Bezpośrednie przeprogramowanie in vivo rezydentnych komórek glejowych na interneurony poprzez domózgowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych

Protokół ten pokazuje, że możliwe jest generowanie nowych neuronów bezpośrednio w mózgu z miejscowego gleju i że te przeprogramowane komórki dojrzewają do neuronów specyficznych dla podtypu. Główną zaletą jest wirus AAV zależny od cre, który umożliwia specyficzne celowanie w glej NG2 i reporter GFP, który znakuje przeprogramowane neurony do analizy. Generowanie nowych neuronów w mózgu może prowadzić do przyszłego rozwoju terapii zastępowania komórek w mózgu.

W naszym protokole generujemy interneurony parwalbuminowo-dodatnie, które mają wpływ na zaburzenia psychiczne. Przeprogramowanie in vivo można zastosować do innych obszarów i obwodów mózgu, w zależności od fenotypu neuronalnego i stanu neurologicznego, na który chcesz celować. Procedurę zademonstrują Jenny Johansson: technik, Maria Pereira: była doktorantka i Marcella Birtele: doktorantka w naszym laboratorium.

Aby wytworzyć wektor wirusa AAV5, HEK293T komórki nasienne standardową pożywką hodowlaną w pięciu kolbach T175. Gdy komórki osiągną 50 do 70% konfluencji, przygotuj następującą mieszankę do transwekcji. W 50-mililitrowej probówce wirówkowej dodaj równe ilości molowe plazmidu wektorowego i plazmidu pomocniczego serii pDG.

Dodaj bufor Tris-EDTA do końcowej objętości 144 mikrolitrów, a następnie dodaj ultraczystą wodę, aby uzyskać całkowitą objętość 1296 mikrolitrów i wymieszaj. Następnie dodaj 144 mikrolitry 2,5-molowego chlorku wapnia i wymieszaj. Następnie dodaj 1,92 mililitra HBS do roztworu DNA i natychmiast wymieszaj.

Inkubować w temperaturze pokojowej dokładnie przez 60 sekund. Następnie przenieś roztwór do 28 mililitrów świeżej pożywki do hodowli komórkowych i wymieszaj. Zastąpić pożywkę w kolbach pożywką zawierającą mieszaninę transwekcyjną.

Odczekaj trzy dni i przenieś nośnik do odpadu. Dodać pięć mililitrów buforu do zbioru do każdej kolby, a następnie dodać kolejne cztery mililitry DPBS do każdej kolby, aby przepłukać pozostałe komórki i połączyć je z roztworem komórkowym. Odwirować zebrane komórki w temperaturze 1 000 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po odwirowaniu usunąć supernatant i rozpuścić osad w 15 mililitrach buforu do lizy. Zamroź 50-mililitrową probówkę wirówkową na suchym lodzie na 15 minut i przechowuj w zamrażarce o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Przed użyciem zebrany lizat komórkowy rozmrozić w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

W tej procedurze należy przeprowadzić oczyszczanie AAV za pomocą ultrawirowania w gradionym jodiksanolu i użyć ultrawirówek sufitowych z wirowaniem przy 350 000 x g przez godzinę i 45 minut w temperaturze pokojowej. Aby wyekstrahować fazę zawierającą AAV, włóż 10-mililitrową strzykawkę z igłą o rozmiarze 18 około dwóch milimetrów poniżej granicy fazy od 40 do 60%, ze skosem skierowanym do góry i wycofaj. Pamiętaj, aby zatrzymać się przed dotarciem do pasma białkowego po ekstrakcji od pięciu do sześciu mililitrów wektora wirusowego.

Następnie należy oczyścić i skoncentrować rozcieńczony gradient jodiksanolu przez filtr anionowymienny, przepychając go z szybkością nie większą niż jedna kropla na sekundę. Następnie powoli przepchnij trzy mililitry buforu IE przez filtr, aby go umyć. Następnie eluować mieszaninę do odśrodkowego zespołu filtrującego z jednym do dwóch mililitrów buforu elucyjnego.

Dodaj DPBS do urządzenia do końcowej objętości czterech mililitrów. Wirować przy 2 000 x g w temperaturze pokojowej, aż w filtrze pozostanie mniej niż 0,5 mililitra DPBS. Następnie usuń płyn z dna probówki, napełnij czterema mililitrami DPBS i ponownie odwiruj.

Powtórz ten krok jeszcze dwa razy, upewnij się, że objętość skoncentrowanego wektora na filtrze wynosi około 200 mikrolitrów po ostatnim odwirowaniu. Usuń skoncentrowany wektor o pojemności 200 mikrolitrów za pomocą pipety i przepchnij go przez filtr 0,22 mikrometra w celu sterylizacji. Następnie przelać 200 mikrolitrów do szklanej fiolki z zablokowaną wkładką.

Aby wstrzyknąć czynniki przeprogramowujące, umieść znieczuloną mysz w ramce stereotaktycznej. Na początku zabiegu należy podać odpowiednią analgezję, a następnie umieścić końcówkę szklanej kapilary igły iniekcyjnej tuż nad bregmą. Upewnij się, że końcówka kapilary jest idealnie prosta zarówno w płaszczyznach AP, jak i ML.

Zresetuj wartości ML i A-P do 0,0 na cyfrowym liczniku współrzędnych. Aby upewnić się, że głowa zwierzęcia znajduje się w idealnie płaskiej pozycji, użyj cyfrowego licznika współrzędnych do zmierzenia wartości współrzędnych D-V, gdy ramię AP znajduje się na plus 2.0 i minus 2.0, a także gdy ramię ML znajduje się na plus 2.0 i minus 2.0. Dostosuj odpowiednio wysokość listwy zębatej i nauszników.

Następnie należy lekko podnieść strzykawkę i wywiercić otwór za pomocą wiertła dentystycznego we współrzędnych wstrzyknięcia. Rozpocznij wiercenie na miejscu, pracując w sposób okrężny i delikatny. Następnie umieść kawałek bawełnianej gazy na otwartym nacięciu i przepłucz strzykawkę roztworem soli fizjologicznej.

Po przepłukaniu należy pobrać pęcherzyk powietrza, a następnie jeden mikrolitr roztworu zawierającego wektor wirusowy. Upewnij się, że roztwór wirusowy można łatwo zwizualizować poniżej pęcherzyka powietrza. Następnie opuść strzykawkę, powoli przesuwając się na żądaną głębokość i upewnij się, że trajektoria jest wolna od fragmentów kości.

Następnie wstrzyknąć jeden mikrolitr roztworu wirusa w tempie 0,4 mikrolitra na minutę. Po wykonaniu wstrzyknięcia należy odczekać dwie minuty do dyfuzji przed pobraniem strzykawki. Po dyfuzji powoli wycofaj strzykawkę, aż końcówka naczynia włosowatego zostanie całkowicie wycofana z mózgu, a następnie ostrożnie zszyj nacięcie i usuń zwierzę z ramy stereotaktycznej.

Monitorować zwierzę na stacji pooperacyjnej do czasu odzyskania przytomności. Zwierzęta są trzymane do 12 tygodni po wstrzyknięciu wirusa, aby umożliwić miejscowemu glejowi przeprogramowanie się w dojrzałe neurony. Aby przygotować wycinki mózgu do elektrofizjologii za pomocą wibratomu, należy z dużą prędkością przeciąć mózg od najbardziej rostralnej części w dół do poziomu prążkowia.

Następnie przekrój prążkowia koronalnie na 275 mikrometrów z prędkością 0,1 milimetra na sekundę. Po każdym wycięciu należy ostrożnie usunąć niewstrzykniętą stronę prążkowia i przenieść wstrzykniętą stronę do fiolki z siatką denną i natlenionym szkiełkiem CREB sense w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej. Przechowywać fiolkę w temperaturze pokojowej do momentu przecięcia wszystkich skrawków.

Następnie powoli zwiększaj temperaturę łaźni wodnej do 37 stopni Celsjusza i pozostaw ją na 30 minut, a następnie wyłącz grzałkę i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej. Po przeniesieniu jednego wycinka tkanki do komory rejestrującej w celu elektrofizjologii, zamontuj szklaną pipetę na elektrodzie rejestrującej i opuść ją do roztworu. Dokładnie sprawdź rezystancję elektrody.

Następnie powoli zbliż się pipetą do przeprogramowanej komórki, utrzymując lekkie dodatnie ciśnienie w elektrodzie, aby uniknąć zatkania końcówki, i sprawdź, czy ogniwo jest dodatnie GFP przed załataniem. Gdy ogniwo zostanie załatane, utrzymuj ogniwo w zacisku prądowym od minus 60 do minus 70 miliwoltów i wstrzyknij prądy 500 milisekund od minus 20 do plus 90 pikoamperów z przyrostami 10 pikoamperów, aby indukować potencjały czynnościowe. Wskazuje to na dojrzewanie neuronów i udane przeprogramowanie.

Następnie przełącz się na cęgi napięciowe i zmierz wewnętrzne prądy sodu i opóźnione prostowanie prądów potasowych w krokach depolaryzacji 10 miliwoltów. Oto nagrany po nagraniu przeprogramowany neuron wypełniony biocytyną, który pokazuje dojrzałą morfologię neuronów i kolce dendrytyczne. W tym przypadku zapisy elektrofizjologiczne przeprogramowanych neuronów wykazują obecność postsynaptycznych połączeń funkcjonalnych z pomiarami spontanicznej aktywności.

Ślady pokazują aktywność hamującą, która jest blokowana przez pikrotoksynę, antagonistę receptora GABAA i aktywność pobudzającą, która jest blokowana przez CNQX, antagonistę receptora AMPA. Poprawione neurony wykazują aktywność postsynaptyczną już po pięciu tygodniach od wstrzyknięcia i utrzymują się po ośmiu i 12 tygodniach od wstrzyknięcia. Liczba neuronów z potencjałami czynnościowymi indukowanymi prądem również wzrasta z czasem.

Bardziej szczegółowa analiza ujawniła kilka odrębnych wzorców wypalania, w których większość komórek wykazuje szybką aktywność impulsową, podobną do interneuronów parwalbuminy. Analiza immunohistochemiczna po 12 tygodniach wykazała ponadto koekspresję reporterowego GFP i parwalbuminy. Postępując zgodnie z tą procedurą, możesz zbadać ekspresję genów za pomocą techniki wyszukiwania plam lub ocenić trójwymiarową łączność synaptyczną za pomocą śledzenia monosynaptycznego i iDISCO.

Teraz, gdy możliwe jest przeprogramowanie miejscowego gleju w interneurony wyrażające parwalbuminę, zaczęliśmy badać, czy są one autentyczne i czy mogą być używane jako narzędzie terapeutyczne. Pamiętaj, aby postępować zgodnie z ustalonymi protokołami i wytycznymi podczas obchodzenia się ze zwierzętami i używania wirusa AAV.