Name: Chemiczna inaktywacja cereblon ligazy ubikwityny E3 przez Homo-PROTAC na bazie pomalidomidu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Poznaj metodę chemicznej inaktywacji ligazy ubikwityny E3 cereblon za pomocą homo-PROTAC na bazie pomalidomidu. Ta technologia umożliwia celowaną degradację białek wcześniej uznawanych za nieosiągalne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (Program Emmy-Noether Kr-3886/2-1 i SFB-1074 dla J.K.; FOR2372 do M.G.)

1. Przygotowanie cząsteczek PROTAC
UWAGA: Proszę zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) przed użyciem. Kilka substancji chemicznych stosowanych w tych syntezach jest toksycznych i rakotwórczych. Prosimy o stosowanie wszystkich odpowiednich praktyk bezpieczeństwa i środków ochrony osobistej.
<ol>
	<li>Otrzymywanie N-(2,6-diokso-3-piperydylo)karbaminianu tert-butylu (związek 1)
	<ol>
		<li>Dodać 1,1'-karbonylodimidazol (1,95 g, 12 mmol) i katalityczną ilość 4-(dimetyloamino)pirydyny (5 mg) do mieszaniny Boc-Gln-OH (2,46 g, 10 mmol) w THF (50 ml) w 100 ml kolbie okrągłodennej z mieszadłem i wyposażonej w chłodnicę zwrotną. Podgrzewać pod chłodnicą zwrotną przez 10 godzin, mieszając, aż powstanie klarowny roztwór.</li>
		<li>Usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej, dodać EtOAc (200 ml) i przenieść go do rozdzielacza. Umyj warstwę organicznąH2O(50 mL) i solanką (50 mL) i wysusz ją na Na2SO4.</li>
		<li>Przefiltrować roztwór przez krótką podkładkę z żelu krzemionkowego (5 cm średnicy i 5 cm wysokości) i wypłukać z dalszą objętością (200 ml) EtOAc.</li>
		<li>Odparować rozpuszczalnik i wysuszyć otrzymane bezbarwne ciało stałe w próżni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparat N-(1-metylo-2,6-diokso-3-piperydylo)karbaminianu tert-butylu (związek 2)
	<ol>
		<li>Połączyć związek 1 (2,28 g, 10 mmol) ze zmielonym węglanem potasu (2,76 g, 20 mmol) i DMF (25 ml) w kolbie okrągłodennej o pojemności 100 ml. Dodawać kroplami jodometan (1,42 g, 0,62 ml, 10 mmol) za pomocą strzykawki i wyposażyć kolbę w przebitą gumową przegrodę. Umieścić naczynie reakcyjne w kąpieli ultradźwiękowej na 2 godziny.</li>
		<li>Rozcieńczyć mieszaninę reakcyjną EtOAc (100 ml) i przenieść ją do rozdzielacza. Przemyć warstwę organiczną 1 N NaOH (2x 25 mL), H2O (25 mL) i solanką (25 mL) i wysuszyć ją nad Na2SO4.</li>
		<li>Przefiltrować i odparować rozpuszczalnik. Oczyścić produkt metodą chromatografii kolumnowej z żelem krzemionkowym (6 cm średnicy kolumny i 20 cm wysokości) przy użyciu eteru naftowego/EtOAc (2:1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparat 2-(2,6-dioksopiperydyno-3-ylo)-4-fluoroisoindoliny-1,3-dionu (związek 3)
	<ol>
		<li>Połączyć bezwodnik 3-fluoroftalowy (1,25 g, 7,5 mmol), glutarimid 1 (1,14 g, 5 mmol) i roztwór octanu sodu (0,50 g, 6,0 mmol) w lodowatym kwasie octowym (20 ml) w kolbie okrągłodennej o pojemności 50 ml z mieszadłem i wyposażonej w chłodnicę zwrotną. Podgrzewać mieszaninę w temperaturze 120 °C przez 6 godzin.</li>
		<li>Po schłodzeniu wlać fioletową mieszaninę naH2O(100 ml) i mieszać przez 10 min. Zebrać powstałe ciało stałe przez filtrację, przemyćH2O(3 × 5 ml) i eterem naftowym (3 × 5 ml) i wysuszyć w próżni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparat 4-fluoro-2-(1-metylo-2,6-dioksopirydyno-3-ylo)izoindoliny-1,3-dionu (związek 4)
	<ol>
		<li>Połączyć bezwodnik 3-fluoroftalowy (1,25 g, 7,5 mmol), glutarimid 2 (1,21 g, 5 mmol) i roztwór octanu sodu (0,50 g, 6,0 mmol) w lodowatym kwasie octowym (20 ml) w kolbie okrągłodennej o pojemności 100 ml z mieszadłem i wyposażonej w chłodnicę zwrotną. Podgrzewać mieszaninę w temperaturze 120 °C przez 6 godzin.</li>
		<li>Po schłodzeniu wlać fioletową mieszaninę naH2O(100 ml) i mieszać przez 10 min. Zebrać powstałe ciało stałe przez filtrację, przemyćH2O(3 × 5 ml) i eterem naftowym (3 × 5 ml) i wysuszyć w próżni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparat N-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,6-diokso-3-piperydylo)-1,3-diokso-izoindolin-4-ylo]amino]etoksy]etoksy]etylo]karbaminianu tert-butylu (związek 7)
	<ol>
		<li>Napełnij 50 ml kolby okrągłodennej N-[2-[2-(2-aminoetoksy)etoksy]etylo]karbaminianem tert-butylu (5, 0,41 g, 1,65 mmol), związkiem 3 (0,41 g, 1,50 mmol), suchym DMF (10 ml) i DIPEA (0,39 g, 0,51 mL, 3,0 mmol). Wyposaż się w mieszadło i skraplacz zwrotny. Ogrzewać w atmosferze argonu w temperaturze 90 °C przez 10 godzin.</li>
		<li>Po schłodzeniu do temperatury pokojowej wlać ciemnozieloną mieszaninę naH2O(100 ml) i ekstrahować za pomocą EtOAc (3 x 50 ml) w rozdzielaczu. Połączone warstwy organiczne przemyćH2O(50 ml) i solanką (50 ml), wysuszyć na Na2SO4, przefiltrować i zagęścić w próżni.</li>
		<li>Oczyszczać surowy produkt metodą chromatografii kolumnowej nad żelem krzemionkowym (3 cm średnicy kolumny i 60 cm wysokości) przy użyciu gradientu eteru naftowego/EtOAc (1:1 do 1:2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie homodimeru (związek 8)
	<ol>
		<li>Połączyć łącznik α,ω-diaminy 6 (0,22 g, 0,22 ml, 1,50 mmol), DIPEA (1,05 mL, 6,00 mmol) i roztwór 3 (0,83 g, 3,00 mmol) w suchym DMSO (20 ml) w kolbie okrągłodennej o pojemności 50 ml z mieszadłem i wyposażonej w chłodnicę zwrotną. Ogrzewać w atmosferze argonu w temperaturze 90 °C przez 18 godzin.</li>
		<li>Po schłodzeniu do temperatury pokojowej wlać ciemnozieloną mieszaninę naH2O(100 ml) i ekstrahować za pomocą EtOAc (3 x 50 ml) w rozdzielaczu. Połączone warstwy organiczne przemyćH2O(50 ml) i solanką (50 ml), wysuszyć na Na2SO4, przefiltrować i zagęścić w próżni.</li>
		<li>Oczyszczać surowy produkt metodą chromatografii kolumnowej nad żelem krzemionkowym (3 cm średnicy kolumny i 50 cm wysokości) przy użyciu gradientu eteru naftowego/EtOAc (1:2) do EtOAc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie heterodimeru (związek 9)
	<ol>
		<li>Związek 7 rozpuścić (0,83 g, 1,65 mmol) w suchym CH2Cl2 (10 ml). Dodać kwas trifluorooctowy (10 ml) i mieszać żółtą mieszaninę w temperaturze 40 °C przez 2 godziny w zamkniętej kolbie okrągłodennej o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Usunąć substancje lotne i odparować za pomocą CH2Cl2 (4 x 5 ml). Suszyć pozostałość w próżni przez 10 godzin.</li>
		<li>Ponownie rozpuścić materiał w suchym DMF (20 ml). Dodać związek 4 (0,44 g, 1,50 mmol) i DIPEA (0,78 g, 1,05 mL, 6,00 mmol) i wyposażyć kolbę w chłodnicę zwrotną. Ogrzewać w atmosferze argonu w temperaturze 90 °C przez 10 godzin.</li>
		<li>Po schłodzeniu do temperatury pokojowej wlać ciemnozieloną mieszaninę naH2O(100 ml) i ekstrahować za pomocą EtOAc (3 x 50 ml) w rozdzielaczu. Połączone warstwy organiczne przemyć nasyconym NaHCO3 (50 ml),H2O(50 ml), 10% KHSO4 (50 ml),H2O(50 ml) i solanką (50 ml), wysuszyć na Na2SO4, przefiltrować i zagęścić w próżni.</li>
		<li>Oczyszczać surowy produkt metodą chromatografii kolumnowej nad żelem krzemionkowym (3 cm średnicy kolumny i 50 cm wysokości) przy użyciu gradientu eteru naftowego/EtOAc (1:2) do EtOAc.</li>
		<li>Wyjaśnij i zweryfikuj strukturę cząsteczki (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 5A związek 8, związek 5B 9) za pomocą widm 1H NMR i 13C NMR w DMSO-d 6 na spektrometrze magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR). Sprawdzić, czy czystość obu związków jest wyższa niż 97%, za pomocą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS), stosując detekcję matrycy diodowej (DAD) przy 220–500 nm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Walidacja funkcjonalna cząsteczek PROTAC
<ol>
	<li>Analiza Western blot degradacji CRBN przez PROTAC 
	UWAGA: Wpływ związku 8 i związku 9 na poziom białka CRBN przetestowano za pomocą analizy western blot. Ponadto można również potwierdzić wpływ na poziomy IKZF1 i IKZF3 (<silna klasa="xfig">Rysunek 6).
	<ol>
		<li>Przygotowanie próbki
		<ol>
			<li>Rozpuścić związki 8 i 9, lenalidomid (Len), pomalidomid (Pom), MG132 i MLN-4924 w DMSO w stężeniu 10 mM, podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.</li>
			<li>Zasiać 1 x 106 komórek MM1S na płytce 6-dołkowej z 2,5 ml pożywki i traktować komórki 100 nM lub 1 μM związkiem 8 lub 9 przez 24 godziny.</li>
			<li>Zebrać komórki po obróbce i odwirować w temperaturze 700 x g, 5 min, 4 °C. Przemyć osad komórkowy zimnym 1x PBS w celu usunięcia pozostałej pożywki, odwirować przy 700 x g, 5 min, 4 °C i odrzucić supernatant. Powtórz ten krok raz.</li>
			<li>Lizować komórki w buforze do lizy (25 mM Tris HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 5% glicerol, 1x koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy) przez 10 minut na lodzie, wirować przy 320 x g przez 10 minut, 4 °C. Zebrać supernatant i oznaczyć stężenie białka za pomocą testu białkowego kwasu bicinchoninowego (test BCA) zgodnie z protokołem producenta.</li>
			<li>Denaturować białka (15–30 μg/próbkę) za pomocą 1x buforu ładującego LDS (5% 2-merkaptoetanolu) i gotować 10 minut w temperaturze 75 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>STRONA SDS
		<ol>
			<li>Utrwal kanapkę z żelem 10% żel separujący [4 ml 3x bufor żelowy (3 M Tris/HCl, 0,3% (w/v) dodecylosiarczan sodu (SDS), pH 8,45), 4 ml akrylamidu 30%, 2,52 ml glicerolu 50%, 1,395 ml H2O, 75 μl 11% nadsiarczanu amonu (APS) i 9,75 μl TEMED] i 4% żelu do układania w stos [1,992 ml 3x bufor żelowy, 0,792 ml 30% akrylamidu, 3,168 mlH2O, 36 μl 11% APS i 6 μl TEMED] w zespole do montażu elektrod. Usuń grzebienie, przepłucz studzienki buforem katodowym (100 mM Tris/HCl, 100 mM tricine, 0,1% (w/v) SDS) i załaduj próbki.</li>
			<li>Napełnij zbiornik buforem anodowym (100 mM Tris/HCl, pH 8,9). Załadować próbkę białka z kroku 2.1.1.4 i uruchomić SDS-PAGE przy napięciu 70 V, 20 min, a następnie 115 V, 150 min przy stałym napięciu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Immunoblotting i wykrywanie CRBN, IKZF1 i IKZF3
		<ol>
			<li>Aktywuj membranę PVDF (0,45 μm) w 100% metanolu przez 1 min. Wyrównaj membranę i żel separujący w 1x buforze transferowym [10x bufor transferowy (192 mM glicyna, 25 mM Tris-zasada/HCl, 900 mL H2O), 20% metanol, 0,1% SDS, pH 8,3].</li>
			<li>Kasetę bibułkową należy zmontować zgodnie z protokołem producenta. Przenieś żel pod ciśnieniem 180 mA przez 90 min.</li>
			<li>Płukać membranę 3x w 1x TBS-T (25 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6, 0,1% Tween 20) przez 5–10 minut w temperaturze pokojowej. Membrana blokowa w 5% beztłuszczowym mleku w proszku (NFDM), TBS-T przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Pierz membranę 3x w 1X TBS-T przez 5-10 min każdy w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Inkubować błonę z pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko CRBN (1:500 w 5% BSA, TBS-T) z delikatnym wstrząsaniem w temperaturze 4 °C, przez noc.</li>
			<li>Pierz membranę 3x w 1X TBS-T przez 5-10 min każdy w temperaturze pokojowej. Inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym anty-mysim (1:10 000 w 5% NFDM, TBS-T) lub anty-króliczym (1:5 000 w 5% NFDM, TBS-T) sprzężonym z peroksydazą chrzanową HRP (1 h w temperaturze pokojowej).</li>
			<li>Pierz membranę 2x w 1X TBS-T przez 5-10 min każdy w temperaturze pokojowej. Powtórz ten krok dwa razy z 1x TBS.</li>
			<li>Inkubować membranę przez 2 minuty z roztworem substratu HRP zgodnie z protokołami producenta i wykryć chemiluminescencję w urządzeniu do wykrywania chemiluminescencji.</li>
			<li>Pierz membranę 1x w 1X TBS przez 5-10 min każdy w temperaturze pokojowej. W celu uwolnienia przeciwciał należy zawiesić błonę paskową w dostępnym w handlu buforze do oddzielania na 15 minut. Pierz membranę 3x w 1X TBS przez 5-10 min w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Błonę ponownie zablokować w 5% beztłuszczowym mleku w proszku, TBS-T przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyj membranę 3x w 1x TBS-T przez 5-10 minut każdy w temperaturze pokojowej i ponownie sonduj za pomocą IKZF1, IKZF3 lub tubuliny zgodnie z krokiem 2.1.3.4.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eksperymenty konkursowe z MG132, MLN4942 lub pomalidomidem 
	UWAGA: Aby potwierdzić, czy CRBN ulega degradacji poprzez szlak ubikwityna-proteasom, przeprowadziliśmy eksperymenty konkursowe z inhibitorem proteasomu MG132 i inhibitorem enzymu aktywującego neddylację (NAE) MLN4942 (<silna klasa = "xfig">Figura 7).
	<ol>
		<li>Wysiewaj 1 x 10 komórek6 MM1S na dołek w płytce 6-dołkowej. Wstępnie potraktuj komórki 10 μM MG132, 10 μM MLN4942 lub lenalidomidem (100x) i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
		<li>Dodać 100 nM związku 8 przez 3 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
		<li>Pobrać komórki pod kątem western blot zgodnie z krokiem 2.1.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Testy żywotności komórek w liniach komórkowych szpiczaka mnogiego 
	UWAGA: Ten test służy do badania wpływu na żywotność komórek i dodatkowo antagonizowania wpływu IMiDs na komórki szpiczaka mnogiego poprzez wstępne traktowanie komórek związkiem 8 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 8, Rysunek 9A, B).
	<ol>
		<li>Wysiew: 5 x 104 komórek MM1S na studzienkę na 96-dołkowej płytce w biologicznych triplikatach do oznaczania żywotności. W przypadku analizy western blot należy wysiać 1 x 106 komórek MM1S na studzienkę na płytce 6-dołkowej w trójkach biologicznych.</li>
		<li>Potraktuj komórki DMSO lub 100 nM, 1 μM lub 10 μM związku 8, związku 9 lub pomalidomidu i inkubuj przez 24 godziny, 48 godzin lub 96 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . W przypadku eksperymentów ratunkowych należy traktować komórki związkiem 100 nM 8 przez 3 godziny, przed lub po dodaniu 1 μM pomalidomidu i inkubować przez 96 godzin.</li>
		<li>Zmierz luminescencję 96-dołkowej płytki za pomocą testu żywotności komórek luminescencyjnych, zgodnie z protokołem producenta na czytniku płytek lub zbierz komórki z płytki 6-dołkowej do analizy western blot.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+primary+target+of+thalidomide+teratogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity.</a> Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).</li>
<li>Lopez-Girona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cereblon+is+a+direct+protein+target+for+immunomodulatory+and+antiproliferative+activities+of+lenalidomide+and+pomalidomide%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide.</a> Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).</li>
<li>Fischer, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+DDB1-CRBN+E3+ubiquitin+ligase+in+complex+with+thalidomide%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide.</a> Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).</li>
<li>Gandhi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+agents+lenalidomide+and+pomalidomide+co-stimulate+T+cells+by+inducing+degradation+of+T+cell+repressors+Ikaros+and+Aiolos+via+modulation+of+the+E3+ubiquitin+ligase+complex+CRL4%28CRBN%29%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN).</a> British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).</li>
<li>Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lenalidomide+induces+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3.</a> Oncoimmunology. 3 (7), e941742(2014).</li>
<li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myeloma+drug+lenalidomide+promotes+the+cereblon-dependent+destruction+of+Ikaros+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins.</a> Science. 343 (6168), 305-309 (2014).</li>
<li>Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+action+of+immune-modulatory+drugs+thalidomide%2C+lenalidomide+and+pomalidomide+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+Lymphona%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma.</a> Leukemia & Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).</li>
<li>Chamberlain, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+Cereblon-DDB1-lenalidomide+complex+reveals+basis+for+responsiveness+to+thalidomide+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).</li>
<li>Donovan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalidomide+promotes+degradation+of+SALL4%2C+a+transcription+factor+implicated+in+Duane+Radial+Ray+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Matyskiela, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SALL4+mediates+teratogenicity+as+a+thalidomide-dependent+cereblon+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate.</a> Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).</li>
<li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lenalidomide+induces+ubiquitination+and+degradation+of+CK1alpha+in+del%285q%29+MDS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS.</a> Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).</li>
<li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protacs%3A+chimeric+molecules+that+target+proteins+to+the+Skp1-Cullin-F+box+complex+for+ubiquitination+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).</li>
<li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Protacs+to+target+cancer-promoting+proteins+for+ubiquitination+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).</li>
<li>Schneekloth, J. S. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genetic+control+of+protein+levels%3A+selective+in+vivo+targeted+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).</li>
<li>Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PROTACs%3A+An+Emerging+Targeting+Technique+for+Protein+Degradation+in+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery.</a> Bioessays. 40 (4), e1700247(2018).</li>
<li>Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+approaches+to+targeted+protein+degradation+through+modulation+of+the+ubiquitin-proteasome+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).</li>
<li>Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+protein+degradation+by+PROTACs%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Targeted protein degradation by PROTACs.</a> Pharmacology & Therapeutics. 174, 138-144 (2017).</li>
<li>Winter, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phthalimide+conjugation+as+a+strategy+for+in+vivo+target+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation.</a> Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).</li>
<li>Maniaci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homo-PROTACs%3A+bivalent+small-molecule+dimerizers+of+the+VHL+E3+ubiquitin+ligase+to+induce+self-degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation.</a> Nature Communications. 8 (1), 830(2017).</li>
<li>Crew, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Characterization+of+Von+Hippel-Lindau-Recruiting+Proteolysis+Targeting+Chimeras+%28PROTACs%29+of+TANK-Binding+Kinase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hijacking+the+E3+Ubiquitin+Ligase+Cereblon+to+Efficiently+Target+BRD4%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4.</a> Chemistry & Biology. 22 (6), 755-763 (2015).</li>
<li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PROTAC-mediated+crosstalk+between+E3+ligases%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases.</a> Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).</li>
<li>Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule-mediated+protein+knockdown+as+a+new+approach+to+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Medchemcomm%22%5BJournal%5D)">Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery.</a> Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).</li>
<li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homo-PROTACs+for+the+Chemical+Knockdown+of+Cereblon%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon.</a> ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).</li>
<li>Ambrozak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+Antiangiogenic+Properties+of+Tetrafluorophthalimido+and+Tetrafluorobenzamido+Barbituric+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids.</a> ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).</li>
<li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+Small-Molecule+Degrader+of+Bromodomain+and+Extra-Terminal+%28BET%29+Proteins+with+Picomolar+Cellular+Potencies+and+Capable+of+Achieving+Tumor+Regression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+Targeting+Chimeras+%28PROTACs%29+of+Anaplastic+Lymphoma+Kinase+%28ALK%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK).</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).</li>
<li>Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genetics+approaches+for+selective+intervention+in+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).</li>
<li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lenalidomide+causes+selective+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3+in+multiple+myeloma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells.</a> Science. 343 (6168), 301-305 (2014).</li>
<li>Eichner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+drugs+disrupt+the+cereblon-CD147-MCT1+axis+to+exert+antitumor+activity+and+teratogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity.</a> Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).</li>
<li>Zhu, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cereblon+expression+is+required+for+the+antimyeloma+activity+of+lenalidomide+and+pomalidomide%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide.</a> Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).</li>
<li>Kortum, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+sequencing+of+refractory+myeloma+reveals+a+high+incidence+of+mutations+in+CRBN+and+Ras+pathway+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes.</a> Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).</li>
<li>Gil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cereblon+deficiency+confers+resistance+against+polymicrobial+sepsis+by+the+activation+of+AMP+activated+protein+kinase+and+heme-oxygenase-1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).</li>
<li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cereblon+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cereblon in health and disease.</a> Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).</li>
<li>Lee, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+cereblon+gene+enhances+hepatic+AMPK+activity+and+prevents+high-fat+diet-induced+obesity+and+insulin+resistance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice.</a> Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie deklarują potencjalnego finansowego konfliktu interesów.

Konstrukcja takich homo-PROTAC, jak opisana tutaj dla CRBN, opiera się na specyficznym powinowactwie pomalidomidu do CRBN, które zostało z powodzeniem wykorzystane w wielu heterobifunkcyjnych PROTAC i doprowadziło do opracowania PROTAC 8 jako wysoce selektywnego degradera CRBN. Specyficzność naszej cząsteczki została już potwierdzona analizami proteomicznymi24. W przypadku nokautu o podłożu genetycznym wykluczenie i walidacja skutków ubocznych jest trudne i czasochłonne. Ponadto n...

Leki immunomodulujące (IMiDs) talidomid i jego analogi, lenalidomid i pomalidomid, wszystkie zatwierdzone do leczenia szpiczaka mnogiego, wiążą się z ligazą ubikwityny E3 cereblon (CRBN), adaptorem substratu dla ligazy ubikwityny cullin4A-RING E3 (CRL4CRBN)1,2,3. Wiązanie IMiDs zwiększa powinowactwo CRL4CRBN do limfoidalnych czynników transkrypcyjnych Ikaros (IKZF1) i Aiolos (IKZF3), prowadząc do ich ubikwitynacji i degradacji (Rysunek 1)4,5,6,7,8. Ponieważ IKZF1 i IKZF3 są niezbędne dla komórek szpiczaka mnogiego, ich inaktywacja powoduje zahamowanie wzrostu. SALL4 został niedawno odkryty jako dodatkowy neosubstrat CRBN indukowany przez IMiD, który jest prawdopodobnie odpowiedzialny za teratogenność i tzw. katastrofę Contergan w latach 50. spowodowaną przez talidomid9,10. W przeciwieństwie do tego, kinaza kazeinowa 1α (CK1α) jest specyficznym dla lenalidomidu substratem CRBN, który jest zaangażowany w efekt terapeutyczny w zespole mielodysplastycznym z delecjami chromosomu 5q11.
Zdolność małych cząsteczek do celowania w określone białko w celu degradacji jest ekscytującą implikacją dla rozwoju nowoczesnych leków. Podczas gdy mechanizm działania talidomidu i jego analogów został odkryty po ich pierwszym zastosowaniu u ludzi, tak zwane Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) zostały zaprojektowane tak, aby były ukierunkowane na białko będące przedmiotem zainteresowania (POI) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)12,13,14,15,16,17,18. PROTAC to heterobifunkcyjne cząsteczki, które składają się ze specyficznego liganda dla punktu POI, połączonego za pomocą łącznika z ligandem ligazy ubikwityny E3, takim jak CRBN lub von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20,21,22. PROTAC indukują tworzenie przejściowego kompleksu trójskładnikowego, kierując POI do ligazy ubikwityny E3, co powoduje jej ubikwitynację i degradację proteasomalną. Główną zaletą PROTAC w porównaniu z konwencjonalnymi inhibitorami jest to, że wystarczające jest wiązanie się z POI, a nie jego hamowanie, a zatem PROTAC mogą potencjalnie celować w znacznie szersze spektrum białek, w tym te, które zostały uznane za nieuleczalne, takie jak czynniki transkrypcyjne15. Ponadto cząsteczki chimeryczne działają katalitycznie i dlatego mają dużą moc. Po przeniesieniu ubikwityny do punktu POI kompleks trójskładnikowy dysocjuje i jest dostępny do tworzenia nowych kompleksów. W związku z tym bardzo niskie stężenia PROTAC są wystarczające do degradacji docelowego białka23.
Tutaj opisujemy syntezę homo-PROTAC (związek 8) sprzężony z pomalidomidem-pomalidomidem (związek 8), który rekrutuje CRBN do degradacji samego siebie24. CRBN ligazy ubikwityny E3 służy zarówno jako rekruter, jak i cel w tym samym czasie (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3). Aby zweryfikować nasze dane, zsyntetyzowaliśmy również negatywną kontrolę wiązania (związek 9). Nasze dane potwierdzają, że nowo zsyntetyzowany homo-PROTAC jest specyficzny dla degradacji CRBN i ma tylko minimalny wpływ na inne białka.

<table><tbody><tr><td>1,1'-karbonylodimidazol</td><td>TCI chemikalia</td><td>C0119</td><td></td></tr><tr><td>2,2&-(Etylenodioksy)-bis(etyloamina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>385506</td><td>Związek 6</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>3-Bezwodnik fluoroftalowy, 98 %</td><td>Alfa</td><td>Aesar A12275</td><td></td></tr><tr><td>4-dimetyloaminopirydyna, 99 %</td><td>Acros</td><td>148270250</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>akryloamidstamml&ouml; śpiewany/ Bisakryloamid (30%/0,8%)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.1</td><td></td></tr><tr><td>Aiolos (D1C1E)</td><td>mAB Sygnalizacja komórkowa</td><td>15103S</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CRBN wytwarzane w króliku</td><td>Sigma</td><td>HPA045910</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-królicze IgG sprzężone z HRP</td><td>Sigma</td><td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Roth</td><td>9592.2</td><td></td></tr><tr><td>Boc-Gln-OH</td><td>TCI chemikalia</td><td>B1649</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>Test żywotności komórek luminescencyjnych CellTiter-Glo</td><td>Promega</td><td>G7571</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc XRS+</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>DMF, bezwodny, 99,8 %</td><td>Acros</td><td>348435000</td><td>Extra Dry na sicie molekularnym</td></tr><tr><td>DMSO, bezwodny, 99,7 %</td><td>Acros</td><td>348445000</td><td>Extra Dry over Molecular Site</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15523-1L-R Kozia</td><td></td></tr><tr><td>anty-mysia (sprzężona z HRP)</td><td>Santa Cruz biotechnology</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>Halt Proteaza & Inhibitor fosfatazy Jednorazowy koktajl (100X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1861280</td><td></td></tr><tr><td>Ikaros (D6N9Y) Sygnalizacja komórek Mab</td><td></td><td>14859S Membrana</td><td></td></tr><tr><td>transferowa ImmobilonP (0,45&mikro; m)</td> <td>Merck</td><td>IPVH000010</td><td></td></tr><tr><td>Jodometan, 99</td>% <td>Sigma-Aldrich</td><td>I8507</td><td>Wysoce toksyczny</td></tr><tr><td>metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32213-2,5L</td><td></td></tr><tr><td>Mg132</td><td>Selleckchem</td><td>S2619</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot elektroforetyczne ogniwo transferowe</td><td>Bio-Rad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Pionowe ogniwo</td> <td>do elektroforezyBio-Rad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>MLN4942</td><td>biomol (kajman)</td><td>Cay15217-1</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonalne przeciwciało anty-&alfa;-tubulinowe wytwarzane u myszy (B512)</td><td>Sigma</td><td>T5168</td><td></td></tr><tr><td>N-etylodiizopropyloamina, 99</td>% <td>Alfa Aesar</td><td>A11801</td><td></td></tr><tr><td>Beztłuszczowe mleko w proszku</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A0830,0500</td><td></td></tr><tr><td>Nunc F96 MicroWell Biały Płyta polistyrenowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>136101</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Bufor do próbek (4X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pomalidomid</td><td>Selleckchem</td><td>S1567</td><td></td></tr><tr><td>RestoreTM Western Blot Stripping Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>46430</td><td></td></tr><tr><td>sód siarczan dodecylu</td><td>Carl Roth</td><td>183.1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539-500g</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Carl Roth</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>N-[2-[2-(2-aminoetoksy)etoksy]etylo]karbaminian tert-butylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89761</td><td>Związek 5</td></tr><tr><td>Tricin</td><td>Carl Roth</td><td>6977.4</td><td></td></tr><tr><td>Baza Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-500ml</td><td></td></tr><tr><td>WesternBright ECL spray</td><td>Advansta</td><td>K-12049-D50</td><td></td></tr></tbody></table>

chemiczna inaktywacja cereblon ligazy ubikwityny e3 przez homo-protac na bazie pomalidomidu

Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs

Leki immunomodulujące (IMiDs) talidomid i jego analogi, lenalidomid i pomalidomid, wszystkie zatwierdzone przez FDA leki do leczenia szpiczaka mnogiego, wywołują ubikwitynację i degradację limfoidalnych czynników transkrypcyjnych Ikaros (IKZF1) i Aiolos (IKZF3) za pośrednictwem ligazy ubikwityny E3 w celu degradacji proteasomalnej. IMiD zostały ostatnio wykorzystane do generowania dwufunkcyjnych chimer ukierunkowanych na proteolizę (PROTAC) w celu ukierunkowania na inne białka w celu ubikwitynacji i degradacji proteasomalnej przez ligazę CRBN E3. Zaprojektowaliśmy i zsyntetyzowaliśmy homobifunkcyjne PROTAC na bazie pomalidomidu i przeanalizowaliśmy ich zdolność do indukowania samosterowanej ubikwitynacji i degradacji CRBN. W tym przypadku CRBN służy zarówno jako ligaza ubikwityny E3, jak i cel w tym samym czasie. Związek homo-PROTAC 8 rozkłada CRBN z dużą siłą działania przy minimalnym wpływie na IKZF1 i IKZF3. Inaktywacja CRBN przez związek 8 nie miała wpływu na żywotność komórek i proliferację różnych linii komórkowych szpiczaka mnogiego. Ten homo-PROTAC znosi działanie IMiD w komórkach szpiczaka mnogiego. Dlatego nasze homodimeryczne związki na bazie pomalidomidu mogą pomóc w identyfikacji endogennych substratów i funkcji fizjologicznych CRBN oraz w badaniu mechanizmu molekularnego IMiD.

W niniejszej pracy opisaliśmy projektowanie, syntezę oraz ocenę biologiczną homodimerycznego PROTAC-u opartego na pomalidomidzie do degradacji białka CRBN. Nasz PROTAC oddziałuje jednocześnie z dwiema cząsteczkami CRBN i tworzy kompleksy trójskładnikowe, które indukują autoubi Kwitylację i degradację proteasomalną CRBN, wywierając jedynie minimalny wpływ na indukowane pomalidomidem neo-substraty IKZF1 lub IKZF3.
Z serii wcześnie...

Ta praca opisuje syntezę i charakterystykę dwufunkcyjnego homo-PROTAC na bazie pomalidomidu jako nowatorskie podejście do indukowania ubikwitynacji i degradacji cereblonu ligazy ubikwityny E3 (CRBN), celu analogów talidomidu.

Chemiczna inaktywacja cereblon ligazy ubikwityny E3 przez Homo-PROTAC na bazie pomalidomidu

The immunomodulatory drugs (IMiDs) thalidomide and its analogs, lenalidomide and pomalidomide, all FDA approved drugs for the treatment of multiple ...

Nasze homodimeryczne PROTAC są pierwszymi chemicznymi inhibitorami Cereblonu i mogą pomóc w dalszym wyjaśnieniu mechanizmu molekularnego analogów talidomidu, a także w badaniu fizjologicznych funkcji Cereblonu. Ta nowa technologia platformy PROTAC może być bardzo pomocna w celowaniu w białka będące przedmiotem zainteresowania, które w przeciwnym razie byłyby uważane za niemożliwe do śledzenia. Samo hamowanie CRBN nie ma działania przeciwnowotworowego.Jednak degradery CRBN mogą mieć implikacje kliniczne w otyłości, chorobach zakaźnych i innych zaburzeniach. Synteza jest trudna i trudno jest znaleźć optymalne łączniki i przyłączenie do generowania skutecznych degraderów białek podczas projektowania związku PROTAC. Na początek umieść 2,46 grama L-glutaminy chronionej przed Boc i 50 mililitrów tetrahydrofuranu w 100-mililitrowej kolbie okrągłodennej i mieszaj z prędkością 800 obr./min przez jedną minutę.Następnie dodaj 1,95 grama 1,1'karbonylodiimidazolu i katalityczną ilość 4-pirydyny. Kontynuuj mieszanie przez 10 godzin przy refluksie, aby uzyskać klarowny, bezbarwny roztwór związku glutarimidu. Pozwól roztworowi ostygnąć do temperatury pokojowej i usuń rozpuszczalnik za pomocą wyparki obrotowej.Ponownie rozpuść pozostałość w 200 mililitrach octanu etylu i wlej ją do rozdzielacza. Umyj warstwę organiczną po 50 mililitrami dejonizowanej wody i solanki i wysusz warstwę organiczną na siarczanie sodu. Przefiltruj grawitacyjnie roztwór przez żel krzemionkowy w celu usunięcia środka osuszającego, a następnie przepłucz żel krzemionkowy 200 mililitrami octanu etylu.Usunąć rozpuszczalnik z filtratu w próżni, aby otrzymać związek 1 w postaci bezbarwnego ciała stałego. Wysuszyć produkt w próżni przez noc przed użyciem. Następnie rozpuść 0,50 grama octanu sodu w 20 mililitrach lodowatego kwasu octowego w 100-mililitrowej kolbie okrągłodennej wyposażonej w mieszadło.Dodać 1,25 grama bezwodnika 3-fluoroftalowego i 1,14 grama glutarimidu i mieszać pod chłodnicą zwrotną przez sześć godzin, aby uzyskać fioletowy roztwór związku 3. Pozwól mieszaninie ostygnąć do temperatury pokojowej, a następnie wlej ją do 100 mililitrów wody dejonizowanej i mieszaj przez 10 minut, aby wytrącić związek 3. Zbierz ciało stałe przez filtrację, umyj je wodą i eterem naftowym i susz w próżni przez dwa dni.Następnie umieść 0,83 grama związku trzy i 20 mililitrów suchego dimetylosulfotlenku w 50-mililitrowej kolbie Schlenka i mieszaj przez dwie minuty. Dodać 0,22 grama związku 6 łącznika alfa omega diaminy i 1,05 mililitra N, N-diizopropyloetyloaminy i mieszać mieszaninę pod argonem w temperaturze 90 stopni Celsjusza przez 18 godzin, aby uzyskać Homodimer 8 w ciemnozielonej mieszaninie. Pozostaw mieszaninę do ostygnięcia do temperatury pokojowej i wlej ją do 100 mililitrów wody dejonizowanej.Wyekstrahuj produkt na trzy 50-mililitrowe porcje octanu etylu, połącz warstwy organiczne i umyj je po 50 mililitrami wody i solanki. Wysuszyć umytą warstwę organiczną na siarczanie sodu, odfiltrować środek osuszający i usunąć rozpuszczalnik pod próżnią. Ponownie rozpuścić pozostałość w minimalnej ilości rozpuszczalnika chromatograficznego i nałożyć na kolumnę z żelem krzemionkowym w celu oczyszczenia.Zebrać frakcje produktu fluorescencyjnego, połączyć je i usunąć rozpuszczalnik, aby otrzymać homodimer 8 w postaci żółtego ciała stałego. Na początek rozpuść 2,28 grama glutarimidu 1 na 25 mililitrów dimetyloformamidu w 100-mililitrowej kolbie okrągłodennej. Zawiesić 2,76 grama zmielonego węglanu potasu w tym roztworze.Następnie pobierz 0,62 mililitra jodometanu do strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 20. Dodawaj jodometan kroplami w ciągu 10 sekund. Zakorkować kolbę gumową przegrodą i dodać igłę odpowietrzającą.Sonikować mieszaninę przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, aby uzyskać związek glutarimidu 2. Rozcieńczyć mieszaninę 50 mililitrami octanu etylu i wlać do rozdzielacza. Przepłukać kolbę do lejka z kolejnymi 50 mililitrami octanu etylu.Rozdrobnić produkt i oczyścić go za pomocą chromatografii kolumnowej z żelem krzemionkowym w celu otrzymania glutarimidu 2 w postaci bezbarwnego ciała stałego. Porównaj czasy retencji związków glutarimidu 1 i 2, aby potwierdzić, że N-metylacja zakończyła się sukcesem. Aby rozpocząć walidację, należy potraktować komórki szpiczaka mnogiego związkami będącymi przedmiotem zainteresowania.Wyizolować odpowiednie białka i przygotować próbki do analizy degradacji białek metodą Western Blot. Następnie przygotuj żelową kanapkę dla SDS-PAGE i napełnij zbiornik buforowy anody roztworem tris-HCl o pH 8,9. Załaduj próbki białka do żelu i uruchom go pod napięciem 70 V przez 20 minut, a następnie 115 V przez 150 minut.Następnie przygotuj 1x bufor transferowy do immunoblottingu i ostrożnie przenieś żel z kasety do bufora transferowego w celu zrównoważenia. Musisz być bardzo ostrożny podczas wyjmowania żelu z kasety w celu zrównoważenia, ponieważ może on bardzo szybko pęknąć i zgniecić się. Zanurz membranę z polifluorku winylidenu o grubości 0,45 mikrometra w czystym metanolu na co najmniej 20 sekund, aby ją aktywować, a następnie zanurz ją w 1x buforze transferowym.Pozwól żelowi i membranie zrównoważyć się przez 10 minut. Następnie zmontuj kasetę Western Blotting i zastosuj 180 miliamperów przez 90 minut, aby przenieść białka do błony. Następnie zwizualizuj białka za pomocą barwienia immunologicznego.Aby ocenić wpływ na żywotność komórek, najpierw wysiewa się 50 000 komórek szpiczaka mnogiego na dołek z 96-dołkowej płytki w biologicznym potrójnym ploi. Dodać do każdej studzienki 100 mikrolitrów pożywki zawierającej DMSO lub 0,1, jeden lub 10 mikromolów związku 8, związku 9 lub pomalidomidu. Aby przeprowadzić eksperyment ratujący żywotność komórek, zamiast tego należy potraktować komórki 100-nanomolowym roztworem związku 8 przez trzy godziny, przed lub po dodaniu jednego mikromolowego roztworu pomalidomidu.Inkubuj komórki przez 24, 48 lub 96 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% dwutlenku węgla i zmierz żywotność komórek za pomocą testu luminescencyjnego. Struktura homodimerycznego PROTAC 8 została potwierdzona za pomocą NMR protonowego i węglowego. Heterodimeryczny PROTAC 9 został zsyntetyzowany jako kontrola ujemna, ponieważ N-metylacja w części glutarimidu powoduje utratę zdolności wiązania cereblonu, czyli CRBN.Homo PROTAC 8 indukował prawie całkowitą proteosomalną degradację CRBN przy minimalnym wpływie na limfoidalne czynniki transkrypcyjne IKZF1 i IKZF3. Natomiast hetero PROTAC 9 zachowywał się podobnie jak pomalidomidy. Degradacja CRBN indukowana związkiem 8 może być blokowana przez bezpośredni inhibitor proteasomu lub pośrednio blokowana przez hamowanie netylacji.Komórki poddane wstępnej obróbce związkiem 8 były znacząco odporne na działanie pomalidomidu na IKZF1 i IKZF3. Degradacja CRBN wywołana związkiem 8 miała znacznie mniejszy wpływ na żywotność komórek szpiczaka mnogiego po 96 godzinach niż degradacja IKZF1 i IKZF3 ze związku 9 i pomalidomidu. Komórki szpiczaka mnogiego wstępnie leczone związkiem 8 miały znacznie większą żywotność po ekspozycji na pomalidomid niż komórki nieleczone, co sugeruje, że związek 8 może być stosowany do naśladowania immunomodulującej oporności IMiD na leki.Odkryliśmy, że związek 8 indukuje całkowitą degradację proteasomalną mózgu, nie ma skutków ubocznych dla żywotności i proliferacji komórek IKZF1 i IKZF3. Rozszerzenie technologii opracowanej w ramach projektu na inne cele może przyczynić się do inaktywacji i śledzenia białek związanych z nowotworami i innymi chorobami. Dostosowując tę technikę do innych leków i białek, należy dokładnie zbadać struktury molekularne leku i docelowego białka, aby wybrać optymalne łączniki i przyłączenia.IMiDs nie będzie działać u myszy z powodu mutacji punktowej w mózgu, ale istnieje transgeniczny model myszy knock-in, który można wykorzystać do dalszych badań na zwierzętach. Ponieważ pomalidomid jest analogiem talidomidu, który wykazuje silne działanie teratogenne, nie zalecamy kobietom w ciąży stosowania tych leków.

chemical-inactivation-e3-ubiquitin-ligase-cereblon-pomalidomide-based

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Cytotoksyczna aktywność fenantrydyny PJ-34 w komórkach nowotworowych przechodzących mitozę została udokumentowana w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania konfokalnego na żywo. PJ-34 zlikwidował ludzkiego raka piersi Komórki MDA-MB-231 zawierające extracentrosomy w mitozie. W przeciwieństwie do normalnej dwuogniskowej mitozy, pozacentrosomy nie były skupione w dwóch biegunach wrzeciona w obecności PJ-34.

Śmierć komórki związana z nieprawidłową mitozą obserwowana przez obrazowanie konfokalne w żywych komórkach rakowych

Ocena siły działania chemikaliów i leków środowiskowych, które mają być enzymatycznie bioaktywowane do produktów pośrednich generujących kowalencyjne addukty DNA, jest ważnym polem w rozwoju raka i jego leczeniu. Opisano metody aktywacji związków w celu utworzenia adduktów DNA, a także techniki ich wykrywania i kwantyfikacji.

Tworzenie kowalencyjnych adduktów DNA przez enzymatycznie aktywowane czynniki rakotwórcze i leki in vitro oraz ich oznaczanie za pomocą 32p-posttagingu

Ten artykuł wykorzystuje test oparty na cytometrii przepływowej do badania bibliotek chemicznych inhibitorów w celu identyfikacji inhibitorów i ich celów, które wpływają na sygnalizację receptora limfocytów T. Opisane tutaj metody można również rozszerzyć o badania przesiewowe o wysokiej przepustowości.

Identyfikacja mediatorów sygnalizacji receptora limfocytów T poprzez badania przesiewowe bibliotek inhibitorów chemicznych

Ten protokół ma na celu ustalenie proteomów specyficznych dla ubikwityny (Ub) i ubikwitynopodobnych (Ubls) w celu identyfikacji zmian tego rodzaju modyfikacji potranslacyjnych (PTM), związanych z konkretnym stanem, takim jak leczenie lub fenotyp.

Profilowanie ubikwityny i zależnych od ubikwityny modyfikacji potranslacyjnych oraz identyfikacja istotnych zmian

Ten protokół opisuje ilościowe wykrywanie kinetyki degradacji białek w żywych komórkach, które zostały zaprojektowane przy użyciu CRISPR/Cas9 do ekspresji znacznika wykrywania endogennego białka wolnego od przeciwciał połączonego z białkiem docelowym. Dołączone są szczegółowe instrukcje dotyczące obliczania i uzyskiwania ilościowych parametrów degradacji, szybkości, Dmax, DC50 i Dmax50.

Wysokoprzepustowe profilowanie komórkowe ukierunkowanych związków degradacji białek przy użyciu linii komórkowych HiBiT CRISPR

Tutaj opisujemy test biologiczny z użyciem bromku 3-(4′,5′-dimetylotiazol-2′-ylo)-2,5-difenylotetrazolowego (MTT) do testowania wcześniej zsyntetyzowanych oksymów spirocyklicznych.

Funkcjonalizowana spirocykliczna synteza heterocykliczna i test cytotoksyczności

Obecny protokół podkreśla zmodyfikowaną metodę wykrywania i ilościowego oznaczania wiązań krzyżowych DNA-białko (DPC) oraz ich modyfikacji potranslacyjnych (PTM), w tym ubikwitylacji, SUMOylacji i ADP-rybozylacji indukowanej przez inhibitory topoizomerazy i formaldehyd, umożliwiając tym samym badanie powstawania i naprawy DPC i ich PTM.

Ilościowe wykrywanie wiązań krzyżowych DNA-białko i ich modyfikacji potranslacyjnych

Ten artykuł opisuje budowę komórek nokautujących białko-E związanych z centromerem (CENP-E) przy użyciu systemu CRISPR/Cas9 i trzech strategii przesiewowych opartych na fenotypie. Wykorzystaliśmy linię komórkową z nokautem CENP-E do opracowania nowatorskiego podejścia do walidacji swoistości i toksyczności inhibitorów CENP-E, co jest przydatne przy opracowywaniu leków i badaniach biologicznych.

Generowanie linii komórkowych nokautujących związanych z centromerem Protein-E CENP-E-/- przy użyciu systemu CRISPR/Cas9

Tutaj opisujemy protokoły biofizycznej charakterystyki tworzenia kompleksów trójskładnikowych indukowanych przez chimery ukierunkowane na proteolizę (PROTACS), które obejmują ligazy ubikwityny: ligazę Von Hippel-Lindau, ligazę E3 (VHL) i Cereblon (CRBN).  Metody biofizyczne zilustrowane w niniejszym artykule obejmują powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR), interferometrię biowarstwową (BLI) i izotermiczną kalorymetrię miareczkową (ITC).

Opracowanie i zastosowanie testów biofizycznych do oceny tworzenia kompleksów trójskładnikowych indukowanych przez chimery ukierunkowane na proteolizę (PROTACS)

Opisujemy eksperymentalne szczegóły syntezy wzorcowych i rekonfigurowalnych cząstek z dwuwymiarowych (2D) prekursorów. Metodologia ta może być stosowana do tworzenia cząstek o różnych kształtach, w tym wielościanów i urządzeń chwytających, w skalach długości od mikro do centymetrów.

Inspirowany origami samomontaż wzorzystych i rekonfigurowalnych cząstek

Poznaj metodę chemicznej inaktywacji ligazy ubikwityny E3 cereblon za pomocą homo-PROTAC na bazie pomalidomidu. Ta technologia umożliwia celowaną degradację białek wcześniej uznawanych za nieosiągalne.

Chemiczna inaktywacja cereblon ligazy ubikwityny E3 przez Homo-PROTAC na bazie pomalidomidu

Przeglądaj więcej filmów