Name: Synteza, funkcjonalizacja i charakterystyka fuzogennych porowatych nanocząstek krzemu do dostarczania oligonukleotydów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-16T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Poznaj metodę syntezy fuzogennych porowatych nanocząstek krzemu do efektywnego dostarczania siRNA in vitro i in vivo. Technika ta umożliwia terapię genową poprzez modulację ekspresji genów w komórkach docelowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez National Institutes of Health poprzez kontrakt # R01 AI132413-01.

1. Synteza porowatych nanocząstek krzemu (pSINPs)
UWAGA: Zawsze zachowuj ostrożność podczas pracy z kwasem fluorowodorowym (HF). Postępuj zgodnie ze wszystkimi instrukcjami bezpieczeństwa zgodnie z kartą charakterystyki (SDS), obchodź się z wszelkimi chemikaliami zawierającymi HF w dygestoriach i noś odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE; podwójne rękawice z rękawicami butylowymi na zewnątrz, fartuch butylowy z fartuchem laboratoryjnym pod spodem, osłona twarzy z okularami ochronnymi pod spodem). Wszystkie uniwersytety i laboratoria badawczo-rozwojowe wymagają specjalnego szkolenia w zakresie bezpieczeństwa HF przed użyciem. Nie próbuj pracować z HF bez uprzedniej zgody lokalnego koordynatora ds. bezpieczeństwa w laboratorium, ponieważ wymagane są dodatkowe środki bezpieczeństwa, które nie zostały tutaj opisane.
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów trawiących
	<ol>
		<li>Aby przygotować roztwór HF w proporcji 3:1 do wytrawiania (stosowany w krokach 1.3 i 1.4), napełnij plastikowy cylinder z podziałką 30 ml wodnego 48% HF i 10 ml absolutnego etanolu (EtOH). Roztwór musi być zawarty w tworzywach sztucznych o dużej gęstości (np. HDPE), ponieważ HF rozpuszcza szkło.</li>
		<li>Aby przygotować roztwór HF w stosunku 1:29 do startu (użyty w kroku 1.5), napełnij plastikowy cylinder z podziałką 1 ml wodnego 48% HF i 29 ml absolutnego etanolu. Roztwór musi być zawarty w tworzywach sztucznych o dużej gęstości (np. HDPE), ponieważ HF rozpuszcza szkło.</li>
		<li>Przygotować 1 M roztwór KOH w 10% EtOH w celu nadmiernego rozpuszczenia pSi (użyte w krokach 1.3 i 1.5).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawianie komórki etch 
	<ol>
		<li>W teflonowej komórce wytrawiającej z dołkiem wytrawiającym 8,6cm2 (powierzchnia jest obliczana poprzez pomiar średnicy powierzchni krzemu dostępnej do wytrawienia w O-ringu i obliczenie powierzchni przez A = πr2), umieść w porządku malejącym (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2a): (1) górna część ogniwa teflonowego; (2) O-ring; (3) ćwiartkę płytki krzemowej monokryształu (1 0 0) o orientacji p++ pociętej na ćwiartki (przy użyciu frezu diamentowego); (4) folia aluminiowa; oraz (5) podstawa ogniwa teflonowego ze delikatnie dokręconymi, aby zapobiec wyciekom.</li>
		<li>Napełnij studzienkę EtOH. Weź chusteczkę i włóż ją w szczelinę między górną częścią ogniwa teflonowego a podstawą. Jeśli chusteczka wyschnie po wyjęciu, komórka wytrawiania jest zapieczętowana. Jeśli jest mokre, ogniwo przecieka i dokręć dalej, aż zostaną uszczelnione.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elektropolerowanie płytki krzemowej
	<ol>
		<li>Przenieś zmontowaną komórkę wytrawiania do dygestorium.</li>
		<li>Napełnij studzienkę 10 ml roztworu HF w proporcji 3:1.</li>
		<li>Podłącz przewód dodatni do folii aluminiowej (elektrody) z ogniwa wytrawiającego i podłącz przewód ujemny do cewki platynowej (przeciwelektrody) zanurzonej w roztworze HF 3:1 ogniwa wytrawiającego, aby zakończyć obwód (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2b).</li>
		<li>Uruchom prąd stały o natężeniu 50 mA cm-2 przez 60 s. Po zakończeniu wytrawiania wyjmij ogniwo z obwodu i ostrożnie wypłucz HF 3:1 za pomocą strzykawki. Spłucz EtOH trzy razy.</li>
		<li>Rozpuścić wytrawioną warstwę, powoli napełniając studzienkę 10 ml 1 M KOH. Poczekaj, aż bulgotanie ustąpi.</li>
		<li>Wypłucz KOH trzykrotnie wodą, a następnie trzykrotnie EtOH</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Elektrochemiczne wytrawianie porowatych warstw w płytce krzemowej
	<ol>
		<li>Uruchom prąd przemienny o przebiegu prostokątnym, o niższej gęstości prądu 50 mA/cm2 przez 0,6 s i wysokiej gęstości prądu 400 mA/cm2 przez 0,36 s powtarzane przez 500 cykli.</li>
		<li>Po zakończeniu wytrawiania wyjmij ogniwo z obwodu i ostrożnie wypłucz HF 3:1 za pomocą strzykawki. Spłucz EtOH trzy razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odnoszenie porowatej warstwy z płytki krzemowej
	<ol>
		<li>Napełnij studzienkę 10 ml roztworu HF w stosunku 1:29.</li>
		<li>Uruchom stałą 3,7 mA/cm2 przez 250 s. Po zakończeniu wytrawiania wyjmij ogniwo z obwodu. Warstwa pSi może mieć widoczne zmarszczki wskazujące na oderwanie się od krystalicznej płytki krzemowej. Delikatnie wypłukać roztwór HF w stosunku 1:29 i trzykrotnie spłukać EtOH, a następnie trzykrotnie wodą.</li>
		<li>Za pomocą końcówki pipety mocno rozerwij obwód warstwy pSi, aby całkowicie oderwać. Za pomocą EtOH zebrać fragmenty (wióry) pSi z teflonowej komórki wytrawiania do łodzi wagowej. Przenieś chipsy do szklanej fiolki. Chipy pSi mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej w EtOH przez ponad 6 miesięcy.</li>
		<li>Rozpuść pozostały porowaty krzem na płytce, powoli napełniając studzienkę 10 ml 1 M KOH. Poczekaj, aż bulgotanie ustąpi.</li>
		<li>Wypłucz KOH trzykrotnie wodą, a następnie trzykrotnie EtOH</li>.
		<li>Powtarzaj kroki 1.3-1.5, aż cała grubość wafla zostanie wytrawiona.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sonikacja warstw porowatych do tworzenia nanocząstek 
	<ol>
		<li>Zastąpić rozpuszczalnik szklanej fiolki zawierającej wiórki pSi z EtOH na 2 ml wody demineralizowanej.</li>
		<li>Mocno zamknij nakrętkę i uszczelnij za pomocą parafilmu.</li>
		<li>Umieść szklaną fiolkę w kąpieli sonikatora i zawieś tak, aby objętość wiórów pSi była całkowicie zanurzona pod powierzchnią.</li>
		<li>Sonicuj przez 12 godzin przy 35 kHz i mocy RF 48W. Aby zapobiec znacznej utracie wody podczas sonikacji, należy umieścić kolbę miarową wypełnioną wodą, odwróconą tak, aby otwór kolby dotykał powierzchni łaźni wodnej.</li>
		<li>Umieść szklaną fiolkę na płaskiej powierzchni na 1 godzinę, aby większe cząstki mogły osiąść na dnie. Zebrać supernatant za pomocą pipety; zawiesina zawiera pSiNP o długości fali poniżej 100 nm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie fuzogennego filmu lipidowego
<ol>
	<li>Przygotowanie podstawowych roztworów lipidów
	<ol>
		<li>W dygestorium wytworzyć zapas lipidów 10 mg/ml poprzez uwodnienie lipidów DMPC, DSPE-PEG-MAL i DOTAP w chloroformie. Te roztwory podstawowe mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy w szczelnym zamknięciu parafilmu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytwarzanie fuzogennego filmu lipidowego 
	UWAGA: Kompozycja fuzogenna składa się z lipidów, DMPC, DSPE-PEG i DOTAP, o stosunku molowym odpowiednio 76,2:3,8:20 i 96,2:3,8:0.
	<ol>
		<li>W szklanej fiolce wymieszać 72,55 μl DMPC, 15,16 μl DSPE-PEG i 19,63 μl DOTAP przez pipetowanie.</li>
		<li>Opcjonalnie: W celu znakowania fluorescencyjnego powłoki lipidowej należy dodatkowo dodać 20 μl DiI rozpuszczonego w EtOH o stężeniu 1 mg/ml.</li>
		<li>Umieścić fiolkę w dygestorium z luźnym wieczkiem, aby chloroform mógł odparować przez noc. Wysuszony film będzie mętną, twardą, żelową substancją na dnie fiolki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ładowanie i uszczelnianie siRNA w pSiNPs
<ol>
	<li>Przygotowanie materiału załadowczego chlorku wapnia
	<ol>
		<li>Rozpuścić 1,11 g CaCl2 w 10 ml wody wolnej od RNAse, aby uzyskać 2 M roztwór CaCl2.</li>
		<li>Odwirować roztwór o stężeniu > 10 000 x g przez 1 minutę, aby osadzić agregaty i zebrać supernatant za pomocą pipety. Alternatywnie przefiltruj roztwór przez filtr 0,22 μm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie materiału załadowczego siRNA
	<ol>
		<li>Uwodnić lub rozcieńczyć siRNA do 150 μM w wodzie wolnej od RNAzy. Roztwór podstawowy można podzielić na porcje i przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -20 °C przez co najmniej 30 dni, pod warunkiem, że nie jest on poddawany częstym cyklom zamrażania i rozmrażania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ładowanie siRNA w pSiNPs chlorkiem wapnia
	<ol>
		<li>Przygotuj lodowatą kąpiel sonikacyjną.</li>
		<li>W ciągu 15 minut ultradźwięków delikatnie odpipetować 150 μL siRNA i 700 μL 2 M CaCl2 do 150 μL pSiNP. Upewnij się, że pokrywa probówki mikrowirówki jest otwarta w celu wytworzenia gazu.</li>
		<li>Wyjmij probówkę zawierającą 1 ml pSiNP pokrytych wapniem z siRNA z sonikatora.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Powlekanie pSiNPs naładowanych siRNA fuzogenicznymi lipidami
<ol>
	<li>Przygotowanie zestawu do wytłaczania liposomów
	<ol>
		<li>Napełnij szeroką zlewkę wodą DI. Namocz 1 membranę poliwęglanową (pory 200 nm) i 4 wsporniki filtrów, unosząc je na powierzchni wody. Zmontuj zestaw do wytłaczania liposomów, postępując zgodnie z instrukcjami producenta</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nawilżanie filmu lipidowego za pomocą pSiNps obciążonych siRNA
	<ol>
		<li>Uwodnić wysuszony film lipidowy w szklanej fiolce za pomocą 1 ml wypełnionych siRNA pSiNP pokrytych wapniem, otrzymanych z kroku 3.3.3. Pipetować do momentu, aż wszystkie warstwy lipidów oderwą się od dna fiolki i zmieszają się w mętny, jednorodny roztwór.</li>
		<li>Umieścić mieszadło magnetyczne w szklanej fiolce i umieścić fiolkę na płycie grzejnej, aby podgrzać cząstki do 40 °C (lub wystarczająco wysoko powyżej temperatury przemiany fazowej lipidów, aby utrzymać lipidy w bardziej płynnej fazie ciekłokrystalicznej), jednocześnie mieszając magnetycznie roztwór przez 20 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytłaczanie powlekanych lipidem pSiNP w celu kontroli wielkości
	<ol>
		<li>Odessać 1 ml roztworu pSiNP-siRNA pokrytego lipidami do strzykawki do wytłaczania. Włożyć pustą strzykawkę po jednej stronie ekstrudera, a napełnioną strzykawkę po drugiej stronie.</li>
		<li>Rozpocznij wytłaczanie, powoli wciskając tłok, aby przepchnąć cząstki z jednej strzykawki przez membranę poliwęglanową i do drugiej. Powtórz 20 razy. Jeśli tłok jest zablokowany, filtr i membrana mogą być zatkane. Zdemontuj ekstruder i wymień membranę oraz wsporniki filtrów. Jeśli problem będzie się powtarzał, rozcieńczyć cząsteczki, aż zatkanie będzie możliwe do opanowania.</li>
		<li>Zbierz wytłaczane cząstki do probówki mikrowirówkowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Koniugacja peptydów docelowych
<ol>
	<li>Sprzęgnięcie peptydu celującego z powłoką lipidową
	<ol>
		<li>Przygotować bulion peptydowy o stężeniu peptydu 1 mg/ml w wodzie wolnej od RNAzy.</li>
		<li>Do probówki mikrowirówki zawierającej fuzogeniczne pSiNP pokryte lipidami dodać 100 μl wywaru peptydowego o stężeniu 1 mg/ml i delikatnie odpipetować. Utrzymuj rurkę statycznie w temperaturze pokojowej przez 20 minut (alternatywnie > 2 godziny w temperaturze 4 °C).</li>
		<li>W celu usunięcia nadmiaru peptydu lub siRNA i innych substancji pomocniczych, przemyć w filtrze odśrodkowym o sile 30 kDa, wirując z prędkością 5 000 x g w temperaturze 25 °C przez 1 godzinę. Odwirować jeszcze dwukrotnie z 1 ml PBS w tym samym ustawieniu.</li>
		<li>Zawiesić końcowe fuzogenne pSiNP pokryte peptydem w PBS w żądanym stężeniu. Cząstki można teraz podzielić na porcje i zamrozić w temperaturze -80 °C w celu przechowywania przez co najmniej 30 dni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+therapeutics%3A+big+potential+from+small+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">siRNA therapeutics: big potential from small RNAs.</a> Gene Therapy. 12, 5(2004).</li>
<li>Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+pharmacology%3A+progresses+in+siRNA+delivery+and+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications.</a> Gene Therapy. 24, 151(2017).</li>
<li>Broderick, J. A., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">MicroRNA therapeutics.</a> Gene Therapy. 18, 1104(2011).</li>
<li>Geisler, A., Fechner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-regulated+viral+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy.</a> World Journal of Experimental Medicine. 6 (2), 37-54 (2016).</li>
<li>Williams, P. D., Kingston, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid-mediated+gene+therapy+for+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).</li>
<li>Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downstream+processing+of+plasmid+DNA+for+gene+therapy+and+DNA+vaccine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications.</a> Trends in Biotechnology. 18 (9), 380-388 (2000).</li>
<li>Shim, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+gene+editing%3A+delivery+and+regulatory+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738(2017).</li>
<li>Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+DNA+With+Fingers+and+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Targeting DNA With Fingers and TALENs.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1, (2012).</li>
<li>Dai, W. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+for+in+vivo+Gene+Therapy%3A+Promise+and+Hurdles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e349(2016).</li>
<li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communications. 9 (1), 1911(2018).</li>
<li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Many+Pathways+of+RNA+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Many Pathways of RNA Degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li>
<li>Sahay, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+siRNA+delivery+by+lipid+nanoparticles+is+limited+by+endocytic+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).</li>
<li>Wang, Y., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+window+onto+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A window onto siRNA delivery.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 611-612 (2013).</li>
<li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle-mediated+siRNA+delivery%2C+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).</li>
<li>Kim, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogene+therapy+with+fusogenic+nanoparticles+modulates+macrophage+response+to+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus.</a> Nature Communications. 9 (1), 1969(2018).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Disruption+of+G%3Csub%3E0%3C%2Fsub%3E%2FG%3Csub%3E1%3C%2Fsub%3E+Switch+Gene+2+Enhances+Adipose+Lipolysis%2C+Alters+Hepatic+Energy+Balance%2C+and+Alleviates+High-Fat+Diet%E2%80%93Induced+Liver+Steatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Targeted Disruption of G0/G1 Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet–Induced Liver Steatosis.</a> Diabetes. 63 (3), 934-946 (2014).</li>
<li>Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+delivery+of+MicroRNA+mimics+with+polyethylenimine+elevates+pulmonary+microRNA+levels%2C+but+lacks+pulmonary+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Pulmonary+Circulation%22%5BJournal%5D)">Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity.</a> Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613(2018).</li>
<li>Komarov, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genetics-directed+identification+of+novel+pharmacological+inhibitors+of+FAS-+and+TNF-dependent+apoptosis+that+protect+mice+from+acute+liver+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure.</a> Cell Death & Disease. 7, e2145(2016).</li>
</ol>

MJS jest naukowym założycielem Spinnaker Biosciences, Inc. i posiada udziały w spółce. Chociaż dotacja ta została zidentyfikowana w celu zarządzania konfliktem interesów w oparciu o ogólny zakres projektu i jego potencjalne korzyści dla Spinnaker Biosciences, Inc., wyniki badań zawarte w tej konkretnej publikacji niekoniecznie muszą odnosić się do interesów Spinnaker Biosciences. Inc. Warunki tej umowy zostały zweryfikowane i zatwierdzone przez Uniwersytet Kalifornijski w San Diego zgodnie z jego zasadami dotyczącymi konfliktu interesów. Inni autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Syntezę porowatych nanocząstek krzemu przedstawiono na rysunku 5. Krytycznym etapem syntezy fuzogennych pSiNPs jest etap ładowania (etap 3). Jeśli fuzogenne nanocząstki agregują się po syntezie (rysunek 3), przyczyna może być następująca: (1) materiał wyjściowy chlorku wapnia nie został przygotowany jednorodnie, dlatego należy dokładnie przestrzegać lub rafinować etap 3.1.2; lub (2) stosunek pSiNP : siRNA : CaCl2 lub stężenie jednego lub więcej z trze...

Terapia genowa moduluje specyficzną ekspresję genów, aby uzyskać wynik terapeutyczny. Odkryto i zbadano liczne narzędzia do modulacji genów, w tym interferencję kwasu rybonukleinowego (RNAi) za pomocą oligonukleotydów (np. krótkiego interferującego RNA (siRNA)1,2, microRNA (miRNA)3,4), plazmidy DNA5,6, nukleazy (np. palec cynkowy, TALENS)7,8 oraz systemy CRISPR/Cas99,10. Chociaż mechanizm działania każdego narzędzia jest inny, wszystkie narzędzia muszą dotrzeć do cytoplazmy komórki lub jądra, aby były aktywne. W związku z tym, chociaż udowodniono, że narzędzia te wywołują znaczący wpływ na modulowanie ekspresji genów in vitro, skuteczność in vivo cierpi z powodu przeszkód zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych. Ze względu na fakt, że narzędzia są pochodzenia biologicznego, w naszym ciele istnieje wiele enzymów i systemów klirensowych, które mają zdolność degradacji lub usuwania obcych cząsteczek11. Nawet w przypadku, gdy narzędzia dotrą do komórki docelowej, cierpią na endocytozę; Tryb wychwytu komórkowego, który zamyka i więzi narzędzia w kwaśnych pęcherzykach przypominających żołądek, które degradują lub wydalają narzędzia z komórki. W rzeczywistości badania wykazały, że nanocząstki lipidowe są endocytozowane przez makropinocytozę, z której około 70% siRNA jest egzocytozowane z komórek w ciągu 24 godzin od wchłonięcia12,13. Większość pozostałego siRNA jest degradowana przez szlak lizosomalny i ostatecznie tylko 1-2% siRNA, które początkowo dostaje się do komórki z nanocząstkami, osiąga endosomalną ucieczkę, aby potencjalnie przejść RNAi13,14.
Niedawno opracowaliśmy fuzogeniczne porowate nanocząstki krzemu (F-pSiNPs), które mają rdzeń naładowany siRNA, składający się z porowatych nanocząsteczek krzemu, oraz fuzogeniczną powłokę lipidową15. F-pSiNP mają trzy główne zalety w porównaniu z innymi konwencjonalnymi systemami dostarczania oligonukleotydów: (1) fuzogenna powłoka lipidowa, która umożliwia cząstkom ominięcie endocytozy i dostarczenie całego ładunku bezpośrednio do cytoplazmy komórki (w porównaniu z 1-2% osiągniętym przez cząstki endocytozowane13,14) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1); (2) wysokie obciążenie masowe siRNA w pSiNPs (>20% wag. w porównaniu do 1-15% wag. przez konwencjonalne systemy)<klasa sup = "xref">15, które szybko ulegają degradacji w cytoplazmie (gdy cząstki rdzenia zrzucają powłokę lipidową poprzez wychwyt fuzogenny) w celu uwolnienia siRNA; oraz (3) ukierunkowanie koniugacji peptydów w celu selektywnego naprowadzania na pożądane typy komórek in vivo.  
System F-pSiNP wykazał znaczącą skuteczność wyciszania genów (>95% in vitro; >80% in vivo) i późniejszy efekt terapeutyczny w śmiertelnym mysim modelu >S. aureus pneumonia; którego wyniki zostały opublikowane wcześniej15. Jednak złożona struktura systemu F-pSiNP wymaga delikatnego obchodzenia się z nim i precyzyjnej optymalizacji w celu wygenerowania jednolitych i stabilnych nanocząstek. W związku z tym celem tej pracy jest przedstawienie dokładnego protokołu, a także strategii optymalizacyjnych w zakresie syntezy, funkcjonalizacji i charakterystyki F-pSiNPs, które mają być stosowane w ukierunkowanym dostarczaniu siRNA w celu uzyskania silnego efektu wyciszania genów.

<table><tbody><tr><td>1,2-dimyrystoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DMPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850345P</td><td>Proszek</td></tr><tr><td>1,2-dioleoilo-3-trimetyloamonowo-propan (sól chlorkowa) (DOTAP)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>890890P</td><td>Proszek</td></tr><tr><td>1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-[maleimid(glikol polietylenowy)-2000] (sól amonowa) (DSPE-PEG(2000) Maleimid)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880126P</td><td>Proszek</td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>VWR International, LLC</td><td>12175-001</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (CaCl2)</td><td>Spectrum</td><td>C1977</td><td>Bezwodny, granulki</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C6061</td><td></td></tr><tr><td>Komputer</td><td>Dell</td><td>Dimension 9200</td><td>Dopuszczalny</td></tr> <tr><td>jest dowolny komputer z gniazdem karty PCIDil Stain (nadchloran 1,1'-dioctadecylo-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny ("DiI"; DiIC18(3)))Life</td> <td>Technologies</td><td>D3911</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (EtOH)</td><td>UCSD Sklep</td><td>111</td><td>200 Proof</td></tr><tr><td>Kwas hydroflurynowy (HF)</td><td>VWR International, LLC</td><td>MK264008&nbsp;</td><td>Czystość: 48%</td></tr><tr><td>Miernik źródłowy Keithley 2651a</td><td>Przykładowy program Keithley</td><td>2651A</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td><td>dostępny pod adresem:</td></tr> <tr><td>http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/ LysoTracker Green DND-26</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L7526</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wytłaczania liposomów z blokiem grzewczym</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Microcon-30kDa Odśrodkowy Jednostka filtrująca</td><td>EMD Millipore</td><td>MRCF0R030</td><td></td></tr><tr><td>O-ring</td><td>ChemGlass</td><td>CG-305-220</td><td></td></tr><tr><td>Sola fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Cewka platynowa</td><td>VWR International, LLC</td><td>AA10285-BU</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu (KOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-3</td><td></td></tr><tr><td>Wafel</td> <td>krzemowySiltronix</td><td>na zamówienie</td><td></td></tr><tr><td>niestandardowe siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>na zamówienie</td><td>IRF5, sense 5'-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3' i antysensowne 5'-dTdT UCA GGG UUA UUC GCA G dTdT-3'</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>VWR International, LLC</td><td>97043-960</td><td></td></tr><tr><td>Peptyd celujący (CRV)</td><td>CPC Scientific</td><td>Sekwencja zamówień niestandardowych</td><td>CRVLRSGSC; wytwarzany cyklicznie przez wiązanie dwusiarczkowe między łańcuchami bocznymi dwóch reszt cysteiny Ogniwo</td></tr><tr><td>teflonowe</td><td>Interface Performance Materials, Inc.</td><td>Na zamówienie</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Woda destylowana wolna od DNaz/RNaz&nbsp;</td><td>Thermo Fisher 10977015</td><td></td><td></td> Naukowy</tr></tbody></table>

synteza, funkcjonalizacja i charakterystyka fuzogennych porowatych nanocząstek krzemu do dostarczania oligonukleotydów

Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery

Wraz z pojawieniem się terapii genowej, rozwój skutecznego systemu dostarczania ładunku nukleotydów in vivo stał się równolegle ważny. Fusogeniczne porowate nanocząstki krzemu (F-pSiNPs) wykazały ostatnio wysoką skuteczność wyciszania genów in vivo ze względu na wysoką zdolność ładowania oligonukleotydów i unikalny szlak wychwytu komórkowego, który pozwala uniknąć endocytozy. Synteza F-pSiNPs jest procesem wieloetapowym, który obejmuje: (1) ładowanie i uszczelnianie ładunków oligonukleotydowych w porach krzemu; (2) jednoczesne powlekanie i wymiarowanie fuzogennych lipidów wokół porowatych rdzeni krzemowych; oraz (3) koniugacja peptydów celujących i płukanie w celu usunięcia nadmiaru oligonukleotydów, resztek krzemu i peptydu. Jednorodność wielkości cząstki charakteryzuje się dynamicznym rozpraszaniem światła, a jej strukturę rdzeń-powłoka można zweryfikować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Wychwyt fuzogeniczny jest weryfikowany przez załadowanie barwnika lipofilowego, nadchloranu 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny (DiI), do fuzogennej dwuwarstwy lipidowej i poddanie go komórkom in vitro w celu obserwacji barwienia błony plazmatycznej w porównaniu z lokalizacjami endocytarnymi. Skuteczność celowania i wyciszania genów in vivo została wcześniej określona ilościowo w mysim modelu zapalenia płuc Staphylococcus aureus, w którym oczekuje się, że peptyd celujący pomoże F-pSiNPs zadomowić się w miejscu infekcji. Poza zastosowaniem w zakażeniu S. aureus, system F-pSiNP może być stosowany do dostarczania dowolnego oligonukleotydu do terapii genowej wielu chorób, w tym infekcji wirusowych, nowotworów i chorób autoimmunologicznych.

Pomyślna synteza fuzogennych pSiNPs powinna dać jednorodny, lekko mętny roztwór (Rysunek 3a). Brak optymalizacji stosunku i stężenia pSiNPs : siRNA : CaCl2 może prowadzić do agregacji podczas ładowania (Rysunek 3b). Ponieważ cząstki są przeciskane przez membrany 200 nm, średnia średnica hydrodynamiczna fuzogennych pSiNPs mierzona metodą DLS powinna wynosić około 200 nm, a średni potencjał zeta około +7 mV, jak pokazano...

Demonstrujemy syntezę fuzogennych porowatych nanocząsteczek krzemu do skutecznego dostarczania oligonukleotydów in vitro i in vivo. Porowate nanocząstki krzemu są ładowane siRNA w celu utworzenia rdzenia, który jest pokryty fuzogenicznymi lipidami poprzez wytłaczanie w celu utworzenia powłoki. Uwzględniono ugrupowanie celowe, funkcjonalizację i charakterystykę cząstek.

Synteza, funkcjonalizacja i charakterystyka fuzogennych porowatych nanocząstek krzemu do dostarczania oligonukleotydów

With the advent of gene therapy, the development of an effective in vivo nucleotide-payload delivery system has become of parallel import. Fusogenic ...

Protokół ten opisuje syntezę systemu nanocząstek, który jest w stanie wyciszyć geny in vivo, dostarczając siRNA z wysoką wydajnością. Poprzez prostą wymianę peptydu docelowego i ładunku siRNA, nanocząstki fuzogenne mogą być wykorzystane jako potencjalny preparat terapeutyczny dla chorób wymagających modulacji genów in vivo. Wcześniej opublikowaliśmy wyniki wykorzystujące nanoplatformę fuzogenną przeciwko infekcjom bakteryjnym Gram-dodatnim poprzez wyciszenie genu kodującego stan zapalny w makrofagach w celu zakończenia przewlekłego stanu zapalnego.Przed wykonaniem tej procedury zmontuj teflonowe ogniwo trawiące zawierające płytkę krzemową w roztworze kwasu fluorowodorowego w proporcji trzy do jednego. Uruchom prąd przemienny o przebiegu prostokątnym o niskiej gęstości prądu 50 miliamperów na centymetr do kwadratu przez 0,6 sekundy i wysokiej gęstości prądu 400 miliamperów na centymetr do kwadratu przez 0,36 sekundy powtarzane przez 500 cykli. Po zakończeniu trawienia wyjmij ogniwo z obwodu i ostrożnie wypłucz roztwór kwasu fluorowodorowego za pomocą strzykawki.Następnie spłucz trzykrotnie etanolem. Aby usunąć porowatą warstwę z płytki krzemowej, najpierw napełnij studzienkę komórki wytrawiania 10 mililitrami roztworu kwasu fluorowodorowego od jednego do 29. Następnie uruchom stałą 3,7 miliampera na centymetr kwadratowy przez 250 sekund.Po zakończeniu trawienia wyjmij ogniwo z obwodu. Porowata warstwa krzemu może mieć widoczne zmarszczki, wskazujące na oderwanie się od krystalicznej płytki krzemowej. Delikatnie wypłukać roztwór kwasu fluorowodorowego i spłukać po trzy razy etanolem i wodą.Za pomocą końcówki pipety mocno rozbij obwód porowatej warstwy krzemu, aby całkowicie oderwać ją. Za pomocą etanolu zbierz porowate fragmenty lub wióry krzemu z ogniwa wytrawiającego teflonu do łodzi wagowej. Następnie przenieś chipsy do szklanej fiolki w celu przechowywania.Następnie zastąp etanol w szklanej fiolce zawierającej porowate wióry krzemowe dwoma mililitrami wody wolnej od RNaz. Mocno zakręcić i zamknąć fiolkę za pomocą Parafilm. Umieścić szklaną fiolkę w kąpieli sonikatora i zawiesić tak, aby objętość porowatych wiórów krzemowych była całkowicie zanurzona pod powierzchnią łaźni wodnej.Aby zapobiec znacznej utracie wody podczas sonikacji, należy umieścić kolbę miarową wypełnioną wodą, odwróconą tak, aby otwór kolby dotykał powierzchni łaźni wodnej. Następnie sonikuj porowate chipy krzemowe przez 12 godzin z częstotliwością 35 kiloherców z mocą RF 48 watów. Po sonikacji umieść szklaną fiolkę na płaskiej powierzchni na jedną godzinę, aby większe cząstki mogły osiąść na dnie.Następnie zebrać supernatant za pomocą pipety. Do szklanej fiolki dodać 72,55 mikrolitra roztworu DMPC, 15,16 mikrolitra roztworu DSPE-PEG i 19,63 mikrolitra roztworu DOTAP i wymieszać pipetując. Umieścić fiolkę w dygestorii z luźną nakrętką, aby rozpuszczalnik mógł odparować przez noc.Wysuszony film będzie mętną, twardą, żelową substancją na dnie fiolki. Następnie umieść probówkę do mikrowirówki zawierającą 150 mikrolitrów porowatych nanocząstek krzemu w wcześniej przygotowanej lodowatej kąpieli sonicznej. Pod 15-minutową ultrasonikacją delikatnie odpipetuj 150 mikrolitrów siRNA i 700 mikrolitrów dwumolowego chlorku wapnia do porowatych nanocząstek krzemu.Wyjmij probówkę zawierającą jeden mililitr porowatych nanocząstek krzemu pokrytych wapniem z sonikatora obciążonych siRNA. Napełnij szeroką zlewkę wodą dejonizowaną. Namocz membranę poliwęglanową i cztery wsporniki filtrów, unosząc je na powierzchni wody.Następnie zmontuj zestaw do wytłaczania liposomów, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie uwodnić wysuszony film lipidowy w szklanej fiolce jednym mililitrem porowatych nanocząstek krzemu pokrytych wapniem obciążonych siRNA. Pipetować pipetą, aż wszystkie lipidy zostaną usunięte z dna fiolki i zaobserwuje się mętny, jednorodny roztwór.Dodaj magnetyczny pręt mieszający do szklanej fiolki i umieść fiolkę na płycie grzejnej, aby podgrzać cząstki do 40 stopni Celsjusza, jednocześnie mieszając roztwór magnetycznie przez 20 minut. Następnie podłącz pustą strzykawkę po jednej stronie ekstrudera. Następnie napełnij kolejną strzykawkę jednym mililitrem porowatego roztworu nanocząstek krzemu pokrytego lipidami i przymocuj strzykawkę po drugiej stronie ekstrudera.Rozpocznij wytłaczanie od powolnego wciskania tłoka, aby przepchnąć cząstki z jednej strzykawki przez membranę poliwęglanową i do drugiej strzykawki. Powtórz 20 razy. Następnie zbierz wytłoczone cząstki do probówki mikrowirówkowej.Przygotuj bulion peptydowy o stężeniu peptydu jeden miligram na mililitr w wodzie wolnej od RNaz. Do probówki mikrowirówki zawierającej fuzogeniczne, porowate nanocząstki krzemu pokryte lipidami dodaj 100 mikrolitrów peptydu i delikatnie pipetuj. Utrzymuj rurkę statyczną w temperaturze pokojowej przez 20 minut.Aby usunąć nadmiar peptydu lub siRNA i innych substancji pomocniczych, przemyj w 30-kilodaltonowym filtrze odśrodkowym, wirując z prędkością 5 000 g w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Odwirować jeszcze dwa razy z jednym mililitrem PBS przy tych samych ustawieniach. Po odwirowaniu ponownie zawiesić końcowe fuzogeniczne, porowate, pokryte lipidami nanocząstki krzemu sprzężone z peptydami w PBS w żądanym stężeniu.Cząstki można poddawać i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej 30 dni. Udana synteza fuzogennych porowatych nanocząstek krzemu powinna dać jednorodny, lekko nieprzezroczysty roztwór, który może być przechowywany przez 30 dni i rozmrażany bez powodowania zmian strukturalnych. Brak optymalizacji proporcji i stężenia, a także powtarzające się cykle zamrażania i rozmrażania mogą prowadzić do agregacji podczas załadunku.Gdy cząstki są wytłaczane, średnia średnica hydrodynamiczna fuzogennych porowatych nanocząstek krzemu mierzona za pomocą dynamicznego rozpraszania światła powinna wynosić około 200 nanometrów, a średni potencjał zeta około dodatnio siedem miliwoltów. Po modyfikacji powierzchni za pomocą peptydów celujących, całkowita średnica powinna być mniejsza niż 230 nanometrów, a średni potencjał zeta spada do minus 3,4 miliwolta. Fuzję można potwierdzić poprzez znakowanie lipidów fuzogennych lipofilowym fluoroforem DiI i obserwację lokalizacji in vitro za pomocą mikroskopii konfokalnej.Udaną fuzję obserwuje się, gdy lipidy fuzogennej porowatej nanocząstki krzemu przenoszą DiI do błony plazmatycznej i są zlokalizowane niezależnie od lizosomów. Nieudana fuzja wykaże lokalizację DiI w cytoplazmie komórki i kolokalizację z lizosomami. Ten fuzogenny system nanocząstek jest obecnie wykorzystywany do zastosowań terapeutycznych nie tylko w infekcjach bakteryjnych, ale także w terapii adjuwantowej nowotworów i immunoterapii nowotworów.Protokół ten może być dodatkowo zoptymalizowany, aby ładować więcej niż siRNA. Fuzogeniczny system nanocząstek wykazał potencjał w ładowaniu i dostarczaniu większych ładunków anionowych, takich jak mRNA i kompleksy CRISPR/Cas9.

synthesis-functionalization-characterization-fusogenic-porous-silicon

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

W niniejszym artykule przedstawiono wysokoprzepustową metodę syntezy oligosacharydów oraz ich przyłączania do powierzchni nanocząsteczek polianhydrydu w celu ich dalszego wykorzystania w celowaniu w specyficzne receptory na komórkach prezentujących antygen.

Wysokoprzepustowa synteza węglowodanów i funkcjonalizacja nanocząstek polianhydrydu

Dostarczanie pozostaje głównym wyzwaniem dla terapeutycznej implementacji małego interferującego RNA (siRNA). Protokół ten polega na wykorzystaniu wielofunkcyjnej i biokompatybilnej platformy dostarczania siRNA, składającej się z porowatych mikrocząstek krzemu szczepionych argininą i polietyleniną.

Porowate mikrocząsteczki krzemu do dostarczania terapii siRNA

Opisujemy kluczowe etapy biodetekcji za pomocą tranzystorów polowych z polikrzemu nanoprzewodowego, w tym przygotowanie urządzenia oraz immobilizację i potwierdzenie sondy molekularnej DNA na powierzchni nanodrutu, a także warunki do wykrywania DNA.

Przygotowanie tranzystora polowego z nanodrutu krzemowego do zastosowań chemicznych i biosensorycznych

Prezentujemy nowatorską metodę, która wykorzystuje fotoczułe kopolimery blokowe do bardziej efektywnej czasoprzestrzennej kontroli wyciszania genów bez wykrywalnych efektów poza celem. Ponadto zmiany w ekspresji genów można przewidzieć za pomocą prostych testów uwalniania siRNA i prostego modelowania kinetycznego.

Przewidywanie wyciszania genów poprzez czasoprzestrzenną kontrolę uwalniania siRNA z reagujących na światło nanonośników polimerowych

Opisujemy metodę syntezy biokompatybilnych nanocząsteczek złota 10 nm, funkcjonalizowanych przez powlekanie powierzchni glikolu polietylenowego. Cząstki te mogą być wykorzystywane in vitro i in vivo do dostarczania środków terapeutycznych do nanoskalowych przestrzeni komórkowych i zewnątrzkomórkowych, które są trudno dostępne przy konwencjonalnych rozmiarach nanocząstek.

Synteza funkcjonalizowanych cząstek złota pokrytych polimerem 10 nm do celowania w śródbłonek i dostarczania leków

Tutaj prezentujemy protokół projektowania i wytwarzania nanostrukturalnych porowatych folii krzemowych (PSi) jako degradowalnych nośników dla czynnika wzrostu nerwów (NGF). Różnicowanie neuronalne i wzrost komórek PC12 i neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) myszy są charakteryzowane po leczeniu nośnikami PSi załadowanymi NGF.

Projektowanie porowatych filmów krzemowych jako nośników czynnika wzrostu nerwów

Przedstawiono metody przygotowania i scharakteryzowania właściwości fizykochemicznych i bioaktywności neutralnie naładowanych, reagujących na pH nanocząstek siRNA. Omówiono kryteria skutecznego stosowania nanoleków siRNA, takie jak rozmiar, morfologia, ładunek powierzchniowy, obciążenie siRNA i wyciszanie genów.

Przygotowanie neutralnie naładowanych, reagujących na pH nanocząstek polimerowych do dostarczania cytozolowego siRNA

Dostarczamy protokoły i reprezentatywne dane do projektowania, montażu i charakteryzowania miceli kompleksu polielektrolitowego, nanocząstek typu rdzeń-powłoka tworzonych przez polielektrolity i hydrofilowe naładowane-nienaładowane kopolimery blokowe.

Montaż i charakterystyka miceli kompleksu polielektrolitu

Protokół opisuje tworzenie wytrzymałych i biokompatybilnych mikrokapsułek z DNA jako multipleksowane biosensory in vitro zdolne do śledzenia kilku ligandów.

Przygotowanie wielofunkcyjnych mikrokapsułek na bazie jedwabiu wypełnionych plazmidami DNA kodującymi aptamery RNA i ryboprzełączniki

Nanożele są doskonałą i wszechstronną platformą nanocząsteczek do dostarczania leków biologicznych. Reagujące na bodźce polimerowe nanożele na bazie glikolu poli(etylenowego), zdolne do kapsułkowania ładunków opartych na białkach, zsyntetyzowano przy użyciu jednoetapowej strategii sieciowania ko-nanopolimeryzacji w warunkach wodnych. Przedstawiono tutaj optymalne wytwarzanie i charakterystykę tych nowych nanocząstek.

Synteza nanożeli reagujących na bodźce przy użyciu wodnego jednoetapowego sieciowania i konanopolimeryzacji

Protokół ten szczegółowo opisuje syntezę, enkapsulację hemoglobiny oraz powierzchniową PEGylację hierarchicznie porowatych nanocząstek UiO-66 zaprojektowanych do dostarczania tlenu. Procedura łączy inżynierię defektów z koniugacją biortogonalną wspieraną przez odkształcenie, aby uzyskać wysoce przepuszczalne i fizjologicznie stabilne nośniki odpowiednie do zastosowań biomedycznych.

Synteza, enkapsulacja hemoglobiny i biortogonalna PEGylacja w hierarchicznie porowatych nanocząstkach UiO-66 do zastosowań dostarczania tlenu

Poznaj metodę syntezy fuzogennych porowatych nanocząstek krzemu do efektywnego dostarczania siRNA in vitro i in vivo. Technika ta umożliwia terapię genową poprzez modulację ekspresji genów w komórkach docelowych.

Synteza, funkcjonalizacja i charakterystyka fuzogennych porowatych nanocząstek krzemu do dostarczania oligonukleotydów

Przeglądaj więcej filmów