólną morfologię we wszystkich stadiach rozwojowych w porównaniu z zarodkami kontrolnymi, poza różnicą wielkości.

Z drugiej strony, zarodki posiekane tylko przez blastulę wykazywały specyficzną morfologię, zwłaszcza we wcześniejszych stadiach. Podczas epibolii zarodki miały zwężony i wcięty wygląd. Na kolejnym etapie somitowym stwierdzono, że struktury linii środkowej są spłaszczone na wielu poziomach osiowych.

W późniejszych stadiach struktury ciała przylegające do żółtka, takie jak śródmózgowie i tyłomózgowie, nadal wykazywały stosunkowo spłaszczony kształt, prawdopodobnie z powodu zwiększonego napięcia ze strony stosunkowo większego żółtka. Obrazowanie poklatkowe powstawania somitów wykazało, że zarówno w zarodkach kontrolnych, jak i posiekanych rozmiary somitów, które powstały w późniejszych stadiach, były mniejsze w porównaniu z tymi z wcześniejszych etapów. Ponadto, na wszystkich etapach tworzenia somitów, rozdrobnione zarodki miały mniejsze somity niż te w zarodkach kontrolnych.

Kiedy technikę dwuetapowego siekania przeprowadzono na zarodkach, którym wstrzyknięto mCherry do błony, obrazowanie ich rdzenia kręgowego po 20 godzinach od zapłodnienia wykazało zmniejszenie wysokości cewy nerwowej z powodu zmniejszenia rozmiaru. Dwuetapowe siekanie jest bardzo ważne, aby uzyskać mniejsze, ale poza tym normalne zarodki z wysoką wydajnością. Ważne jest, aby pamiętać, aby nie siekać żółtka podczas odcinania komórek z blastuli.

W przypadku żółtka zrób na nim małe zranienie, aby zawartość wypłynęła. A błona żółtkowa zagoi się naturalnie w odpowiednim buforze. Ponieważ rozdrobnione zarodki można szybko odzyskać, wszelkie metody lub analizy można zastosować do normalnych zarodków zgodnie z metodą zmniejszania rozmiaru.

Prostota i wszechstronność tej techniki jest bardzo potężna, ponieważ każdy może wprowadzić tę technikę do badania problemu łuszczenia się w dowolnej tkance lub narządzie u danio pręgowanego. Wierzymy, że dzięki tej technice naukowcy mogą rozwiązać problemy ze skalowaniem w różnych systemach, które wcześniej nie były tknięte. Dokonaliśmy już ważnych odkryć w zakresie skalowania wzorców somitów i cewy neuronalnej.