VirWaTest, metoda punktowa do wykrywania wirusów w próbkach wody

Wirusy jelitowe znajdują się głównie w różnych zbiornikach wodnych, w tym w wodach gruntowych, wodach stojących, strumieniach, rzekach i wodach. Wiążą się one z zagrożeniami dla zdrowia i są odpowiedzialne za infekcje u ludzi. Wirusy jelitowe często powodują zapalenie żołądka i jelit i są najczęściej przenoszone drogą fekalno-oralną.

Inne choroby przenoszone przez wodę powodują ostre zapalenie wątroby wywołane wirusem zapalenia wątroby typu A i wirusami zapalenia wątroby typu E, ze znaczną śmiertelnością związaną zwłaszcza z wirusowym zapaleniem wątroby typu E u kobiet w ciąży. Rzeczywiste protokoły monitorowania jakości wody zaproponowane w kontekście humanitarnym zostały zaprojektowane tak, aby bakterie takie jak E.Coli były wskaźnikiem zanieczyszczenia kałem. Ale już wiadomo, że nie ma korelacji z innymi mikroorganizmami, takimi jak wirusy, które są bardziej odporne na wiele procesów aktywacji.

Do tej pory wykrywanie wirusów w sytuacjach kryzysów humanitarnych odbywało się poprzez dostosowanie istniejących protokołów do warunków panujących w tych kontekstach i wysyłanie próbek do laboratoriów referencyjnych w celu molekularnego wykrywania wirusów. Istnieje zapotrzebowanie na metody wykrywania patogenów wirusowych i wskaźników wirusowych w celu zmniejszenia zagrożeń dla zdrowia publicznego, zapobiegania wybuchom epidemii i zwiększenia skuteczności interwencji humanitarnych. Proponujemy metodę wykrywania wirusów w 10-litrowych próbkach wody, która jest podzielona na trzy etapy: stężenie wirusa, ekstrakcja kwasów nukleinowych i wykrywanie wirusów.

Wszystkie te etapy zostały zaadaptowane z metod stosowanych obecnie w naszym laboratorium i mogą być wykonywane w ujęciu poglądowym przy użyciu przenośnych odczynników i sprzętu, wytwarzającego czynniki zależne od zasilania i zamrażarek. Do metody dodano również roztwór konserwujący, aby zagwarantować stabilność kwasów nukleinowych do wysyłki do laboratoriów referencyjnych w razie potrzeby. Proponowana przez nas metoda nazywa się VirWaTest i została opracowana we współpracy GenIUL i Intermon Oxfam.

Przed rozpoczęciem należy wziąć pod uwagę liczbę próbek, które mają być badane w celu przygotowania odczynników i materiału. Zaleca się pobranie dwóch powtórzeń każdej próbki wody w celu uzyskania reprezentatywnych wyników. Kilka próbek może być testowanych w tym samym czasie, jeśli dostępna jest odpowiednia ilość materiału.

Odczynniki i materiały powinny być przygotowane i zapakowane przed przemieszczeniem lub wysyłką do miejsca, w którym metoda jest potrzebna. Wykaz materiałów i drobnego sprzętu, które należy spakować, został opisany w tabeli pierwszej. Przygotować materiał bakteriofagowy MS2, który zostanie dodany do każdej próbki wody w ramach kontroli procesu, postępując zgodnie z odpowiednią metodą ISO.

Następnie rozprowadzić 10 mikrolitrów zawiesiny zawierającej od 10 do 10 jednostek platformowych wstępnie przygotowanych do probówek o pojemności 10 ml i pozostawić wodę do wyschnięcia. Potrzebna będzie jedna probówka na próbkę wody. Dodatkowo należy przygotować jedną probówkę zawierającą 10 ml sterylnej wody destylowanej na pobraną próbkę.

Do wstępnie flokulowanego roztworu mleka odtłuszczonego przygotuj probówkę zawierającą odtłuszczone mleko, plastikową torbę z zamkiem błyskawicznym zawierającą sól morską oraz plastikową butelkę zawierającą wodę destylowaną. W celu dostosowania pH przygotuj probówkę zawierającą kwas cytrynowy, probówkę zawierającą wodorotlenek sodu oraz dwa plastikowe pojemniki z 25 i 50 ml wody destylowanej. Dla każdej próbki wody, która ma być badana, przygotuj saszetkę kondycjonującą, dodając sole morskie i kwas cytrynowy do plastikowej torby z zamkiem błyskawicznym, a roztwór konserwujący, dodając bufor do lizy i środek konserwujący kwasy nukleinowe do probówki o pojemności 5 ml.

Na koniec przygotuj cztery saszetki neutralizujące, dodając detergent do czterech plastikowych torebek z zamkiem błyskawicznym. Dla każdej próbki wody, która ma być ekstrahowana, przygotuj jedną probówkę o pojemności pięciu ml zawierającą cząstki magnetyczne i etanol oraz trzy probówki o pojemności 2 ml zawierające odpowiednio 500, 600 i 200 mikrolitrów płuczących jeden, dwa i trzy oraz jedną probówkę zawierającą bufor elucyjny. Dwie różne ekstrakcje kwasów nukleinowych mogą być analizowane jednocześnie w każdym teście PCR, jeśli używany jest termocykler Newell.

Do wszystkich testów PCR przygotuj wodę z biologii molekularnej. Przygotować mieszaniny zawierające dwa startery i jeden dowód specyficzny dla każdego wirusa docelowego zgodnie z objętościami i stężeniami opisanymi w protokole. Dla każdego wirusa dodaj wskazane objętości do probówek od pierwszej do ośmiu tacek na probówki.

Pokrój pasek, dzieląc go na dwa paski. Rurki od pierwszej do piątej i rurki od szóstej do ośmiu. Dla każdego wirusa suche na powietrzu zawiesiny DNA zawierające od 10 do 5, 10 do 7 i od 10 do 9 oraz znane kopie wstępnie przygotowane w probówkach szóstej, siódmej i ósmej.

Ten protokół koncentracji opiera się na zasadzie flokulacji organicznej, dzięki której warunki niskiego pH i wysokiej przewodności napędzają białka mleka odtłuszczonego do organizowania się w kłaczki, do których wchłaniają się wirusy. Po ustabilizowaniu się kłaczków można je łatwo zebrać. Zbierz 10-litrową próbkę wody do wiadra z płaskim dnem wyposażonego w pokrywkę.

Jeśli zbierasz z rury, pozwól wodzie płynąć przez kilka sekund przed zebraniem wody. Ważne jest, aby używać przezroczystych wiader do wizualizacji peletów. Poszukaj płaskiej przestrzeni w świeżym miejscu, z dala od bezpośredniego światła słonecznego Umieść mieszadło magnetyczne podłączone do akumulatora pod wspornikiem wiadra i umieść wiadro zawierające próbkę wody na każdym wsporniku.

Ponownie rozważ kwas cytrynowy i wodorotlenek sodu i potrząsaj aż do całkowitego rozpuszczenia. Wlej 500 ml wody destylowanej do stojącej torby i umieść worek na mieszadle magnetycznym. Dodaj zawartość jednej saszetki soli morskiej i zawartość jednej rurki z odtłuszczonym mlekiem i mieszaj przez pięć minut na średnich obrotach.

Dostosuj pH flokulowanego mleka odtłuszczonego za pomocą kwasu cytrynowego i wodorotlenku sodu do pH między 3,4 a 3,6. Wyłącz mieszadło magnetyczne i upewnij się, że kłaczki są widoczne. Latarka może pomóc w wizualizacji kłaczków.

Wrzuć magnes mieszający do wody. Ustaw mieszadło magnetyczne na maksymalną prędkość i włącz je. Dodaj 10 ml wody destylowanej do probówki kontrolowanej przez proces.

Odwróć go kilka razy i wlej roztwór do wody. Wsypać zawartość jednej saszetki z kondycjonowaniem próbki do wody i mieszać przez pięć minut. Upewnij się, że pH próbki wody, które powinno wynosić od 3,4 do 3,6.

W razie potrzeby dostosuj pH. Dodaj 100 ml wstępnie flokulowanego roztworu mleka odtłuszczonego, zamknij wiadro pokrywką i pozostaw wodę mieszającą przez osiem godzin z minimalną prędkością. Po ośmiu godzinach wyłącz mieszadło magnetyczne i pozwól kłaczkom osiąść przez co najmniej pięć dodatkowych godzin.

W przypadku systemu opartego na użyciu kontrolera pipet, plastikowej rurki i kilku pipet należy wyrzucić supernatant, uważając, aby nie naruszyć kłaczków na dnie wiadra. Gdy poziom wody dotrze do magnesu mieszającego, ściśnij plastikową rurkę, aby zatrzymać przepływ wody i odsuń pipetę od wiadra. Potrząśnij wiadrem, aby ponownie zawiesić kłaczki i wlej je do stojącej plastikowej torby.

Pozwól kłaczkom osiąść przez dodatkową godzinę. Ostrożnie odessać supernatant wodny za pomocą pipety, unikając uszkodzenia kłaczków. Odessać kłaczki za pomocą pipety i przenieść je do stożkowej probówki.

Zanotuj końcową objętość koncentratu próbki i przenieś 1 ml do probówki zawierającej roztwór konserwujący. Zawiesina może być wykorzystana do przeprowadzenia ekstrakcji kwasów nukleinowych w terenie lub wysłana do laboratorium referencyjnego w celu dalszej analizy. Woda wyrzucona podczas zbierania kłaczków musi zostać oczyszczona przed usunięciem.

Dodać zawartość saszetki ze środkiem neutralizującym do wiadra zawierającego wylaną wodę. Wymieszaj wodę i pozostaw ją nieruchomą na trzydzieści minut. Następnie uzdatnioną wodę należy zutylizować jako odpad ogólny.

Cząstki magnetyczne mogą być przenoszone z jednej probówki do drugiej za pomocą pipety magnetycznej. Przyzwyczaj się do działania pipety magnetycznej przed wykonaniem ekstrakcji. Ułóż probówki zawierające odczynnik wymagany do ekstrakcji w stojaku.

To znaczy od lewej do prawej: bufor wiążący, płuczące i bufor elucyjny. Przenieść 1 ml koncentratu próbki do probówki zawierającej bufor wiążący za pomocą jednorazowej pipety plastikowej. Odwróć rurkę dziesięć razy, aby zoptymalizować roztwór.

Inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez dziesięć minut, ciągle mieszając za pomocą pojedynczego orbitalu lub ręcznie. Zbierz cząstki magnetyczne za pomocą pipety magnetycznej i czystej końcówki, która może być ponownie użyta do trzech myjących, a następnie uwolnij cząstki magnetyczne do probówki zawierającej pierwszy bufor myjący. Umyj je, delikatnie potrząsając roztworem końcówką przez trzydzieści sekund i zbierz.

Powtórz tę procedurę mycia dla mycia drugiego i trzeciego. Zebrać cząstki magnetyczne w buforze płuczącym nr 3 i uwolnić je do probówki zawierającej bufor elucyjny. Następnie wyrzuć końcówkę.

Inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez pięć minut, ciągle mieszając przy użyciu orbitalu solo. Zamień końcówkę pipety magnetycznej na dowolną i zbierz wszystkie cząstki magnetyczne z buforu elucyjnego. Wyrzuć końcówkę z przyczepionymi cząstkami.

Kwas nukleinowy pozostaje w buforze elucyjnym, który powinien być przechowywany do dalszej analizy lub transportu. Należy użyć paska składającego się z pięciu probówek i trzech probówek przygotowanych do wykrywania ludzkich adenowirusów. Dodaj wodę, mieszaninę PCR i ekstrację kwasów nukleinowych do probówek od pierwszej do piątej zgodnie z protokołem.

Następnie dodaj wodę i mieszankę PCR do probówek od szóstej do ósmej. Umieść oba paski w termocyklerze i wybierz odpowiedni przebieg. Po zakończeniu biegu zbierz wyniki i przeanalizuj uzyskane dane.

Tylko wtedy, gdy testy na obecność wirusa dały wynik ujemny, należy przeprowadzić detekcję MS2. Użyj pasków probówek przygotowanych do wykrywania MS2 i wybierz odpowiedni profil termiczny do PCR. Ekstrakcję magnetycznych kwasów nukleinowych VirWaTest porównano z RNA wirusa QIAgen, naśladowano go, testując próbki wody z dodatkiem ludzkich adenowirusów i MS2.

Wartość p testu redukcji wykazuje znacznie wyższy odzysk wirusa przy użyciu VirWaTest niż QiAgen jako metody ekstrakcji dla obu testowanych wirusów. Opracowana metoda zagęszczania wirusa została przetestowana w terenie we współpracy z zespołami myjącymi Oxfam zlokalizowanymi w Bangi w Republice Środkowoafrykańskiej i w Pedernales w Ekwadorze, które pobrały próbki wody, zagęściły je przy zastosowaniu opracowanej metody koncentracji i wysłały do laboratorium w Barcelonie w celu ekstrakcji kwasów nukleinowych i ilościowego określenia wirusa. W Ekwadorze ludzkie adenowirusy wykryto we wszystkich badanych próbkach, podczas gdy jedna na pięć próbek pobranych i skoncentrowanych w Bangi dała wynik pozytywny na obecność ludzkich adenowirusów.

Opracowana metoda okazała się przydatna, gdy została oceniona przez zespoły myjące z Oxfam Intermon w Bangi w Republice Środkowoafrykańskiej oraz przez inny zespół w Pedernales w Ekwadorze. VirWaTest może być częścią systemu wczesnego ostrzegania lub może być używany w dochodzeniu w sprawie epidemii przez organizacje zajmujące się uzdatnianiem wody. Sprzęt ten ułatwia analizę patogenów wirusowych w wodzie i poprawę zarządzania bezpieczeństwem wody w celu zmniejszenia liczby przypadków chorób wirusowych w kontekście kryzysów humanitarnych.