Stosowanie konsekwentnych perturbacji przypominających masaż na cielętach myszy i monitorowanie wynikających z nich zmian ciśnienia śródmięśniowego
20 września 2019
Tutaj opisujemy protokoły do przykładania zdefiniowanych obciążeń mechanicznych do cieląt myszy i monitorowania towarzyszących im zmian ciśnienia domięśniowego. Opracowane przez nas systemy eksperymentalne mogą być przydatne do badania mechanizmu stojącego za korzystnym wpływem ćwiczeń fizycznych i masażu.
Nasz protokół może być przydatny w systemach i mechanizmach. A odpowiednie informacje pokazują wpływ stresu fizycznego i masażu. Nasz lokalny system cyklicznego uzupełniania jest znacznie prostszy.
Konwencjonalne metody nie są wymagane do lokalnego wstawiania. Przyłóż taśmę chirurgiczną do obustronnych kończyn tylnych w pozycji leżącej z wyprostowanymi stawami kolanowymi i zgiętymi podeszwowo stawami skokowymi. Umieść drut aluminiowy na tułowiu na poziomie kręgosłupa L4-5 i zwiń drut w konfiguracji spiralnej wokół tylnych kończyn z pięciomilimetrowymi odstępami między każdym zwojem spirali.
Aby zminimalizować możliwość ucieczki z okablowania, należy ręcznie wyregulować konfigurację przewodów, aby unieruchomić stawy biodrowe w pozycji odwodzenia pod kątem 90 stopni. Następnie umieść mysz z powrotem w klatce domowej z monitorowaniem aż do pełnego wyzdrowienia. Aby zmierzyć domięśniowe ciśnienie mięśnia brzuchatego łydki, umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej i ogol, wydepiluj i częściowo wysterylizuj skórę tylnej części łydki.
Za pomocą skalpela wykonaj dwumilimetrowe nacięcie w zdezynfekowanej skórze. I włóż igłę o rozmiarze 20 do mięśnia brzuchatego łydki pod kątem od 150 do 170 stopni do powierzchni skóry. Następnie, używając plastikowej osłonki igły jako prowadnicy, umieść czujnik telemetru ciśnienia krwi w środkowej części brzucha mięśnia brzuchatego łydki.
Owiń skórę nylonowym szwem 4-O. Następnie użyj kilku różnych cylindrycznych odważników jednostkowych, aby zastosować miejscową cylindryczną kompresję na mięsień łydki przez jedną minutę. I monitoruj ciśnienie śródmięśniowe za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy sygnałów biologicznych.
W celu miejscowego cyklicznego leczenia uciskowego odłącz znieczuloną mysz od przewodu kończyny tylnej. I ułóż zwierzę w pozycji leżącej. Wyreguluj kończyny tylne tak, aby stawy kolanowe były wyprostowane, a stawy skokowe zgięte podeszwowo z łydkami skierowanymi do góry.
I przesuwaj pionowo cylindryczną jednostkę ciężaru, pokrytą amortyzowaną podkładką, po mięśniu łydki z częstotliwością jednego herca przez 30 minut dziennie przez siedem dni. Po każdym codziennym napadzie ucisku przeprogramuj tylne kończyny myszy przed powrotem zwierzęcia do jego domowej klatki. Pod koniec eksperymentu należy wykonać depilację tylnej powierzchni łydki i wykonać nacięcie skóry, aby umożliwić oddzielenie mięśni brzuchatych łydek od kości piszczelowo-strzałkowej.
Szybko zamroź pobraną tkankę mięśniową w roztworze związku o optymalnej temperaturze cięcia. I użyj kriostatu, aby uzyskać odcinki mięśni brzuchatego łydki na szkiełkach podstawowych. W celu znakowania immunohistochemicznego rozmrozić i odwodnić skrawki poprzez suszenie na powietrzu w temperaturze pokojowej przed użyciem pisaka hydrofobowego do narysowania pierścienia wokół odcinków tkanki na każdym szkiełku.
Następnie umieść szkiełka w komorze wilgotnościowej. I dodaj 100 mikrolitrów buforu blokującego z każdej strony. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej przepłukać szkiełka dwoma 5-minutowymi płukaniami w PBS-T, a następnie oznaczyć skrawki 100 mikrolitrami podstawowego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania przez noc w temperaturze pokojowej.
Następnego ranka umyj szkiełka 3 razy w PBS-T przez 5 minut na mycie. I oznaczyć próbki odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Pod koniec inkubacji umyć szkiełka 3 razy w świeżym PBS-T, jak pokazano.
I barwić jądra 100 mikrolitrami DAPI przez trzy minuty w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie umyj szkiełko jeszcze trzy razy. I zamontuj próbki za pomocą kompatybilnego podłoża montażowego i szkiełek nakrywkowych.
W celu analizy histomorfometrycznej umieść preparaty na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego i obejrzyj próbki pod subiektywnym 20-X w odpowiednich filtrach. Następnie w oprogramowaniu do analizy obrazu zmierz pole przekroju poprzecznego każdego włókna mięśniowego i policz liczbę komórek wyrażających interesujące nas markery eksperymentalne. Pole przekroju poprzecznego mięśnia brzuchatego łydki jest znacznie zmniejszone przez unieruchomienie kończyn tylnych.
Co więcej, analiza barwienia immunofluorescencyjnego ujawnia, że komórki wyrażające MCP-1 i TNF-alfa są znacznie zwiększone w tkankach mięśniowych brzuchatego łydki unieruchomionych kończyn tylnych. Wraz ze wzrostem liczby komórek pozytywnie wybarwionych F4/80, unieruchomienie kończyn tylnych wydaje się inicjować zanik mięśni łydek, obejmujący miejscowe reakcje zapalne, w tym akumulację makrofagów. Spośród kilku różnych lokalnych cyklicznych wielkości kompresji testowanych przez zmianę masy jednostki cylindrycznej, kompresja odpowiadająca 50 mililitrom międzymięśniowych fal ciśnienia rtęci wydaje się najskuteczniej łagodzić wywołany unieruchomieniem spadek pola przekroju poprzecznego włókien mięśniowych i zwiększać akumulację makrofagów w mięśniach brzuchatych łydki.
Miejscowa cykliczna kompresja o wadze 66 gramów, stosowana z częstotliwością 1 Hz przez 30 minut dziennie przez 7 dni, znacznie łagodzi obserwowane zmniejszenie powierzchni przekroju poprzecznego mięśni brzuchatych łydki wywołane unieruchomieniem. Co więcej, miejscowa cykliczna kompresja częściowo łagodzi unieruchomienie wywołane spadkiem siły skurczu mięśni trójgłowych łydki. Ponadto lokalna cykliczna kompresja łagodzi wzrost komórek F4/80 dodatnich, TNF-alfa-dodatnich i MCP-1 one w tkance mięśniowej mięśnia brzuchatego łydki unieruchomionych kończyn tylnych.
Nasze podejście zapewni naukowe podstawy do wzrostu masy mięśniowej u pacjenta i naszą potencjalną strategię postępowania prewencyjnego. Szczur stwierdził, że brak aktywności fizycznej jest ograniczony. Korzystając z naszego systemu, zaczęliśmy oceniać większość pacjentów, u których brakuje mechaniki mięśniowej.
Umiarkowany lokalny przemysłowy sposób, aby to zrobić, sprawia, że atrofia mięśni wywołana unieruchomieniem.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W tym artykule opisano protokoły dotyczące przykładania obciążeń mechanicznych do strzałek myszy i monitorowania zmian ciśnienia wewnątrzmięśniowego. Te systemy eksperymentalne zostały zaprojektowane w celu zbadania mechanizmów leżących u podstaw korzystnych efektów aktywności fizycznej i masażu.
Kluczowe Komponenty Badania
Dział Neurologii
- Neuroscience
- Biomechanics
- Physiology
Tło
- Zrozumienie wpływu obciążeń mechanicznych na fizjologię mięśni.
- Badanie roli stresu fizycznego i masażu.
- Opracowywanie prostszych metod monitorowania ciśnienia wewnątrzmięśniowego.
- Poszerzanie wiedzy na temat korzyści płynących z ćwiczeń.
Cel Badania
- Ustalenie protokołów dotyczących przykładania obciążeń mechanicznych do strzałek myszy.
- Monitorowanie zmian ciśnienia wewnątrzmięśniowego podczas tych aplikacji.
- Zbadanie mechanizmów leżących u podstaw korzyści płynących z aktywności fizycznej i masażu.
Wykorzystane Metody
- Przykładanie obciążeń mechanicznych za pomocą taśmy chirurgicznej na kończyny tylne.
- Pozycjonowanie myszy w pozycji supinowanej z wyprostowanymi stawami kolanowymi.
- Zwinięcie drutu aluminiowego wokół kończyn tylnych w celu monitorowania ciśnienia.
- Wykorzystanie lokalnych układów cyklicznego uzupełniania dla uproszczenia.
Główne Wyniki
- Pomyślne przykładanie zdefiniowanych obciążeń mechanicznych do strzałek myszy.
- Skuteczne monitorowanie zmian ciśnienia wewnątrzmięśniowego.
- Wykażenie prostoty nowej metody w porównaniu z konwencjonalnymi technikami.
- Wgląd w wpływ stresu fizycznego i masażu na fizjologię mięśni.
Wnioski
- Opracowane protokoły mogą przyczynić się do rozwoju badań nad korzyściami płynącymi z ćwiczeń.
- Nowe metody zapewniają prostsze podejście do badania reakcji mięśni.
- Wymagane są dalsze badania, aby w pełni zrozumieć zaangażowane mechanizmy.
Najczęściej Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
Mechanical perturbation models, such as consistent massage-like compression in murine systems, enable biopharma teams to interrogate the mechanistic basis of muscle inflammation and atrophy. Quantitative monitoring of intramuscular pressure and inflammatory markers supports predictive confidence in target validation for musculoskeletal and inflammation-modulating therapeutics. This approach strengthens translational continuity from early discovery through preclinical model optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables hypothesis-driven interrogation of mechanical regulation in muscle homeostasis and inflammation.
- Supports functional target validation by linking pressure modulation to macrophage and cytokine responses.
- Facilitates biological de-risking for anti-inflammatory and muscle-preserving drug candidates.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible system for generating and measuring defined intramuscular pressure changes.
- Standardizes quantifiable outputs such as myofiber cross-sectional area and inflammatory cell counts.
- Enables assay readiness for evaluating compound effects on mechanically induced muscle atrophy and inflammation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models of immobilization-induced muscle atrophy and local inflammation.
- Supports continuity from mechanistic discovery to preclinical efficacy assessment in muscle and inflammation research.
- Improves predictive value for interventions targeting physical inactivity or rehabilitation settings.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates from early discovery through preclinical validation, supporting mechanistic de-risking and translational biomarker development in musculoskeletal and inflammation-focused pipelines.
- Discovery Biology: Quantifies the impact of mechanical stress on inflammatory pathways and muscle atrophy.
- Screening: Delivers standardized, reproducible pressure and histological readouts for compound evaluation.
- Analytics: Enables statistical comparison of pressure thresholds, cellular markers, and muscle morphology.
- Translational Research: Bridges mechanistic findings to disease-relevant preclinical models of muscle loss and inflammation.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for diverse muscle and inflammation research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic understanding of muscle inflammation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of mechanical perturbation and pressure measurement.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for anti-inflammatory and muscle-preserving therapeutic candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of programs targeting muscle atrophy and inflammation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in small animal handling, pressure measurement, and immunohistochemistry.
- Needs access to pressure sensors, telemeter systems, and fluorescence microscopy infrastructure.
- Demands cross-team standardization of compression parameters and histological analysis.
- Adaptable to other muscle groups or disease models with protocol optimization.
- Limitations include the need for further development for broader mechanistic studies as noted by the authors.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:32
Mouse Bilateral Hindlimb Immobilization
2:20
Local Cyclical Compression (LCC) Treatment
1:20
Intramuscular Mouse Gastrocnemius Muscle Pressure Measurement
5:14
Results: Representative Effects of LCC on Mouse Calf Muscle
7:01
Conclusion
3:01
Immunohistochemical Preparation and Histo-Morphometric Analysis
