Zwiększenie wszczepienia indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych poprzez przejściowe hamowanie aktywności kinazy Rho

Nasze dane pokazują, że przejściowe hamowanie aktywności kinazy Rho zwiększa adhezję, przeżycie i wszczepienie kardiomiocytów pochodzących z hiPSC po przeszczepieniu do serc zwierząt po zawale. Zapewniamy prostą, tanią, a jednocześnie wysoce skuteczną metodę zwiększania wszczepienia przeszczepionych kardiomiocytów pochodzących z hiPSC do uszkodzonych serc zwierząt. Ponieważ technika ta może bezpiecznie i skutecznie poprawić tempo wszczepiania komórek w ostrym zawale serca i niewydolności serca, przyczynia się do poprawy funkcji serca, naczyń krwionośnych i apoptozy.

Chociaż przetestowaliśmy nasze protokoły tylko w hiPSC, metody te można zastosować do innych typów komórek, takich jak embrionalne komórki macierzyste, mezenchymalne komórki macierzyste i tak dalej. Dawka i czas trwania leczenia Y-27632 mają kluczowe znaczenie. Demonstracja wizualna może bardzo szczegółowo zademonstrować wszystkie kluczowe kroki w protokole, co jest korzystne dla kogoś, kto nigdy wcześniej nie wykonywał tej techniki.

W 21 dniu po różnicowaniu hiPSC-CM należy odessać pożywkę i raz przemyć komórki sterylnym PBS. Inkubuj komórki z 0,5 mililitra enzymów dysocjacji komórek na studzienkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do siedmiu minut. Po czasie inkubacji kilkakrotnie odpipetować zawiesinę komórek za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra w celu dokładnej dysocjacji komórek.

Następnie dodaj jeden mililitr roztworu neutralizującego do każdej studzienki, zbierz mieszaninę komórek w 15-mililitrowej probówce wirówkowej i odwiruj 200 razy g przez trzy minuty. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w roztworze neutralizującym. Następnie przesadź komórki na pokryte żelatyną, sześciodołkowe płytki o gęstości dwóch milionów komórek na dołek.

Po 24 do 48 godzinach zastąp pożywkę hodowlaną pożywką oczyszczającą na trzy do pięciu dni. Przed przeszczepem należy hodować komórki w grupie leczonej przez 12 godzin w pożywce RB-plus uzupełnionej 10-mikromolowym Y-27632. Podobnie, należy przeprowadzić leczenie werapamilem na komórkach w pożywce RB-plus z jednym mikromolem werapamilu przez 12 godzin.

Po zabiegu należy raz przemyć hiPSC-CM PBS i inkubować komórki z 0,5 mikrolitra enzymów dysocjacji komórek na studzienkę przez maksymalnie dwie minuty. Kilkakrotnie pipetować zawiesinę komórek za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra, aby dokładnie oddzielić komórki. Następnie zneutralizuj komórki roztworem neutralizującym, zbierz mieszaninę komórek w 15-mililitrowej probówce wirówkowej i odwiruj 200 razy g przez trzy minuty.

Po odwirowaniu ponownie zawiesić komórki w PBS w stężeniu 0,1 miliona komórek na pięć mikrolitrów w ramach przygotowań do wstrzyknięcia. Bezpośrednio po indukcji zawału mięśnia sercowego wstrzyknij pięć mikrolitrów kontrolnych hiPSC-CM, hiPSC-CM traktowanych Y-27632, hiPSC-CM leczonych werapamilem lub równą objętość PBS do mięśnia sercowego myszy w każdym miejscu, jeden w obszarze zawału i dwa w obszarach wokół zawału. Na 12 godzin przed wykonaniem wykrywania przejściowych stanów wapnia i kurczliwości należy dodać 10-mikromolowy Y-27632, 100-nanomolowy RA, jednomikromolowy werapamil lub równą objętość PBS do pożywki hodowlanej hiPSC-CMs.

Następnie wyrzuć pożywkę i raz umyj płytkę PBS. Zmień pożywkę na DMEM wolny od czerwieni fenolowej zawierający 0,02 procenta wagowego na objętość poliolu powierzchniowo czynnego, pięciomikromolowego wskaźnika wapnia i odpowiadającego mu Y-27632, RA, werapamilu lub równej objętości PBS i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po inkubacji wyrzucić supernatant, trzykrotnie przemyć komórki bezbarwnikowym DMEM i pozostawić pożywkę na 30 minut w celu deestryfikacji barwnika mapującego.

Umieść szkiełko nakrywkowe z nasionami komórek w otwartej komorze kąpieli i włóż komorę do systemu mikroinkubacji o temperaturze 37 stopni Celsjusza z automatycznym regulatorem temperatury. Perfuzjuj go roztworem Tyrode'a i ciągle dodawaj RI, RA lub PBS do roztworu perfuzyjnego. Użyj odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego i laserowej głowicy skanującej, aby zarejestrować spontaniczne stany przejściowe wapnia za pomocą skanu linii x-t.

Rejestruj spontaniczne skurcze hiPSC-CM za pomocą funkcji kontrastu różnicowego interferencyjnego mikroskopu konfokalnego. Przeżywalność przeszczepionych komórek została potwierdzona przez zwiększoną aktywność lucyferazy. Zwiększona ekspresja ludzkiej troponiny sercowej T i ludzkiego antygenu jądrowego wykazała, że wstępne leczenie Y-27632 może znacznie poprawić szybkość wszczepiania komórek.

Wstępnie potraktowane komórki Y-27632 wykazywały większą i bardziej zdefiniowaną strukturę cytoszkieletu w kształcie pręcika. Ponadto wstępne leczenie Y-27632 zmniejszyło liczbę komórek TUNEL-dodatnich, co wskazuje na zmniejszoną apoptozę przeszczepionego hiPSC-CM in vivo. Western blot sugerował, że wstępne leczenie Y-27632 zwiększało ekspresję integryny beta-1 i N-kadheryny oraz zmniejszało ekspresję łańcucha lekkiego fosfo-miozyny 2.

Ta zmiana została znormalizowana 72 godziny po wycofaniu Y-27632. Eksperymenty in vitro z przyłączaniem mysich komórek HL-1 wykazały, że wstępne leczenie Y-27632 znacznie zwiększyło przyleganie hiPSC-CM w stosunku do HL-1. Wstępna obróbka Y-27632 zmniejszyła siłę skurczu, szczytową fluorescencję przejściową wapnia i czas trwania przejściowego wapnia.

Wstępne leczenie Y-27632 regulowało skurcz kardiomiocytów poprzez znaczne zmniejszenie ekspresji cTnI i cTnT. Podobnie jak w przypadku Y-27632, wstępne leczenie werapamilem zwiększyło aktywność lucyferazy i liczbę podwójnie dodatnich komórek hcTnT / HNA. Najważniejszym krokiem jest hodowla komórek w grupie leczonej przez 12 godzin w pożywce Rb-plus uzupełnionej 10-mikromolowym Y-27632.

Opierając się na tej metodzie, obiecującą strategią jest powolne uwalnianie Y-27632 w celu dalszego zwiększenia szybkości wszczepiania komórek. Technika ta toruje naukowcom drogę do badania fizjologii i funkcji hiPSC CM in vivo. Mała cząsteczka CHIR99021 używana do różnicowania kardiomiocytów jest niebezpieczna, co może powodować podrażnienie dróg oddechowych.

Proszę w żaden sposób nie przyjmować ani nie wdychać.