Name: Zwiększenie wszczepienia indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych poprzez przejściowe hamowanie aktywności kinazy Rho (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Poznaj metodę zwiększania wszczepienia kardiomiocytów pochodzących z hiPSC poprzez przejściowe hamowanie kinazy Rho. Protokół wykorzystuje inhibitor Y-27632 w modelu zawału mięśnia sercowego u myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Dr. Josephowi C. Wu (Uniwersytet Stanforda) za uprzejme dostarczenie konstrukcji Fluc-GFP oraz Dr. Yanwen Liu za doskonałą pomoc techniczną. Badanie to jest wspierane przez granty National Institutes of Health RO1 HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (dla J.Z.) i HL121206A1 (dla L.Z.) oraz grant R56 HL142627 (dla WZ), American Heart Association Scientist Development Grant 16SDG30410018 oraz University of Alabama w Birmingham Faculty Development Grant (dla W.Z.).

Wszystkie procedury na zwierzętach w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Alabama w Birmingham i były oparte na wytycznych National Institutes of Health Laboratory Animal Care and Use (Publikacja NIH nr 85-23).
1. Przygotowanie pożywek hodowlanych i płytek hodowlanych
<ol>
	<li>Przygotowanie podłoża
	<ol>
		<li>W przypadku pożywki hiPSC zmieszać 400 ml podłoża podstawowego z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) (tabela materiałów 1) i 100 ml suplementu hPSC 5x; mieszaninę przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>W przypadku pożywki RPMI 1640/B27 minus insulina (RB-) wymieszaj 500 ml RPMI 1640 i 10 ml suplementu B27 bez insuliny.</li>
		<li>W przypadku pożywki RPMI 1640/B27 (RB+) wymieszaj 500 ml RPMI 1640, 10 ml suplementu B27 i 5 ml antybiotyku penicylina-streptomycyna (pen-strep).</li>
		<li>Dla pożywki oczyszczającej16, wymieszaj 500 ml RPMI 1640 bez glukozy, 10 ml suplementu B27, 5 ml antybiotyku pen-strep i 1,000 μL roztworu DL-mleczanu sodu (o końcowym stężeniu 4 mM).</li>
		<li>Aby uzyskać roztwór neutralizujący, wymieszaj 200 ml RPMI 1640, 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2,5 ml antybiotyku pen-strep i 50 μl Y-27632 (przy końcowym stężeniu 10 μM).</li>
		<li>W przypadku pożywki do zamrażania wymieszać 9 ml FBS, 1 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) i 10 μl Y-27632 (przy końcowym stężeniu 10 μM).</li>
		<li>W przypadku roztworu macierzy zewnątrzkomórkowej (EMS) należy rozmrozić zagęszczoną macierz zewnątrzkomórkową (tabela materiałów 1) w temperaturze 4 °C, aż do osiągnięcia równomiernie spójnego stanu ciekłego. Schłodzone końcówki i probówki do pipet przed przygotowaniem podwielokrotności matrycy po 350 μl każda na lodzie i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Przed pokryciem płytek rozcieńczyć jedną rozmrożoną porcję w 24 ml lodowatego podłoża DMEM/F12 (EMS); przechowywać EMS w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni. 
		nuta: Wszystkie etapy powlekania należy wykonać na lodzie, aby zapobiec zestaleniu się macierzy błony podstawnej.</li>
		<li>Do roztworu Tyrode'a weź 90% końcowej wymaganej objętości wody klasy kultur tkankowych, dodaj odpowiednią ilość następujących odczynników i mieszaj aż do rozpuszczenia. Następnie użyj 1 N NaOH, aby dostosować pH do 7,4. Dodaj więcej wody do końcowego stężenia 140 mmol/l chlorku sodu, 1 mmol/l chlorku magnezu, 10 mmol/L HEPES, 5 mmol/L chlorku potasu, 10 mmol/L glukozy i 1,8 mmol/L chlorku wapnia. Sterylizować przez filtrację, używając membrany 0,22 μm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powlekanie płytki do hodowli komórkowych
	<ol>
		<li>W przypadku płytek hodowlanych hiPSC należy nałożyć 1 ml EMS na każde zagłębienie płytki 6-dołkowej i inkubować płytkę przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Odessać roztwór DMEM/F12 przed wysiewem komórek.</li>
		<li>W celu pokrycia żelatynowego rozpuść 0,2 g żelatyny w proszku w wodzie klasy kultur tkankowych, aby uzyskać 0,2% (w/v) roztwór. Sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C, 15 psi przez 30 min. Pokryć każde zagłębienie płytki 6-dołkowej 2 ml roztworu i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Przed pasażowaniem komórek należy odessać roztwór i pozostawić płytkę do wyschnięcia przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej wewnątrz okapu do hodowli tkankowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. utrzymanie hiPSC i różnicowanie Ddifferentiate kardiomiocytów
<ol>
	<li>Hoduj hiPSC w pożywce hiPSC (patrz krok 1.1.1) z codzienną zmianą pożywki, aż komórki osiągną 80%-90% konfluencji na studzienkę. 
	nuta: Do celów konserwacyjnych hiPSC są zazwyczaj gotowe do przejścia co 4 dni.</li>
	<li>Aby przejść przez hiPSC, odessać pożywkę i przemyć studzienkę 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Dodać 0,5 ml roztworu do oddzielania komórek macierzystych (tabela materiałów 1) do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5–7 min. 
	nuta: Czas inkubacji zależy od gęstości komórek i szybkości dysocjacji, które można zaobserwować pod mikroskopem.</li>
	<li>Zneutralizować roztwór do odłączania komórek macierzystych za pomocą 1 ml pożywki hiPSC uzupełnionej 5 μM Y-27632. Zebrać mieszaninę do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować probówkę przez 5 minut przy 200 x g, odessać supernatant bez naruszania osadu komórkowego, a następnie ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki hiPSC zawierającej 5 μM Y-27632.</li>
	<li>Wysiewać hiPSC na nowej 6-dołkowej płytce pokrytej EMS w stosunku od 1:6 do 1:18. Po 24 godzinach zmień pożywkę na pożywkę hiPSC bez Y27632.</li>
	<li>Aby zamrozić komórki, należy ponownie zawiesić zdysocjowane hiPSC w pożywce zamrażającej o stężeniu 0,5–1 miliona/500 μl, umieścić zawiesinę w kriowialach i przechowywać je w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Po 24 godzinach przenieść zamrożone fiolki do ciekłego azotu.</li>
	<li>Aby to zmienić, zastąp pożywkę hiPSC 2 ml pożywki RB uzupełnionej 10 μM inhibitorem GSK-3β CHIR99021 (CHIR) przy 80%-90% konfluencji komórek. Po 24 godzinach zastąpić pożywkę 3 ml pożywki RB i inkubować przez dodatkowe 48 godzin (dzień 3).</li>
	<li>W dniu 3 zmień pożywkę na 3 ml pożywki RB z 10 μM inhibitorem Wnt IWR1 przez 48 godzin (dzień 5), a następnie zastąp pożywkę 3 ml pożywki RB i utrzymuj przez 48 godzin (dzień 7).</li>
	<li>W 7 dniu zastąp pożywkę 3 ml pożywki RB i zmieniaj pożywkę co 3 dni. Spontaniczne bicie hiPSC-CM należy obserwować między 7 a 10 dniem.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie hiPSC-CMs i wstępna obróbka małych cząsteczek
UWAGA: Do dysocjacji hiPSC-CM użyto wysoce oczyszczonych, rekombinowanych enzymów dysocjacji komórek (Tabela Materiałów 1).
<ol>
	<li>W 21 dniu po różnicowaniu hiPSC-CM odessać pożywkę i przemyć komórki 1x sterylnym PBS. Inkubować komórki z 0,5 ml enzymów dysocjujących komórki na studzienkę przez 5–7 minut w temperaturze 37 °C. Wielokrotnie pipetować zawiesinę komórek za pomocą pipety o pojemności 1 ml w celu dokładnej dysocjacji komórek.</li>
	<li>Po dysocjacji komórek dodać 1 ml roztworu neutralizującego do każdej studzienki, zebrać mieszaninę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować przy 200 x g przez 3 minuty. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w roztworze neutralizującym.</li>
	<li>Ponownie posadź komórki na pokrytych żelatyną płytkach 6-dołkowych o gęstości 2 milionów komórek na dołek.</li>
	<li>Po 24–48 godzinach zastąp pożywkę pożywką oczyszczającą na 3–5 dni. 
	nuta: Oczyszczanie jest zakończone, gdy ponad 90% komórek w każdym polu widzenia mikroskopu bije. Aby zapobiec dalszemu uszkodzeniu kardiomiocytów, nie należy przedłużać czasu oczyszczania powyżej 5 dni. Jeśli pierwsza runda nie przyniesie wymaganej czystości, zastąp pożywkę oczyszczającą pożywką RB+ na 1 dzień, a następnie zakończ drugą rundę oczyszczania.</li>
	<li>Przed przeszczepem należy hodować komórki w grupie leczonej przez 12 godzin w pożywce RB+ uzupełnionej 10 μM Y-27632. Podobnie należy przeprowadzić leczenie werapamilem na komórkach w pożywce RB+ za pomocą 1 μM werapamilu przez 12 godzin (hiPSC-CMs+VER).</li>
	<li>Po poddaniu działaniu substancji należy przemyć hiPSC-CMs 1x PBS i inkubować komórki z 0,5 ml enzymów dysocjacji komórek na dołek przez maksymalnie 2 minuty. Kilkakrotnie pipetować zawiesinę komórek za pomocą pipety o pojemności 1 ml, aby dokładnie zdysocjować komórki. Zneutralizować komórki roztworem neutralizującym, zebrać mieszaninę komórek w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 x g przez 3 minuty. Zawiesić komórki w PBS w stężeniu 0,1 miliona komórek/5 μl w celu przygotowania do wstrzyknięcia.</li>
</ol>
4. Zawał mięśnia sercowego i przeszczep komórek
UWAGA: Wszystkie narzędzia chirurgiczne są wstępnie sterylizowane w autoklawie i utrzymywane w stanie aseptycznym podczas wielu operacji za pomocą sterylizatora z gorącymi kulkami (Tabela materiałów 2).
<ol>
	<li>Znieczulenie myszy NOD/scid (tabela materiałów 2) wziewnym izofluranem (1,5%-2%). Monitoruj poziom znieczulenia na podstawie reakcji myszy na uszczypnięcie palca u nogi. Umieść maść optyczną weterynarza na oczach, aby zapobiec ich wysuszeniu podczas zabiegu.</li>
	<li>Podawać podskórnie 0,1 mg/kg buprenorfiny w celu złagodzenia bólu przed zabiegiem.</li>
	<li>Ustaw i zabezpiecz mysz w pozycji leżącej na rozgrzanym stole operacyjnym, usuń włosy z brzusznej okolicy szyi i lewej klatki piersiowej za pomocą kremu do depilacji, odsłoń skórę i zdezynfekuj ją 70% alkoholem.</li>
	<li>Wytnij 0,5 cm nacięcie na środku szyi za pomocą nożyczek chirurgicznych, oddziel podskórny tłuszcz sterylnymi kleszczami i odsłoń tchawicę. Wprowadzić doustnie kaniulę intubacyjną do tchawicy, podłączyć kaniulę do respiratora dla małych zwierząt i dostosować ustawienia wentylacji (ustaw objętość oddechową na 100–150 μl, a częstość oddechów na 100x–150x na minutę).</li>
	<li>Po ustabilizowaniu się myszy wytnij 0,5 cm nacięcie na środku skóry lewej klatki piersiowej. Użyj kleszczy, aby tępo oddzielić warstwę mięśniową i wykonaj małe nacięcie w piątej przestrzeni międzyżebrowej, aby odsłonić jamę klatki piersiowej. Umieść retraktor w nacięciu, aby otworzyć jamę piersiową i zlokalizować lewą zstępującą tętnicę wieńcową (LAD). Pod mikroskopem chirurgicznym preparacyjnym podwiązaj LAD za pomocą 8-0 szew niewchłanialny.</li>
	<li>Bezpośrednio po indukcji zawału mięśnia sercowego należy wstrzyknąć 5 μl hiPSC-CMs-RI, hiPSC-CMs+RI, hiPSC-CMs-VER, hiPSC-CMs+VER lub równą objętość PBS do mięśnia sercowego myszy w każdym miejscu (3 x 105 komórek/zwierzę, 1 x 105 komórek/miejsce), jeden w obszar zawału i dwa w obszary wokół zawału. 
	nuta: Ponieważ 5 μl to bardzo mała objętość, nie jest łatwo dokładnie kontrolować objętość poprzez bezpośrednie zasysanie jej strzykawką. Pokrywkę sterylnej szalki Petriego można odwrócić, a 5 μl komórek można najpierw nanieść na pokrywkę za pomocą pipety. Ze względu na napięcie powierzchniowe nie rozprzestrzenia się, ale skondensuje się w niewielką płynną masę. Może być łatwo wchłonięty i wstrzyknięty do mięśnia sercowego myszy.</li>
	<li>Wyeliminuj resztki powietrza w jamie klatki piersiowej, wypełniając ją ciepłym izotonicznym roztworem soli fizjologicznej. Zszyj żebra, mięśnie i skórę w kolejności za pomocą wchłanialnego szwu 6-0. Wyłączyć wstrzykiwanie znieczulenia izofluranem. Trzymaj zwierzęta operowane na poduszce grzewczej i uważnie je obserwuj, aż odzyskają pełną świadomość. Następnie umieść zwierzęta w czystej klatce. Nie należy zwracać zwierząt do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie zostaną w pełni wyleczone.</li>
	<li>Po zabiegu chirurgicznym należy wstrzykiwać myszom dootrzewnowo buprenorfinę (0,1 mg/kg) co 12 godzin przez 3 kolejne dni i wstrzykiwać im ibuprofen (5 mg/kg) co 12 godzin przez jeden dzień. Wykonaj kolejne badania analityczne w określonych punktach czasowych. 
	nuta: Postępuj zgodnie z wytycznymi lokalnej komisji opieki nad zwierzętami dotyczącymi analgezji.</li>
</ol>
5. Zapis stanów przejściowych wapnia i kurczliwości
<ol>
	<li>Szkiełka nakrywkowe o średnicy 15 mm należy umieścić w autoklawie (tabela materiałów 2) i pęsetę w małej szklanej zlewce w temperaturze 121 °C, 15 psi przez 15 min. Szkiełka nakrywkowe i pęsetę schłodzić w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Za pomocą pęsety umieść szkiełko nakrywkowe w 12-dołkowej płytce i odpipetuj 300 μl macierzy zewnątrzkomórkowej na każde szkiełko nakrywkowe. 
	nuta: Nie pozwól, aby matryca wystawała poza krawędź szkiełka nakrywkowego, aby zapobiec zmniejszeniu ilości powłoki matrycy. Inkubować 12-dołkową płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Odessać pożywkę na pokrytej żelatyną 6-dołkowej płytce z oczyszczonymi hiPSC-CMs, przemyć ją 1x PBS, a następnie wytrawić 0,5 ml enzymów dysocjujących komórki przez 1,5 min. Dodać 1 ml roztworu neutralizującego, pipetować kilkakrotnie nie więcej niż 5x–10x pipetą o pojemności 1 ml i odwirować mieszaninę przy 200 x g przez 3 min.</li>
	<li>Odessać powlekaną macierz zewnątrzkomórkową z szkiełek nakrywkowych. Policz liczbę komórek i ponownie zawieś komórki w roztworze neutralizującym do stężenia 40 000/300 μl, a następnie dodaj 300 μl zawiesiny komórek na każde szkiełko nakrywkowe. Wyhodować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po 24 godzinach delikatnie odessać zobojętniony roztwór, dodać 500 μl pożywki RB+ do każdego dołka płytki i kontynuować hodowlę przez 2 dni.</li>
	<li>Dodać Y-27632 (10 μM), aktywator kinazy Rho (RA, 100 nM), werapamil (1 μM) lub równą objętość PBS do pożywki hodowlanej hiPSC-CMs, 12 godzin przed wykryciem przejściowego wapnia i kurczliwości. 
	nuta: Oprócz wykrywania przejściowości wapnia i kurczliwości komórek po 12 godzinach obróbki chemicznej, testowano również wykrywanie tych parametrów po 12, 24, 48 i 72 godzinach od wycofania chemicznego.</li>
	<li>Wyjmij płytkę, wyrzuć podłoże i umyj płytkę 1x PBS. Zmienić pożywkę na DMEM wolny od czerwieni fenolowej zawierający 0,02% (w/v) poliolu środka powierzchniowo czynnego (tabela materiałów 1), wskaźnik wapnia 5 μM (tabela materiałów 1) i odpowiadający mu Y-27632 (10 μM), RA (100 nM), werapamil (1 μM) lub równą objętość PBS, i inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wyrzuć supernatant, przemyj komórki 3x bezbarwnikową pożywką DMEM i pozwól pożywce odpocząć przez 30 minut, aby odestryfikować barwnik mapujący.</li>
	<li>Umieścić szkiełko nakrywkowe z nasionami komórek w otwartej komorze kąpieli i włożyć komorę do systemu mikroinkubacji o temperaturze 37 °C z automatycznym regulatorem temperatury (tabela materiałów 2), perfuzjować go roztworem Tyrode'a i ciągle dodawać inhibitor kinazy Rho (RI), RA lub PBS do roztworu perfuzyjnego.</li>
	<li>Użyj odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego (Tabela materiałów 2) i laserowej głowicy skanującej (Tabela materiałów 2), aby zarejestrować spontaniczne stany przejściowe wapnia za pomocą skanowania linii x-t, przy użyciu lasera argonowego 488 nm do wzbudzenia barwnika i filtra barierowego 515 ± 10 nm do zbierania światła emisyjnego. Rejestruj spontaniczne skurcze hiPSC-CM za pomocą funkcji kontrastu interferencji różnicowej w mikroskopie konfokalnym (tabela materiałów 2). 
	nuta: Zapisy stanów przejściowych wapnia przetworzono i przeanalizowano za pomocą oprogramowania MATLAB R2016A (Tabela materiałów 4). Testy zmian skurczu komórek przeprowadzono przy użyciu oprogramowania ImageJ (Tabela materiałów 4).</li>
</ol>

<ol><li>Menasche, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+clinical+use+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiac+progenitors%3A+a+translational+experience%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience.</a> European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).</li>
<li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+de+novo+cardiomyocytes%3A+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li>
<li>Frisch, S. M., Francis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+epithelial+cell-matrix+interactions+induces+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis.</a> Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).</li>
<li>Haun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+anoikis+signalling+pathway+using+the+fungal+virulence+factor+gliotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin.</a> Nature Communications. 9 (1), 3524(2018).</li>
<li>Ohashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-associated+kinase+ROCK+activates+LIM-kinase+1+by+phosphorylation+at+threonine+508+within+the+activation+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).</li>
<li>Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-associated+kinase-dependent+contraction+of+stress+fibres+and+the+organization+of+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+The+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions.</a> Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).</li>
<li>Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoikis+molecular+pathways+and+its+role+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).</li>
<li>Legate, K. R., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+that+regulate+adaptor+binding+to+beta-integrin+cytoplasmic+tails%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails.</a> Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
<li>Emre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ROCK+inhibitor+Y-27632+improves+recovery+of+human+embryonic+stem+cells+after+fluorescence-activated+cell+sorting+with+multiple+cell+surface+markers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers.</a> PLoS One. 5 (8), e12148(2010).</li>
<li>Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+Inhibitor+Y-27632+Promotes+Human+Retinal+Pigment+Epithelium+Survival+by+Altering+Cellular+Biomechanical+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties.</a> Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).</li>
<li>Laflamme, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infarcted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts.</a> Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).</li>
<li>Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCND2+Overexpression+Enhances+the+Regenerative+Potency+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes%3A+Remuscularization+of+Injured+Ventricle%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle.</a> Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).</li>
<li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li>
<li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+Oxidation+Is+Indispensable+for+Survival+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).</li>
<li>Ong, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Single-Cell+Analysis+of+Transplanted+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+After+Acute+Myocardial+Infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction.</a> Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Y-27632+Preconditioning+Enhances+Transplantation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+in+Myocardial+Infarction+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice.</a> Cardiovascular Research. , (2018).</li>
<li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li>
<li>Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+inhibition+promotes+atypical+anoikis+in+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells.</a> Cell Death & Disease. 5, e1012(2014).</li>
<li>Lelievre, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-cadherin+mediates+neuronal+cell+survival+through+Bim+down-regulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation.</a> PLoS One. 7 (3), e33206(2012).</li>
<li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+cell+motility+by+carbon+ion+irradiation+via+the+Rho+signaling+pathway+and+its+inhibition+by+the+ROCK+inhibitor+Y-27632+in+lung+adenocarcinoma+A549+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells.</a> Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).</li>
<li>Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKC-beta+exacerbates+in+vitro+brain+barrier+damage+in+hyperglycemic+settings+via+regulation+of+RhoA%2FRho-kinase%2FMLC2+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kluczowe etapy tego badania obejmują uzyskanie czystych hiPSC-CM, poprawę aktywności hiPSC-CM poprzez wstępne leczenie Y-27632 i wreszcie przeszczepienie precyzyjnej ilości hiPSC-CM do mysiego modelu MI.
Kluczowe kwestie, które zostały tutaj poruszone, polegały na tym, że po pierwsze, zoptymalizowaliśmy metody oczyszczania bez glukozy19 i opracowaliśmy nowatorski, wydajny system oczyszczania. Procedura systemowa obejmowała zastosowanie enzymów dysocjacji komórek, ponown...

Terapie oparte na komórkach macierzystych wykazały znaczny potencjał w leczeniu uszkodzeń serca spowodowanych przez MI1. Zastosowanie zróżnicowanych hiPSCs stanowi niewyczerpane źródło hiPSC-CMs2 i otwiera drzwi do szybkiego rozwoju przełomowych metod leczenia. Pozostaje jednak wiele ograniczeń w translacji terapeutycznej, w tym wyzwanie związane z bardzo niskim wskaźnikiem wszczepiania wszczepionych komórek.
Dysocjacja komórek za pomocą trypsyny inicjuje anoikis3, który jest przyspieszany tylko wtedy, gdy te komórki są wstrzykiwane do trudnych warunków, takich jak niedokrwienny mięsień sercowy, gdzie niedotlenione środowisko przyspiesza bieg w kierunku śmierci komórki. Spośród pozostałych komórek duża część jest wypłukiwana z miejsca implantacji do krwiobiegu i rozprzestrzenia się po całym obwodzie. Jednym z kluczowych szlaków apoptotycznych jest szlak RhoA/ROCK4. Opierając się na wcześniejszych badaniach, szlak RhoA/ROCK reguluje organizację cytoszkieletu aktyny5,6, który jest odpowiedzialny za dysfunkcję komórki7,8. Inhibitor ROCK Y-27632 jest szeroko stosowany podczas dysocjacji i pasażu komórek somatycznych i macierzystych, w celu zwiększenia adhezji komórek i zmniejszenia apoptozy komórek9,10,11. W tym badaniu Y-27632 jest stosowany w leczeniu hiPSC-CM przed przeszczepem w celu zwiększenia szybkości wszczepiania komórek.
Ustanowiono kilka metod mających na celu poprawę szybkości przeszczepiania komórek, takich jak szok cieplny i powlekanie macierzy błony podstawnej12. Oprócz tych metod, technologia genetyczna może również promować proliferację kardiomiocytów13 lub odwracać komórki niemięśnia sercowego do kardiomiocytów14. Z punktu widzenia bioinżynierii, kardiomiocyty są umieszczane na rusztowaniu z biomateriału w celu poprawy wydajności przeszczepu15. Niestety, większość z tych metod jest skomplikowana i kosztowna. Wręcz przeciwnie, proponowana tutaj metoda jest prosta, opłacalna i skuteczna i może być stosowana jako leczenie podstawowe przed przeszczepem, a także w połączeniu z innymi technologiami.

<table><tbody><tr><td>Odczynnik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase (roztwór do odrywania komórek macierzystych)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>#07920</td><td></td></tr><tr><td>B27 bez insuliny</td><td>Fisher Scientific</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>Suplement B27</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-504-044</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>72054</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x), wysoki poziom glukozy, HEPES, bez czerwieni fenolowej</td><td>Thermofisher</td><td>20163029</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM (wskaźnik wapnia)</td><td>Invitrogen/Thermofisher</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Bez glukozy RPMI 1640</td><td>Fisher Scientific</td><td>11879020</td><td></td></tr><tr><td>IWR1</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>72562</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (macierz zewnątrzkomórkowa)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>CB-40230C</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR (pożywka dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych)</td> <td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk Pen-strep</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 (poliol powierzchniowo czynny)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Aktywator Rho II</td><td>Cytoszkielet</td><td>CN03</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Fisher Scientific</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>DL-mleczan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4263</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE (enzymy dysocjacji komórek)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-605-010</td><td></td></tr><tr><td>Verapamil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Sprzęt i zaopatrzenie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina III Instrumenty bioluminescencyjne</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>15 mm Szkiełka nakrywkowe</td><td>Warner</td><td>CS-15R15</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo Scientific</td><td>NX50</td><td></td></tr><tr><td>Podwójny automatyczny regulator temperatury</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz do elektroforezy</td><td>BIO-RAD</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus</td>Szybka kamera <td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>pco</td><td></td><td>1200 s</td><td></td></tr><tr><td>Laserowa głowica skanująca</td><td>Olympus</td><td>FV-1000</td><td></td></tr><tr><td>Niskoprofilowa otwarta komora kąpielowa (montowana w powyższym systemie mikroinkubacji)System mikroinkubacji</td> <td>Warner Instruments</td><td>RC-42LP</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Warner Instruments</td><td>DH-40iL</td><td></td></tr><tr><td>Minivent Wentylator dla myszy</td><td>Aparat Harvard</td><td>845</td><td></td></tr><tr><td>myszy NOD/SCID</td><td>Jackson Laboratory</td><td>001303</td><td></td></tr><tr><td>Prefabrykowane żele białkowe</td><td>BIO-RAD</td><td>4561033</td><td></td></tr><tr><td>Pakiety transferowe PVDF</td><td>BIO-RAD</td><td>1704156</td><td></td></tr><tr><td>System Trans-Blot</td><td>BIO-RAD</td><td>Trans-Blot Turbo</td><td></td></tr><tr><td>Sterylizator gorących kulek</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td> Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Przeciwciało</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anty-ludzka nukleolina (Alexa Fluor 647)</td><td>Abcam</td><td>ab198580</td><td></td></tr><tr><td>Troponina sercowa T</td><td>R& Systemy D</td><td>MAB1874</td><td></td></tr><tr><td>Troponina sercowa C</td><td>Abcam</td><td>ab137130</td><td></td></tr><tr><td>Troponina sercowa I</td><td>Abcam</td><td>ab47003</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-osioł anty-mysz</td><td>Laboratorium ImmunoResearch Jacksona</td><td>715-175-150</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-osioł anty-królik</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>Fitc-osioł anty-mysz</td><td>Jackson Laboratorium ImmunoResearch</td><td>715-095-150</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab22555</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka troponina sercowa T</td><td>Abcam</td><td>ab91605</td><td></td></tr><tr><td>Integryna &beta; 1</td><td>Abcam</td><td>ab24693</td><td></td></tr><tr><td>Ki67</td><td>EMD Millipore</td><td>ab9260</td><td></td></tr><tr><td>N-kadheryna</td><td>Abcam</td><td>ab18203</td><td></td></tr><tr><td>Łańcuch lekki fosfo-miozyny 2</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>3671s</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company<</td><td>strong>Numer katalogowy</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td>R2016A</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>1.52g</td><td></td></tr></tbody></table>

zwiększenie wszczepienia indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych poprzez przejściowe hamowanie aktywności kinazy rho

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Kluczowym czynnikiem w poprawie skuteczności terapii komórkowej w regeneracji mięśnia sercowego jest bezpieczne i efektywne zwiększenie szybkości wszczepiania komórek. Y-27632 jest bardzo silnym inhibitorem kinazy białkowej zawierającej zwinięte cewki związane z Rho (RhoA/ROCK) i jest stosowany w celu zapobiegania apoptozie komórek wywołanej dysocjacją (anoikis). Wykazujemy, że wstępne leczenie Y-27632 indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-CMs+RI) przed implantacją powoduje poprawę szybkości przeszczepiania komórek w mysim modelu ostrego zawału mięśnia sercowego (MI). W tym miejscu opisujemy pełną procedurę różnicowania, oczyszczania i wstępnego traktowania komórek hiPSC-CM za pomocą Y-27632, a także wynikającego z tego skurczu komórek, pomiarów stanów przejściowych wapnia i przeszczepu do mysich modeli MI. Proponowana metoda zapewnia prostą, bezpieczną, skuteczną i tanią metodę, która znacznie zwiększa szybkość wszczepiania komórek. Metoda ta może być stosowana nie tylko w połączeniu z innymi metodami w celu dalszego zwiększenia efektywności przeszczepu komórek, ale także stanowi korzystną podstawę do badania mechanizmów innych chorób serca.

hiPSC-CM użyte w niniejszym badaniu pochodziły od ludzi i posiadały gen reporterowy lucyferazy; w związku z tym przeżywalność przeszczepionych komórek in vivo była wykrywana za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego (BLI)17 (Rysunek 1A,B). W przypadku histologicznych przekrojów serca komórki podwójnie dodatnie w kierunku ludzkiej swoistej troponiny T serca (hcTnT) oraz ludzkiego antygenu jądrowego (HNA) sklasyfikowano...

W tym protokole pokazujemy i rozwijamy, jak używać ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do różnicowania i oczyszczania kardiomiocytów, a ponadto, jak poprawić efektywność ich przeszczepu za pomocą wstępnego leczenia inhibitorem kinazy białkowej związanej z Rho w modelu zawału mięśnia sercowego u myszy.

Zwiększenie wszczepienia indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych poprzez przejściowe hamowanie aktywności kinazy Rho

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Nasze dane pokazują, że przejściowe hamowanie aktywności kinazy Rho zwiększa adhezję, przeżycie i wszczepienie kardiomiocytów pochodzących z hiPSC po przeszczepieniu do serc zwierząt po zawale. Zapewniamy prostą, tanią, a jednocześnie wysoce skuteczną metodę zwiększania wszczepienia przeszczepionych kardiomiocytów pochodzących z hiPSC do uszkodzonych serc zwierząt. Ponieważ technika ta może bezpiecznie i skutecznie poprawić tempo wszczepiania komórek w ostrym zawale serca i niewydolności serca, przyczynia się do poprawy funkcji serca, naczyń krwionośnych i apoptozy.Chociaż przetestowaliśmy nasze protokoły tylko w hiPSC, metody te można zastosować do innych typów komórek, takich jak embrionalne komórki macierzyste, mezenchymalne komórki macierzyste i tak dalej. Dawka i czas trwania leczenia Y-27632 mają kluczowe znaczenie. Demonstracja wizualna może bardzo szczegółowo zademonstrować wszystkie kluczowe kroki w protokole, co jest korzystne dla kogoś, kto nigdy wcześniej nie wykonywał tej techniki.W 21 dniu po różnicowaniu hiPSC-CM należy odessać pożywkę i raz przemyć komórki sterylnym PBS. Inkubuj komórki z 0,5 mililitra enzymów dysocjacji komórek na studzienkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do siedmiu minut. Po czasie inkubacji kilkakrotnie odpipetować zawiesinę komórek za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra w celu dokładnej dysocjacji komórek.Następnie dodaj jeden mililitr roztworu neutralizującego do każdej studzienki, zbierz mieszaninę komórek w 15-mililitrowej probówce wirówkowej i odwiruj 200 razy g przez trzy minuty. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w roztworze neutralizującym. Następnie przesadź komórki na pokryte żelatyną, sześciodołkowe płytki o gęstości dwóch milionów komórek na dołek.Po 24 do 48 godzinach zastąp pożywkę hodowlaną pożywką oczyszczającą na trzy do pięciu dni. Przed przeszczepem należy hodować komórki w grupie leczonej przez 12 godzin w pożywce RB-plus uzupełnionej 10-mikromolowym Y-27632. Podobnie, należy przeprowadzić leczenie werapamilem na komórkach w pożywce RB-plus z jednym mikromolem werapamilu przez 12 godzin.Po zabiegu należy raz przemyć hiPSC-CM PBS i inkubować komórki z 0,5 mikrolitra enzymów dysocjacji komórek na studzienkę przez maksymalnie dwie minuty. Kilkakrotnie pipetować zawiesinę komórek za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra, aby dokładnie oddzielić komórki. Następnie zneutralizuj komórki roztworem neutralizującym, zbierz mieszaninę komórek w 15-mililitrowej probówce wirówkowej i odwiruj 200 razy g przez trzy minuty.Po odwirowaniu ponownie zawiesić komórki w PBS w stężeniu 0,1 miliona komórek na pięć mikrolitrów w ramach przygotowań do wstrzyknięcia. Bezpośrednio po indukcji zawału mięśnia sercowego wstrzyknij pięć mikrolitrów kontrolnych hiPSC-CM, hiPSC-CM traktowanych Y-27632, hiPSC-CM leczonych werapamilem lub równą objętość PBS do mięśnia sercowego myszy w każdym miejscu, jeden w obszarze zawału i dwa w obszarach wokół zawału. Na 12 godzin przed wykonaniem wykrywania przejściowych stanów wapnia i kurczliwości należy dodać 10-mikromolowy Y-27632, 100-nanomolowy RA, jednomikromolowy werapamil lub równą objętość PBS do pożywki hodowlanej hiPSC-CMs.Następnie wyrzuć pożywkę i raz umyj płytkę PBS. Zmień pożywkę na DMEM wolny od czerwieni fenolowej zawierający 0,02 procenta wagowego na objętość poliolu powierzchniowo czynnego, pięciomikromolowego wskaźnika wapnia i odpowiadającego mu Y-27632, RA, werapamilu lub równej objętości PBS i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po inkubacji wyrzucić supernatant, trzykrotnie przemyć komórki bezbarwnikowym DMEM i pozostawić pożywkę na 30 minut w celu deestryfikacji barwnika mapującego.Umieść szkiełko nakrywkowe z nasionami komórek w otwartej komorze kąpieli i włóż komorę do systemu mikroinkubacji o temperaturze 37 stopni Celsjusza z automatycznym regulatorem temperatury. Perfuzjuj go roztworem Tyrode'a i ciągle dodawaj RI, RA lub PBS do roztworu perfuzyjnego. Użyj odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego i laserowej głowicy skanującej, aby zarejestrować spontaniczne stany przejściowe wapnia za pomocą skanu linii x-t.Rejestruj spontaniczne skurcze hiPSC-CM za pomocą funkcji kontrastu różnicowego interferencyjnego mikroskopu konfokalnego. Przeżywalność przeszczepionych komórek została potwierdzona przez zwiększoną aktywność lucyferazy. Zwiększona ekspresja ludzkiej troponiny sercowej T i ludzkiego antygenu jądrowego wykazała, że wstępne leczenie Y-27632 może znacznie poprawić szybkość wszczepiania komórek.Wstępnie potraktowane komórki Y-27632 wykazywały większą i bardziej zdefiniowaną strukturę cytoszkieletu w kształcie pręcika. Ponadto wstępne leczenie Y-27632 zmniejszyło liczbę komórek TUNEL-dodatnich, co wskazuje na zmniejszoną apoptozę przeszczepionego hiPSC-CM in vivo. Western blot sugerował, że wstępne leczenie Y-27632 zwiększało ekspresję integryny beta-1 i N-kadheryny oraz zmniejszało ekspresję łańcucha lekkiego fosfo-miozyny 2.Ta zmiana została znormalizowana 72 godziny po wycofaniu Y-27632. Eksperymenty in vitro z przyłączaniem mysich komórek HL-1 wykazały, że wstępne leczenie Y-27632 znacznie zwiększyło przyleganie hiPSC-CM w stosunku do HL-1. Wstępna obróbka Y-27632 zmniejszyła siłę skurczu, szczytową fluorescencję przejściową wapnia i czas trwania przejściowego wapnia.Wstępne leczenie Y-27632 regulowało skurcz kardiomiocytów poprzez znaczne zmniejszenie ekspresji cTnI i cTnT. Podobnie jak w przypadku Y-27632, wstępne leczenie werapamilem zwiększyło aktywność lucyferazy i liczbę podwójnie dodatnich komórek hcTnT / HNA. Najważniejszym krokiem jest hodowla komórek w grupie leczonej przez 12 godzin w pożywce Rb-plus uzupełnionej 10-mikromolowym Y-27632.Opierając się na tej metodzie, obiecującą strategią jest powolne uwalnianie Y-27632 w celu dalszego zwiększenia szybkości wszczepiania komórek. Technika ta toruje naukowcom drogę do badania fizjologii i funkcji hiPSC CM in vivo. Mała cząsteczka CHIR99021 używana do różnicowania kardiomiocytów jest niebezpieczna, co może powodować podrażnienie dróg oddechowych.Proszę w żaden sposób nie przyjmować ani nie wdychać.

enhancing-engraftment-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opracowaliśmy protokół indukcji kardioblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z użyciem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów serca oraz funkcjonalnych kardiomiocytów do regeneracji układu sercowo-naczyniowego.

Efektywne otrzymywanie prekursorów kardiologicznych i kardiomiocytów ludzkich z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukcji małocząsteczkowej

Pluripotencjalne komórki macierzyste, zarówno embrionalne, jak i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS), stanowią cenne źródło ludzkich zróżnicowanych komórek, w tym kardiomiocytów. Tutaj skupimy się na indukcji komórek iPS w sercu, pokazując, jak wykorzystać je do uzyskania funkcjonalnych ludzkich kardiomiocytów za pomocą protokołu opartego na ciałach embrionalnych.

Generowanie ludzkich kardiomiocytów: protokół różnicowania od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych bez karmienia

Dostarczanie komórek do mięśnia sercowego w mysich modelach chorób sercowo-naczyniowych, takich jak nadciśnienie czy zawał mięśnia sercowego, jest szeroko stosowane do testowania potencjału terapeutycznego różnych typów komórek w badaniach regeneracyjnych. Dlatego szczegółowy opis i przejrzysta wizualizacja tego zabiegu chirurgicznego pomogą określić ograniczenia i zalety analiz terapeutycznych komórek sercowo-naczyniowych u małych gryzoni.

Dostarczanie komórek do mięśnia sercowego: obserwacje w mysich sercach

Artykuł opisuje szczegółową metodologię skutecznego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w kardiomiocyty poprzez selektywne modulowanie szlaku Wnt, a następnie analizę markerów referencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny jednorodności i tożsamości populacji.

Wysoka skuteczność różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów i charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej

Tutaj opisujemy solidny protokół do pozyskiwania ludzkich kardiomiocytów, który łączy modulowane małymi cząsteczkami różnicowanie serca i oczyszczanie kardiomiocytów za pośrednictwem deprywacji glukozy, umożliwiając produkcję oczyszczonych kardiomiocytów dla celów modelowania chorób sercowo-naczyniowych i badań przesiewowych leków.

Otrzymywanie wysoce oczyszczonych kardiomiocytów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu różnicowania modulowanego małymi cząsteczkami i późniejszego głodu glukozy

Prezentujemy trzy nowatorskie i bardziej efektywne protokoły różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych na kardiomiocyty, komórki śródbłonka i komórki mięśni gładkich oraz metodę dostarczania, która poprawia wszczepianie przeszczepionych komórek poprzez połączenie iniekcji komórek z dostarczaniem cytokin za pośrednictwem łatki.

Pluripotencjalne komórki serca pochodzące z komórek macierzystych do naprawy mięśnia sercowego

Tutaj prezentujemy solidną metodę przeprogramowania pierwotnych fibroblastów embrionalnych w funkcjonalne kardiomiocyty poprzez nadekspresję GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 i miR-133 (GHMT2m) wraz z hamowaniem sygnalizacji TGF-β. Nasz protokół generuje bicie kardiomiocytów już po 7 dniach od transdukcji z wydajnością do 60%.

Tłumienie sygnalizacji pro-fibrotycznej nasila przeprogramowanie fibroblastów embrionalnych myszy w indukowane kardiomiocyty za pośrednictwem czynników

Tutaj prezentujemy protokół do solidnego generowania i rozbudowy ludzkich kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta.

Wytwarzanie i ekspansja ludzkich kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta

Dostarczanie komórek pod kontrolą ultradźwięków w miejscu zawału mięśnia sercowego u myszy jest bezpiecznym, skutecznym i wygodnym sposobem przeszczepu komórek.

Indukowana ultradźwiękami indukowana pluripotencjalna implantacja kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych u myszy z zawałem mięśnia sercowego

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) stanowią alternatywę dla wykorzystywania zwierząt do przedklinicznych badań przesiewowych kardiotoksyczności. Ograniczeniem dla powszechnego stosowania hiPSC-CM w przedklinicznych badaniach przesiewowych toksyczności jest niedojrzały, podobny do płodu fenotyp komórek. Poniżej przedstawiono protokoły solidnego i szybkiego dojrzewania hiPSC-CM.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe kardiotoksyczności z wykorzystaniem dojrzałych, indukowanych przez człowieka monowarstw kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Użycie światła do kontrolowania komórek i tkanek serca umożliwia bezkontaktową stymulację, zachowując w ten sposób naturalny stan i funkcję komórek, co czyni ją wartościowym podejściem zarówno do badań podstawowych, jak i zastosowań terapeutycznych.

Mikrofizjologiczny system serca do badania propagacjiCa2+ za pomocą niegenetycznej stymulacji optycznej

Poznaj metodę zwiększania wszczepienia kardiomiocytów pochodzących z hiPSC poprzez przejściowe hamowanie kinazy Rho. Protokół wykorzystuje inhibitor Y-27632 w modelu zawału mięśnia sercowego u myszy.

Zwiększenie wszczepienia indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych poprzez przejściowe hamowanie aktywności kinazy Rho (Wideo) | JoVE Journal

Zwiększenie wszczepienia indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych poprzez przejściowe hamowanie aktywności kinazy Rho

Przeglądaj więcej filmów