Chirurgiczne zmniejszanie rozmiaru danio pręgowanego w celu zbadania skalowania wzorca embrionalnego
3 maja 2019
Tutaj opisujemy metodę zmniejszania wielkości zarodków danio pręgowanego bez zakłócania normalnych procesów rozwojowych. Technika ta umożliwia badanie skalowania wzorca i odporności rozwojowej na zmiany rozmiaru.
Chociaż skalowanie jest jednym z uniwersalnych i podstawowych atrybutów systemów rozwojowych, mechanizmy leżące u jego podstaw nie zostały poznane w wielu narządach i tkankach. Technika zmniejszania rozmiaru danio pręgowanego przedstawiona w tym filmie pogłębi Twoje zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw procesów dynamicznego skalowania. Zaletą pracy z danio pręgowanym jest to, że łatwo jest przeprowadzić obrazowanie na żywo, genetykę i analizę ilościową.
Nasza technika jest również bardzo prosta i łatwa do zastosowania bez specjalistycznego sprzętu czy intensywnego treningu. Zdrowie zarodków jest kluczem do sukcesu w tej technice. Użyj młodych ryb jako rodziców i uważaj, aby zminimalizować uszkodzenia, usuwając kosmówkę.
A także pobaw się rozmiarem rany na żółtku i liczbą usuniętych komórek. Ponieważ zarodki, których używamy, są bardzo młode i delikatne, należy obchodzić się z nimi bardzo ostrożnie podczas przenoszenia i siekania. Jednocześnie musi być szybki, aby procedura mogła zostać wykonana we właściwym oknie czasowym rozwoju.
Demonstracja wizualna może dać dobre wyobrażenie o tym, jak skutecznie produkować mniejsze zarodki. Aby zrobić drucianą pętlę do siekania zarodków, przełóż sztywny i niekorozyjny drut ze stali nierdzewnej o długości 20 centymetrów przez szklaną kapilę, tworząc małą, milimetrową pętlę u góry. Umieść małą kropelkę przezroczystego lakieru do paznokci na końcówce kapilary klasy, między kapilarą a drucianą pętlą, aby utrzymać ją na miejscu, uważając, aby nie dostać lakieru do paznokci na część pętelkową, ponieważ może to uszkodzić zarodki.
A potem pozwól mu wyschnąć. Użyj taśmy laboratoryjnej, aby przymocować szklaną kapilarnę z pętlą do drewnianej pałeczki, pozostawiając około dwóch i pół centymetra szklanej kapilary wystającej poza pałeczkę, aby pałeczka nie zanurzyła się później w wodzie. Na 100-milimetrowej szklanej szalce Petriego za pomocą plastikowej szpatułki rozprowadź około 0,5 mililitra 2% metylocelulozy w pobliżu środka dna cienko i równomiernie do grubości około 0,5 milimetra.
Wlej około 30 mililitrów jednej trzeciej roztworu Ringera na bok naczynia i pozwól mu rozprowadzić się na resztę naczynia i przykryj metylocelulozą. Umieść wcześniej pozbawione kosmówki zarodki w stadium 256 komórek do jednego komórki K na 2% metylocelulozie, upewniając się, że zarodki są zorientowane na bok. Aby posiekać blastulę, użyj drucianej pętli, aby przeciąć w pobliżu słupa zwierzęcego, prostopadle do osi roślinnej zwierzęcia i odciąć około 30 do 40% komórek blastodermy.
Następnie delikatnie postukaj końcami o siebie, aby pozostałe komórki skleiły się z powrotem. W przypadku żółtka użyj zamontowanego drutu, aby zrobić małą ranę w pobliżu bieguna roślinnego, nacinając błonę jaja, co spowoduje, że żółtko będzie wyciekać przez kilka minut, a następnie się zagoi. Kiedy żółtko przestanie wyciekać, użyj pipety, aby przesunąć zarodek poza metylocelulozę w tym samym naczyniu w celu odzyskania.
Powtórz siekanie blastuli i żółtka dla wszystkich zarodków, a następnie pozostaw naczynie w spokoju na 30 minut, aż zarodki dojdą do siebie. Następnie za pomocą szklanej pipety przenieś zarodki do wcześniej przygotowanego szklanego naczynia o średnicy 35 milimetrów zawierającego świeżą jedną trzecią roztworu Ringera i umieść je w inkubatorze o temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza, aby umożliwić całkowite wyzdrowienie przed kontynuowaniem obrazowania. Po wykonaniu dwuetapowego siekania z blastulą i żółtkiem, zarodki wykazywały pozornie normalną ogólną morfologię we wszystkich stadiach rozwojowych w porównaniu z zarodkami kontrolnymi, poza różnicą wielkości.
Z drugiej strony, zarodki posiekane tylko przez blastulę wykazywały specyficzną morfologię, zwłaszcza we wcześniejszych stadiach. Podczas epibolii zarodki miały zwężony i wcięty wygląd. Na kolejnym etapie somitowym stwierdzono, że struktury linii środkowej są spłaszczone na wielu poziomach osiowych.
W późniejszych stadiach struktury ciała przylegające do żółtka, takie jak śródmózgowie i tyłomózgowie, nadal wykazywały stosunkowo spłaszczony kształt, prawdopodobnie z powodu zwiększonego napięcia ze strony stosunkowo większego żółtka. Obrazowanie poklatkowe powstawania somitów wykazało, że zarówno w zarodkach kontrolnych, jak i posiekanych rozmiary somitów, które powstały w późniejszych stadiach, były mniejsze w porównaniu z tymi z wcześniejszych etapów. Ponadto, na wszystkich etapach tworzenia somitów, rozdrobnione zarodki miały mniejsze somity niż te w zarodkach kontrolnych.
Kiedy technikę dwuetapowego siekania przeprowadzono na zarodkach, którym wstrzyknięto mCherry do błony, obrazowanie ich rdzenia kręgowego po 20 godzinach od zapłodnienia wykazało zmniejszenie wysokości cewy nerwowej z powodu zmniejszenia rozmiaru. Dwuetapowe siekanie jest bardzo ważne, aby uzyskać mniejsze, ale poza tym normalne zarodki z wysoką wydajnością. Ważne jest, aby pamiętać, aby nie siekać żółtka podczas odcinania komórek z blastuli.
W przypadku żółtka zrób na nim małe zranienie, aby zawartość wypłynęła. A błona żółtkowa zagoi się naturalnie w odpowiednim buforze. Ponieważ rozdrobnione zarodki można szybko odzyskać, wszelkie metody lub analizy można zastosować do normalnych zarodków zgodnie z metodą zmniejszania rozmiaru.
Prostota i wszechstronność tej techniki jest bardzo potężna, ponieważ każdy może wprowadzić tę technikę do badania problemu łuszczenia się w dowolnej tkance lub narządzie u danio pręgowanego. Wierzymy, że dzięki tej technice naukowcy mogą rozwiązać problemy ze skalowaniem w różnych systemach, które wcześniej nie były tknięte. Dokonaliśmy już ważnych odkryć w zakresie skalowania wzorców somitów i cewy neuronalnej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę zmniejszania wielkości zarodków ryby zebrafish, zachowując normalne procesy rozwojowe. Technika ułatwia badanie skalowania wzorców i odporności rozwojowej w odpowiedzi na zmiany wielkości.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia rozwoju
- Badania nad rybami zebrafish
- Embriologia
Tło
- Skalowanie jest podstawową cechą systemów rozwojowych.
- Zrozumienie mechanizmów skalowania w różnych narządach i tkankach jest kluczowe.
- Ryby zebrafish są korzystne dla obrazowania na żywo i badań genetycznych.
- Zdrowie zarodków jest krytyczne dla pomyślnego zastosowania techniki zmniejszania wielkości.
Cel badania
- Aby poszerzyć zrozumienie dynamicznych procesów skalowania w biologii rozwoju.
- Aby zapewnić prostą metodę zmniejszania wielkości zarodków ryby zebrafish.
- Aby umożliwić ilościową analizę odporności rozwojowej.
Zastosowane metody
- Technika zmniejszania wielkości zarodków ryby zebrafish.
- Obrazowanie na żywo do obserwacji procesów rozwojowych.
- Manipulacje genetyczne dla lepszej analizy.
- Szczególna ostrożność, aby zminimalizować uszkodzenia podczas usuwania chorionu.
Główne wyniki
- Technika pozwala na efektywne zmniejszenie wielkości bez zakłócania rozwoju.
- Zdrowie zarodków jest kluczowe dla sukcesu metody.
- Najlepsze wyniki uzyskuje się, gdy rodzicielami są młode ryby.
- Metoda jest prosta i nie wymaga specjalistycznego sprzętu.
Wnioski
- Technika zmniejszania wielkości jest cennym narzędziem do badania procesów rozwojowych.
- Poprawia zrozumienie mechanizmów skalowania u ryb zebrafish.
- To podejście może być szeroko stosowane w badaniach nad biologią rozwoju.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding embryonic pattern scaling is critical for de-risking target validation in developmental biology and regenerative medicine. The zebrafish size reduction technique enables quantitative assessment of morphogen-mediated patterning robustness, supporting predictive confidence in early discovery. This approach addresses a key inflection point in portfolio triage by linking size perturbation to functional readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by testing whether body patterning scales proportionally with embryo size.
- Operational Value: Provides a simple, equipment-free method to generate smaller embryos for high-throughput phenotypic screening.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by revealing whether morphogen gradients adjust dynamically to tissue size.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates size-matched biological systems for standardized assay conditions across genetic or chemical perturbations.
- Operational Value: Facilitates reproducible live imaging and quantitative analysis of developmental dynamics in scaled systems.
- Scalability: The technique’s simplicity allows adaptation across laboratories without specialized training or infrastructure.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables disease-relevant scaling studies in zebrafish models of congenital disorders involving body plan abnormalities.
- Preclinical Model: Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying patterning fidelity under size stress.
- Biomarker Alignment: Facilitates correlation of morphological readouts with molecular markers in scaled embryos.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification by providing scalable embryonic systems for mechanistic insight.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by testing scaling behavior in mutants or drug-treated embryos.
- Screening: Delivers assay-ready, size-reduced embryos with recovered morphology for compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative dependent variable measurements such as somite size, neural tube height, and midline structure integrity.
- Translational Research: Connects to preclinical work through conserved scaling mechanisms in vertebrate development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying scaling in multiple tissues and organs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in size-dependent patterning mechanisms.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility across labs through a simple, low-cost procedure.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of scaling failures in candidate pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on developmental robustness data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology and microsurgical techniques.
- Needs standard laboratory tools: glass capillaries, stainless steel wire, methyl cellulose, and Ringer’s solution.
- Demands cross-team standardization of embryo staging and wound size for consistent results.
- Involves adaptation considerations when applying to different genetic backgrounds or environmental conditions.
- Limited by embryo fragility and the narrow time window for blastula-stage manipulation.
