Zaawansowany mysi model niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby w połączeniu z cukrzycą typu 2

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytania w dziedzinie immunometabolizmu dotyczące udziału komórek odpornościowych w wywołanym otyłością zapaleniu tkanki tłuszczowej i stłuszczeniowym zapaleniu wątroby w tkance wątrobowej. Techniki te zostały zoptymalizowane pod kątem izolacji komórek tłuszczowych i wątrobowych komórek odpornościowych w indukowanym dietą modelu niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby uzyskanego poprzez niespecyficzną hodowlę gryzoni wolną od patogenów. Metody te mogą pomóc w pogłębieniu naszego zrozumienia mechanizmów immunologicznych zaangażowanych w utrzymanie homeostazy metabolicznej.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej technice, będą miały trudności z maksymalizacją wydajności funkcjonalnie żywotnych zdysocjowanych komórek i ustawieniem prawidłowego bramkowania w cytometrii przepływowej. Aby wytworzyć zawiesinę jednokomórkową tkanki tłuszczowej, spryskaj klatkę piersiową myszy poddanej eutanazji 70% etanolem i ostrożnie wykonaj centralne nacięcie o długości od pięciu do sześciu centymetrów przez powłokę i ścianę brzucha na całej długości klatki piersiowej, aby odsłonić jamę opłucnej i serce. Za pomocą igły o rozmiarze 26 wstrzyknij co najmniej 10 mililitrów 0,9% roztworu soli fizjologicznej w wierzchołek lewej komory i użyj nożyczek, aby otworzyć jamę otrzewnej.

Następnie wypreparuj tkankę tłuszczową nabłonka nastego i zważ ją. Mechanicznie zdysocjuj tkankę tłuszczową na drobne kawałki na szalce Petriego w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie przenieś fragmenty tkanki do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Przepłukać szalkę Petriego jednym mililitrem 0,5% albuminy surowicy bydlęcej lub BSA w PBS i dodać trzy mililitry świeżo przygotowanego roztworu do trawienia tkanki tłuszczowej na gram tkanki tłuszczowej do probówki.

Po 20 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obrotach na minutę dodaj pięć mililitrów 0,5% BSA do PBS i umieść trawienie tłuszczu na lodzie. Kilkakrotnie rozcierać roztwór za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej i za pomocą tłoka przepuścić roztwór przez sitko o średnicy 100 mikrometrów. Oddziel frakcje tkankowe przez odwirowanie i użyj pipety, aby odrzucić pływającą frakcję adipocytów.

Zawiesić osad komórek frakcji zrębu frakcji naczyniowej w jednym mililitrze buforu do lizy chlorku amonu i potasu lub ACK, zatrzymując reakcję lizy za pomocą 10 mililitrów 2% płodowej surowicy cielęcej lub FCS w PBS po kilku sekundach. Następnie zbierz wyizolowane białe krwinki przez odwirowanie i ponownie zawieś osad w 250 mikrolitrach 2% FCS w PBS do zliczenia. Pobrać wątrobę do stożkowej probówki PBS na lodzie, a następnie użyć strzykawek do mechanicznej dysocjacji tkanki na szalce Petriego w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Przenieś wypreparowane fragmenty tkanki wątroby do 50-mililitrowej probówki zawierającej 10 mililitrów ciepłego roztworu do trawienia wątroby i przepłucz szalkę Petriego trzema mililitrami świeżego roztworu do trawienia wątroby. Po 20 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obrotach na minutę przerwij trawienie za pomocą 20 mililitrów HBSS i kilkakrotnie rozcieraj zawiesinę tkanek za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej. Za pomocą tłoka przepuścić roztwór tkankowy przez sitko o średnicy 100 mikrometrów i zebrać komórki wątroby przez odwirowanie.

Ponownie zawiesić osad w 20 mililitrach świeżego HBSS i usunąć matrycę hepatocytów przez odwirowanie. Zebrać supernatant do odwirowania, ponownie zawieszając osad w 10 mililitrach 33% roztworu pożywki o niskim gradiencie gęstości w HBSS. Oddziel komórki odpornościowe wątroby przez wirowanie w gradiacji gęstości i ponownie zawieś osad leukocytów w jednym mililitrze buforu do lizy ACK.

Po czterech minutach w temperaturze pokojowej przerwij lizę za pomocą 10 mililitrów HBSS i przefiltruj komórki przez 30-mikrometrowe sitko porowe do 15-mililitrowej probówki do odwirowania. Następnie ponownie zawieś granulat w 250 mikrolitrach 2% FCS w PBS do liczenia. W przypadku analizy cytometrycznej przepływowej izolowanych populacji leukocytów należy dodać do trzech razy 10 do sześciu komórek w 100 mikrolitrach 2% FCS w PBS z tkanki będącej przedmiotem zainteresowania do indywidualnych probówek do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją polistyrenu lub FACS.

Dodać 10 mikrolitrów przeciwciała anty-CD16/CD32 do każdej probówki, aby zablokować wszelkie niespecyficzne wiązania na 10 minut na lodzie, a następnie wybarwić odpowiednią objętością mieszaniny przeciwciał i jednym mikrolitrem barwnika żywotności na próbkę, aby umożliwić rozróżnienie żywych i martwych komórek. Po 20 minutach w temperaturze czterech stopni Celsjusza chronionych przed światłem, umyć próbki dwa razy dwoma mililitrami 2% FCS plus PBS na pranie i odwirować przy 300 razy g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ponownie zawiesić osad w świeżym PBS plus FCS.

Aby przeanalizować komórki za pomocą cytometrii przepływowej, użyj niebarwionej próbki kontroli ujemnej, aby ustawić rozproszenie do przodu i z boku oraz dostosować napięcia cytometru przepływowego, aby wykryć żywotną populację leukocytów i wykluczyć zanieczyszczenia. Następnie uruchom pojedyncze barwione próbki kontrolne w celu kompensacji wielobarwnej przed uruchomieniem próbek eksperymentalnych, zbierając co najmniej pięć razy 10 do czterech zdarzeń na probówkę. Następnie wyeksportuj pliki danych FCS do analizy i ustaw strategię bramkowania dla leukocytów CD45-dodatnich, aby umożliwić identyfikację kolejnych interesujących populacji komórek odpornościowych.

W tym miejscu przedstawiono reprezentatywną strategię bramkowania dla subpopulacji limfocytów T, w tym dyskryminację dubletową i barwienie żywotności w mysim tłuszczu okołogonadalnym. Leukocyty CD45-dodatnie są najpierw bramkowane dla CD4 i CD8, a następnie dla ligandów CD44 i CD62 w celu rozróżnienia między naiwnymi, centralnymi komórkami pamięci, pamięcią efektorową i efektorowymi limfocytami T. Komórki CD44-dodatnie są następnie charakteryzowane za pomocą CD127, receptora lektynopodobnego G1 komórki zabójczej i programowanej śmierci-1.

Tutaj pokazano strategię bramkowania do analizy limfocytów B, granulocytów, komórek NK, makrofagów i komórek dendrytycznych. Wyższy odsetek komórek CD4-dodatnich i CD8-dodatnich pamięci efektorowej można wykryć u myszy na diecie wysokotłuszczowej trzymanych w warunkach bez SPF, podczas gdy wewnątrzwątrobowe naiwne limfocyty T CD4-dodatnie i CD8-dodatnie okazały się znacznie niższe u tych zwierząt w porównaniu z myszami na diecie wysokotłuszczowej SPF w siódmym tygodniu. Ciężkie stłuszczenie, w tym wzrost dużych kropelek lipidów powodujący stłuszczenie makropęcherzykowe, zapalenie zrazików, balonowanie komórek wątrobowych i zniszczoną strukturę zrazikową, występuje u myszy narażonych na dietę wysokotłuszczową, podczas gdy tylko niektóre myszy SPF wykazują łagodne nagromadzenie tłuszczu w wątrobie.

Ponadto odsetek komórek NK jest wyższy w tkance tłuszczowej okołotłuszczowej myszy narażonych na dietę wysokotłuszczową, podczas gdy myszy SPF na diecie wysokotłuszczowej wykazywały wyższy odsetek komórek dendrytycznych. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby trzymać komórki na lodzie i w ciemności, chyba że zaznaczono inaczej. Powinieneś teraz dobrze zrozumieć, jak prawidłowo przygotować zawiesiny jednokomórkowe i jak wyizolować mysią tkankę tłuszczową i wątrobową do eksperymentów z cytometrią przepływową.