Name: VirWaTest, metoda punktowa do wykrywania wirusów w próbkach wody (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Poznaj metodę VirWaTest do wykrywania wirusów jelitowych w próbkach wody. Ta przenośna technika umożliwia skuteczną koncentrację i detekcję patogenów w warunkach terenowych, poprawiając bezpieczeństwo wody pitnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

VirWaTest był projektem badawczym finansowanym przez program HIF (Humanitarian Innovation Funds) ELHRA (Enhancing Learning & Research for Humanitarian Assistance). Autorzy dziękują zespołom WASH, które uprzejmie współpracowały przy tym badaniu. Analiza próbek w Ekwadorze została sfinansowana przez Oxfam Ecuador i Dirección de Investigaciones de la Universidad de las Americas (AMB. BRT.17.01). S. Bofill-Mas jest stypendystą Serra-Hunter na Uniwersytecie w Barcelonie.

<ol><li>The Sphere Project. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Sphere+Project%3A+Humanitarian+Charter+and+Minimum+Standards+in+Humanitarian+Response%22">The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response</a>. , Practical Action Publishing. Rugby, UK. https://www.spherestandards.org/wp-content/uploads/2018/06/Sphere_Handbook_2011_English.pdf (2011).</li>
<li>Bartram, J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBartram%2C+J+%22Water+Safety+Plan+Manual%3AStep-by-step+risk+management+for+drinking-water+suppliers%22">Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers</a>. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/handle/10665/75141 (2009).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+for+Drinking-water+Quality%22">Guidelines for Drinking-water Quality</a>. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548151_eng.pdf?ua=1 (2011).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%2225+Years+Progress+on+Sanitation+and+Drinking+Water%22">25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water</a>. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/177752/1/9789241509145_eng.pdf?ua=1 (2015).</li>
<li>Girones, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+pathogens+in+water+-+The+pros+and+cons+of+molecular+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of pathogens in water - The pros and cons of molecular techniques.</a> Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).</li>
<li>Rodriguez-Manzano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+and+new+fecal+indicators+and+pathogens+in+sewage+treatment+plants%2C+microbiological+parameters+for+improving+the+control+of+reclaimed+water%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water.</a> Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).</li>
<li>Puig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+adenoviruses+and+enteroviruses+in+polluted+waters+by+nested+PCR+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification.</a> Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).</li>
<li>Carter, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterically+infecting+viruses%3A+Pathogenicity%2C+transmission+and+significance+for+food+and+waterborne+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection.</a> Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).</li>
<li>Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Documenting+the+epidemiologic+patterns+of+polyomaviruses+in+human+populations+by+studying+their+presence+in+urban+sewage%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage.</a> Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).</li>
<li>Bofill-Mas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+stability+of+human+adenoviruses+and+polyomavirus+JCPyV+in+wastewater+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).</li>
<li>Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+aspects+of+using+human+adenovirus+as+a+viral+water+quality+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator.</a> Water Research. 96, 308-326 (2016).</li>
<li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).</li>
<li>Bofill-Mas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effective+method+for+microbial+source+tracking+using+specific+human+and+animal+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses.</a> Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).</li>
<li>International Organization for Standardization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ISO+10705-1%3A1995%3A+Water+quality+-+Detection+and+enumeration+of+bacteriophages+-+Part+1%3A+Enumeration+of+F-specific+RNA+bacteriophages%22">ISO 10705-1:1995: Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages</a>. , https://www.iso.org/standard/18794.html (1995).</li>
<li>Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+factors+influencing+human+viral+pathogens+and+their+potential+indicator+organisms+in+the+blue+mussel%2C+Mytilus+edulis%3A+the+first+Scandinavian+report%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report.</a> Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).</li>
<li>Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+PCR+for+determining+the+infectivity+of+bacteriophage+MS2+upon+inactivation+by+heat%2C+UV-B+radiation%2C+and+singlet+oxygen%3A+Advantages+and+limitations+of+an+enzymatic+treatment+to+reduce+false-positive+results%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).</li>
<li>Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantitation+of+infectious+human+adenoviruses+and+JC+polyomaviruses+in+water+by+immunofluorescence+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay.</a> Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).</li>
<li>Bofill-Mas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effective+method+for+microbial+source+tracking+using+specific+human+and+animal+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses.</a> Journal of Visualized Experiments. (58), e2820(2011).</li>
<li>Gonzales-Gustavson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+efficiency+and+uncertainty+of+skimmed+milk+flocculation+for+the+simultaneous+concentration+and+quantification+of+water-borne+viruses%2C+bacteria+and+protozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa.</a> Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metoda VirWaTest umożliwia zagęszczenie wirusów i ekstrakcję kwasów nukleinowych z próbek wody w miejscu użytkowania przez niedoświadczonych użytkowników. Jest to niedrogi, szybki i prosty protokół. Zagęszczenie opiera się na zasadzie organicznej flokulacji przy użyciu mleka odtłuszczonego, dzięki której warunki niskiego pH i wysokiej przewodności powodują, że białka mleka odtłuszczonego agregują się w kłaczki, w których adsorbują się wirusy. Gdy kłaczki opadną, łatwo je zebrać, co pozwala na zagęszczenie 10 l wody, podc...

Podczas pierwszych faz każdej sytuacji humanitarnej, dostęp do czystej wody, urządzeń sanitarnych i higieny jest krytyczny dla przetrwania osób dotkniętych kryzysem. Dlatego monitorowanie jakości wody jest priorytetem, aby zapobiec epidemiom przenoszonym przez wodę. Powszechnie wiadomo, że zanieczyszczona woda jest często źródłem chorób, ale często trudno jest określić źródła epidemii wirusów, takich jak wirus zapalenia wątroby typu E (HEV), nawet przy dostępności konwencjonalnych metod laboratoryjnych. Kontrola jakości wody opiera się na kwantyfikacji FIB1,2,3,4. Zostało jednak obszernie udokumentowane, że nie ma korelacji między brakiem FIB a obecnością wirusowych patogenów przenoszonych przez wodę, takich jak rotawirus (RoV), norowirus (NoV) lub HEV5,6. W związku z tym stosowanie kryteriów jakości wody opartych na FIB może prowadzić do niedoszacowania zagrożeń związanych z obecnością patogenów wirusowych przenoszonych przez wodę. Nadzór nad wirusami wskaźnikowymi, takimi jak ludzkie adenowirusy (HAdV) lub określone patogeny, byłby pomocny w określeniu narażenia na patogeny wirusowe i identyfikacji potencjalnego źródła infekcji u ludzi7,8,9,10 oraz w walidacji skuteczności środków sanitarnych11.
Do tej pory wykrywanie wirusów w tych scenariuszach polegało na wykwalifikowanym personelu i skomplikowanej logistyce. VirWaTest (virwatest.org) ma na celu opracowanie prostej, niedrogiej i przenośnej metody zagęszczania, a następnie wykrywania wirusów z próbek wody w miejscu użytkowania.
Koncentracja wirusa opiera się na zasadzie organicznej flokulacji 10 litrowych próbek wody, dzięki której wirusy są odzyskiwane w mniejszych ilościach12,13. Kłaczki są zbierane i dodawane do buforu, który lizuje wirusy i zapobiega degradacji kwasów nukleinowych, gdy są przechowywane w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 2 tygodnie.
Metoda ekstrakcji kwasów nukleinowych opiera się na użyciu cząstek magnetycznych, do których kwasy nukleinowe są adsorbowane. Można je przenieść z jednego bufora płuczącego do drugiego, a na koniec do buforu elucyjnego za pomocą pipety magnetycznej, do której przyczepiają się cząstki. Otrzymane zawiesiny wirusowych kwasów nukleinowych można wysłać do laboratorium referencyjnego, gdzie można przeprowadzić detekcję przy użyciu metod molekularnych opartych na PCR. Dla każdej ekstrakcji kwasu nukleinowego badane są dwie różne wielkości, aby wykluczyć inhibicję enzymatyczną pochodzącą z próbki. Alternatywnie, przy minimalnej dostępności sprzętu, testy PCR można przeprowadzić w miejscu użytkowania. Cały proces został zaprojektowany tak, aby można go było przeprowadzić niezależnie od źródła zasilania (ilustracja 1).
Ilościowy test PCR do wykrywania HAdV, wydalanego przez ludzi i znajdującego się w próbkach ścieków w wysokich stężeniach, został przystosowany do przeprowadzenia w miejscu użycia. HAdV są stosowane jako wskaźniki wirusa ludzkiego kału. PCR do oznaczania ilościowego bakteriofaga MS2 został również dostosowany, ponieważ MS2 jest używany w VirWaTest jako kontrola procesu. Metodę można dostosować do wykrywania dowolnego wirusa, który Cię interesuje.
Po opracowaniu, metoda VirWaTest została zastosowana przez użytkowników w dwóch różnych ustawieniach w Republice Afryki Środkowej (RCA) i Ekwadorze, dostarczając informacji zwrotnych na temat zastosowania protokołu w rzeczywistych sytuacjach.
O naszej wiedzy, jest to pierwsza procedura, która pozwala na koncentrację i wykrywanie wirusów w miejscu użytkowania, niezależnie od jakiegokolwiek zasilania, dużego sprzętu i warunków zamrażania/chłodzenia. Zaleca się pobranie dwóch powtórzeń każdej próbki wody w celu uzyskania wiarygodnych wyników.

<table><tbody><tr><td>5x HOT FIREPol Sonda qPCR Mix Plus (ROX)</td><td>Solis BioDyne</td><td>08-14-00001</td><td>Zawiera 5x sonda HOT FIREPol firmy Solis Biodyne qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 reakcji</td></tr><tr><td>Paski z 8 mikroprobówkami z nasadkami</td><td>dD Biolab</td><td>840637</td><td>niskoprofilowy, cienkościenny, przystosowany do ilościowego i jakościowego PCR</td></tr><tr><td>Baterie i zasilacze do mieszadła magnetycznego</td><td>GenIUL</td><td>900011674</td><td>Zawiera zasilanie samochodu 12V adapter</td></tr><tr><td>Wspornik łyżki</td><td>GenIUL</td><td>900011648</td><td>Aluminiowy wspornik</td></tr><tr><td>Wiadro, 10 L</td><td>Cater4You</td><td>10LTR</td><td>Polipropylen, Zabezpieczenie przed manipulacją, Przezroczysty kolor</td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa, 50 ml</td><td>LabBox</td><td>CTSP-E50-050</td><td>Polipropylen, sterylny, z podziałką, z osłoną</td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy 1-hydrat, 500 g</td><td>PanReac AppliChem</td><td>1410181211</td><td>czysty, klasa farmaceutyczna, 1 kilogram</td></tr><tr><td>Przezroczysta butelka PET</td><td>LabBox</td><td>FPET-500-088</td><td>Przezroczysty kolor, PET, nakrętka nie jest dołączona</td></tr><tr><td>Mleko odtłuszczone Difco, 500 g</td><td>Becton Dickinson</td><td>232100</td><td>Dehydrated</td></tr><tr><td>DNA/RNA Shield, 250 mL</td><td>Zymo Research</td><td>R1100-250</td><td>Pożywka do konserwacji DNA/RNA, 250 ml</td></tr><tr><td>Easy9 Kontroler pipet</td><td>LabBox</td><td>EAS9-001-001</td><td>0,3 &mu; m filtr, Pipety od 0,1 do 100 mL, Autoklawowalny silikonowy uchwyt na pipety</td></tr><tr><td>Eppendorf Tube, 0,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030121023</td><td>polipropylen, Bezpiecznik Eppendorf</td></tr><tr><td>Probówka, 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td>polipropylen, Safe-Lock</td></tr><tr><td>Eppendorf Tube, 5 mL</td><td>dD Biolab</td><td>999542</td><td>polipropylen, sterylny, stopniowany</td></tr><tr><td>etanol 96% v/v, 1 l</td><td>Panreac AppliChem</td><td>361085-1611</td> Pęseta laboratoryjna <td>UV, IR&nbsp; i HPLC</td></tr><tr><td></td><td>LabBox</td><td>FORS-007-002</td><td>Cienkie, zakrzywione końcówki, L=120 mm</td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>GenIUL</td><td>900017000</td><td>Marker bateryjny</td></tr><tr><td></td><td>dD Biolab</td><td>929203</td><td>, bardzo cienka końcówka, wodoodporny, szybkoschnący, do plastiku i szkła</td></tr><tr><td>Micro Rota-Rack do mikroprobówek</td><td>dD Biolab</td><td>37782</td><td>4 moduły, dł. x szer. x wys. = 208 x 100 x 100 mm</td></tr><tr><td>Mini8 Real-Time PCR Cycler</td><td>Coyote Biosciences, Chiny</td><td>Mini-8</td><td>Portable, Współpracuje z zasilaczami 12 V lub bateriami zewnętrznymi, Dwa kanały, Pojemność na 8 probówek</td></tr><tr><td>NucliSens Lysis Buffer</td><td>Biomerieux</td><td>200292</td><td>Odczynniki do 48 izolacji, Przechowywać w temperaturze otoczenia</td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna z otwartą końcówką, 10 ml</td><td>Deltalab</td><td>900136N</td><td>Sterylna, pakowana pojedynczo (papier/plastik)</td></tr> <tr><td>nakrętka PE PP28</td><td>LabBox</td><td>TP28-004-020</td><td>do butelek PET</td></tr><tr><td>Pasek wskaźnika pH</td><td>LabBox</td><td>WSPH-001-001</td><td>Zakres pH od 2,8 do pH 4,4, 50 pasków w opakowaniu</td></tr><tr><td>Plastikowa probówka</td><td>Quimikals</td><td>300913</td><td>zawiera nasadkę</td></tr><tr><td>Pipeta z polietylenu Pasteura</td><td>LabBox</td><td>PIPP-003-500</td><td>z podziałką, całkowita objętość 7 ml, Niesterylna</td></tr><tr><td>kolba polipropylenowa z nakrętką, 150 ml</td><td>Deltalab</td><td>409726</td><td>Zakrętka, sterylna, z podziałką do 100 ml</td></tr><tr><td>Polipropylenowa kolba z nakrętką, 60 ml</td><td>Deltalab</td><td>409526G</td><td>Zakrętka, sterylna, z podziałką do 50 ml</td></tr><tr><td>Detergent w proszku</td> <td>-</td><td></td> <td>zwykłe mydło w proszku do prania ubrań</td></tr><tr><td>zasilające do mieszadła magnetycznego</td><td>GenIUL</td><td>900011692</td><td>Połączenie między bateriami a mieszadłami</td></tr><tr><td>magnetycznymi QuickPick Narzędzie magnetyczne</td><td>BioNobile</td><td>24001</td><td>Ręczne narzędzie do cząstek magnetycznych</td></tr><tr><td>Końcówki QuickPick w pudełku</td><td>BioNobile</td><td>24296</td><td>Bez RNaz, autoklawowane, 96 jednostek</td></tr><tr><td>QuickPick XL gDNA Cząsteczki magnetyczne</td><td>BioNobile</td><td>SN51100</td><td>3,2 ml</td></tr><tr><td>Sole morskie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9883-500G</td><td>Sztuczna mieszanina soli bardzo przypominająca skład rozpuszczonych soli wody oceanicznej</td></tr><tr><td>Rurka silikonowa</td><td>LabBox</td><td>SILT-006-005</td><td>Rolka 5 metrów, wewnętrzna&nbsp; &oslash; x Zewnętrzna&nbsp; &oslash;= 6 x 10 mm</td></tr><tr><td>Granulki wodorotlenku sodu, 98,5 - 100,5%</td><td>VWR Chemicals</td><td>28244295</td><td>Granulki, 1 kg</td></tr><tr><td>Solarna platforma obrotowa</td><td>SOL-EXPERT Group</td><td>70020</td><td>Płyta akrylowa, 10 obr./min, obsługuje do 300 gramów</td></tr><tr><td>Zestaw 1-etapowej sondy SOLIScript</td><td>Solis BioDyne</td><td>08-57-00250</td><td>Zawiera 5x jednoetapową mieszankę sond Solis Biodyne (qPCR Mix) i 40x jednoetapową mieszankę SOLIScript (enzym odwrotnej transkryptazy), 250 reakcji</td></tr><tr><td>SPEEDTOOLS Zestaw do ekstrakcji wirusa RNA</td><td>BioTools</td><td>21.141-4197</td><td>Zawiera bufor BAW firmy BioTools (bufor płuczący 1), bufor BAV3 (bufor płuczący 2 i 3) oraz bufor BRE (bufor elucyjny).</td></tr><tr><td>SpinBar Octhaedral Stirring Magnet</td><td>dD Biolab</td><td>045926</td><td>Pivot Ring, L x&nbsp; &oslash; = 38 x 8 mm,</td></tr><tr><td>Niebieska pipeta serologiczna z taśmą, 10 ml</td><td>Deltalab</td><td>PN10E1</td><td>Sterylna, pakowana pojedynczo (papier/plastik)</td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna z taśmą, 50 ml</td><td>Deltalab</td><td>900043</td><td>sterylna, pakowana pojedynczo (papier/plastik)</td></tr><tr><td>Termi-DNA-Tor - Zmywacz</td> <td>kwasów nukleinowychBioTools</td><td>22001-4291</td><td>Środek do usuwania kwasów nukleinowych, bakterii, grzybów i mykoplazm z materiału i powierzchni, 450 ml</td></tr><tr><td>wodnego odczynnika do biologii molekularnej, 1L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502-1L</td><td>bez nukleaz i proteazy, 0,1 &mu; m</td></tr><tr><td>Filtrowana torba Whirl-Pak, 540 ml</td><td>Deltalab</td><td>200361</td><td>Stabilna dolna</td></tr><tr><td>torba z zamkiem błyskawicznym</td><td>LabBox</td><td>BZIP-080-100</td><td>Polietylen, dł. x szer. = 120 x 80 mm</td></tr></tbody></table>

virwatest, metoda punktowa do wykrywania wirusów w próbkach wody

VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples

Wirusy wydzielane przez ludzi i zwierzęta mogą zanieczyszczać źródła wody i stanowić zagrożenie dla zdrowia ludzkiego, gdy ta woda jest używana do picia, nawadniania żywności, mycia itp. Klasyczny wskaźnik bakterii kałowych nie zawsze sprawdza obecność patogenów wirusowych, dlatego wykrywanie patogenów wirusowych i wskaźników wirusowych jest istotne w celu przyjęcia środków ograniczających ryzyko, zwłaszcza w scenariuszach humanitarnych i na obszarach, na których często występują epidemie wirusów przenoszonych przez wodę.
Obecnie dostępnych jest kilka komercyjnych testów pozwalających na ilościowe określenie bakterii wskaźnikowych kału (FIB) w miejscu użycia. Jednak takie komercyjne testy nie są dostępne do wykrywania wirusów. Wykrycie wirusów w próbkach wody środowiskowej wymaga skoncentrowania kilku litrów w mniejszych objętościach. Co więcej, po skoncentrowaniu wykrywanie wirusów opiera się na metodach takich jak ekstrakcja kwasów nukleinowych i wykrywanie molekularne (np. testy oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy [PCR]) genomów wirusa.
Opisana tutaj metoda pozwala na koncentrację wirusów z 10 litrowych próbek wody, jak również ekstrakcję wirusowych kwasów nukleinowych w miejscu użycia, za pomocą prostego i przenośnego sprzętu. Pozwala to na badanie próbek wody w miejscu użycia pod kątem kilku wirusów i jest przydatne w scenariuszach humanitarnych, a także w każdym kontekście, w którym nie jest dostępne wyposażone laboratorium. Alternatywnie, metoda ta pozwala na zagęszczenie wirusów obecnych w próbkach wody i wysłanie koncentratu do laboratorium w temperaturze pokojowej w celu dalszej analizy.

Opracowanie metody
Niniejsza procedura została opracowana w Laboratorium Wirusów Zanieczyszczających Wodę i Żywność we współpracy z GenIUL i Oxfam Intermón. Składa się ona z trzech różnych etapów. Pierwszy z nich, koncentracja cząstek wirusowych, stanowi adaptację metody flokulacji mlekiem odtłuszczonym, opisanej wcześniej12,17,<sup class="xre...

Tutaj prezentujemy VirWaTest, który jest prostą, niedrogą i przenośną metodą koncentracji i wykrywania wirusów z próbek wody w miejscu użycia.

VirWaTest, metoda punktowa do wykrywania wirusów w próbkach wody

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food ...

Wirusy jelitowe znajdują się głównie w różnych zbiornikach wodnych, w tym w wodach gruntowych, wodach stojących, strumieniach, rzekach i wodach. Wiążą się one z zagrożeniami dla zdrowia i są odpowiedzialne za infekcje u ludzi. Wirusy jelitowe często powodują zapalenie żołądka i jelit i są najczęściej przenoszone drogą fekalno-oralną.Inne choroby przenoszone przez wodę powodują ostre zapalenie wątroby wywołane wirusem zapalenia wątroby typu A i wirusami zapalenia wątroby typu E, ze znaczną śmiertelnością związaną zwłaszcza z wirusowym zapaleniem wątroby typu E u kobiet w ciąży. Rzeczywiste protokoły monitorowania jakości wody zaproponowane w kontekście humanitarnym zostały zaprojektowane tak, aby bakterie takie jak E.Coli były wskaźnikiem zanieczyszczenia kałem. Ale już wiadomo, że nie ma korelacji z innymi mikroorganizmami, takimi jak wirusy, które są bardziej odporne na wiele procesów aktywacji.Do tej pory wykrywanie wirusów w sytuacjach kryzysów humanitarnych odbywało się poprzez dostosowanie istniejących protokołów do warunków panujących w tych kontekstach i wysyłanie próbek do laboratoriów referencyjnych w celu molekularnego wykrywania wirusów. Istnieje zapotrzebowanie na metody wykrywania patogenów wirusowych i wskaźników wirusowych w celu zmniejszenia zagrożeń dla zdrowia publicznego, zapobiegania wybuchom epidemii i zwiększenia skuteczności interwencji humanitarnych. Proponujemy metodę wykrywania wirusów w 10-litrowych próbkach wody, która jest podzielona na trzy etapy: stężenie wirusa, ekstrakcja kwasów nukleinowych i wykrywanie wirusów.Wszystkie te etapy zostały zaadaptowane z metod stosowanych obecnie w naszym laboratorium i mogą być wykonywane w ujęciu poglądowym przy użyciu przenośnych odczynników i sprzętu, wytwarzającego czynniki zależne od zasilania i zamrażarek. Do metody dodano również roztwór konserwujący, aby zagwarantować stabilność kwasów nukleinowych do wysyłki do laboratoriów referencyjnych w razie potrzeby. Proponowana przez nas metoda nazywa się VirWaTest i została opracowana we współpracy GenIUL i Intermon Oxfam.Przed rozpoczęciem należy wziąć pod uwagę liczbę próbek, które mają być badane w celu przygotowania odczynników i materiału. Zaleca się pobranie dwóch powtórzeń każdej próbki wody w celu uzyskania reprezentatywnych wyników. Kilka próbek może być testowanych w tym samym czasie, jeśli dostępna jest odpowiednia ilość materiału.Odczynniki i materiały powinny być przygotowane i zapakowane przed przemieszczeniem lub wysyłką do miejsca, w którym metoda jest potrzebna. Wykaz materiałów i drobnego sprzętu, które należy spakować, został opisany w tabeli pierwszej. Przygotować materiał bakteriofagowy MS2, który zostanie dodany do każdej próbki wody w ramach kontroli procesu, postępując zgodnie z odpowiednią metodą ISO.Następnie rozprowadzić 10 mikrolitrów zawiesiny zawierającej od 10 do 10 jednostek platformowych wstępnie przygotowanych do probówek o pojemności 10 ml i pozostawić wodę do wyschnięcia. Potrzebna będzie jedna probówka na próbkę wody. Dodatkowo należy przygotować jedną probówkę zawierającą 10 ml sterylnej wody destylowanej na pobraną próbkę.Do wstępnie flokulowanego roztworu mleka odtłuszczonego przygotuj probówkę zawierającą odtłuszczone mleko, plastikową torbę z zamkiem błyskawicznym zawierającą sól morską oraz plastikową butelkę zawierającą wodę destylowaną. W celu dostosowania pH przygotuj probówkę zawierającą kwas cytrynowy, probówkę zawierającą wodorotlenek sodu oraz dwa plastikowe pojemniki z 25 i 50 ml wody destylowanej. Dla każdej próbki wody, która ma być badana, przygotuj saszetkę kondycjonującą, dodając sole morskie i kwas cytrynowy do plastikowej torby z zamkiem błyskawicznym, a roztwór konserwujący, dodając bufor do lizy i środek konserwujący kwasy nukleinowe do probówki o pojemności 5 ml.Na koniec przygotuj cztery saszetki neutralizujące, dodając detergent do czterech plastikowych torebek z zamkiem błyskawicznym. Dla każdej próbki wody, która ma być ekstrahowana, przygotuj jedną probówkę o pojemności pięciu ml zawierającą cząstki magnetyczne i etanol oraz trzy probówki o pojemności 2 ml zawierające odpowiednio 500, 600 i 200 mikrolitrów płuczących jeden, dwa i trzy oraz jedną probówkę zawierającą bufor elucyjny. Dwie różne ekstrakcje kwasów nukleinowych mogą być analizowane jednocześnie w każdym teście PCR, jeśli używany jest termocykler Newell.Do wszystkich testów PCR przygotuj wodę z biologii molekularnej. Przygotować mieszaniny zawierające dwa startery i jeden dowód specyficzny dla każdego wirusa docelowego zgodnie z objętościami i stężeniami opisanymi w protokole. Dla każdego wirusa dodaj wskazane objętości do probówek od pierwszej do ośmiu tacek na probówki.Pokrój pasek, dzieląc go na dwa paski. Rurki od pierwszej do piątej i rurki od szóstej do ośmiu. Dla każdego wirusa suche na powietrzu zawiesiny DNA zawierające od 10 do 5, 10 do 7 i od 10 do 9 oraz znane kopie wstępnie przygotowane w probówkach szóstej, siódmej i ósmej.Ten protokół koncentracji opiera się na zasadzie flokulacji organicznej, dzięki której warunki niskiego pH i wysokiej przewodności napędzają białka mleka odtłuszczonego do organizowania się w kłaczki, do których wchłaniają się wirusy. Po ustabilizowaniu się kłaczków można je łatwo zebrać. Zbierz 10-litrową próbkę wody do wiadra z płaskim dnem wyposażonego w pokrywkę.Jeśli zbierasz z rury, pozwól wodzie płynąć przez kilka sekund przed zebraniem wody. Ważne jest, aby używać przezroczystych wiader do wizualizacji peletów. Poszukaj płaskiej przestrzeni w świeżym miejscu, z dala od bezpośredniego światła słonecznego Umieść mieszadło magnetyczne podłączone do akumulatora pod wspornikiem wiadra i umieść wiadro zawierające próbkę wody na każdym wsporniku.Ponownie rozważ kwas cytrynowy i wodorotlenek sodu i potrząsaj aż do całkowitego rozpuszczenia. Wlej 500 ml wody destylowanej do stojącej torby i umieść worek na mieszadle magnetycznym. Dodaj zawartość jednej saszetki soli morskiej i zawartość jednej rurki z odtłuszczonym mlekiem i mieszaj przez pięć minut na średnich obrotach.Dostosuj pH flokulowanego mleka odtłuszczonego za pomocą kwasu cytrynowego i wodorotlenku sodu do pH między 3,4 a 3,6. Wyłącz mieszadło magnetyczne i upewnij się, że kłaczki są widoczne. Latarka może pomóc w wizualizacji kłaczków.Wrzuć magnes mieszający do wody. Ustaw mieszadło magnetyczne na maksymalną prędkość i włącz je. Dodaj 10 ml wody destylowanej do probówki kontrolowanej przez proces.Odwróć go kilka razy i wlej roztwór do wody. Wsypać zawartość jednej saszetki z kondycjonowaniem próbki do wody i mieszać przez pięć minut. Upewnij się, że pH próbki wody, które powinno wynosić od 3,4 do 3,6.W razie potrzeby dostosuj pH. Dodaj 100 ml wstępnie flokulowanego roztworu mleka odtłuszczonego, zamknij wiadro pokrywką i pozostaw wodę mieszającą przez osiem godzin z minimalną prędkością. Po ośmiu godzinach wyłącz mieszadło magnetyczne i pozwól kłaczkom osiąść przez co najmniej pięć dodatkowych godzin.W przypadku systemu opartego na użyciu kontrolera pipet, plastikowej rurki i kilku pipet należy wyrzucić supernatant, uważając, aby nie naruszyć kłaczków na dnie wiadra. Gdy poziom wody dotrze do magnesu mieszającego, ściśnij plastikową rurkę, aby zatrzymać przepływ wody i odsuń pipetę od wiadra. Potrząśnij wiadrem, aby ponownie zawiesić kłaczki i wlej je do stojącej plastikowej torby.Pozwól kłaczkom osiąść przez dodatkową godzinę. Ostrożnie odessać supernatant wodny za pomocą pipety, unikając uszkodzenia kłaczków. Odessać kłaczki za pomocą pipety i przenieść je do stożkowej probówki.Zanotuj końcową objętość koncentratu próbki i przenieś 1 ml do probówki zawierającej roztwór konserwujący. Zawiesina może być wykorzystana do przeprowadzenia ekstrakcji kwasów nukleinowych w terenie lub wysłana do laboratorium referencyjnego w celu dalszej analizy. Woda wyrzucona podczas zbierania kłaczków musi zostać oczyszczona przed usunięciem.Dodać zawartość saszetki ze środkiem neutralizującym do wiadra zawierającego wylaną wodę. Wymieszaj wodę i pozostaw ją nieruchomą na trzydzieści minut. Następnie uzdatnioną wodę należy zutylizować jako odpad ogólny.Cząstki magnetyczne mogą być przenoszone z jednej probówki do drugiej za pomocą pipety magnetycznej. Przyzwyczaj się do działania pipety magnetycznej przed wykonaniem ekstrakcji. Ułóż probówki zawierające odczynnik wymagany do ekstrakcji w stojaku.To znaczy od lewej do prawej: bufor wiążący, płuczące i bufor elucyjny. Przenieść 1 ml koncentratu próbki do probówki zawierającej bufor wiążący za pomocą jednorazowej pipety plastikowej. Odwróć rurkę dziesięć razy, aby zoptymalizować roztwór.Inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez dziesięć minut, ciągle mieszając za pomocą pojedynczego orbitalu lub ręcznie. Zbierz cząstki magnetyczne za pomocą pipety magnetycznej i czystej końcówki, która może być ponownie użyta do trzech myjących, a następnie uwolnij cząstki magnetyczne do probówki zawierającej pierwszy bufor myjący. Umyj je, delikatnie potrząsając roztworem końcówką przez trzydzieści sekund i zbierz.Powtórz tę procedurę mycia dla mycia drugiego i trzeciego. Zebrać cząstki magnetyczne w buforze płuczącym nr 3 i uwolnić je do probówki zawierającej bufor elucyjny. Następnie wyrzuć końcówkę.Inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez pięć minut, ciągle mieszając przy użyciu orbitalu solo. Zamień końcówkę pipety magnetycznej na dowolną i zbierz wszystkie cząstki magnetyczne z buforu elucyjnego. Wyrzuć końcówkę z przyczepionymi cząstkami.Kwas nukleinowy pozostaje w buforze elucyjnym, który powinien być przechowywany do dalszej analizy lub transportu. Należy użyć paska składającego się z pięciu probówek i trzech probówek przygotowanych do wykrywania ludzkich adenowirusów. Dodaj wodę, mieszaninę PCR i ekstrację kwasów nukleinowych do probówek od pierwszej do piątej zgodnie z protokołem.Następnie dodaj wodę i mieszankę PCR do probówek od szóstej do ósmej. Umieść oba paski w termocyklerze i wybierz odpowiedni przebieg. Po zakończeniu biegu zbierz wyniki i przeanalizuj uzyskane dane.Tylko wtedy, gdy testy na obecność wirusa dały wynik ujemny, należy przeprowadzić detekcję MS2. Użyj pasków probówek przygotowanych do wykrywania MS2 i wybierz odpowiedni profil termiczny do PCR. Ekstrakcję magnetycznych kwasów nukleinowych VirWaTest porównano z RNA wirusa QIAgen, naśladowano go, testując próbki wody z dodatkiem ludzkich adenowirusów i MS2.Wartość p testu redukcji wykazuje znacznie wyższy odzysk wirusa przy użyciu VirWaTest niż QiAgen jako metody ekstrakcji dla obu testowanych wirusów. Opracowana metoda zagęszczania wirusa została przetestowana w terenie we współpracy z zespołami myjącymi Oxfam zlokalizowanymi w Bangi w Republice Środkowoafrykańskiej i w Pedernales w Ekwadorze, które pobrały próbki wody, zagęściły je przy zastosowaniu opracowanej metody koncentracji i wysłały do laboratorium w Barcelonie w celu ekstrakcji kwasów nukleinowych i ilościowego określenia wirusa. W Ekwadorze ludzkie adenowirusy wykryto we wszystkich badanych próbkach, podczas gdy jedna na pięć próbek pobranych i skoncentrowanych w Bangi dała wynik pozytywny na obecność ludzkich adenowirusów.Opracowana metoda okazała się przydatna, gdy została oceniona przez zespoły myjące z Oxfam Intermon w Bangi w Republice Środkowoafrykańskiej oraz przez inny zespół w Pedernales w Ekwadorze. VirWaTest może być częścią systemu wczesnego ostrzegania lub może być używany w dochodzeniu w sprawie epidemii przez organizacje zajmujące się uzdatnianiem wody. Sprzęt ten ułatwia analizę patogenów wirusowych w wodzie i poprawę zarządzania bezpieczeństwem wody w celu zmniejszenia liczby przypadków chorób wirusowych w kontekście kryzysów humanitarnych.

virwatest-point-use-method-for-detection-viruses-water

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Szybkość wymiany wirusów w systemach morskich i słodkowodnych można oszacować za pomocą techniki redukcji i ponownego pojawienia się. Uzyskane dane pozwalają badaczom wywnioskować tempo śmiertelności mikroorganizmów indukowanej przez wirusy w systemach wodnych.

Szacowanie szybkości produkcji wirusów w systemach wodnych

Badanie opisuje kosztowo efektywną metodę identyfikacji źródła zanieczyszczenia kałowego/moczowego lub zanieczyszczenia azotanami w wodzie z wykorzystaniem qPCR do specyficznej kwantyfikacji ludzkich/świńskich/bydlęcych wirusów DNA, adenowirusów i poliomawirusów, proponowanych jako narzędzia MST.

Kosztowo efektywna metoda śledzenia źródeł mikrobów z wykorzystaniem specyficznych wirusów ludzkich i zwierzęcych

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie systemu zagęszczania próbek z wykorzystaniem ultrafiltracji stycznoprzepływowej z pustymi włóknami oraz dysocjacji termicznej jako alternatywnych kroków w wykrywaniu gatunków Cryptosporidium i Giardia przenoszonych przez wodę zgodnie z metodą EPA 1623.

Zmodyfikowana metoda EPA 1623 wykorzystująca ultrafiltrację przezroświećną z przepływem stycznym oraz etapy dysocjacji termicznej do wykrywania wodnych Cryptosporidium i Giardia spp.

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

Opracowano podejście do identyfikacji optymalnych warunków koncentracji wirusa dla małych objętości próbek wody przy użyciu kolców ludzkiego adenowirusa. Opisane tutaj techniki są wykorzystywane do identyfikacji parametrów stężenia dla innych celów wirusowych i stosowane do eksperymentów z stężeniem wirusa na dużą skalę.

Procedura małej objętości do pomiaru stężenia wirusa z wody

Metoda EPA 1615 wykorzystuje filtr elektrododatni do koncentracji enterowirusów i norowirusów w środowisku i wodach pitnych. Niniejszy manuskrypt opisuje procedurę pobierania próbek do analiz metodą 1615.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. I. Pobieranie próbek wirusów

Tutaj prezentujemy procedurę pomiaru całkowitej liczby wirusów zdolnych do hodowli za pomocą linii komórkowej nerki Buffalo Green Monkey. Procedura zapewnia ustandaryzowane narzędzie do pomiaru występowania zakaźnych wirusów w środowisku i wodach pitnych.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. II. Całkowity test na obecność wirusa hodowlanego

Tutaj prezentujemy procedurę ilościowego oznaczania enterowirusa i norowirusa w wodach środowiskowych i pitnych za pomocą odwrotnej transkrypcji ilościowej PCR. Średni odzysk wirusa z wód gruntowych przy użyciu tej znormalizowanej procedury z metody EPA 1615 wynosił 20% dla wirusa polio i 30% dla mysiego norowirusa.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. Część III. Wykrywanie wirusów za pomocą RT-qPCR

Pokazano metodę opartą na żywicy anionowymiennej, dostosowaną do pobierania próbek wirusów z bioaerozolu na bazie płynnych uderzeń. W połączeniu z detekcją molekularną, metoda ta pozwala na łatwe i czułe wykrywanie wirusów w bioaerozolach.

Wykrywanie wirusów w bioaerozolach za pomocą żywicy anionowymiennej

Stężenie wirusa z próbek wody i ścieków środowiskowych jest trudnym zadaniem, przeprowadzanym głównie w celu identyfikacji i kwantyfikacji wirusów. Chociaż opracowano i przetestowano kilka metod koncentracji wirusów, tutaj wykazujemy skuteczność ultrafiltracji i flokulacji mleka odtłuszczonego dla wirusów RNA z różnymi typami próbek.

Zagęszczenie cząstek wirusa w próbkach wody i ścieków środowiskowych przy użyciu flokulacji mleka odtłuszczonego i ultrafiltracji

Poznaj metodę VirWaTest do wykrywania wirusów jelitowych w próbkach wody. Ta przenośna technika umożliwia skuteczną koncentrację i detekcję patogenów w warunkach terenowych, poprawiając bezpieczeństwo wody pitnej.

VirWaTest, metoda punktowa do wykrywania wirusów w próbkach wody

Przeglądaj więcej filmów