Obrazowanie dynamiki jądrowej w wysokiej rozdzielczości w żywych komórkach pod wpływem jednoosiowego odkształcenia rozciągającego

Wcześniej zaprojektowaliśmy urządzenie do mechanicznego obciążania przylegających komórek. W ramach obecnych prac przeprojektowaliśmy geometrię podłoża i dostosowaliśmy konfigurację do obrazowania tych komórek odkształcających w wysokiej rozdzielczości. Główną zaletą tego systemu rozciągania komórek jest to, że zapewnia on obrazowanie subkomórkowe o wysokiej rozdzielczości przy 100-krotności komórek szczepu.

Sposób wytwarzania podłoża zademonstruje Vicki, asystentka naukowa z mojego laboratorium. Zacznij od zaprojektowania jednodołkowej formy polidimetylosiloksanu, postępując zgodnie z dołączonym protokołem tekstowym. Następnie wymieszaj 20 części bazy polidimetylosiloksanu z jedną częścią utwardzacza w jednorazowym kubku.

Po wymieszaniu umieść mieszaninę polidimetylosiloksanu w odgazowywaczu próżniowym pod ciśnieniem 0,8 bara na 30 minut, aby usunąć pęcherzyki z mieszanki. Następnie wlej mieszankę polidimetylosiloksanu do formy i naczynia. Na tym etapie należy usunąć wszelkie dodatkowe pęcherzyki, ponownie odgazowując je w próżni 0,8 bara przez 30 minut.

Po zakończeniu odgazowywania próbki należy piec w temperaturze 80 stopni Celsjusza na stole wyrównującym przez dwie godziny. Następnie ostrożnie wyjmij próbki z piekarnika i pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej. Odetnij krawędzie ostrzem i delikatnie oderwij utwardzony polidimetylosiloksan.

Na polidimetylosiloksanach o średnicy 150 milimetrów narysuj markerem siatkę o wymiarach dwa centymetry na dwa centymetry. W każdym kwadracie narysuj kwadrat o wymiarach jeden centymetr na jeden centymetr, pozostawiając margines 0,5 centymetra ze wszystkich stron. Użyj ostrza, aby ostrożnie przeciąć wzdłuż linii i uzyskać kwadratowe przegródki.

Następnie oczyść próbki, inkubując je w 100% acetonie przez cztery godziny, 100% etanolu przez dodatkowe cztery godziny, a następnie w autoklawie wodnym przez cztery godziny. Oczyszczone próbki należy umieścić na papierze podkładowym z folii parafinowej w plastikowym naczyniu o średnicy 150 milimetrów i wysuszyć próbkę w piekarniku o temperaturze 80 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Po zakończeniu uszczelnij naczynia folią parafinową i przechowuj je w chłodnym pomieszczeniu do dalszego użycia.

Przygotuj komórki progenitorowe i zawieś je w pożywce proliferacyjnej. Umieść te komórki w gęstości 35 000 komórek na centymetr kwadratowy na powierzchniach z tworzywa sztucznego pokrytych PDL. Dostosuj objętość pożywki proliferacyjnej do trzech mililitrów na dziesięć centymetrów kwadratowych powierzchni.

Mniejsza objętość pożywki może prowadzić do zbrylania się komórek, wynikającego z sił napięcia powierzchniowego, podczas gdy większa objętość pożywki w naczyniach może powodować rozlewanie się pożywki. Trzeciego dnia po wysiewie zbierz komórki i policz je za pomocą hemocytometru. Następnie wysiewaj 35 000 komórek na płytkę polidimetylosiloksanu z 700 mikrolitrami pożywki proliferacyjnej.

Następnie dodaj konstrukt plazmatyczny do znakowania kompleksów histonowych H2B komórki zielonym białkiem fluorescencyjnym, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Po 24 godzinach zamontuj próbki polidimetylosiloksanu z komórkami, które mają być rozciągnięte na jednoosiowym urządzeniu do odkształcania. Następnie zmień pożywkę we wszystkich próbkach na pożywkę różnicującą.

Zmierz długość komory nienaprężonej komórki i przekręć mikrometru stage, aby zwiększyć długość komory komórki o żądaną ilość odkształcenia. Rozciągnięte i nierozciągnięte próbki polidimetylosiloksanu pozostawić w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza do czasu obrazowania. Przygotuj inkubator mikroskopowy do obrazowania na żywo, ustawiając temperaturę inkubatora na 37 stopni Celsjusza.

Następnie ustaw obiektyw ze 100-krotnym zanurzeniem w oleju do pozycji środkowej, ponieważ obrót obiektywunie będzie później dostępny. Po ustawieniu się na miejscu odkręć obiektyw i przykręć go z powrotem do pierścienia obiektywu, aby obiektyw można było zbliżyć do komórek. Następnie dodaj kroplę oleju do celu.

Za pomocą uchwytu z nadrukiem na zamówienie pokryj uchwyt smarem próżniowym na obrzeżach okna i umieść szkiełko nakrywkowe o grubości zero na górnej powierzchni uchwytu. Przyklej plastikowe okienko do stolika mikroskopu. Następnie przykręć stolik translacyjny Z do stolika mikroskopu i przesuń go do najwyższej pozycji Z.

Usunąć 500 mikrolitrów pożywki z rozciągniętej płytki polidimetylosiloksanu, która ma być zobrazowana, i dodać to podłoże na szklane szkiełko nakrywkowe w białym plastikowym okienku. Następnie użyj sterylnej pęsety, aby ostrożnie odłączyć kwadratową komorę od płytki z polidimetylosiloksanu. Trzymaj urządzenie naprężające w pozycji pionowej, tak aby komórki były skierowane do góry, nad białym plastikowym okienkiem i ostrożnie odwróć urządzenie naprężające, tak aby dodatkowe medium spadło bezpośrednio na środek szklanego szkiełka nakrywkowego, z komórkami skierowanymi w dół.

Umieść dolną część urządzenia naprężającego na stoliku translacyjnym Z za pomocą taśmy dwustronnej, aby utrzymać je na miejscu. Patrząc przez okular w jasnym polu, bardzo powoli opuść urządzenie napinające, a obiektyw przesuń w górę, aby skupić się na komórkach. Wykonuj ten krok ustawiania ostrości powoli, na przemian obniżając stopień przesunięcia Z i podnosząc obiektyw.

Jeśli etap translacji Z obniży się zbyt mocno, komórki mogą się skompresować, a tym samym umrzeć. Jeśli podniesiemy obiektyw zbyt wysoko, może to spowodować pęknięcie szklanego szkiełka nakrywkowego i wyciek medium. Zeskanuj płytkę polidimetylosiloksanu w kierunkach X i Y, aby znaleźć komórkę, która ma jądro fluorescencyjne, używając epiflorescencji przy wzbudzeniu 488 nanometrów.

Upewnij się również, że komórka ma odpowiednią morfologię, patrząc na próbkę w jasnym polu. Rejestruj obrazy jądra o szerokim polu lub z otwartym otworkiem o długości fali 488 nanometrów oraz komórki ze wzbudzeniem w jasnym polu w odstępach 30-sekundowych na klatkę przez łączny czas trwania co najmniej 30 minut. Przeprojektowana geometria podłoża polidimetylosiloksanowego i konfiguracja obrazowania pokazana na tym filmie minimalizuje odległość między komórkami a obiektywem.

Umożliwia to obrazowanie poklatkowe znakowanych fluorescencyjnie jąder komórkowych przy użyciu 100-krotnego obiektywu immersyjnego z olejkiem. Aby zmierzyć fluktuacje jądrowe, najpierw wykreśl obszar jądra w funkcji czasu. Następnie zdetrenduj dane przy użyciu wielomianu trzeciego rzędu.

I na koniec wykreśl fluktuacje szczątkowe i oblicz odchylenie standardowe fluktuacji resztkowych. Fluktuacje jądrowe komórek progenitorowych oligodendrocytów, następujące po chemicznej indukcji różnicowania z 10% szczepem rozciągającym i bez niego, pokazują, że przy samej indukcji chemicznej amplituda fluktuacji jądrowych wykazała znaczny spadek po 48 godzinach, ale nie po 24 godzinach. Z drugiej strony, indukcja chemiczna wraz z 10% odkształceniem rozciągającym wykazała znaczny spadek po 24 godzinach, który pozostał stały bez dalszej redukcji po 48 godzinach.

Najważniejszą rzeczą do zapamiętania jest to, że odległość robocza wybranego obiektywu powinna być równa lub większa niż głębokość komory celi plus grubość szkiełka nakrywkowego. Podłoże można przeprojektować tak, aby zawierało siatkę, co ułatwiłoby obrazowanie tej samej komórki przed i po zastosowaniu szczepu, ponieważ zestaw danych typu przed i po zmniejsza szum wynikający z błędu eksperymentalnego. Korzystając z tej konfiguracji obrazowania, wiele zjawisk subkomórkowych w przylegających żywych komórkach, takich jak lokalizacja białek lub dynamika składników komórkowych, można zobrazować w ciągu kilku sekund od zastosowania naprężenia mechanicznego.