Nieinwazyjne strategie przewlekłej manipulacji aktywnością neuronalną kontrolowaną przez DREADD

DREADD są najpopularniejszym podejściem chemogenetycznym do zdalnej kontroli aktywności neuronalnej. W tym miejscu oferujemy nowe alternatywy dla powtarzalnej lub przewlekłej kontroli DREADD, koncentrując się na mniej inwazyjnych metodach dostarczania CNO. Opisujemy dwie strategie przedłużonego dostarczania CNO u myszy za pomocą powtarzających się kropli do oczu lub przewlekle przez wodę pitną zwierzęcia.

Opisane tutaj protokoły są przykładami przewlekłych i nieinwazyjnych opcji dostarczania CNO, które można dostosować do różnych projektów eksperymentalnych, w tym różnych wariantów DREADD, tkanek, a nawet gatunków. Kluczową kwestią w przypadku porodu CNO jest stres i ból zwierzęcia. Protokoły te minimalizują ten problem i są łatwe do wykonania i dostosowania do różnych ustawień eksperymentalnych.

Przed wykonaniem zabiegu należy oczyścić i wysterylizować ramę stereotaktyczną oraz wszystkie potrzebne instrumenty. Gdy ramka jest gotowa, potwierdź brak reakcji na szczypanie palców u nóg w znieczulonej myszy męskiej typu dzikiego na znieczulonym mieszanym tle, ogol czubek głowy i przymocuj głowę myszy do ramki. Następnie nałóż lubrykant ochronny do oczu na oczy, a na koniec oczyść odsłoniętą skórę sekwencyjnym peelingiem z jodonem i 70% etanolem.

Użyj sterylnego skalpela, aby odsłonić czaszkę i skalibrować ramę do punktu bregma. Wywierć współrzędną przyśrodkowo-boczną 2,9 milimetra i przednią tylną współrzędną minus 2,7 milimetra, aby celować w hipokamp. Kiedy mózg jest odsłonięty, użyj mikrowstrzykiwacza i ciągniętych pipet mikrokapilarnych, aby jednostronnie wstrzyknąć 90 nanolitrów wirusa adenozwiązanego do hipokampa na grzbietowej głębokości brzusznej minus trzy milimetry.

Następnie zamknij nacięcie nylonowymi szwami i wyjmij zwierzę z ramy w celu podania środka przeciwbólowego. W przypadku powtarzalnego podawania CNO, rozpoczynającego się cztery tygodnie po wstrzyknięciu, należy przyzwyczaić zwierzęta do obchodzenia się z nimi, smagając każdą mysz przez trzy minuty dziennie przez trzy do czterech dni przed podaniem kropli do oczu. Kiedy myszy przyzwyczaiły się do obchodzenia się z myszami, zważ każdą mysz, aby określić odpowiednią ilość CNO, która ma być dostarczona, aby osiągnąć stężenie jednego miligrama CNO na kilogram masy ciała.

Na dwie godziny przed wyłączeniem światła w fazie nieaktywnej załaduj od jednego do trzech mikrolitrów przygotowanego roztworu CNO do mikropipety P10 i unieruchomij mysz za pomocą sfatygowania. Powoli wydalaj roztwór, aż na końcówce pipety utworzy się stabilna kropla i ostrożnie zbliż kroplę do rogówki, aż roztwór zostanie dostarczony bez dotykania końcówki pipety do oka myszy. Następnie umieść mysz z powrotem w klatce domowej przed nałożeniem kropli CNO na oko następnego zwierzęcia.

W przypadkach, gdy CNO musi być dostarczone w fazie aktywnej myszy, upewnij się, że jest słabe czerwone światło, aby zapewnić prawidłowe obchodzenie się ze zwierzętami i dostarczanie CNO. W przypadku przewlekłego leczenia CNO, rozpoczynającego się cztery tygodnie po wstrzyknięciu i trzy dni przed rozpoczęciem leczenia, zastąp zwykłe butelki z wodą małymi butelkami zakończonymi gumowymi dziobkami i przykrytymi folią aluminiową zawierającą 10 mililitrów zwykłej wody. Przymocuj do klatek taśmą, aby myszy mogły zaaklimatyzować się w butelkach.

Zmierz dzienne zużycie wody dla każdej myszy i zważ każdą mysz. Przetestuj zakres stężeń CNO, aby określić dawkę, która wykazuje maksymalną skuteczność przy minimalnym stężeniu CNO. Następnie napełnij każdą małą butelkę ośmioma mililitrami zwykłej wody plus wymaganą ilością CNO.

W przypadku ograniczonego leczenia CNO, rozpoczynając cztery tygodnie po wstrzyknięciu i trzy dni przed rozpoczęciem leczenia, umieść małą butelkę zawierającą 10 mililitrów wody plus 1% sacharozy na klatce z dala od oryginalnej butelki z wodą podczas ostatniej porcji aktywnej fazy zwierzęcia. Pod koniec ekspozycji usuń wodę i roztwory sacharozy z każdej klatki i zmierz spożycie sacharozy przez każde zwierzę. W przypadku dostawy CNO napełnij butelki pięcioma mililitrami wody plus 1% sacharozy i jednym miligramem na kilogram CNO.

Umieścić butelkę w tej samej pozycji, w jakiej znajdowała się w okresie aklimatyzacji wody z cukrem podczas ostatniej porcji fazy aktywnej, wyjmując butelki i odmierzając ilość spożytej wody, sacharozy i CNO, jak pokazano. Pod koniec eksperymentu zbierz leczony mózg zwierzęcia na świeży utrwalacz. Po 9 do 12 godzinach krioprotekcjonij tkankę mózgową w 30% roztworze sacharozy.

Kiedy mózg opadnie, podziel próbkę na kriostat. Po uzyskaniu wszystkich skrawków mózgu i zablokowaniu niespecyficznego wiązania, należy inkubować próbki tkanek z roztworem przeciwciała anty-c-Fos w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc przy ciągłym mieszaniu. Następnego ranka umyj próbki trzema pięciominutowymi płukaniami w świeżym PBS na pranie przed inkubacją próbek z odpowiednim fluorescencyjnym przeciwciałem drugorzędowym.

Po godzinie w temperaturze pokojowej i ciągłym mieszaniu chronionym przed światłem, uzyskaj cyfrowe obrazy znakowanych skrawków tkanek za pomocą fluorescencji konfokalnej. Po załadowaniu obrazów do ImageJ, nakreśl obszary zakażonych zakażonych komórek mCherry związanych z adenowirusem i określ ilościowo liczbę komórek fałszywie dodatnich C w tym regionie, aby uzyskać liczbę aktywowanych komórek na obszar. Powtarzające się dostarczanie CNO za pomocą kropli do oczu wywołuje silną indukcję ekspresji cFos w większości zainfekowanych neuronów, co pokazuje, że skuteczność dostarczania CNO utrzymuje się podczas powtarzającej się ekspozycji.

Ponadto obserwuje się znaczącą indukcję cFos w próbkach pobranych dwie godziny po poddaniu działaniu CNO w porównaniu z próbkami uzyskanymi sześć godzin po ekspozycji na CNO, co wskazuje, że zmiany wywołane przez CNO są zależne od czasu. Dzienne spożycie wody plus CNO nie różni się znacząco w porównaniu z całkowitą objętością zwykłej spożywanej wody. Podobnie, ilość wody plus 1% sacharozy spożywanej w nocy nie ma wpływu na dodatek CNO, ani nie obserwuje się różnic w dziennym spożyciu zarówno wody z CNO, jak i wody z sacharozą i CNO w pięciodniowym okresie doświadczalnym.

Podobnie jak w przypadku stosowania kropli do oczu CNO, silną indukcję cFos obserwuje się po dwóch, ale nie sześciu godzinach dostępu do wody pitnej CNO. Ponadto istnieje wyraźny próg skuteczności dla CNO, ponieważ niska dawka CNO nie wywołuje aktywacji cFos w porównaniu z kontrolą soli fizjologicznej, podczas gdy wyższe dawki indukują silną i podobną indukcję cFos. Zalecamy przeprowadzenie analizy odpowiedzi na dawkę w celu określenia najniższej dawki CNO, która nie zmniejsza znacząco aktywacji neuronów, oraz rozważenie zastosowania klozapiny jako liganda.

Tutaj zademonstrowaliśmy użycie indukcji cFos za pośrednictwem CNO w wyniku aktywacji neuronów. Protokoły te można jednak łatwo zaadaptować do analizy elektrofizjologicznej lub testów behawioralnych. Technologia DREADD jest potężnym narzędziem do zdalnego sterowania aktywnością neuronalną i projektowania alternatywnych strategii dostarczania CNO.

Zwiększymy spektrum opcji dla warunków eksperymentalnych i potencjalnych interwencji klinicznych.