Wykorzystanie tlenku deuteru jako nieinwazyjnego, nieśmiertelnego narzędzia do oceny składu ciała i spożycia wody przez ssaki

Korzystając z tego protokołu, tlenek deuteru lub D2O, nieradioaktywny, stabilny izotop wody, może być użyty do oszacowania składu ciała i zużycia wody. Technika ta jest nieinwazyjna i dlatego może być stosowana do oceny składu ciała u gatunków zagrożonych, a także u ludzi i gatunków domowych. Unikalnym zastosowaniem techniki rozcieńczania tlenku deuteru jest możliwość pomiaru zużycia wody przez wolno żyjące dzikie zwierzęta o wysokim wskaźniku odłowu lub zwierzęta trzymane społecznie.

Chociaż znieczulenie nie jest wymagane, osobom niezaznajomionym z podawaniem zastrzyków podskórnych może być łatwiej uspokoić zwierzęta przed podaniem tlenku deuteru. Procedurę zademonstrują wraz ze mną i Sarah Hooper Amanda Eshelman i Ashley Cowan, studentki weterynarii, oraz Alicia Roistacher, doktorantka z mojego laboratorium. Aby przygotować 50-mililitrowy roztwór podstawowy dziewięciu gramów na litr zasolonego tlenku deuteru, najpierw zważ 450 miligramów chlorku sodu klasy farmaceutycznej i zapisz dokładną ilość z dokładnością do czterech miejsc po przecinku.

Przenieś całą sól do wysterylizowanej 100-mililitrowej zlewki i odmierz 50 gramów większego lub równego 99,8% tlenku deuteru w sterylnym, wyskalowanym cylindrze. Zapisać dokładną ilość tlenku deuteru z dokładnością do czterech miejsc po przecinku i przenieść tlenek deuteru do sterylnej zlewki z chlorkiem sodu. Następnie przymocuj igłę o rozmiarze 20 do niepirogennego, sterylnego filtra dyskowego z submikronowymi porami wyposażonymi w 10-mililitrowy cylinder strzykawki i włóż igłę do przegrody sterylnej, pustej 100-mililitrowej fiolki.

Podłącz rurkę próżniową do igły o rozmiarze 22 i włóż igłę do przegrody 100-mililitrowej fiolki. Następnie załaduj 10 mililitrów chlorku sodu o stężeniu izosmotycznym do cylindra strzykawki i powoli włącz próżnię, aż roztwór tlenku deuteru zacznie powoli filtrować się do fiolki. Kontynuuj wlewanie roztworu podstawowego tlenku deuteru do cylindra strzykawki, aż cała objętość 50 mililitrów zostanie przefiltrowana.

Po potwierdzeniu braku reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonego nietoperza, użyj wacika nasączonego alkoholem, aby oczyścić uropatagium nad żyłą międzyudową i pozostaw zdezynfekowaną błonę ogonową do wyschnięcia. Nałóż cienką warstwę wazeliny na żyłę międzyudową i użyj igły o rozmiarze 29, aby nakłuć grzbietową część żyły międzyudowej. Następnie użyj plastikowych probówek kapilarnych z heparyną sodu, aby zebrać 100 mikrolitrów krwi.

Aby zapewnić odpowiednie wymieszanie krwi pełnej z heparyną sodową, delikatnie zwiń każdą probówkę po pobraniu krwi przed etykietowaniem. Po określeniu masy tlenku deuteru w gramach do wstrzyknięcia, należy załadować strzykawkę insulinową wyposażoną w igłę o rozmiarze 29 odpowiednią objętością tlenku deuteru. Zważyć strzykawkę i igłę insulinową obciążoną deuterem, zapisując wagę z dokładnością do czterech miejsc po przecinku, i wstrzyknąć całą objętość tlenku deuteru podskórnie na grzbietową część biodra znieczulonego nietoperza.

Zalecamy użycie precyzyjnej wagi z antystatyczną osłoną przeciwwiatrową i upewnienie się, że przed wstrzyknięciem należy odciągnąć tłok, aby zapewnić podciśnienie. Bezpośrednio po wstrzyknięciu należy zważyć pustą strzykawkę insulinową i igłę i zapisać masę ciała z dokładnością do czterech miejsc po przecinku. W ciągu 30 minut po pobraniu krwi użyj wirówki hematokrytowej, aby odwirować każdą rurkę kapilarną z prędkością 10 000 g przez pięć minut.

Za pomocą ostrych nożyczek przetnij plastikową rurkę kapilarną między krwią pełną a osoczem i użyj pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby wydalić osocze bezpośrednio do oznakowanej probówki o pojemności 500 mikrolitrów. Po okresie równowagi zbierz i przechowuj kolejne 100 mikrolitrów krwi z żyły międzyudowej, jak właśnie pokazano. W przypadku analizy spektrofotometrii FTIR należy ustawić temperaturę kąpieli piaskowej na 60 stopni Celsjusza, aby ułatwić destylację, a następnie dodać 50 mikrolitrów każdej próbki osocza i wzorca do indywidualnych stożkowych nasadek mikrowirówek o pojemności 1,5 mililitra.

Trzymając nasadkę mikrowirówki do góry nogami, przykręć stożkową rurkę do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra do nasadki i umieść odwróconą probówkę w kontakcie z piaskiem w kąpieli piaskowej na co najmniej 12 godzin. Następnego ranka umieść nową, czystą nakrętkę na każdej probówce i pulsuj probówki mikrowirówki przez 10 sekund w mikrowirówce. Zainstaluj ogniwo transmisyjne z cieczą w spektrometrze FTIR i napełnij ogniwo metanolem.

Podłącz port do wstrzykiwań i powoli napełniaj kuwetę wodą w tle, ostrożnie wyjmując strzykawkę z metanolem, aby zmniejszyć ryzyko powstania pęcherzyków powietrza. Podłącz rurkę do portu wyjściowego, aby umożliwić usunięcie próbek po analizie, a następnie otwórz oprogramowanie spektrometru FTIR. Ustaw parametry zgodnie z tabelą i zbierz próbkę tła za pomocą rozcieńczalnika, przefiltrowanej do 0,22 mikrometra, wody destylowanej.

Wstrzyknij 40 mikrolitrów wzorca tlenku deuteru o zerowej liczbie części na milion, a następnie zapisz i zapisz widma jako plik z wartościami oddzielonymi przecinkami. Po wstrzyknięciu i zapisaniu widm wszystkich wzorców w celu utworzenia krzywej wzorcowej, wstrzyknij 40 mikrolitrów każdej destylowanej próbki do ciekłej komórki transmisyjnej i zapisz widma. Dzięki znanemu czasowi równowagi można określić całkowitą ilość wody w organizmie, beztłuszczową masę ciała i masę tkanki tłuszczowej dla dziko żyjących dużych nietoperzy brązowych i dużych nietoperzy brunatnych żyjących w niewoli.

Ujemną masę tkanki tłuszczowej można obliczyć z jednego lub więcej z następujących powodów: nieotrzymanie całej dawki tlenku deuteru, odrętwienie w fazie równowagi, posiadanie nienormalnie dużej masy tłuszczu i minimalnej masy beztłuszczowej lub posiadanie poniżej trzech do 5% tkanki tłuszczowej, jak określono za pomocą podwójnej absorpcjometrii rentgenowskiej. Tutaj pokazano reprezentatywny procent tkanki tłuszczowej oznaczony techniką rozcieńczania tlenku deuteru w porównaniu z podwójną absorpcjometrią rentgenowską. Te dwie techniki są dobrze skorelowane, przy czym masa tkanki tłuszczowej wykazuje silne korelacje między tkanką tłuszczową a masą ciała, a technika rozcieńczania tlenkiem deuteru nie konsekwentnie zawyża lub nie zaniża masy tkanki tłuszczowej.

Metoda rozcieńczania tlenkiem deuteru została wcześniej zwalidowana u kotów, a technika została dostosowana, aby umożliwić pomiar dziennego spożycia wody przez koty trzymane w pomieszczeniach socjalnych podczas każdego bloku dietetycznego eksperymentu. Pamiętaj, że ta technika powinna być wykonywana tylko na zdrowych zwierzętach i że powinieneś dokładnie zważyć, zarejestrować i dostarczyć pełną dawkę tlenku deuteru każdemu zwierzęciu. Drugorzędna metoda określania składu ciała, taka jak pełna analiza tuszy lub DEXA, może zostać opracowana w celu walidacji techniki tlenku deuteru.

Ta technika pozwoliła nam zidentyfikować kota trzymanego w pomieszczeniach socjalnych, który spożywał nienormalnie duże ilości wody, bez oddzielania każdego kota w celu zmierzenia jego spożycia wody.