Pomiar specyficznych wskaźników błędnej translacji prątków za pomocą systemów reporterowych wzmocnienia funkcji

Synteza białek jest podatna na błędy. Jednak błędy mogą być adaptacyjne pod wpływem stresu fizjologicznego. Wcześniej wykazaliśmy, że specyficzne błędy translacji w prątkach przyczyniają się do tolerancji antybiotyków.

Możliwość zmierzenia konkretnych wskaźników błędów pozwala nam skupić się na tym mechanizmie adaptacyjnym do pracy bakterii. Główną zaletą tych technik jest to, że reportery wzmocnienia funkcji mogą być wyjątkowo czułe w pomiarze małych poziomów błędów, które nie są łatwe do wykrycia za pomocą spektrometrii mas. Test Nluc/GFP umożliwia badania przesiewowe o średniej przepustowości, ponieważ pozwala uniknąć nadmiernego obchodzenia się z bakteriami i ich lizy

Procedurę zademonstruje doktorant Yue-Meng Chen. Dzisiaj zademonstrujemy procedurę korzystania z tych dwóch reporterów za pomocą tego filmu. Na początek zaszczep dwa mililitry pożywki 7H9 dzikimi i zmutowanymi szczepami reporterowymi prątków.

Wstrząsaj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden do dwóch dni lub do momentu, gdy OD o długości 600 nanometrów osiągnie fazę stacjonarną. Podwielokrotność i rozcieńczyć w celu uzyskania średnicy zewnętrznej o długości 600 nanometrów około 0,5 do 1. Następnie dodaj ATC do końcowego stężenia 50 nanogramów na mililitr.

Natychmiast dodaj różne dawki ksg do kultury zgodnie z manuskryptem, aby zmierzyć jego wpływ na wskaźniki błędnych tłumaczeń. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając przez cztery do sześciu godzin. Następnie przenieś kultury bakteryjne do dwumililitrowej probówki.

I odwirować przy 3 220 gach w temperaturze pokojowej przez pięć minut, aby rozdrobnić bakterie. Po etapie wirowania wyrzuć supernatant i rozbij bakterie, dodając 40 mikrolitrów 1x pasywnego buforu do lizy. Przenieś zawieszony lizat bakteryjny na białą 96-dołkową płytkę, po jednym dołku na próbkę, i wstrząsaj w temperaturze pokojowej przez 20 minut.

Dodaj 80 mikrolitrów podłoża świetlika do każdej studzienki. Wstrząsaj przez 15 sekund i zmierz luminescencję za pomocą luminometru. Następnie dodaj 80 mikrolitrów substratu Renilla do każdej studzienki.

Potrząsaj przez 15 sekund i zmierz luminescencję za pomocą luminometru. Użyj poprawionych wartości, aby obliczyć współczynniki błędnych tłumaczeń dla każdego warunku. Na początek zaszczepij dwa mililitry pożywki 7H9 bakteryjnym szczepem reporterowym.

Wstrząsaj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden do dwóch dni lub do momentu, gdy OD o długości 600 nanometrów osiągnie fazę stacjonarną. Następnie subkulturuj w 50 mililitrach pożywki 7H9 i hoduj, aż OD przy 600 nanometrach osiągnie późną fazę stacjonarną. Przed przeniesieniem bakterii na 96-dołkową płytkę dodaj ATC o końcowym stężeniu 50 nanogramów na mililitr i dobrze wymieszaj.

Dodaj 100 mikrolitrów na studzienkę do klarownej, okrągłodennej 96-dołkowej płytki. Następnie dodaj różne dawki ksg do wybranych studzienek, aby przebadać jego wpływ na wskaźniki błędnej translacji. Dodaj 200 mikrolitrów sterylnej wody do dołków brzegowych płytki, aby ograniczyć parowanie z dołków na próbki.

Szczelnie zamknąć płytkę, wstrząsnąć i indukować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 do 20 godzin. Użyj pipety wielokanałowej, aby pobrać 80 mikrolitrów z każdej studzienki. Przenieść próbki na 96-dołkową płytkę z czarnym dnem i zmierzyć sygnał GFP za pomocą luminometru.

Po zmierzeniu sygnału GFP odwirować płytkę przy 3 220 g przez 10 minut. Następnie przenieś 50 mikrolitrów supernatantu na 96-dołkową płytkę z białym dnem. Następnie dodaj 50 mikrolitrów substratu Nluc do każdej studzienki.

Dobrze wymieszaj i zmierz luminescencję za pomocą luminometru. Na koniec określ stosunek Nluc/GFP, dzieląc skorygowaną wartość luminescencji Nluc przez fluorescencję GFP. W niniejszej pracy wykorzystano system reporterski Renilla Firefly do pomiaru wskaźnika błędnej translacji w obecności kasumamicyny w typie dzikim i w szczepie S.Smegmatis, który został usunięty.

Wyniki wykazały wyraźny, zależny od dawki sposób zmniejszania wskaźnika błędnej translacji ksg, podczas gdy w szczepie z delecją ksgA ksg był słabszy, a wyjściowy wskaźnik błędnej translacji był wyższy ze względu na oporność na modulację przez kasugamycynę. Działanie kasumamicyny na błędne tłumaczenie mierzono również za pomocą reportera Nluc/GFP. Zarówno Renilla firefly, jak i Nluc/GFP reporter obejmują pomiar aktywności lucyferazy.

Małe błędy w pipetowaniu mogą powodować duże wahania w odczytach. Na początek sugerujemy zwiększenie liczby każdej replikacji, aby zminimalizować ryzyko uzyskania niewiarygodnych odczytów.