Synteza, funkcjonalizacja i charakterystyka fuzogennych porowatych nanocząstek krzemu do dostarczania oligonukleotydów
16 kwietnia 2019
Demonstrujemy syntezę fuzogennych porowatych nanocząsteczek krzemu do skutecznego dostarczania oligonukleotydów in vitro i in vivo. Porowate nanocząstki krzemu są ładowane siRNA w celu utworzenia rdzenia, który jest pokryty fuzogenicznymi lipidami poprzez wytłaczanie w celu utworzenia powłoki. Uwzględniono ugrupowanie celowe, funkcjonalizację i charakterystykę cząstek.
Protokół ten opisuje syntezę systemu nanocząstek, który jest w stanie wyciszyć geny in vivo, dostarczając siRNA z wysoką wydajnością. Poprzez prostą wymianę peptydu docelowego i ładunku siRNA, nanocząstki fuzogenne mogą być wykorzystane jako potencjalny preparat terapeutyczny dla chorób wymagających modulacji genów in vivo. Wcześniej opublikowaliśmy wyniki wykorzystujące nanoplatformę fuzogenną przeciwko infekcjom bakteryjnym Gram-dodatnim poprzez wyciszenie genu kodującego stan zapalny w makrofagach w celu zakończenia przewlekłego stanu zapalnego.
Przed wykonaniem tej procedury zmontuj teflonowe ogniwo trawiące zawierające płytkę krzemową w roztworze kwasu fluorowodorowego w proporcji trzy do jednego. Uruchom prąd przemienny o przebiegu prostokątnym o niskiej gęstości prądu 50 miliamperów na centymetr do kwadratu przez 0,6 sekundy i wysokiej gęstości prądu 400 miliamperów na centymetr do kwadratu przez 0,36 sekundy powtarzane przez 500 cykli. Po zakończeniu trawienia wyjmij ogniwo z obwodu i ostrożnie wypłucz roztwór kwasu fluorowodorowego za pomocą strzykawki.
Następnie spłucz trzykrotnie etanolem. Aby usunąć porowatą warstwę z płytki krzemowej, najpierw napełnij studzienkę komórki wytrawiania 10 mililitrami roztworu kwasu fluorowodorowego od jednego do 29. Następnie uruchom stałą 3,7 miliampera na centymetr kwadratowy przez 250 sekund.
Po zakończeniu trawienia wyjmij ogniwo z obwodu. Porowata warstwa krzemu może mieć widoczne zmarszczki, wskazujące na oderwanie się od krystalicznej płytki krzemowej. Delikatnie wypłukać roztwór kwasu fluorowodorowego i spłukać po trzy razy etanolem i wodą.
Za pomocą końcówki pipety mocno rozbij obwód porowatej warstwy krzemu, aby całkowicie oderwać ją. Za pomocą etanolu zbierz porowate fragmenty lub wióry krzemu z ogniwa wytrawiającego teflonu do łodzi wagowej. Następnie przenieś chipsy do szklanej fiolki w celu przechowywania.
Następnie zastąp etanol w szklanej fiolce zawierającej porowate wióry krzemowe dwoma mililitrami wody wolnej od RNaz. Mocno zakręcić i zamknąć fiolkę za pomocą Parafilm. Umieścić szklaną fiolkę w kąpieli sonikatora i zawiesić tak, aby objętość porowatych wiórów krzemowych była całkowicie zanurzona pod powierzchnią łaźni wodnej.
Aby zapobiec znacznej utracie wody podczas sonikacji, należy umieścić kolbę miarową wypełnioną wodą, odwróconą tak, aby otwór kolby dotykał powierzchni łaźni wodnej. Następnie sonikuj porowate chipy krzemowe przez 12 godzin z częstotliwością 35 kiloherców z mocą RF 48 watów. Po sonikacji umieść szklaną fiolkę na płaskiej powierzchni na jedną godzinę, aby większe cząstki mogły osiąść na dnie.
Następnie zebrać supernatant za pomocą pipety. Do szklanej fiolki dodać 72,55 mikrolitra roztworu DMPC, 15,16 mikrolitra roztworu DSPE-PEG i 19,63 mikrolitra roztworu DOTAP i wymieszać pipetując. Umieścić fiolkę w dygestorii z luźną nakrętką, aby rozpuszczalnik mógł odparować przez noc.
Wysuszony film będzie mętną, twardą, żelową substancją na dnie fiolki. Następnie umieść probówkę do mikrowirówki zawierającą 150 mikrolitrów porowatych nanocząstek krzemu w wcześniej przygotowanej lodowatej kąpieli sonicznej. Pod 15-minutową ultrasonikacją delikatnie odpipetuj 150 mikrolitrów siRNA i 700 mikrolitrów dwumolowego chlorku wapnia do porowatych nanocząstek krzemu.
Wyjmij probówkę zawierającą jeden mililitr porowatych nanocząstek krzemu pokrytych wapniem z sonikatora obciążonych siRNA. Napełnij szeroką zlewkę wodą dejonizowaną. Namocz membranę poliwęglanową i cztery wsporniki filtrów, unosząc je na powierzchni wody.
Następnie zmontuj zestaw do wytłaczania liposomów, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie uwodnić wysuszony film lipidowy w szklanej fiolce jednym mililitrem porowatych nanocząstek krzemu pokrytych wapniem obciążonych siRNA. Pipetować pipetą, aż wszystkie lipidy zostaną usunięte z dna fiolki i zaobserwuje się mętny, jednorodny roztwór.
Dodaj magnetyczny pręt mieszający do szklanej fiolki i umieść fiolkę na płycie grzejnej, aby podgrzać cząstki do 40 stopni Celsjusza, jednocześnie mieszając roztwór magnetycznie przez 20 minut. Następnie podłącz pustą strzykawkę po jednej stronie ekstrudera. Następnie napełnij kolejną strzykawkę jednym mililitrem porowatego roztworu nanocząstek krzemu pokrytego lipidami i przymocuj strzykawkę po drugiej stronie ekstrudera.
Rozpocznij wytłaczanie od powolnego wciskania tłoka, aby przepchnąć cząstki z jednej strzykawki przez membranę poliwęglanową i do drugiej strzykawki. Powtórz 20 razy. Następnie zbierz wytłoczone cząstki do probówki mikrowirówkowej.
Przygotuj bulion peptydowy o stężeniu peptydu jeden miligram na mililitr w wodzie wolnej od RNaz. Do probówki mikrowirówki zawierającej fuzogeniczne, porowate nanocząstki krzemu pokryte lipidami dodaj 100 mikrolitrów peptydu i delikatnie pipetuj. Utrzymuj rurkę statyczną w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
Aby usunąć nadmiar peptydu lub siRNA i innych substancji pomocniczych, przemyj w 30-kilodaltonowym filtrze odśrodkowym, wirując z prędkością 5 000 g w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Odwirować jeszcze dwa razy z jednym mililitrem PBS przy tych samych ustawieniach. Po odwirowaniu ponownie zawiesić końcowe fuzogeniczne, porowate, pokryte lipidami nanocząstki krzemu sprzężone z peptydami w PBS w żądanym stężeniu.
Cząstki można poddawać i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej 30 dni. Udana synteza fuzogennych porowatych nanocząstek krzemu powinna dać jednorodny, lekko nieprzezroczysty roztwór, który może być przechowywany przez 30 dni i rozmrażany bez powodowania zmian strukturalnych. Brak optymalizacji proporcji i stężenia, a także powtarzające się cykle zamrażania i rozmrażania mogą prowadzić do agregacji podczas załadunku.
Gdy cząstki są wytłaczane, średnia średnica hydrodynamiczna fuzogennych porowatych nanocząstek krzemu mierzona za pomocą dynamicznego rozpraszania światła powinna wynosić około 200 nanometrów, a średni potencjał zeta około dodatnio siedem miliwoltów. Po modyfikacji powierzchni za pomocą peptydów celujących, całkowita średnica powinna być mniejsza niż 230 nanometrów, a średni potencjał zeta spada do minus 3,4 miliwolta. Fuzję można potwierdzić poprzez znakowanie lipidów fuzogennych lipofilowym fluoroforem DiI i obserwację lokalizacji in vitro za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Udaną fuzję obserwuje się, gdy lipidy fuzogennej porowatej nanocząstki krzemu przenoszą DiI do błony plazmatycznej i są zlokalizowane niezależnie od lizosomów. Nieudana fuzja wykaże lokalizację DiI w cytoplazmie komórki i kolokalizację z lizosomami. Ten fuzogenny system nanocząstek jest obecnie wykorzystywany do zastosowań terapeutycznych nie tylko w infekcjach bakteryjnych, ale także w terapii adjuwantowej nowotworów i immunoterapii nowotworów.
Protokół ten może być dodatkowo zoptymalizowany, aby ładować więcej niż siRNA. Fuzogeniczny system nanocząstek wykazał potencjał w ładowaniu i dostarczaniu większych ładunków anionowych, takich jak mRNA i kompleksy CRISPR/Cas9.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę syntezy fuzogennych porowatych nanopartykuł krzemowych, zaprojektowanych do wydajnego dostarczania oligonukleotydów in vitro oraz in vivo. Nanopartykule te są konstruowane w celu transportu siRNA i powlekane fuzogennymi lipidami, co zwiększa ich zdolność do dostarczania ładunku.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Synteza nanocząstek
- Systemy dostarczania genów
- Zastosowania terapeutyczne
Wstęp
- Nanocząstki fuzogenne mogą skutecznie wyciszać geny.
- Peptydy celujące oraz ładunki siRNA mogą być dostosowywane do konkretnych potrzeb.
- Poprzednie badania wykazały skuteczność w walce z infekcjami bakteryjnymi.
- Przewlekły stan zapalny może zostać złagodzony poprzez modulację genów.
Cel badania
- Opracowanie systemu nanocząsteczek do wyciszania genów in vivo.
- Zbadanie formulacji terapeutycznych w chorobach wymagających modulacji genów.
- Zademonstrowanie wszechstronności platformy nanocząsteczkowej.
Użyte metody
- Montaż teflonowej celi trawnej z płytką krzemową.
- Wykorzystanie kwasu fluorowodorowego do trawienia krzemu.
- Zastosowanie prądu przemiennego o określonych parametrach w celu formowania nanocząstek.
- Płukanie celi trawnej w celu przygotowania jej do dalszego użytku.
Główne wyniki
- Skuteczna synteza fuzogennych porowatych nanocząstek krzemowych.
- Wysoka wydajność dostarczania siRNA w celu wyciszania genów.
- Potencjał do zastosowań terapeutycznych w różnych jednostkach chorobowych.
- Wykazana zdolność do hamowania przewlekłego stanu zapalnego w makrofagach.
Wnioski
- Nanocząstki fuzogenne są obiecujące w terapii genowej.
- Konfigurowalne systemy dostarczania mogą być ukierunkowane na konkretne schorzenia.
- Wskazane są dalsze badania w celu sprawdzenia dodatkowych zastosowań.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Fusogenne nanopartykuły porowatego krzemu (F-pSiNPs) stanowią modułową platformę dostarczania oligonukleotydów, umożliwiając wyciszanie genów z wysoką wydajnością i omijanie barier związanych z poborem endocytarnym. System ten wspiera szybką walidację celu oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesach odkrywania terapii genowych, co ma bezpośrednie znaczenie dla rozszerzania portfolio o wskazania w obszarze chorób zakaźnych, onkologicznych i immunologicznych. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną we wczesnych etapach odkrywania i w punktach przejścia do fazy przedklinicznej, umożliwiając precyzyjne i regulowane dostarczanie ładunków kwasów nukleinowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednie badanie funkcji genu poprzez wydajne wyciszanie genów in vivo.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez ułatwienie ukierunkowanej modulacji szlaków istotnych dla przebiegu choroby.
- Zapewnia elastyczną platformę do szybkiej wymiany peptydów celujących i ładunków oligonukleotydowych.
- Zwiększa pewność prognostyczną w decyzjach dotyczących wyboru i walidacji celu.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Zapewnia ustandaryzowane, jednorodnie rozmiarowe nanocząsteczki charakteryzowane za pomocą dynamicznego rozpraszania światła w celu uzyskania powtarzalnych wyników analiz.
- Umożliwia ilościową ocenę wychwytu komórkowego i fuzji przy użyciu mikroskopii konfokalnej i znakowania fluorescencyjnego.
- Umożliwia skalowalne przygotowanie zwalidowanych nośników do dalszych procesów przesiewowych.
- Wspiera wiarygodną ocenę skuteczności oligonukleotydów w modelach komórkowych i in vivo.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z modelami istotnymi dla przebiegu chorób, w tym z systemami chorób zakaźnych i zapalnych.
- Zapewnia ciągłość translacyjną poprzez wsparcie modulacji genów in vivo w badaniach przedklinicznych.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne, umożliwiając funkcjonalną walidację hipotez terapeutycznych w odpowiednich modelach zwierzęcych.
- Ułatwia dostosowany do ryzyka rozwój kandydatów do terapii genowej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Platforma F-pSiNP integruje etapy od wczesnego odkrywania po walidację przedkliniczną, wspierając testowanie hipotez, identyfikację wiodących związków oraz badania translacyjne.
- Biologia odkrywcza: Dostarcza niezawodnego narzędzia do izolowania funkcji genów i wyjaśniania roli szlaków poprzez celowaną dostawę oligonukleotydów.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki w zakresie rozmiaru, ładunku i wydajności fuzji nanocząsteczek.
- Analityka: Umożliwia bezpośredni pomiar poboru komórkowego, fuzji błon oraz wyników wyciszania genów.
- Badania translacyjne: Wspiera przejście od walidacji in vitro do skuteczności in vivo w modelach istotnych dla danych jednostek chorobowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako modularny system dostarczania, który można dostosować do różnych kombinacji oligonukleotydów i peptydów ukierunkowujących.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach i rozwoju terapii genowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje syntezę i charakterystykę nanocząstek w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektu (go/no-go) oraz efektywne pod względem kapitałowym rozwijanie portfolio.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz wdrażanie strategii modulacji genów.
Kwestie dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w syntezie nanocząsteczek, funkcjonalizacji powierzchni oraz charakterystyce analitycznej.
- Wymaga dostępu do dynamicznego rozpraszania światła, mikroskopii konfokalnej oraz urządzeń do ekstruzji.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów przygotowania nanocząsteczek i kontroli jakości pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowalna do różnych ładunków oligonukleotydowych i peptydów kierujących dla różnych modeli chorób.
- Ryzyko agregacji i stabilność przechowywania muszą być zarządzane w celu utrzymania wydajności funkcjonalnej.
Najczęściej zadawane pytania dot. biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:42
Synthesis of Porous Silicon Nanoparticles (pSiNPs)
3:12
Preparation of Fusogenic Lipid Film and Loading of siRNA in pSiNPs
4:20
Coating siRNA-loaded pSiNPs with Fusogenic Lipids
5:42
Conjugation of Targeting Peptides
6:45
Results: Characterization of Fusogenic Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery
8:16
Conclusion
