Przygotowanie i zastosowanie nowego biosensora bakteryjnego do przypuszczalnego wykrywania pozostałości po postrzałach z broni palnej

Protokół ten opisuje przygotowanie i analizę unikalnego bioczujnika, który został zaprojektowany do wykrywania składników chemicznych pozostałości po śrutach. Zastosowanie biosensorów w zastosowaniach kryminalistycznych jest wyjątkowe. Stanowi tanią, prostą w użyciu alternatywę dla wysoce specjalistycznego oprzyrządowania zwykle używanego w laboratoriach kryminalistycznych.

Opisane metody biologii syntetycznej mogą być stosowane w każdym systemie, który wykorzystuje standardowe części biologii syntetycznej. Opisana analiza chemiczna ma zastosowanie do każdego bioczujnika, który wyraża białko czerwonej fluorescencji. Procedurę zademonstrują Andrea Soles i Elle Richardson, studentki studiów licencjackich na Uniwersytecie Longwood.

Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj dziesięć mikrolitrów wcześniej wyizolowanego plazmidowego DNA J10060 do probówki mikrowirówkowej. Dodaj osiem mikrolitrów wody i jeden mikrolitr każdego z enzymów EcoRI i NHEL wstępnie zmieszanych z jednym mikrolitrem buforu. W przypadku DNA promotora dodać dziesięć mikrolitrów wyżarzonych sekwencji DNA promotora do świeżej probówki do mikrowirówki.

Dodaj osiem mikrolitrów wody i jeden mikrolitr każdego z enzymów EcoRI i NHEL wstępnie zmieszanych z jednym mikrolitrem buforu. Używając pipety o pojemności dziesięciu mikrolitrów, delikatnie pipetuj próbki w górę i w dół, aby wymieszać. Próbki należy inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Następnie podgrzej i aktywuj enzymy w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez pięć minut. Przechowuj strawione DNA w zamrażarce, aż będzie gotowe do kontynuowania. Po pierwsze, użyj plazmidu i promotora DNA, które zostały wcześniej strawione, aby ustawić reakcję w probówce mikrocetrifużowej na lodzie, jak opisano w tabeli pierwszej protokołu tekstowego.

Upewnij się, że dodajesz ligazę DNA T4 na końcu. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby wymieszać reakcję, i krótko odwirować. Inkubować w temperaturze pokojowej przez dziesięć minut.

Następnie podgrzej i aktywuj w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez dziesięć minut. Wykonaj transformację zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Najpierw należy skonfigurować mieszaniny reakcyjne do PCR, jak opisano w tabeli drugiej protokołu tekstowego.

Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby wymieszać reakcje. Za pomocą żółtej końcówki pipety zeskrob kolonię przekształconej E. coli. Przenieś przeciągnięcie tej E. coli na nową płytkę agarową LB-ampicyliny, która została oddzielona, a następnie włóż końcówkę pipety do probówki do PCR.

Potrząśnij końcówką pipety, aby wymieszać E.Coli z mieszanką PCR. Powtórz ten proces jeszcze trzy razy, aby uzyskać dodatkowe kolonie. Następnie załaduj probówki PCR do maszyny do PCR i rozpocznij termocykling, jak opisano w tabeli trzeciej protokołu tekstowego.

Na początek należy oznaczyć odpowiednią liczbę sterylnych probówek hodowlanych, jak opisano w tabeli czwartej protokołu tekstowego. Dodaj dwa mililitry przygotowanego bulionu kulturowego do każdej probówki. Dodać podstawowy roztwór anilitu do probówek, jak opisano w tabeli czwartej.

Następnie umieść zatrzaski na probówkach hodowlanych tak, aby były luźne, aby umożliwić przepływ powietrza do probówki. Wiruj każdą rurkę hodowlaną. Następnie umieść probówki w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 220 obr./min na co najmniej 24 godziny.

Najpierw użyj chusteczki na bazie etanolu przeznaczonej do usuwania ołowiu, aby wytrzeć wszystkie powierzchnie dłoni, w tym między palcami. Chusteczki należy przechowywać w odpowiednio oznakowanej, zamykanej torebce do czasu analizy. Użyj chusteczki nasączonej alkoholem, aby wytrzeć wszelkie duże powierzchnie, które mają być testowane.

Użyj bawełnianej podstawki zwilżonej etanolem, aby wytrzeć wszelkie małe powierzchnie, które mają być testowane. Zakładając czyste rękawice i używając nożyczek oczyszczonych alkoholem, wytnij odcinek o długości około jednego centymetra kwadratowego od środka chusteczki. Następnie umieść odcięty kawałek chusteczki lub bawełnianego wacika bezpośrednio w probówce hodowlanej zawierającej dwa mililitry bakterii czujnika i upewnij się, że jest całkowicie zanurzony w bulionie.

Przygotuj spektrometr do zbierania fluorescencji o długości fali odpowiedniej dla wariantu zapytania ofertowego, o długości fali wzbudzenia 500 nanometrów. Następnie użyj miksera wirowego, aby potrząsnąć rurkami. Ostrożnie przenieś każdy supernatant do kuwety o małej objętości i zbierz intensywność emisji.

Za pomocą miksera wirowego potrząśnij rurkami. Przenieś 200 mikrolitrów bulionu do studzienki w płytce studzienki. Zapisz, które próbki trafiły do każdej studzienki tej płytki.

Ustaw fluorometr tak, aby zbierał intensywność emisji na odpowiedniej długości fali dla wariantu zapytania ofertowego. Widma fluorescencji dla reprezentatywnego wariantu RFP pokazują zarówno kontrolę ujemną, jak i widma na dwóch różnych poziomach dodanego anilitu. Maksymalny sygnał fluorescencyjny dla wariantu RFP użytego w tej pracy jest obserwowany przy 575 nanometrach.

Reprezentatywne dane są zbierane dla tego samego zestawu roztworów, zarówno z przenośnego spektrometru, jak i fluorometru. Istnieje ogólna tendencja do zwiększania się fluorescencji wraz ze wzrostem stężenia anilitu. Warto zauważyć, że przy wysokich stężeniach, większych niż około 800 części na miliard dla czujnika ołowiu, odpowiedź zanika ze względu na toksyczność ołowiu przy tak wysokim stężeniu.

Analiza próbek wymazu etanolowego z wnętrza zużytej łuski naboju kalibru 40 dostarcza dowodów na słuszność zasad. Pozytywne wyniki każdej z trzech bakterii czujnika wskazują na pozytywny wynik testu na obecność pozostałości po postrzałach. Biosensory przygotowane w tym protokole mogą być również używane indywidualnie do wykrywania zanieczyszczeń w próbkach żywności, wody lub środowiska.

Technika ta toruje naukowcom drogę do opracowania bioczujników wykorzystujących standardowe techniki biologii syntetycznej dla wielu różnych anilitów chemicznych. Należy nosić środki ochrony osobistej, a analitycy powinni myć ręce i dezynfekować powierzchnie po kontakcie z E. coli. Odpady powinny być sterylizowane w autoklawie, a wszelkie odpady zawierające metale ciężkie powinny być odpowiednio traktowane.