Name: Bezpośrednie przeprogramowanie in vivo rezydentnych komórek glejowych na interneurony poprzez domózgowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Poznaj metodę bezpośredniego przeprogramowania komórek glejowych na interneurony in vivo przy użyciu wektorów AAV w modelu mysim. Technika ta umożliwia generowanie dojrzałych neuronów parwalbuminowych z potencjałem terapeutycznym w zaburzeniach psychiatrycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Marcella Birtele została sfinansowana przez Program Unii Europejskiej Horyzont 2020 (H2020-MSCA-ITN-2015) w ramach Innowacyjnej Sieci Szkoleniowej Marie Skłodowska-Curie oraz Umowy o Grant nr 676408. Daniella Rylander Ottosson jest finansowana przez Szwedzką Radę ds. Badań Naukowych (2017-01234).

<ol><li>Barker, R. A., Parmar, M., Studer, L., Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Trials+of+Stem+Cell-Derived+Dopamine+Neurons+for+Parkinson%27s+Disease%3A+Dawn+of+a+New+Era%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human Trials of Stem Cell-Derived Dopamine Neurons for Parkinson's Disease: Dawn of a New Era.</a> Cell Stem Cell. 21 (5), 569-573 (2017).</li>
<li>Southwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneurons+from+embryonic+development+to+cell-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interneurons from embryonic development to cell-based therapy.</a> Science. 344 (6180), 1240622(2014).</li>
<li>Parmar, M., Torper, O., Drouin-Ouellet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+therapy+for+Parkinson%27s+disease%3A+A+journey+through+decades+toward+the+light+side+of+the+Force%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cell-based therapy for Parkinson's disease: A journey through decades toward the light side of the Force.</a> European Journal of Neuroscience. , (2018).</li>
<li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Reprogramming+of+Striatal+NG2+Glia+into+Functional+Neurons+that+Integrate+into+Local+Host+Circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry.</a> Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).</li>
<li>Su, Z., Niu, W., Liu, M. L., Zou, Y., Zhang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+conversion+of+astrocytes+to+neurons+in+the+injured+adult+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">In vivo conversion of astrocytes to neurons in the injured adult spinal cord.</a> Nature Communication. 5, 3338(2014).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascl1+Converts+Dorsal+Midbrain+Astrocytes+into+Functional+Neurons+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ascl1 Converts Dorsal Midbrain Astrocytes into Functional Neurons In Vivo.</a> Journal of Neuroscience. 35 (25), 9336-9355 (2015).</li>
<li>Guo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+direct+reprogramming+of+reactive+glial+cells+into+functional+neurons+after+brain+injury+and+in+an+Alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an Alzheimer's disease model.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 188-202 (2014).</li>
<li>Grande, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+impact+on+direct+neuronal+reprogramming+in+vivo+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Environmental impact on direct neuronal reprogramming in vivo in the adult brain.</a> Nature Communication. 4, 2373(2013).</li>
<li>Niu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+astrocytes+to+neuroblasts+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of astrocytes to neuroblasts in the adult brain.</a> Nature Cell Biology. 15 (10), 1164-1175 (2013).</li>
<li>Weinberg, M. S., Criswell, H. E., Powell, S. K., Bhatt, A. P., McCown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+Vector+Reprogramming+of+Adult+Resident+Striatal+Oligodendrocytes+into+Functional+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Viral Vector Reprogramming of Adult Resident Striatal Oligodendrocytes into Functional Neurons.</a> Molecular Therapy. 25 (4), 928-934 (2017).</li>
<li>Pereira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Reprogramming+of+Resident+NG2+Glia+into+Neurons+with+Properties+of+Fast-Spiking+Parvalbumin-Containing+Interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct Reprogramming of Resident NG2 Glia into Neurons with Properties of Fast-Spiking Parvalbumin-Containing Interneurons.</a> Stem Cell Reports. 9 (3), 742-751 (2017).</li>
<li>Rivetti di Val Cervo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+functional+dopamine+neurons+from+human+astrocytes+in+vitro+and+mouse+astrocytes+in+a+Parkinson%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Induction of functional dopamine neurons from human astrocytes in vitro and mouse astrocytes in a Parkinson's disease model.</a> Nature Biotechnology. 35 (5), 444-452 (2017).</li>
<li>Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-free+Production+of+Laboratory+Grade+AAV+and+Purification+by+Iodixanol+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Methods+%26+Clinial+Development%22%5BJournal%5D)">Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation.</a> Molecular Therapy Methods & Clinial Development. 10, 1-7 (2018).</li>
<li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+neurons+via+direct+conversion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Generation of induced neurons via direct conversion in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 7038-7043 (2013).</li>
<li>Kawaguchi, Y., Kubota, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+physiological+subgroupings+of+nonpyramidal+cells+with+parvalbumin-+and+calbindinD28k-immunoreactive+neurons+in+layer+V+of+rat+frontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Correlation of physiological subgroupings of nonpyramidal cells with parvalbumin- and calbindinD28k-immunoreactive neurons in layer V of rat frontal cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 70 (1), 387-396 (1993).</li>
<li>Grealish, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+A9+dopamine+neuron+component+in+grafts+of+ventral+mesencephalon+is+an+important+determinant+for+recovery+of+motor+function+in+a+rat+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The A9 dopamine neuron component in grafts of ventral mesencephalon is an important determinant for recovery of motor function in a rat model of Parkinson's disease.</a> Brain. 133 (Pt 2), 482-495 (2010).</li>
<li>Thompson, L., Barraud, P., Andersson, E., Kirik, D., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+dopaminergic+neurons+of+nigral+and+ventral+tegmental+area+subtypes+in+grafts+of+fetal+ventral+mesencephalon+based+on+cell+morphology%2C+protein+expression%2C+and+efferent+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of dopaminergic neurons of nigral and ventral tegmental area subtypes in grafts of fetal ventral mesencephalon based on cell morphology, protein expression, and efferent projections.</a> Journal of Neuroscience. 25 (27), 6467-6477 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Bezpośrednie przeprogramowanie in vivo można osiągnąć przy użyciu wektorów AAV FLEX w szczepach myszy z ekspresją Cre. Należy zauważyć, że zaobserwowano różnice między szczepami myszy pod względem skuteczności przeprogramowywania. W przypadku przeprogramowania in vivo prążkowia, linia myszy NG2-Cre okazała się bardziej wydajna w porównaniu z innymi szczepami. Przed rozpoczęciem stosowania nowego szczepu zwierzęcego ważne jest, aby zapoznać się z wytycznymi dostawcy myszy dotyczącymi ekspresji Cre w czasie, ponieważ wiek zwierząt często wpływa na specyficzność ekspresji tego białka. W naszych badaniach zwierzęta w wieku powyżej 12 tygodni nie były wykorzystywane do przeprogramowania in vivo, ponieważ istniało ryzyko ekspresji Cre w komórkach innych niż glej NG2. Zaleca się stałą obecność i monitorowanie zwierząt kontrolnych, którym wstrzyknięto wyłącznie konstrukt Synapsin-FLEX-GFP. Pozwala to na monitorowanie zwierząt pod kątem komórek GFP-dodatnich, które nie powinny być obecne, jeśli nie stosuje się genów przeprogramowujących (ALN).
Aby zidentyfikować nowo przeprogramowane neurony, niezwykle ważna jest metoda identyfikacji specyficzna dla neuronów, taka jak ta opisana w tym protokole. Pozwala to na właściwą identyfikację i odróżnienie przeprogramowanych neuronów od endogennych komórek otaczających, co ma szczególne znaczenie w przypadku przeprogramowania w regionie homotopowym.
Ważne jest również, aby celować w odpowiednią strukturę do wstrzyknięcia wirusa. Dlatego chirurgia stereotaktyczna do wstrzykiwania wirusa jest ważna i należy do niej podchodzić z dokładnością, zwłaszcza gdy celuje się w mniejsze struktury mózgu.
Wcześniej wykazaliśmy11 , że nie jest wiarygodne przewidywanie wyniku przeprogramowania in vivo na podstawie eksperymentów z przeprogramowaniem in vitro przy użyciu tych samych czynników przeprogramowania. W związku z tym wszystkie czynniki będące przedmiotem zainteresowania muszą zostać przetestowane in vivo. W naszych rękach wiele różnych kombinacji czynników daje ten sam podtyp neuronów (tj. interneurony11 in vivo), pomimo faktu, że geny te są zaangażowane w rozwój innych neuronów.
Zacisk łatki na całe komórki dla przeprogramowanych neuronów jest delikatną techniką, a przetwarzanie tkanek jest ważne dla dobrego wyniku. Perfuzja z lodowatym roztworem Krebsa poprawia jakość tkanek. Również neurony z łatami muszą być traktowane ostrożnie. Nawet jeśli dojrzewanie i tożsamość fenotypową przeprogramowanych neuronów można w pewnym stopniu ocenić za pomocą klamry krosowej całej komórki, komórki te nie są w pełni porównywalne z ich endogennymi odpowiednikami. Dodatkowe rodzaje analiz, takie jak sekwencjonowanie genomu (np. sekwencjonowanie RNA), powinny być stosowane w celu dalszego potwierdzenia przeprogramowanej tożsamości komórki.
Opisana w niniejszym dokumencie technika może być brana pod uwagę przy opracowywaniu przyszłych terapii, w których konieczna jest wymiana neuronów w mózgu. Chociaż przeprogramowanie in vivo jest wciąż na wczesnym etapie, a translacja na ludzi nie jest jeszcze przewidziana, technika ta może zapewnić metodę oceny funkcji genów egzogennych w mózgu i badania dojrzewania komórek in vivo.

Ogólnym celem tej metody jest skuteczne przekształcenie komórek glejowych w mózgu in vivo w funkcjonalne i specyficzne dla podtypów neurony, takie jak interneurony wykazujące ekspresję parwalbuminy. Jest to krok naprzód w kierunku opracowania alternatywnej terapii zastępczej w chorobach mózgu bez konieczności stosowania egzogennego źródła komórek. Tworzy również narzędzie do badania przełączników losu komórek in situ. 
Mózg ma ograniczoną zdolność do generowania nowych neuronów. Dlatego w chorobach neurologicznych istnieje zapotrzebowanie na egzogenne źródła komórek do naprawy mózgu. W tym celu różne źródła komórek zostały poddane intensywnym badaniom na przestrzeni lat, w tym komórki z tkanki pierwotnej, komórki pochodzące z komórek macierzystych i komórki przeprogramowane1,2,3. Bezpośrednie przeprogramowanie rezydentnych komórek mózgowych na neurony jest nowym podejściem, które może zapewnić atrakcyjną metodę naprawy mózgu, ponieważ wykorzystuje własne komórki pacjenta do generowania nowych neuronów w mózgu. Do tej pory kilka raportów wykazało przeprogramowanie in vivo poprzez dostarczanie wektorów wirusowych w mózgu4,5,6,78,9 w różnych obszarach mózgu, takich jak kora, rdzeń kręgowy, prążkowie i śródmózgowie5,10,11, a także w nienaruszonym i uszkodzonym mózgu5,8,11,12. Uzyskano zarówno neurony hamujące, jak i pobudzające4,8, ale dokładny fenotyp lub funkcjonalność tych komórek nie została jeszcze szczegółowo przeanalizowana. 
W tym protokole opisujemy bardziej efektywne przeprogramowanie i specyficzną dla komórki identyfikację neuronów przeprogramowanych in vivo. Udostępniamy protokół oceny funkcjonalnej dojrzewania neuronów i charakterystyki fenotypu w oparciu o funkcjonalność i cechy immunohistochemiczne. 
Użyliśmy indukowanego przez Cre wektora AAV i reportera GFP, aby zidentyfikować przeprogramowane neurony in vivo. Ten wybór wektorów wirusowych ma tę zaletę, że infekuje zarówno dzielące się, jak i niedzielące się komórki mózgu, zwiększając liczbę komórek docelowych, jako alternatywa dla stosowania retrovirus7,8. Specyficzny dla neuronów reporter FLEX (GFP) napędzany synapsyną umożliwił nam specyficzne wykrycie nowo wygenerowanych neuronów. W poprzednich badaniach do przeprogramowania in vivo wykorzystano promotory specyficzne dla podtypu7,9, które również umożliwiają ekspresję genów przeprogramowujących i reporterów w określonych typach komórek. Metoda ta wymaga jednak dalszej identyfikacji przeprogramowanych neuronów poprzez pośmiertną analizę koekspresji markerów reporterowych i neuronalnych. Użycie reportera specyficznego dla neuronu, takiego jak ten opisany w niniejszym dokumencie, pozwala na bezpośrednią identyfikację. Stanowi to bezpośredni dowód udanej konwersji i umożliwia identyfikację żywych komórek, która jest wymagana do elektrofizjologii z klamrą krosową.

<table><tbody><tr><td>ODCZYNNIKI DO KLONOWANIA AAV5 I PRZYGOTOWANIA WEKTORÓW WIRUSOWYCH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAAV-CA-FLEX</td><td>AddGene</td><td>38042</td><td></td></tr><tr><td>Ascl1</td><td>AddGene</td><td>67291</td><td>NM_008553.4</td></tr><tr><td>Lmx1a</td><td>AddGene</td><td>33013</td><td>NM_0033652.5</td></tr><tr><td>Nurr1</td><td>AddGene</td><td>35000</td><td>NM_013613.2</td></tr><tr><td>GFP-syn</td><td>AddGene</td><td>30456</td><td></td></tr><tr><td>LoxP (FLEX) sekwencja 1</td><td></td><td></td><td>GATCTccataacttcgtataaagtatcctatac gaagttatatcaaaataggaagaccaatgcttc accatcgacccgaattgccaagcatcaccatcg acccataacttcgtataatgctatacgaa gttatactagtcccgggaagggaagacggcgga agaggctctaga</td></tr><tr><td>LoxP (FLEX) sekwencje 2</td><td></td><td></td><td>tactagtataacttcgtataggatactttatac gaagttatcattgggattctttttattttgatc caagcatcaccatcgaccctctagtccacatct caccatcgacccataacttcgtatagcatacat tatacgaagttatgtccctcgagaggttcgagaggtc<gaabr/br/>ttcgtttaaacGGTACCCTCGAC</td></tr><tr><td>pDP5</td><td>Fabryka plazmidów</td><td>PF435</td><td></td></tr><tr><td>Fabryka plazmidów</td><td>pDP6</td><td>PF436</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>FBS (płodowa surowica bydlęca)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)+ Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61965026</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Sól fizjologiczna buforu fosforanowego Dulbecco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>14190094</tr><tr><td>ogniwa HEK293</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85120602-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Kolby</td><td>BD Falcon</td><td>10078780</td><td>175 cm2</td></tr><tr><td>Tris H-CL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10812846001</td><td> Dla buforu TE użyj 10 mM, pH 8,0; dla buforu do lizy użyj 50 mM, pH 8,5; dla buforu IE użyj 20 mM, pH 8,0; dla buforu elucyjnego użyj 20 mM, pH 8,0 </td></tr><tr><td>EDTA</td><td>EDTA: Invitrogen</td><td>EDTA: AM9260G</td><td> W przypadku buforu TE użyj 1 mM EDTA </td></tr><tr><td>Ultrapure water</td><td></td><td></td><td> patrz System wody ultraczystej </td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SigmaAldrich</td><td>C5080</td><td>2.5 M</td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td> DLA HBS użyj 140 mM; dla buforu do lizy użyj 150 mM; dla buforu IE użyj 15 mM; dla buforu elucyjnego użyj 250 mM </td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td> Do lizy Bufor : 1 mM </td></tr><tr><td>Ultrawirówki uszczelniające</td><td>Beckman Coulter</td><td>Quick-Seal&reg; &nbsp; Rurka</td><td></td>polipropylenowa</tr><tr><td>OptiPrep&trade; &nbsp; Gradient gęstości Medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 10 ml igła 18G</td><td>BD</td><td>305064</td><td></td></tr><tr><td>Szklane butelki laboratoryjne</td><td>VWR?</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtr anionowymienny</td><td>Laboratorium PALL</td><td>MSTG25Q6</td><td> Jednostka Acrodisc z membraną Mustang Q </td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy</td><td>Urządzenie Merck</td><td>Z740210-24EA</td><td> Amicon Ultra-4 </td></tr><tr><td>Zestawy do izolacji plazmidu DNA bez endotoksyn</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A33073</td><td></td></tr><tr><td>Na2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>Probówka Falcon</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Corning 352196</td><td></td></tr><tr><td>Falcon</td><td>rurka Thermo Fisher Scientific</td><td>Corning 352070</td><td></td></tr><tr><td>Szklane fiolki</td><td>Novatech</td><td>30209-1232</td><td> CGGCCTCAGFGAGCGA </td></tr><tr><td>Podkład do przodu do sekwencji</td><td></td><td></td> powtórzeń z odwróconym terminalem końcowym (ITR) <td> GGAACCCCTAGTGATGGAGTT </td></tr><tr><td>Odwrotny podkład do sekwencji</td><td></td><td></td> powtórzeń odwróconego terminalu końcowego (ITR) <td> CACTCCCTCTCTGCGCGCTGcCGG&</td></tr><tr><td>acute; FAM / 3&acute; Sonda BHQ1</td><td>Jena Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>filtr 0,22 mm</td><td>Merck</td><td>SLGV004SL</td><td>Millex-GV filtr</td></tr><tr><td><mocny>SPRZĘT AAV5 PRZYGOTOWANIE WEKTORÓW WIRUSOWYCH</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka -20 &deg; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka -80 & deg; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lodówka +4 &deg; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV wirusowy pokój</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>System wody ultraczystej</td><td>Merck</td><td>Milli-Q&reg; IQ 7000</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>VWR</td><td>444-0004</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>Beckman Optima LE-80K Autoklaw ultrawirówkowy</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tuttnauer</td><td>2540 EL</td><td></td></tr><tr><td>Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)</td><td>BioRad</td><td>C1000 Dotykowy termocykler</td><td></td></tr><tr><td>Ilościowy PCR (qPCR)</td><td>Roche</td><td>LightCycler&reg; 480 </td> Wirówka systemowa <td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Sorvall ST16</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TSGP02</td><td></td></tr><tr><td>ANIMAL MODEL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NG2-Cre myszy</td><td>Jackson</td><td>NG2-CrexB6129, Stock #008533</td><td></td></tr><tr><td>ODCZYNNIKI DO WSTRZYKIWANIA CZYNNIKÓW PRZEPROGRAMOWUJĄCYCH DO MÓZGU</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Apoteket AB</td><td></td><td>70%</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Solveco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolfurane</td><td>Apoteket AB</td><td></td><td> Rozcieńczyć do 1% roztworu ciepłą wodą. </td></tr><tr><td>Virkon</td><td>Viroderm</td><td>7511&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Apoteket AB</td><td>P0500000</td><td> i.p. do postępowania terminalnego w dawce 60 mg/ml. </td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Merck</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Retrobeads</td><td>Lumafluor</td><td>R170</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Apoteket AB</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>STRONG>SPRZĘT DO WSTRZYKIWANIA CZYNNIKÓW PRZEPROGRAMOWUJĄCYCH DO MÓZGU</td><td></td><td></td><td> firmy RSG Solingen. </td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>VWR</td><td>233-1552</td><td>firmy Biochem.</td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>VWR</td><td>232-0007</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcz</td><td>VWR</td><td>232-0120</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na skalpel</td><td>VWR</td><td>RSGA106.621</td><td>Numer 20.</td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>VWR</td><td>RSGA106.200</td><td></td></tr><tr><td>Rama stereotaktyczna</td><td>Stoelting Europe</td><td>51500D</td><td></td></tr><tr><td>Nakładki na uszy myszy</td><td>Stoelting Europe</td><td>51648</td><td>5 ul</td></tr><tr><td>Strzykawka z wyjmowaną igłą</td><td>Hamilton Company</td><td>65</td><td> 0,75 średnica wewnętrzna i 1,5 średnica zewnętrzna. </td></tr><tr><td>Szklane kapilary</td><td>Stoelting</td><td>50811</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do kapilar szklanych</td><td>Firma</td><td>Sutter P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Wiertło</td><td>dentystyczne Agnthos AB</td><td>1464</td><td></td></tr><tr><td>Golarka</td><td>Agnthos AB</td><td>GT420</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran Komora i pompa</td><td>Agnthos AB</td><td>8323101</td><td>Strzykawki 2 mL</td></tr><tr><td></td><td>Merck</td><td>Z118400-30EA</td><td>25G</td></tr><tr><td>Igły</td><td>Merck</td><td>Z192414&nbsp; Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Adapter myszy i noworodka szczura do stereotaktycznego ramki</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>Braintree scientific, inc</td><td>53800M</td><td> od Covidien 2187. </td></tr><tr><td>Gaza bawełniana</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-037-902</td><td></td></tr><tr><td>Rurka gumowa</td><td>Elfa Distrelec</td><td>HFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150</td><td></td></tr><tr><td>Waciki bawełniane</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-366-473</td><td></td></tr><tr><td><mocne>ODCZYNNIKI DO NAGRAŃ Z ZACISKIEM KROSOWYM DLA CAŁYCH KOMÓREK</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4-H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2-6 H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2-6 H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4-7 H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td> patrz System wody ultraczystej </td></tr><tr>Woda <td></td><td></td><td>ultraczysta</td><td>Przygotuj 1 lub 2M.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958-500G</td><td></td></tr><tr><td>K-D-glukonian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500&nbsp; Sigma</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KOH-EGTA (kwas glikol-bis-N-tetracetynowy etilenu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889&nbsp; Kwas Sigma</td><td></td></tr><tr><td>KOH-Hepes (kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Mg2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Biocytyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>Pikrotoksyna</td><td>Merck</td><td>P1675&nbsp; Sigma</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Merck</td><td>C239&nbsp; Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPRZĘT DO NAGRAŃ Z ZACISKIEM KROSOWYM DLA CAŁYCH KOMÓREK</mocna></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipeta ze szkła borokrzemianowego</td><td>Firma Sutter</td><td>B150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz kapilar szklanych</td><td>Firma</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Wibratome</td><td>Leica</td><td>Leica VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie WaterBath</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TSGP02</td><td></td></tr><tr><td>Clampfit</td><td>Urządzenia molekularne Oprogramowanie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp</td> Urządzenia <td></td><td></td><td>molekularne</td></tr><tr><td><mocne>ODCZYNNIKI DO IMMUNOHISTOCHEMII</mocne></td><td></td><td></td><td> Stosować w stężeniu 4%.&nbsp; UWAGA:&nbsp; PFA jest silnym utrwalaczem. Unikać spożycia i kontaktu ze skórą. </td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Merck Millipore</td><td>1040051000</td><td> Stosować w stężeniu 0,1%. </td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific 10254640</td><td></td><td> Donkey.Stosować w stężeniu 1 : 400. </td></tr><tr><td>Serum</td><td>Merck Millipore</td><td>S30-100ML</td><td> Rozpuść proszek w wodzie Milli-Q do 1 mg/ml. Podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20&deg; C,&nbsp; wrażliwy na światło. Stosować w stężeniu 1 : 500. </td></tr><tr><td>Dichlorowodorek 4&,6-diamidyno-2&prime;-fenyloindolu (DAPI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td> 1: 600 w KPBS-T. </td></tr><tr><td>streptawidyna- Cy3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>434315</td><td>1:5000, królik.</td></tr><tr><td>Anti-GAD65/67</td><td>Abcam</td><td></td><td>1:2000, mysz.</td></tr><tr><td>Anty-PV</td><td>Sigma</td><td>P3088</td><td>1:200, koza.</td></tr><tr><td>Anti-Chat</td><td>Merk</td><td>AB143</td><td>1:5000, królik.</td></tr><tr><td>Anti-NPY</td><td>Immunostar</td><td>22940</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NIST200B</td><td>1:1000, kurczak.</td></tr><tr><td>Anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Rozwiązanie montażowe</td><td>Merck</td><td>10981</td><td> Medium montażowe z alkoholu poliwinylowego z DABCO&reg;, zapobiegające blaknięciu </td></tr><tr><td>OCT</td><td>Agar Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Woda</td><td></td><td></td><td></td>destylowana</tr><tr><td>Roztwór przeciw zamarzaniu</td><td>Tissue Pro Technology</td><td>AFS05-1000N, 1000 ml/szt.</td><td></td></tr><tr><td>SPRZĘT DO IMMUNOHISTOCHEMII</td>Odwrócony mikroskop fluorescencyjny Leica DMI6000 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> B <td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td>TCS SP8 ze skaningiem laserowym.</td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>SM2010R</td><td></td></tr></tbody></table>

bezpośrednie przeprogramowanie in vivo rezydentnych komórek glejowych na interneurony poprzez domózgowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

Przekształcanie komórek glejowych w mózgu w funkcjonalne i specyficzne dla podtypów neurony in vivo stanowi krok naprzód w kierunku rozwoju alternatywnych terapii wymiany komórek, jednocześnie tworząc narzędzia do badania losu komórek in situ. Do tej pory możliwe było uzyskanie neuronów poprzez przeprogramowanie in vivo, ale dokładny fenotyp tych neuronów lub sposób ich dojrzewania nie został szczegółowo przeanalizowany. W tym protokole opisujemy bardziej efektywną konwersję i specyficzną dla komórki identyfikację neuronów przeprogramowanych in vivo, przy użyciu systemu wektorów wirusowych opartego na AAV. Udostępniamy również protokół oceny funkcjonalnej dojrzewania neuronalnego przeprogramowanych komórek. Poprzez wstrzykiwanie wektorów przerzucania (FLEX), zawierających geny reporterowe przeprogramowujące i napędzane przez synapsynę do określonych typów komórek w mózgu, które służą jako cel przeprogramowania komórek. Technika ta pozwala na łatwą identyfikację nowo przeprogramowanych neuronów. Wyniki pokazują, że uzyskane przeprogramowane neurony dojrzewają funkcjonalnie w czasie, odbierają kontakty synaptyczne i wykazują właściwości elektrofizjologiczne różnych typów interneuronów. Wykorzystując czynniki transkrypcyjne Ascl1, Lmx1a i Nurr1, większość przeprogramowanych komórek ma właściwości szybko rosnących interneuronów zawierających parwalbuminę.

Iniekcja wektorów AAV jest wykorzystywana do skutecznego przeprogramowania резидентnych komórek glejowych NG2 w neurony w prążkowiu myszy NG2-Cre (Rysunek 1A). Aby specyficznie celować w glej NG2, wektory FLEX z genami przeprogramowującymi/reporterowymi są wstawiane w kierunku antysensownym i flankowane przez dwie pary antyrównoległych, heterotypowych miejsc loxP (Rysunek 1B). Każdy z trzech genów przeprogramowujących (Ascl1, Lmx1a i Nurr1) znajduje się pod kontrolą wszechobecnego promotora cba na oddzielnych wektorach. Aby upewnić się, że ekspresja GFP jest ograniczona do przeprogramowanych neuronów pochodzących z komórki wykazującej ekspresję Cre, GFP umieszczono pod kontrolą swoistego dla neuronów promotora synapsyny (również w wektorze FLEX).
Zastosowanie kombinacji konstruktów reprogramujących i reporterowych umożliwia generowanie neuronów GFP-dodatnich w prążkowiu myszy (Rysunek 1C,C’). Użycie konstruktu reporterowego bez obecności genów reprogramujących nie prowadzi do powstania neuronów GFP-dodatnich (Rysunek 1D).
Przeprogramowane neurony wypełnione biocytyną są widoczne po pośmiertnym barwieniu immunologicznym (Rysunek 2A). W przypadku udanej konwersji powinna wystąpić rozbudowana morfologia neuronalna. Rejestracje elektrofizjologiczne przeprogramowanych neuronów wykazują obecność funkcjonalnych połączeń postsynaptycznych z pomiarami aktywności spontanicznej (Rysunek 2B,C). Można je zablokować za pomocą jonotropowego blokera GABAergicznego lub glutaminergicznego (Pikrotoksyna lub CNQX), co sugeruje zarówno pobudzające, jak i hamujące wejścia synaptyczne do przeprogramowanych neuronów. Występowanie aktywności spontanicznej wzrasta wraz z czasem po wstrzyknięciu wirusa (Rysunek 2D), co wskazuje na stopniowe dojrzewanie.
Potencjały czynnościowe indukowane prądem występują w funkcjonalnych neuronach. Liczba potencjałów czynnościowych wzrasta w czasie po konwersji (Rysunek 2E). Wskazuje to na dalsze dojrzewanie funkcji neuronalnych. W niedojrzałym neuronie prąd nie wywoła żadnych lub wywoła bardzo mało potencjałów czynnościowych (Rysunek 2F).
Wzorce wyładowań neuronu są specyficzne dla typu komórki, ponieważ zależą one od czynników takich jak morfologia komórek i ekspresja kanałów15. Zarejestrowane wzorce w neuronach przeprogramowanych in vivo można podzielić na grupy i porównać z wzorcami endogennych podtypów neuronalnych, np. szybko wyładowujących interneuronów (Typ Komórki B, Rysunek 3B) lub innych typów komórek (Rysunek 3A,C,D). Obserwowane różnice elektrofizjologiczne można potwierdzić poprzez obecność specyficznych markerów podtypu i koekspresję z GFP (Rysunek 3E-H). Łącznie dane te wskazują, że przeprogramowane neurony obecne w prążkowiu wykazują właściwości różnych typów interneuronów, takich jak interneurony wykazujące ekspresję Parwalbuminy, ChAt oraz NPY, a także tożsamość średnioskolistych neuronów prążkowia (DARPP32+) (Rysunek 3E-H).
<img alt="Schemat procesu iniekcji AAV w reprogramowaniu genów; model myszy NG2-Cre; fluorescencja GFP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Reprogramowanie in vivo rezydentnej glei NG2 w neurony. (A) Schematyczne przedstawienie zależnego od wirusa AAV przeprogramowania in vivo glejowych komórek NG2 w prążkowiu. (B) Schematyczne przedstawienie konstruktów AAV5 FLEX wykorzystanych do reprogramowania in vivo, w których ekspresja genów jest regulowana przez ekspresję Cre w komórkach docelowych. (C i C’) Neurony przeprogramowane in vivo, powstałe w wyniku wstrzyknięcia Syn-GFP + ALN do prążkowia. (D) Brak przeprogramowanych neuronów w przypadku braku czynników przeprogramowujących w koktajlu wirusowym i wstrzyknięcia in vivo wyłącznie konstruktu reporterowego. Paski skali = 100 μm (C),25 μm (C'), 25 μm (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Aktywność neuronalna, rejestracje synaptyczne, wykresy kołowe; elektrofizjologia, analiza funkcji synaptycznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2: Neurony przeprogramowane in vivo są funkcjonalne i wykazują dojrzewanie w czasie. (A) Przeprogramowany neuron wypełniony biocytyną wykazuje dojrzałą morfologię neuronalną, w tym kolce dendrytyczne. Ślady pokazują (B) aktywność hamująca (GABAergiczna), która jest blokowana przez pikrotoksynę, antagonistę receptorów GABAA antagonista receptora i (C) aktywność pobudzająca, która zostaje zablokowana przez CNQX, antagonista receptorów AMPA. (DLiczba neuronów z aktywnością postsynaptyczną zwiększa się w czasie.ENeurony poddane rejestracji metodą patch-clamp wykazują powtarzalne wyładowania już w 5. tygodniu po wstrzyknięciu (w.p.i.) i nadal wykazują je w 8. oraz 12. tygodniu po wstrzyknięciu (F) Potencjał czynnościowy indukowany prądem oraz aktywność postsynaptyczna niedojrzałego neuronu, wykazująca mniej zdarzeń synaptycznych i mniej potencjałów czynnościowych w porównaniu do B i D. Pasek skali = 25 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza elektrofizjologiczna typów komórek neuronów i ekspresji GFP; wykres danych i fluorescencja." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3: Neurony przeprogramowane in vivo wykazują właściwości immunohistochemiczne i elektrofizjologiczne charakterystyczne dla interneuronów prążkowia. (A-DWzorce wyładowań neuronów przeprogramowanych in vivo mogą być różnych typów:A) Typ A jest podobny do endogennego średniego neuronu kolczastego (DARPP32+); (B) podobnie jak interneurony szybko wyładowujące (PV+); (C) podobne do neuronów niskoprogowych (LTS) z wyraźnym ugięciem potencjału (NPY+); (D) neurony wyładowujące z silną hiperpolaryzacją następczą (Chat+). (E-H) Obrazy konfokalne wykazujące kolokalizację GFP i markerów interneuronów PV (E), ChAT (F), NPY (G), oraz marker neuronów projekcyjnych DARPP32 (H). Wszystkie paski skali = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>

Ten protokół ma na celu generowanie bezpośrednio przeprogramowanych interneuronów in vivo, przy użyciu systemu wirusowego opartego na AAV w mózgu i reportera GFP sterowanego przez synapsynę FLEX, który pozwala na identyfikację komórek i dalszą analizę in vivo.

Bezpośrednie przeprogramowanie in vivo rezydentnych komórek glejowych na interneurony poprzez domózgowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

Protokół ten pokazuje, że możliwe jest generowanie nowych neuronów bezpośrednio w mózgu z miejscowego gleju i że te przeprogramowane komórki dojrzewają do neuronów specyficznych dla podtypu. Główną zaletą jest wirus AAV zależny od cre, który umożliwia specyficzne celowanie w glej NG2 i reporter GFP, który znakuje przeprogramowane neurony do analizy. Generowanie nowych neuronów w mózgu może prowadzić do przyszłego rozwoju terapii zastępowania komórek w mózgu.W naszym protokole generujemy interneurony parwalbuminowo-dodatnie, które mają wpływ na zaburzenia psychiczne. Przeprogramowanie in vivo można zastosować do innych obszarów i obwodów mózgu, w zależności od fenotypu neuronalnego i stanu neurologicznego, na który chcesz celować. Procedurę zademonstrują Jenny Johansson: technik, Maria Pereira: była doktorantka i Marcella Birtele: doktorantka w naszym laboratorium.Aby wytworzyć wektor wirusa AAV5, HEK293T komórki nasienne standardową pożywką hodowlaną w pięciu kolbach T175. Gdy komórki osiągną 50 do 70% konfluencji, przygotuj następującą mieszankę do transwekcji. W 50-mililitrowej probówce wirówkowej dodaj równe ilości molowe plazmidu wektorowego i plazmidu pomocniczego serii pDG.Dodaj bufor Tris-EDTA do końcowej objętości 144 mikrolitrów, a następnie dodaj ultraczystą wodę, aby uzyskać całkowitą objętość 1296 mikrolitrów i wymieszaj. Następnie dodaj 144 mikrolitry 2,5-molowego chlorku wapnia i wymieszaj. Następnie dodaj 1,92 mililitra HBS do roztworu DNA i natychmiast wymieszaj.Inkubować w temperaturze pokojowej dokładnie przez 60 sekund. Następnie przenieś roztwór do 28 mililitrów świeżej pożywki do hodowli komórkowych i wymieszaj. Zastąpić pożywkę w kolbach pożywką zawierającą mieszaninę transwekcyjną.Odczekaj trzy dni i przenieś nośnik do odpadu. Dodać pięć mililitrów buforu do zbioru do każdej kolby, a następnie dodać kolejne cztery mililitry DPBS do każdej kolby, aby przepłukać pozostałe komórki i połączyć je z roztworem komórkowym. Odwirować zebrane komórki w temperaturze 1 000 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po odwirowaniu usunąć supernatant i rozpuścić osad w 15 mililitrach buforu do lizy. Zamroź 50-mililitrową probówkę wirówkową na suchym lodzie na 15 minut i przechowuj w zamrażarce o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Przed użyciem zebrany lizat komórkowy rozmrozić w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza.W tej procedurze należy przeprowadzić oczyszczanie AAV za pomocą ultrawirowania w gradionym jodiksanolu i użyć ultrawirówek sufitowych z wirowaniem przy 350 000 x g przez godzinę i 45 minut w temperaturze pokojowej. Aby wyekstrahować fazę zawierającą AAV, włóż 10-mililitrową strzykawkę z igłą o rozmiarze 18 około dwóch milimetrów poniżej granicy fazy od 40 do 60%, ze skosem skierowanym do góry i wycofaj. Pamiętaj, aby zatrzymać się przed dotarciem do pasma białkowego po ekstrakcji od pięciu do sześciu mililitrów wektora wirusowego.Następnie należy oczyścić i skoncentrować rozcieńczony gradient jodiksanolu przez filtr anionowymienny, przepychając go z szybkością nie większą niż jedna kropla na sekundę. Następnie powoli przepchnij trzy mililitry buforu IE przez filtr, aby go umyć. Następnie eluować mieszaninę do odśrodkowego zespołu filtrującego z jednym do dwóch mililitrów buforu elucyjnego.Dodaj DPBS do urządzenia do końcowej objętości czterech mililitrów. Wirować przy 2 000 x g w temperaturze pokojowej, aż w filtrze pozostanie mniej niż 0,5 mililitra DPBS. Następnie usuń płyn z dna probówki, napełnij czterema mililitrami DPBS i ponownie odwiruj.Powtórz ten krok jeszcze dwa razy, upewnij się, że objętość skoncentrowanego wektora na filtrze wynosi około 200 mikrolitrów po ostatnim odwirowaniu. Usuń skoncentrowany wektor o pojemności 200 mikrolitrów za pomocą pipety i przepchnij go przez filtr 0,22 mikrometra w celu sterylizacji. Następnie przelać 200 mikrolitrów do szklanej fiolki z zablokowaną wkładką.Aby wstrzyknąć czynniki przeprogramowujące, umieść znieczuloną mysz w ramce stereotaktycznej. Na początku zabiegu należy podać odpowiednią analgezję, a następnie umieścić końcówkę szklanej kapilary igły iniekcyjnej tuż nad bregmą. Upewnij się, że końcówka kapilary jest idealnie prosta zarówno w płaszczyznach AP, jak i ML.Zresetuj wartości ML i A-P do 0,0 na cyfrowym liczniku współrzędnych. Aby upewnić się, że głowa zwierzęcia znajduje się w idealnie płaskiej pozycji, użyj cyfrowego licznika współrzędnych do zmierzenia wartości współrzędnych D-V, gdy ramię AP znajduje się na plus 2.0 i minus 2.0, a także gdy ramię ML znajduje się na plus 2.0 i minus 2.0. Dostosuj odpowiednio wysokość listwy zębatej i nauszników.Następnie należy lekko podnieść strzykawkę i wywiercić otwór za pomocą wiertła dentystycznego we współrzędnych wstrzyknięcia. Rozpocznij wiercenie na miejscu, pracując w sposób okrężny i delikatny. Następnie umieść kawałek bawełnianej gazy na otwartym nacięciu i przepłucz strzykawkę roztworem soli fizjologicznej.Po przepłukaniu należy pobrać pęcherzyk powietrza, a następnie jeden mikrolitr roztworu zawierającego wektor wirusowy. Upewnij się, że roztwór wirusowy można łatwo zwizualizować poniżej pęcherzyka powietrza. Następnie opuść strzykawkę, powoli przesuwając się na żądaną głębokość i upewnij się, że trajektoria jest wolna od fragmentów kości.Następnie wstrzyknąć jeden mikrolitr roztworu wirusa w tempie 0,4 mikrolitra na minutę. Po wykonaniu wstrzyknięcia należy odczekać dwie minuty do dyfuzji przed pobraniem strzykawki. Po dyfuzji powoli wycofaj strzykawkę, aż końcówka naczynia włosowatego zostanie całkowicie wycofana z mózgu, a następnie ostrożnie zszyj nacięcie i usuń zwierzę z ramy stereotaktycznej.Monitorować zwierzę na stacji pooperacyjnej do czasu odzyskania przytomności. Zwierzęta są trzymane do 12 tygodni po wstrzyknięciu wirusa, aby umożliwić miejscowemu glejowi przeprogramowanie się w dojrzałe neurony. Aby przygotować wycinki mózgu do elektrofizjologii za pomocą wibratomu, należy z dużą prędkością przeciąć mózg od najbardziej rostralnej części w dół do poziomu prążkowia.Następnie przekrój prążkowia koronalnie na 275 mikrometrów z prędkością 0,1 milimetra na sekundę. Po każdym wycięciu należy ostrożnie usunąć niewstrzykniętą stronę prążkowia i przenieść wstrzykniętą stronę do fiolki z siatką denną i natlenionym szkiełkiem CREB sense w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej. Przechowywać fiolkę w temperaturze pokojowej do momentu przecięcia wszystkich skrawków.Następnie powoli zwiększaj temperaturę łaźni wodnej do 37 stopni Celsjusza i pozostaw ją na 30 minut, a następnie wyłącz grzałkę i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej. Po przeniesieniu jednego wycinka tkanki do komory rejestrującej w celu elektrofizjologii, zamontuj szklaną pipetę na elektrodzie rejestrującej i opuść ją do roztworu. Dokładnie sprawdź rezystancję elektrody.Następnie powoli zbliż się pipetą do przeprogramowanej komórki, utrzymując lekkie dodatnie ciśnienie w elektrodzie, aby uniknąć zatkania końcówki, i sprawdź, czy ogniwo jest dodatnie GFP przed załataniem. Gdy ogniwo zostanie załatane, utrzymuj ogniwo w zacisku prądowym od minus 60 do minus 70 miliwoltów i wstrzyknij prądy 500 milisekund od minus 20 do plus 90 pikoamperów z przyrostami 10 pikoamperów, aby indukować potencjały czynnościowe. Wskazuje to na dojrzewanie neuronów i udane przeprogramowanie.Następnie przełącz się na cęgi napięciowe i zmierz wewnętrzne prądy sodu i opóźnione prostowanie prądów potasowych w krokach depolaryzacji 10 miliwoltów. Oto nagrany po nagraniu przeprogramowany neuron wypełniony biocytyną, który pokazuje dojrzałą morfologię neuronów i kolce dendrytyczne. W tym przypadku zapisy elektrofizjologiczne przeprogramowanych neuronów wykazują obecność postsynaptycznych połączeń funkcjonalnych z pomiarami spontanicznej aktywności.Ślady pokazują aktywność hamującą, która jest blokowana przez pikrotoksynę, antagonistę receptora GABAA i aktywność pobudzającą, która jest blokowana przez CNQX, antagonistę receptora AMPA. Poprawione neurony wykazują aktywność postsynaptyczną już po pięciu tygodniach od wstrzyknięcia i utrzymują się po ośmiu i 12 tygodniach od wstrzyknięcia. Liczba neuronów z potencjałami czynnościowymi indukowanymi prądem również wzrasta z czasem.Bardziej szczegółowa analiza ujawniła kilka odrębnych wzorców wypalania, w których większość komórek wykazuje szybką aktywność impulsową, podobną do interneuronów parwalbuminy. Analiza immunohistochemiczna po 12 tygodniach wykazała ponadto koekspresję reporterowego GFP i parwalbuminy. Postępując zgodnie z tą procedurą, możesz zbadać ekspresję genów za pomocą techniki wyszukiwania plam lub ocenić trójwymiarową łączność synaptyczną za pomocą śledzenia monosynaptycznego i iDISCO.Teraz, gdy możliwe jest przeprogramowanie miejscowego gleju w interneurony wyrażające parwalbuminę, zaczęliśmy badać, czy są one autentyczne i czy mogą być używane jako narzędzie terapeutyczne. Pamiętaj, aby postępować zgodnie z ustalonymi protokołami i wytycznymi podczas obchodzenia się ze zwierzętami i używania wirusa AAV.

in-vivo-direct-reprogramming-resident-glial-cells-into-interneurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym materiale przedstawiamy metodę wewnątrzczaszkowej iniekcji wektorów AAV w celu fluorescencyjnego znakowania neuronów i gleju w korze wzrokowej.

Wewnątrzczaszkowe wstrzykiwanie wektorów wirusowych opartych na wirusach adeno-zależnych

Ten film demonstruje protokół oceny dojrzewania i przeprogramowania komórek glejowych w neurony w transfekowanym wycinku prążkowia myszy. Eksperyment mierzy spoczynkowy potencjał błony i odpowiedź na obecne wstrzyknięcia za pomocą specyficznych dla neuronów markerów fluorescencyjnych i technik elektrofizjologicznych. Skoki napięcia podczas tych pomiarów wskazują na pomyślne dojrzewanie i przeprogramowanie neuronów.

Elektrofizjologiczne nagrania przeprogramowanych neuronów w wycinku mózgu myszy

Źródło: Pereira, M. et al., In Vivo Bezpośrednie przeprogramowanie rezydentnych komórek glejowych do interneuronów przez domózgowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film demonstruje stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem do kory mózgowej transgenicznej myszy w celu dostarczenia zależnego od Cre przeprogramowania neuronów i fluorescencyjnych genów reporterowych do komórek glejowych.

Stereotaktyczne wstrzykiwanie wektorów wirusowych do przeprogramowania komórek glejowych w modelu mysim

Celowanie w komórki rezydujące w mózgu w celu bezpośredniego przeprogramowania linii otwiera nowe perspektywy dla naprawy mózgu. Tutaj opisujemy protokół, w jaki sposób przygotować kultury wzbogacone o perycyty rezydujące w mózgu z kory mózgowej dorosłego człowieka i przekształcić je w indukowane neurony przez ekspresję czynników transkrypcyjnych Sox2 i Ascl1 za pośrednictwem retrowirusa.

Przeprogramowanie linii komórek pochodzących z perycytów mózgu dorosłego człowieka na neurony indukowane

Tutaj demonstrujemy technikę rozległej transdukcji neuronalnej poprzez dokomorowe wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem do mózgu noworodka myszy.  Metoda ta zapewnia szybki i łatwy sposób na osiągnięcie trwającej całe życie ekspresji transgenów dostarczanych przez wirusa.

Śródmózgowe wstrzyknięcie wirusa do mózgu nowonarodzonego myszy w celu trwałej i rozległej transdukcji neuronalnej

Oparta na inżynierii lentiwirusowej in vitro prekursorów neuronów, ich kotransplantacji do mózgów dzikich typów i sparowanej ocenie morfometrycznej pochodnych "testowych" i "kontrolnych", metoda ta pozwala na dokładne modelowanie in vivo kontroli genów morfologii neuronów kory nowej w prosty i niedrogi sposób.

Dokomorowy przeszczep zmodyfikowanych prekursorów neuronalnych do badań neuroarchitektury in vivo

Tutaj prezentujemy protokół, zaprojektowany do wykorzystania narzędzi chemogenetycznych do manipulowania aktywnością komórek progenitorowych interneuronów korowych przeszczepionych do kory mózgowej myszy po urodzeniu.

Przeszczepienie chemogenetycznie zmodyfikowanych progenitorów interneuronów korowych do wczesnych postnatalnych mózgów myszy

Opisujemy protokół przeprogramowania fibroblastów pochodzących z ludzkiej skóry w indukowane neuronalne komórki progenitorowe (iNPC), a następnie ich różnicowanie w indukowane astrocyty (iAs). Metoda ta prowadzi do szybkiego i powtarzalnego generowania iNPC i iA w dużych ilościach.

Modelowanie in vitro chorób neurologicznych z wykorzystaniem bezpośredniej konwersji z fibroblastów do neuronalnych komórek progenitorowych i różnicowania w astrocyty

Opisujemy intraparenchymalne przeszczepienie ludzkich nerwowych komórek progenitorowych transdukowanych podwójnym wektorem reporterowym wyrażającym lucyferazy-zielone białko fluorescencyjne (GFP) w mózgu myszy. Po przeszczepie sygnał lucyferazy jest wielokrotnie mierzony za pomocą bioluminescencji in vivo i przeszczepionych komórek wykazujących ekspresję GFP, identyfikowanych w sekcjach mózgu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Przeszczep domózgowy i śledzenie bioluminescencji in vivo ludzkich nerwowych komórek progenitorowych w mózgu myszy

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół generowania wysoce wzbogaconych kultur astrocytów pochodzących z różnych regionów ośrodkowego układu nerwowego myszy po urodzeniu i ich bezpośredniej konwersji w funkcjonalne neurony przez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych.

Izolacja i bezpośrednie przeprogramowanie neuronów astrocytów myszy

Poznaj metodę bezpośredniego przeprogramowania komórek glejowych na interneurony in vivo przy użyciu wektorów AAV w modelu mysim. Technika ta umożliwia generowanie dojrzałych neuronów parwalbuminowych z potencjałem terapeutycznym w zaburzeniach psychiatrycznych.

Bezpośrednie przeprogramowanie in vivo rezydentnych komórek glejowych na interneurony poprzez domózgowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych (Wideo) | JoVE Journal

Bezpośrednie przeprogramowanie in vivo rezydentnych komórek glejowych na interneurony poprzez domózgowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych

Przeglądaj więcej filmów