Name: Obrazowanie dynamiki jądrowej w wysokiej rozdzielczości w żywych komórkach pod wpływem jednoosiowego odkształcenia rozciągającego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Poznaj metodę obrazowania dynamiki jądrowej w wysokiej rozdzielczości w żywych komórkach pod wpływem jednoosiowego odkształcenia rozciągającego. Technika ta umożliwia badanie odpowiedzi komórkowych na naprężenia mechaniczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wszyscy autorzy dziękują za wsparcie finansowe od Narodowej Fundacji Badawczej Singapuru poprzez interdyscyplinarną grupę badawczą Singapore-MIT Alliance for Research and Technology (SMART) BioSystems and Micromechanics (BioSyM). Autorzy, dr Jagielska i dr Van Vliet, dziękują również za finansowanie i wsparcie ze strony Fundacji Saks-Kavanaugh. Autorzy dziękują Williamowi Ongowi i dr Sing Yian Chew z Uniwersytetu Technologicznego Nanyang w Singapurze za dostarczenie komórek progenitorowych oligodendrocytów szczurów do niektórych eksperymentów opisanych w tej pracy, a autorzy dziękują dr G. V. Shivashankar z Instytutu Mechanobiologii Narodowego Uniwersytetu Singapuru w Singapurze za dyskusje na temat fluktuacji obszaru jądrowego.

1. Projekt formy z polidimetylosiloksanu do obrazowania w wysokiej rozdzielczości
UWAGA: Forma do produkcji płytek z polidimetylosiloksanu została zaprojektowana z następującymi cechami, aby umożliwić obrazowanie za pomocą soczewki zanurzeniowej ze 100x olejkiem i prawidłowe dopasowanie do specjalnie zbudowanego urządzenia szczepowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A,B).
<ol>
	<li>Utrzymuj całkowite wymiary płyty tak, aby pasowała do zacisków urządzenia napinającego. 
	UWAGA: Tutaj mają wymiary 60 mm x 73 mm.</li>
	<li>Wykonaj komorę lub studzienkę komórki, która jest znacznie mniejsza niż wymiary boczne całej płytki, aby uniknąć efektów łukowych (zginania poza płaszczyzną), które występują na niezaciśniętych krawędziach płytki polidimetylosiloksanu podczas przykładania naprężenia. 
	UWAGA: W tym przypadku komora została zaprojektowana jako kwadrat o wymiarach 23 mm x 23 mm.</li>
	<li>Głębokość komory na ogniwa powinna być jak najmniejsza (nie większa niż 80 μm), aby umożliwić ustawianie ostrości za pomocą soczewki zanurzonej w oleju 100x przez szkło nakrywkowe umieszczone na górze komory, ale powinna być wystarczająca, aby pomieścić media i uniknąć kontaktu lub ściskania komórek.</li>
	<li>Podnieś komorę na komórkę na kwadracie o wysokości 3 mm, aby zbliżyć komórki do obiektywu w konfiguracji mikroskopu odwróconego, aby umożliwić łatwe ustawianie ostrości. 
	UWAGA: Formy o powyższych cechach mogą być wytwarzane wieloma technikami, w tym np. frezowanym aluminium. Alternatywnie, formy wzorcowe można również montować za pomocą arkuszy akrylowych wyciętych za pomocą wycinarki laserowej, szkła osłonowego #0 do komory ogniwa i super kleju. Ta forma wzorcowa służy do wykonania odcisku z polidimetylosiloksanu, który jest następnie używany do wykonywania form roboczych przy użyciu żywicy odlewniczej.</li>
</ol>
2. Produkcja jednodołkowych płytek polidimetylosiloksanowych i kwadratowych komór
<ol>
	<li>Wymieszaj bazę polidimetylosiloksanu i utwardzacz w stosunku 20:1 (wagowo) w jednorazowym kubku. Zważyć łącznie 20 g polidimetylosiloksanu na formę (w celu wykonania jednej płytki z polidimetylosiloksanu) i 150 g polidimetylosiloksanu w plastikowym naczyniu o średnicy 150 mm (w celu wykonania jednej partii kwadratowych przegródek).</li>
	<li>Pozostawić mieszaninę polidimetylosiloksanu w odgazowywaczu próżniowym pod ciśnieniem -0,8 bara na 30 minut (lub do momentu, gdy wszystkie pęcherzyki zostaną usunięte).</li>
	<li>Wlej mieszankę polidimetylosiloksanu do foremek (na talerze) lub do plastikowych naczyń o średnicy 150 mm (do kwadratowych przegródek).</li>
	<li>Na tym etapie usunąć wszelkie dodatkowe pęcherzyki, powietrzem (doustnie) lub ponownie odgazowując formy/naczynia wypełnione polidimetylosiloksanem w próżni -0,8 bara przez 30 minut.</li>
	<li>Foremki/naczynia pozostawić w piekarniku o temperaturze 80 °C na stole poziomującym na 2 godziny.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij foremki/naczynia z piekarnika i pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej. Delikatnie obierz utwardzony polidimetylosiloksan po dokładnym przycięciu krawędzi ostrzem (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Na polidimetylosiloksanie o średnicy 150 mm narysuj markerem siatkę o wymiarach 2 cm x 2 cm. W każdym kwadracie narysuj kwadrat o wymiarach 1 cm x 1 cm, pozostawiając margines 0,5 cm ze wszystkich stron. Za pomocą ostrza ostrożnie przetnij wzdłuż linii, aby uzyskać kwadratowe przegródki (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Oczyścić płytki/kwadratowe komory z polidimetylosiloksanu, inkubując je w 100% acetonie przez 4 godziny, następnie w 100% etanolu przez 4 godziny, a następnie w autoklawie wodnym przez 4 godziny.</li>
	<li>Umieść talerze/kwadratowe przegródki na papierze podkładowym z folii parafinowej (nie folii parafinowej, ale papieru) w plastikowym naczyniu o średnicy 150 mm (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Pozostawić płytkę z polidimetylosiloksanem w piekarniku o temperaturze 80 °C do wyschnięcia na 4 godziny.</li>
	<li>Uszczelnić naczynia o średnicy 150 mm zawierające płytki i kwadraty pojemników z polidimetylosiloksanu folią parafinową i przechowywać je w chłodni do czasu dalszego użycia.</li>
</ol>
3. Funkcjonalizacja płytek polidimetylosiloksanowych
<ol>
	<li>Usuń folię parafinową, zdejmij pokrywę plastikowego naczynia i umieść płytki z polidimetylosiloksanu i kwadratowe przegródki w świetle ultrafioletowym na 30 minut.</li>
	<li>Poddać działaniu plazmy (przy 150 W przez 5 minut) płytki z polidimetylosiloksanu (z komorą komórkową skierowaną do góry) bez kwadratowych przegródek, aby powierzchnia hodowli stała się hydrofilowa.</li>
	<li>Natychmiast umieść kwadratowe przegródki na powierzchni poddanej obróbce plazmowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B) i naciśnij ręcznie, aby tymczasowo skleić je ze sobą. 
	UWAGA: Nie należy poddawać plazmie kwadratowych przegródek, w przeciwnym razie będą one mocno przylegać do płytki polidimetylosiloksanu i nie odpadną łatwo, gdy będą musiały zostać odklejone podczas obrazowania.</li>
	<li>Dodać 200 μl 100 mM (3-aminopropylo)trietoksysilanu do studzienki na 2 godziny, aby wprowadzić grupy –NH2 na powierzchnię polidimetylosiloksanu. Aby przygotować 100 mM roztwór, rozpuść 234 μl czystego (3-aminopropylo)trietoksysilanu w 10 ml wody. Po 2 godzinnej inkubacji umyj studzienki 3x wodą dejonizowaną.</li>
	<li>Odważyć 2 mg suberatu bisulfosuccinimidylu molekularnego środka sieciującego i rozpuścić go w 700 μl 1 M (4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego buforu (pH 8,0) i 2,8 ml wody. 
	UWAGA: Spowoduje to otrzymanie 1 mM roztworu subergenianu bissulfosuccinimidylu w 200 mM buforze kwasu sulfonowego (4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego. Należy pamiętać, że dobrze sprawdza się również bufor o stężeniu 50 mM.
	<ol>
		<li>Dodać 135 μl tego roztworu i 15 μl 1 mg/ml fibronektyny do studzienki w każdej płytce polidimetylosiloksanu przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przemyć 3x roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami. Dodać 500 μl buforowanego fosforanem roztworu soli fizjologicznej do studzienki. Przykryj naczynie o średnicy 150 mm zawierające polidimetylosiloksan folią parafinową i przechowuj je w chłodnym pomieszczeniu do czasu dalszego użycia.</li>
</ol>
4. Funkcjonalizacja plastikowych naczyń i kolb
<ol>
	<li>Inkubować plastikowe naczynia i kolby z roztworem poli-D-lizyny (PDL, w sterylnej wodzie) o stężeniu 5 μg/ml przez 1 godzinę. Dodać 1,5 ml tego roztworu (liganda) na szalkę o średnicy 35 mm, 3 ml na naczynie o średnicy 60 mm i 10 ml na kolbę hodowlanąo średnicy 75 cm2.</li>
	<li>Umyj naczynia i kolby 2x sterylną wodą.</li>
	<li>Pozostawić je do wyschnięcia w komorze bezpieczeństwa biologicznego na 1 godzinę (lub do wyschnięcia) i przechowywać w chłodni w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.</li>
</ol>
5. Pożywka proliferacji i różnicowania dla mysich komórek progenitorowych oligodendrocytów
<ol>
	<li>Przygotować 50 ml 100-krotnych roztworów pożywki do proliferacji i różnicowania, zrobić porcje po 2,5 ml i przechowywać je w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Skład pożywki proliferacyjnej to 0,1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej, 62 ng/ml progesteronu, 16 μg/ml putrescyny, 5 μg/ml insuliny, 50 μg/ml holotransferyny, 5 ng/ml seleninu sodu, 1x penicylina-streptomycyna, 10 ng/ml płytkowy czynnik wzrostu i 10 ng/ml czynnik wzrostu fibroblastów w zmodyfikowanej pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco z wysoką glukozą i pirogronianem. Podczas gdy albumina surowicy bydlęcej, progesteron, putrescyna i selenin sodu mogą być tworzone i przechowywane w 100x, insulina, holotransferyna i penicylina-streptomycyna muszą być dodawane świeże podczas przygotowywania roztworu 1x. Czynniki wzrostu muszą być utworzone w stężeniu 10 μg/ml i muszą być dodawane świeże do komórek każdego dnia (1 μl/ml pożywki). Skład pożywki różnicującej to 0,1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej, 62 ng/ml progesteronu, 16 μg/ml putrescyny, 5 μg/ml insuliny, 50 μg/ml holotransferyny, 5 ng/ml seleninu sodu, 1x penicylina-streptomycyna, 400 ng/ml trijodotyroniny, 400 ng/ml L-tyroksyny i 0,5% płodowej surowicy bydlęcej w DMEM z wysoką glukozą i pirogronianem. Trójjodotyronina i L-tyroksyna mogą być tworzone z innymi odczynnikami i przechowywane w temperaturze 100x. Insulina, holotransferyna i penicylina-streptomycyna muszą być dodawane świeże podczas przygotowywania 1x roztworu.</li>
	<li>W celu przygotowania 50 ml 100-krotnej pożywki proliferacyjnej, rozpuścić 510 mg albuminy surowicy bydlęcej w 17 ml pożywki Dulbecco, 310 μg progesteronu w 31 μl etanolu, 80 mg putrescyny w 500 μl pożywki Dulbecco, 25 μg seleninu sodu w 10 μl pożywki Dulbecco, i pełne DMEM do 50 ml</li>
	<li>W celu przygotowania 50 ml 100x roztworu pożywki różnicującej należy dodatkowo rozpuścić 2 mg trójjodotyroniny w 40 μl wodorotlenku sodu i 2 mg L-tyroksyny w 40 μl wodorotlenku sodu, a następnie uzupełnić roztwór do 50 ml pożywką Dulbecco. Przefiltrować roztwór przez sterylną jednostkę filtrującą jednorazowego użytku, podwielokrotność, i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Aby przygotować 250 ml 1x pożywki proliferacyjnej/różnicującej, zmieszaj 2,5 ml 100x roztworu pożywki proliferacyjnej/różnicującej z 12,5 mg holotransferyny, 125 μl 10 mg / ml insuliny i 2,5 ml 100x penicyliny-streptomycyny. Napełnij roztwór do 250 ml pożywką Dulbecco i przefiltruj go przez sterylną jednorazową jednostkę filtrującą. 
	UWAGA: Czynniki wzrostu muszą być dodawane świeże i bezpośrednio do hodowli komórkowej, a nie do całej partii odtworzonej pożywki.</li>
</ol>
6. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Zacznij od komórek progenitorowych oligodendrocytów zawieszonych w pożywce proliferacyjnej. Umieść te komórki w gęstości 35 000 komórek/cm2 na powierzchniach z tworzywa sztucznego pokrytych PDL (szalki lub kolby, patrz sekcja 4). Dostosować objętość pożywki proliferacyjnej do 3 ml na 10cm2 powierzchni podłoża z tworzywa sztucznego; Mniejsza objętość pożywki może prowadzić do zlepiania się komórek wynikającego z sił napięcia powierzchniowego, podczas gdy większa objętość pożywki w naczyniach może powodować rozlanie.</li>
	<li>Czynniki wzrostu (płytkowy czynnik wzrostu i czynnik wzrostu fibronektyny) należy dodawać codziennie, utrzymując ich stężenie na poziomie 10 ng/ml i co drugi dzień wymieniać połowę pożywki proliferacyjnej.</li>
	<li>Trzeciego dnia oderwać komórki od powierzchni tworzywa sztucznego za pomocą delikatnego roztworu do oddzielania komórek (np. akutazy): usunąć pożywkę, przemyć 1x roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem, dodać 1 ml roztworu oddzielającego na powierzchnię 20cm2, pozostawić naczynie/kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 10 minut i delikatnie stukać, aż wszystkie komórki się oderwą (patrz pod mikroskopem).</li>
	<li>Pipetować za pomocą końcówki o pojemności 200 μl, aby rozbić grudki na pojedyncze komórki, przenieść je do probówki o pojemności 50 ml, rozcieńczyć w pożywce proliferacyjnej, wirować z prędkością 0,2 x g przez 10 minut, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w pożywce proliferacyjnej, aby uzyskać całkowitą objętość 1 ml. Policz komórki za pomocą cytometru.</li>
	<li>Przemyć płytki polidimetylosiloksanu funkcjonalizowanego fibronektyną 2 razy po 15 minut na mycie pożywką proliferacyjną.</li>
	<li>Wysiewaj 35 000 komórek na płytkę polidimetylosiloksanu w 700 μl pożywki proliferacyjnej.</li>
	<li>Dodaj konstrukt plazmidowy H2B-GFP do znakowania histonu H2B białkiem zielonej fluorescencji. 
	UWAGA: Tutaj do każdej płytki dodano 1,4 μl mieszanki transfekcyjnej CellLight H2B-GFP BacMam2 (2 μl na 50 000 komórek).</li>
	<li>Po 24 godzinach zamontuj próbki polidimetylosiloksanu z komórkami, które mają być rozciągnięte na jednoosiowym urządzeniu do odkształcania (jak pokazano na <silna klasa = "xfig">Rysunek 2D). Zmienić pożywkę we wszystkich próbkach na pożywkę różnicującą.</li>
	<li>Aby odcedzić próbki, zmierz długość komory nienaprężonej komórki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A) i przekręć mikrometru stopnia, aby zwiększyć długość komory celi o żądaną wartość (np. 10%, patrz <silna klasa = "xfig">Rysunek 3B). Rozciągnięte i nierozciągnięte próbki polidimetylosiloksanu pozostawić w inkubatorze w temperaturze 37 °C do czasu obrazowania.</li>
</ol>
7. Obrazowanie
<ol>
	<li>Włącz mikroskop. Ustawić temperaturę inkubatora mikroskopu na 37 °C.</li>
	<li>Ustaw obiektyw, który ma być używany (100-krotne zanurzenie w olejku) do pozycji środkowej, ponieważ wieżyczka obiektywu nie będzie później dostępna. Odkręć obiektyw i przykręć go z powrotem za pomocą pierścienia obiektywu (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A), aby obiektyw można było zbliżyć do komórek. Jeśli używany jest tutaj obiektyw olejowy, na tym etapie dodaj kroplę oleju.</li>
	<li>Zsyntetyzuj wcześniej (poprzez druk 3D lub obróbkę skrawaniem) plastikowy lub metalowy uchwyt, który ma dwie ważne cechy - kątowe okno i stopień (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4B). 
	UWAGA: Okno obsługuje szklane szkiełko nakrywkowe o grubości #0, które utrzyma medium, gdy urządzenie naprężające jest w stanie odwróconym. Ukośne nacięcie na krawędziach okna (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4D) pozwala obiektywowi zbliżyć się do szkiełka nakrywkowego. Stopień w uchwycie pozwala nam sprowadzić rozciągnięty polidimetylosiloksan niżej, bliżej celu.</li>
	<li>Umieść szklane szkiełko nakrywkowe (grubość #0, o wymiarach 25 mm x 25 mm lub 35 mm średnicy) na górnej powierzchni uchwytu, rozprowadzając smar próżniowy na obrzeżach okna (<silna klasa="xfig">Rysunek 4C), a następnie przyklej plastikowe okienko do stolika mikroskopu (<silna klasa="xfig">Rysunek 4D i <silna klasa="xfig">Rysunek 5A).</li>
	<li>Przykręć stolik z translacją z do stolika mikroskopu i przesuń go do najwyższej pozycji z (<silna klasa="xfig">Rysunek 5A).</li>
	<li>Usunąć 500 μl pożywki z rozciągniętej płytki polidimetylosiloksanu, która ma być zobrazowana, i dodać tę pożywkę na szklane szkiełko nakrywkowe w białym plastikowym okienku.</li>
	<li>Ostrożnie odłącz kwadratową komorę od płytki z polidimetylosiloksanem za pomocą sterylnej pęsety.</li>
	<li>Trzymaj urządzenie naprężające w pozycji pionowej (komórki skierowane do góry) nad białym plastikowym okienkiem i ostrożnie odwróć urządzenie naprężające, tak aby dodatkowe medium spadło bezpośrednio na środek szklanego szkiełka nakrywkowego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5B) (komórki skierowane w dół).</li>
	<li>Umieść dolną część urządzenia naprężającego na stoliku z translacją z za pomocą taśmy dwustronnej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5C, D).</li>
	<li>Patrząc przez okular w jasnym polu, powoli opuść urządzenie naprężające w dół (Rysunek 5E) (obniżając stopień translacji z) i przesuń obiektyw w górę, aby ustawić ostrość na komórkach.
	<ol>
		<li>Wykonuj ten krok bardzo powoli, krok po kroku. Jeśli urządzenie naprężające zbyt mocno naciska na szkiełko nakrywkowe, komórki mogą zostać ściśnięte (powodując ich śmierć), a jeśli obiektyw zbyt mocno naciska na szkiełko nakrywkowe, szkiełko nakrywkowe może pęknąć (powodując wyciek medium i rozlanie się na obiektyw).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zeskanuj płytkę polidimetylosiloksanu w kierunkach x i y, aby znaleźć komórkę, która ma jądro fluorescencyjne (pod epifluorescencją ze wzbudzeniem o długości fali 488 nm) i odpowiednią morfologię komórki (w jasnym polu).</li>
	<li>Jeśli boczne przemieszczenie stolika mikroskopu nie wpływa zbytnio na ogniskowanie w pionie, wybierz wiele obszarów zainteresowania za pomocą funkcji wielopunktowej w oprogramowaniu. Czasami ostrość jest bardzo wrażliwa na wszelkie boczne przemieszczenia stolika. W takich przypadkach obrazuj jedną komórkę na raz. Zaznacz pozycje x, y i z dla każdej interesującej nas komórki.</li>
	<li>Rejestruj obrazy jądra o szerokim polu (lub z otwartym otworkiem) o długości fali 488 nm oraz komórki o wzbudzeniu w jasnym polu w odstępach 30 s na klatkę przez łączny czas trwania co najmniej 30 minut.</li>
</ol>
8. Analiza danych
<ol>
	<li>Fluktuacje jądrowe
	<ol>
		<li>Otwórz sekwencję obrazów jądra (Rysunek 6A) w oprogramowaniu do analizy obrazu i proguj obrazy poklatkowe jądra (na przykład użyj polecenia Threshold w ImageJ lub polecenia Graythresh w oprogramowaniu MATLAB).</li>
		<li>Pobierz obszar jądra (w pikselach) w funkcji czasu, wykreśl go w oprogramowaniu do wykreślania danych (<silna klasa="xfig">Rysunek 6B) i dopasuj wielomian trzeciego rzędu do danych (<silna klasa="xfig">Rysunek 6C) (na przykład użyj metody Analiza | Dopasowanie | Polecenie Dopasowanie wielomianowe w Początku układu współrzędnych lub polecenie Dopasowanie wielomianowe w oprogramowaniu MATLAB).</li>
		<li>Odejmij wartość dopasowanego wielomianu od rzeczywistego obszaru (w pikselach) dla każdego punktu czasowego. Ten skorygowany obszar jest znany jako obszar resztkowy. 
		UWAGA: Ten proces usuwa wszelkie tendencje wzrostowe lub spadkowe w danych wynikające z błędów instrumentalnych i jest nazywany detrendingiem.
		<ol>
			<li>Oblicz procent powierzchni resztkowej, dzieląc powierzchnię resztkową w każdym punkcie czasowym przez wartość dopasowanego wielomianu w tym punkcie czasowym (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 6D).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Obliczyć odchylenie standardowe szeregów czasowych powierzchni resztkowej. To odchylenie standardowe oznacza amplitudę fluktuacji jądrowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykreślanie danych i analiza statystyczna
	<ol>
		<li>Obliczyć amplitudę fluktuacji jądrowych jako średnią co najmniej 20 jąder na warunek.</li>
		<li>Przeprowadź jednoczynnikowy test statystyczny analizy wariancji z poprawką Bonferroniego, aby określić, czy istnieje znacząca różnica w amplitudzie fluktuacji w funkcji warunków zainteresowania (na przykład z zastosowanym odkształceniem i bez niego).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+produced+by+nerve+cells+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension produced by nerve cells in tissue culture.</a> Journal of Cell Science. 410, 391-410 (1979).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Developmental Biology. 389, (1983).</li>
<li>Van Essen, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tension-based+theory+of+morphogenesis+and+compact+wiring+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A tension-based theory of morphogenesis and compact wiring in the central nervous system.</a> Nature. , (1997).</li>
<li>Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch+growth+of+integrated+axon+tracts%3A+Extremes+and+exploitations%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations.</a> Progress in Neurobiology. 89, 231-239 (2011).</li>
<li>Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+rate-dependent+induction+of+reactive+astrogliosis+and+cell+death+in+three-dimensional+neuronal-astrocytic+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures.</a> Brain Research. , 103-115 (2011).</li>
<li>Fisher, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+correlates+of+axonal+swelling+in+chronic+multiple+sclerosis+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains.</a> Annals of Neurology. 2, 219-228 (2007).</li>
<li>Nikić, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nature Medicine. 17, 495-500 (2011).</li>
<li>Payne, S. C., Bartlett, C. A., Harvey, A. R., Dunlop, S. A., Fitzgerald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+loss+during+chronic+secondary+degeneration+in+rat+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Functional loss during chronic secondary degeneration in rat optic nerve.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, (2018).</li>
<li>Zeiger, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Static+mechanical+strain+induces+capillary+endothelial+cell+cycle+re-entry+and+sprouting%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Static mechanical strain induces capillary endothelial cell cycle re-entry and sprouting.</a> Physical Biology. 13, 1-16 (2017).</li>
<li>Jagielska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+strain+promotes+oligodendrocyte+differentiation+by+global+changes+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanical strain promotes oligodendrocyte differentiation by global changes of gene expression.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 93(2017).</li>
<li>Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+plasticity+of+the+nucleus+in+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1, 0-5 (2007).</li>
<li>Talwar, S., Kumar, A., Rao, M., Menon, G. I., Shivashankar, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+spatio-temporal+fluctuations+in+chromatin+compaction+states+characterize+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Correlated spatio-temporal fluctuations in chromatin compaction states characterize stem cells.</a> Biophysical Journal. 104, 553-564 (2013).</li>
<li>Makhija, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+strain+alters+cellular+and+nuclear+dynamics+at+early+stages+of+oligodendrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanical strain alters cellular and nuclear dynamics at early stages of oligodendrocyte differentiation.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 59(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wcześniej zaprojektowano urządzenie1 do stosowania zewnątrzkomórkowego naprężenia rozciągającego na przylegające komórki. Konstrukcja podłoża polidimetylosiloksanowego w tej pracy była wystarczająca do testów biochemicznych, a także do obrazowania rozciągniętych komórek w niskiej rozdzielczości. W ramach tej pracy podłoże zostało przeprojektowane i wprowadzono nowatorską konfigurację obrazowania, która ułatwia obrazowanie żywych komórek subkomórkowych o wysokiej rozdzielczości. Zalety tego systemu...

Komórki i tkanki w ciele są poddawane różnym mechanicznym sygnałom, w tym naprężeniom rozciągającym. Jednak wpływ tych wskazówek na biologię komórek nerwowych nie został jeszcze dokładnie zbadany i w pełni zrozumiany. W ośrodkowym układzie nerwowym źródłem obciążenia mechanicznego są wzrosty rozwojowe1,2,3,4, procesy fizjologiczne, takie jak zginanie rdzenia kręgowego, pulsacja krwi i płynu mózgowo-rdzeniowego oraz stany patologiczne, takie jak uraz, obrzęk aksonów, blizny glejowe lub wzrost guza5,6,7,8. Warto zbadać, jak naprężenie rozciągające wpływa na różnicowanie oligodendrocytów i późniejszą mielinizację aksonów, co jest krytycznym procesem w ośrodkowym układzie nerwowym kręgowców. Korzystając z specjalnie zaprojektowanego urządzenia szczepowego i elastomerowych płytek wielodołkowych, poprzednie prace9,10 wykazały, że statyczny jednoosiowy szczep może zwiększać różnicowanie oligodendrocytów poprzez globalne zmiany w ekspresji genów10. Aby uzyskać dalsze zrozumienie mechanizmów mechanotransdukcji odkształceń w tych komórkach, poprzednia aparatura doświadczalna musi zostać przeprojektowana zgodnie z opisem tutaj, aby umożliwić obrazowanie fluorescencyjne w wysokiej rozdzielczości dynamiki jądrowej w żywych komórkach pod obciążeniem. W szczególności opracowano jednodołkową płytkę polidimetylosiloksanową, a konfiguracja obrazowania została przeprojektowana, aby umożliwić obrazowanie poklatkowe żywych komórek pod obciążeniem przy użyciu 100-krotnej soczewki zanurzeniowej w oleju. Aby wyeliminować negatywne skutki optyczne polidimetylosiloksanu na szlaku świetlnym, komórki są obrazowane nie przez płytkę polidimetylosiloksanu, ale w pozycji odwróconej, przez szkło osłonowe pokrywające komorę komórki. Korzystając z tego nowego projektu obrazowania, nagrywane są setki filmów poklatkowych o wysokiej rozdzielczości, przedstawiających pojedyncze jądra komórkowe w nienaruszonych komórkach przylegających, w których chromatyna jest znakowana przez znakowanie histonu H2B do białka zielonej fluorescencji. Filmy te pokazują, że odkształcenie rozciągające indukuje zmiany w strukturze i dynamice chromatyny, które są zgodne z postępem różnicowania oligodendrocytów.
Obrazowanie żywych komórek pod wpływem zastosowanego obciążenia jest technicznie trudne i wymaga konstrukcji urządzenia, która jest kompatybilna z systemem mikroskopowym. Opisany tutaj projekt na zamówienie stanowi niedrogą alternatywę dla rozwiązań komercyjnych. Jego wymiary umożliwiają jego instalację na stolikach mikroskopowych i obrazowanie żywych komórek w wysokiej rozdzielczości przestrzennej podczas stosowanego szczepu. Konfiguracja obrazowania została zaprojektowana tak, aby ułatwić obrazowanie żywych komórek przy użyciu 100-krotnej soczewki olejowej o najwyższej przejrzystości, przez szkło nakrywkowe, a nie przez warstwę płytki polidimetylosiloksanowej, co w przeciwnym razie obniża jakość obrazu i jest powszechne w większości konfiguracji obrazowania pod obciążeniem. Urządzenie, z zamontowaną płytką zawierającą komórki, można również łatwo przechowywać w inkubatorze. To urządzenie jest przeznaczone do stosowania jednoosiowego szczepu do podłoża, które ułatwia przylegającą hodowlę komórek i utrzymuje stabilny i jednolity szczep przez wiele dni. Opisana tutaj konfiguracja może być wykorzystana do obrazowania w wysokiej rozdzielczości różnych przylegających typów komórek pod obciążeniem, dzięki czemu ma zastosowanie do badań mechanotransdukcji w wielu dziedzinach mechanobiologii komórki.

<table><tbody><tr><td><silne>Pierwotne komórki pierwotne</silne></td><td></td><td></td><td>Pierwotne komórki progenitorowe oligodendrocytów wyizolowane od nowonarodzonych szczurów zostały dostarczone przez laboratorium dr S. Y. Chew na Uniwersytecie Technologicznym Nanyang</td></tr> <tr><td>Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM wysoki &nbsp; glukoza</td><td>Gibco</td><td>11996-065-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15070-063-100ml</td><td></td></tr><tr><td>FGF</td><td>Prospec</td><td>CYT-608-50ug</td><td></td></tr><tr><td>PDGF</td><td>Prospec</td><td>CYT-776-10ug</td><td></td></tr><tr><td>Media Składniki magazynowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9418-10G</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783-1G</td><td></td></tr><tr><td>Putrescyna</td><td>Sigma</td><td>P5780-5G</td><td></td></tr><tr><td>Selenin sodu</td><td>Sigma</td><td>S5261-10G</td><td></td></tr><tr><td>Tri-jodotyronina</td><td>Sigma</td><td>T6397-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Tyroksyna</td><td>Sigma</td><td>T1775-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Holo-Transferyna</td><td>Sigma</td><td>T0665-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>Forma i płytka</td><td></td><td></td><td></td>PDMS</tr><tr><td>PDMS - Dow Corning Sylgard 184</td><td>Ellsworth</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5 KG</td><td></td></tr><tr><td>Forma - Płynne tworzywo sztuczne</td><td>Smooth-On</td><td>Smooth Cast 310 - Powłoki podłoża o rozmiarze</td><td></td></tr><tr><td>śladu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>poli-D-lizyna</td><td>Sigma</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>Sigma</td><td>F1141-2MG</td><td></td></tr><<tr><td>mocny>Barwienie histonowe</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sondy molekularne</td> <td>CellLigt H2B-GFP BacMam</td><td>C10594</td><td></td></tr><tr><td>Funkcjonalizacja powierzchni</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma</td><td>A3648-100ml</td><td></td></tr><tr><td>BS3</td><td>Covachem</td><td>13306-100mg</td><td></td></tr><tr><td>HEPES bufor pH 8,0</td><td>Alfa Aesar</td><td>J63578-AK-250ml</td><td></td></tr><tr><td> Odklejanie komórek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501-100ml</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie dynamiki jądrowej w wysokiej rozdzielczości w żywych komórkach pod wpływem jednoosiowego odkształcenia rozciągającego

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Zewnętrzne obciążenie mechaniczne jest znane z wywoływania fenotypowych reakcji komórek i ma fizjologiczne znaczenie w kilku układach tkankowych. Aby uchwycić wpływ zastosowanego zewnątrzkomórkowego naprężenia rozciągającego na populacje komórek in vitro za pomocą testów biochemicznych, wcześniej zaprojektowano urządzenie, które można łatwo wyprodukować i jest wystarczająco małe, aby zmieścić się w inkubatorach do hodowli tkankowych, a także na stolikach mikroskopowych. Jednak poprzedni projekt podłoża z polidimetylosiloksanu nie pozwalał na obrazowanie subkomórkowe w wysokiej rozdzielczości za pomocą obiektywów zanurzeniowych w oleju. W pracy tej opisano przeprojektowaną geometrię podłoża polidimetylosiloksanowego oraz dostosowaną konfigurację obrazowania, które razem mogą ułatwić obrazowanie subkomórkowe w wysokiej rozdzielczości żywych komórek pod obciążeniem. Podłoże to może być używane z tym samym, wcześniej zaprojektowanym urządzeniem, a zatem ma te same zalety, które wymieniono powyżej, oprócz umożliwienia obrazowania optycznego w wysokiej rozdzielczości. Konstrukcję podłoża z polidimetylosiloksanu można ulepszyć poprzez włączenie siatki, która ułatwi śledzenie tej samej komórki przed i po zastosowaniu szczepu. Reprezentatywne wyniki pokazują obrazowanie poklatkowe o wysokiej rozdzielczości znakowanych fluorescencyjnie jąder w napiętych komórkach uchwyconych przy użyciu opisanej tutaj metody. Te dane dotyczące dynamiki jądrowej dają wgląd w mechanizm, za pomocą którego zastosowane naprężenie rozciągające sprzyja różnicowaniu komórek progenitorowych oligodendrocytów.

Niedawne badania mające na celu zbadanie wpływu odkształcenia rozciągającego na oligodendrocyty10 wykazały, że 10% jednowymiarowe odkształcenie rozciągające promuje różnicowanie komórek progenitorowych oligodendrocytów poprzez globalne zmiany w ekspresji genów. Mechanizm stojący za tymi zmianami w ekspresji genów można badać poprzez obrazowanie parametrów subkomórkowych, takich jak struktura cytoszkieletu, lokalizacja czynników transkrypcyjnych, dynamika jądra komó...

Korzystając z wcześniej zaprojektowanego urządzenia do mechanicznego obciążania przylegających komórek, ten artykuł opisuje przeprojektowaną geometrię podłoża i dostosowane urządzenie do obrazowania pojedynczych komórek w wysokiej rozdzielczości z obiektywem 100x zanurzenia w olejku.

Obrazowanie dynamiki jądrowej w wysokiej rozdzielczości w żywych komórkach pod wpływem jednoosiowego odkształcenia rozciągającego

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

Wcześniej zaprojektowaliśmy urządzenie do mechanicznego obciążania przylegających komórek. W ramach obecnych prac przeprojektowaliśmy geometrię podłoża i dostosowaliśmy konfigurację do obrazowania tych komórek odkształcających w wysokiej rozdzielczości. Główną zaletą tego systemu rozciągania komórek jest to, że zapewnia on obrazowanie subkomórkowe o wysokiej rozdzielczości przy 100-krotności komórek szczepu.Sposób wytwarzania podłoża zademonstruje Vicki, asystentka naukowa z mojego laboratorium. Zacznij od zaprojektowania jednodołkowej formy polidimetylosiloksanu, postępując zgodnie z dołączonym protokołem tekstowym. Następnie wymieszaj 20 części bazy polidimetylosiloksanu z jedną częścią utwardzacza w jednorazowym kubku.Po wymieszaniu umieść mieszaninę polidimetylosiloksanu w odgazowywaczu próżniowym pod ciśnieniem 0,8 bara na 30 minut, aby usunąć pęcherzyki z mieszanki. Następnie wlej mieszankę polidimetylosiloksanu do formy i naczynia. Na tym etapie należy usunąć wszelkie dodatkowe pęcherzyki, ponownie odgazowując je w próżni 0,8 bara przez 30 minut.Po zakończeniu odgazowywania próbki należy piec w temperaturze 80 stopni Celsjusza na stole wyrównującym przez dwie godziny. Następnie ostrożnie wyjmij próbki z piekarnika i pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej. Odetnij krawędzie ostrzem i delikatnie oderwij utwardzony polidimetylosiloksan.Na polidimetylosiloksanach o średnicy 150 milimetrów narysuj markerem siatkę o wymiarach dwa centymetry na dwa centymetry. W każdym kwadracie narysuj kwadrat o wymiarach jeden centymetr na jeden centymetr, pozostawiając margines 0,5 centymetra ze wszystkich stron. Użyj ostrza, aby ostrożnie przeciąć wzdłuż linii i uzyskać kwadratowe przegródki.Następnie oczyść próbki, inkubując je w 100% acetonie przez cztery godziny, 100% etanolu przez dodatkowe cztery godziny, a następnie w autoklawie wodnym przez cztery godziny. Oczyszczone próbki należy umieścić na papierze podkładowym z folii parafinowej w plastikowym naczyniu o średnicy 150 milimetrów i wysuszyć próbkę w piekarniku o temperaturze 80 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Po zakończeniu uszczelnij naczynia folią parafinową i przechowuj je w chłodnym pomieszczeniu do dalszego użycia.Przygotuj komórki progenitorowe i zawieś je w pożywce proliferacyjnej. Umieść te komórki w gęstości 35 000 komórek na centymetr kwadratowy na powierzchniach z tworzywa sztucznego pokrytych PDL. Dostosuj objętość pożywki proliferacyjnej do trzech mililitrów na dziesięć centymetrów kwadratowych powierzchni.Mniejsza objętość pożywki może prowadzić do zbrylania się komórek, wynikającego z sił napięcia powierzchniowego, podczas gdy większa objętość pożywki w naczyniach może powodować rozlewanie się pożywki. Trzeciego dnia po wysiewie zbierz komórki i policz je za pomocą hemocytometru. Następnie wysiewaj 35 000 komórek na płytkę polidimetylosiloksanu z 700 mikrolitrami pożywki proliferacyjnej.Następnie dodaj konstrukt plazmatyczny do znakowania kompleksów histonowych H2B komórki zielonym białkiem fluorescencyjnym, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Po 24 godzinach zamontuj próbki polidimetylosiloksanu z komórkami, które mają być rozciągnięte na jednoosiowym urządzeniu do odkształcania. Następnie zmień pożywkę we wszystkich próbkach na pożywkę różnicującą.Zmierz długość komory nienaprężonej komórki i przekręć mikrometru stage, aby zwiększyć długość komory komórki o żądaną ilość odkształcenia. Rozciągnięte i nierozciągnięte próbki polidimetylosiloksanu pozostawić w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza do czasu obrazowania. Przygotuj inkubator mikroskopowy do obrazowania na żywo, ustawiając temperaturę inkubatora na 37 stopni Celsjusza.Następnie ustaw obiektyw ze 100-krotnym zanurzeniem w oleju do pozycji środkowej, ponieważ obrót obiektywunie będzie później dostępny. Po ustawieniu się na miejscu odkręć obiektyw i przykręć go z powrotem do pierścienia obiektywu, aby obiektyw można było zbliżyć do komórek. Następnie dodaj kroplę oleju do celu.Za pomocą uchwytu z nadrukiem na zamówienie pokryj uchwyt smarem próżniowym na obrzeżach okna i umieść szkiełko nakrywkowe o grubości zero na górnej powierzchni uchwytu. Przyklej plastikowe okienko do stolika mikroskopu. Następnie przykręć stolik translacyjny Z do stolika mikroskopu i przesuń go do najwyższej pozycji Z.Usunąć 500 mikrolitrów pożywki z rozciągniętej płytki polidimetylosiloksanu, która ma być zobrazowana, i dodać to podłoże na szklane szkiełko nakrywkowe w białym plastikowym okienku. Następnie użyj sterylnej pęsety, aby ostrożnie odłączyć kwadratową komorę od płytki z polidimetylosiloksanu. Trzymaj urządzenie naprężające w pozycji pionowej, tak aby komórki były skierowane do góry, nad białym plastikowym okienkiem i ostrożnie odwróć urządzenie naprężające, tak aby dodatkowe medium spadło bezpośrednio na środek szklanego szkiełka nakrywkowego, z komórkami skierowanymi w dół.Umieść dolną część urządzenia naprężającego na stoliku translacyjnym Z za pomocą taśmy dwustronnej, aby utrzymać je na miejscu. Patrząc przez okular w jasnym polu, bardzo powoli opuść urządzenie napinające, a obiektyw przesuń w górę, aby skupić się na komórkach. Wykonuj ten krok ustawiania ostrości powoli, na przemian obniżając stopień przesunięcia Z i podnosząc obiektyw.Jeśli etap translacji Z obniży się zbyt mocno, komórki mogą się skompresować, a tym samym umrzeć. Jeśli podniesiemy obiektyw zbyt wysoko, może to spowodować pęknięcie szklanego szkiełka nakrywkowego i wyciek medium. Zeskanuj płytkę polidimetylosiloksanu w kierunkach X i Y, aby znaleźć komórkę, która ma jądro fluorescencyjne, używając epiflorescencji przy wzbudzeniu 488 nanometrów.Upewnij się również, że komórka ma odpowiednią morfologię, patrząc na próbkę w jasnym polu. Rejestruj obrazy jądra o szerokim polu lub z otwartym otworkiem o długości fali 488 nanometrów oraz komórki ze wzbudzeniem w jasnym polu w odstępach 30-sekundowych na klatkę przez łączny czas trwania co najmniej 30 minut. Przeprojektowana geometria podłoża polidimetylosiloksanowego i konfiguracja obrazowania pokazana na tym filmie minimalizuje odległość między komórkami a obiektywem.Umożliwia to obrazowanie poklatkowe znakowanych fluorescencyjnie jąder komórkowych przy użyciu 100-krotnego obiektywu immersyjnego z olejkiem. Aby zmierzyć fluktuacje jądrowe, najpierw wykreśl obszar jądra w funkcji czasu. Następnie zdetrenduj dane przy użyciu wielomianu trzeciego rzędu.I na koniec wykreśl fluktuacje szczątkowe i oblicz odchylenie standardowe fluktuacji resztkowych. Fluktuacje jądrowe komórek progenitorowych oligodendrocytów, następujące po chemicznej indukcji różnicowania z 10% szczepem rozciągającym i bez niego, pokazują, że przy samej indukcji chemicznej amplituda fluktuacji jądrowych wykazała znaczny spadek po 48 godzinach, ale nie po 24 godzinach. Z drugiej strony, indukcja chemiczna wraz z 10% odkształceniem rozciągającym wykazała znaczny spadek po 24 godzinach, który pozostał stały bez dalszej redukcji po 48 godzinach.Najważniejszą rzeczą do zapamiętania jest to, że odległość robocza wybranego obiektywu powinna być równa lub większa niż głębokość komory celi plus grubość szkiełka nakrywkowego. Podłoże można przeprojektować tak, aby zawierało siatkę, co ułatwiłoby obrazowanie tej samej komórki przed i po zastosowaniu szczepu, ponieważ zestaw danych typu przed i po zmniejsza szum wynikający z błędu eksperymentalnego. Korzystając z tej konfiguracji obrazowania, wiele zjawisk subkomórkowych w przylegających żywych komórkach, takich jak lokalizacja białek lub dynamika składników komórkowych, można zobrazować w ciągu kilku sekund od zastosowania naprężenia mechanicznego.

high-resolution-imaging-nuclear-dynamics-live-cells-under-uniaxial

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przedstawiamy dwa niezależne narzędzia oparte na mikroskopii, służące do pomiaru indukowanych odkształceń jądra i cytoszkieletu w pojedynczych, żywych komórkach przylegających w odpowiedzi na globalne lub lokalne przyłożenie naprężenia. Techniki te są wykorzystywane do określenia sztywności jądra (tj. odkształcalności) oraz do badania wewnątrzkomórkowej transmisji sił pomiędzy jądrem a cytoszkieletem.

Analizy biofizyczne służące do badania właściwości mechanicznych interfazy jądra komórkowego: aplikacja odkształcenia podłoża i manipulacja mikroiłką

Prezentujemy w tym artykule nowatorską platformę rozciągającą, która może być wykorzystana do badania reakcji pojedynczych komórek na złożone anizotropowe dwuosiowe deformacje mechaniczne i ilościowego określania właściwości mechanicznych tkanek biologicznych.

Nowatorska platforma do rozciągania do zastosowań w mechanobiologii komórek i tkanek

Nowatorski protokół obrazowania został opracowany przy użyciu niestandardowego mechanicznego siłownika napędzanego silnikiem, aby umożliwić pomiar reakcji w czasie rzeczywistym na mechaniczne naprężenia w żywych komórkach. Istotny z punktu widzenia mechanobiologii system może nanosić szczepy do 20%, umożliwiając jednocześnie obrazowanie w czasie zbliżonym do rzeczywistego za pomocą mikroskopii konfokalnej lub mikroskopii sił atomowych.

Obrazowanie żywych komórek podczas rozciągania mechanicznego

W tym protokole opisujemy metodę mikropipet, która bezpośrednio przykłada kontrolowaną siłę do jądra w żywej komórce. Test ten pozwala na zbadanie właściwości mechanicznych jądra w żywej, przylegającej komórce.

Sonda siły bezpośredniej do pomiaru integracji mechanicznej między jądrem a cytoszkieletem

Różnicowanie mięśni szkieletowych jest bardzo dynamicznym procesem, który szczególnie opiera się na pozycjonowaniu jądra. W tym miejscu opisujemy metodę śledzenia ruchów jąder za pomocą obrazowania żywych komórek podczas różnicowania mioblastów i tworzenia miotubek oraz przeprowadzania ilościowej charakterystyki dynamiki jąder poprzez ekstrakcję informacji z automatycznego śledzenia.

Wykorzystanie obrazowania na żywo do śledzenia jąder podczas różnicowania i fuzji mioblastów

Tutaj prezentujemy obrazowanie żywych komórek, które jest nietoksyczną metodą mikroskopii, która pozwala badaczom badać zachowanie białek i dynamikę jądrową w żywych komórkach drożdży rozszczepialnych podczas mitozy i mejozy.

Badanie dynamiki jądrowej drożdży rozszczepienia mitotycznego i mejotycznego za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek

Prezentowany tutaj jest protokół do obrazowania żywych komórek w nienaruszonej tkance w superrozdzielczości. Ustandaryzowaliśmy warunki obrazowania bardzo wrażliwej populacji dorosłych komórek macierzystych w ich natywnym środowisku tkankowym. Technika ta polega na zrównoważeniu rozdzielczości czasowej i przestrzennej, aby umożliwić bezpośrednią obserwację zjawisk biologicznych w żywej tkance.

Obrazowanie żywych komórek w superrozdzielczości struktur subkomórkowych

Tutaj prezentujemy protokół do badania wewnątrzkomórkowych właściwości mechanicznych izolowanych embrionalnych komórek zebrytanicznego danio pręgowanego w trójwymiarowym zamknięciu z bezpośrednim pomiarem siły przez pułapkę optyczną.

Bezpośrednie pomiary siły mechaniki subkomórkowej w zamknięciu za pomocą pęsety optycznej

Tutaj prezentujemy wszechstronne urządzenie do rozciągania równoosiowego, które jest uruchamiane pneumatycznie i kompatybilne z mikroskopią o wysokiej rozdzielczości.

Równoosiowe urządzenie rozciągające do konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek o dużym powiększeniu

Przedstawiamy tutaj nowatorskie urządzenie, które stosuje fale izotropowe i jednoosiowe odkształcenia na komórkach, wspierając hodowlę na substratach o regulowanej sztywności i konfigurowalnych macierzach białkowych. Ta prosta, ekonomiczna platforma umożliwia badaczom badanie, jak mechaniczne sygnały regulują funkcjonowanie komórek zarówno w badaniach podstawowych, jak i w kontekstach związanych z chorobą.

Nowatorska platforma do rozciągania i obrazowania komórkowego in vitro

Ten proces wykorzystuje mikroskopi konfokalną w połączeniu z fluorescencyjnie oznaczoną linią jądra i markerem chromatyny w Arabidopsis thaliana, aby jednocześnie rejestrować dynamikę jądra i chromatyny w korzeniach Arabidopsis oraz badać zmiany w tej dynamice w odpowiedzi na wskazówki rozwojowe i środowiskowe.

Ilościowa obrazowanie komórek Arabidopsis thaliana in vivo w czasie rzeczywistym w celu analizy kształtu jądra komórkowego oraz dynamiki chromatyny podczas rozwoju i stresu środowiskowego korzeni

Poznaj metodę obrazowania dynamiki jądrowej w wysokiej rozdzielczości w żywych komórkach pod wpływem jednoosiowego odkształcenia rozciągającego. Technika ta umożliwia badanie odpowiedzi komórkowych na naprężenia mechaniczne.

Obrazowanie dynamiki jądrowej w wysokiej rozdzielczości w żywych komórkach pod wpływem jednoosiowego odkształcenia rozciągającego (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie dynamiki jądrowej w wysokiej rozdzielczości w żywych komórkach pod wpływem jednoosiowego odkształcenia rozciągającego

Przeglądaj więcej filmów