Stosowanie konsekwentnych perturbacji przypominających masaż na cielętach myszy i monitorowanie wynikających z nich zmian ciśnienia śródmięśniowego

Nasz protokół może być przydatny w systemach i mechanizmach. A odpowiednie informacje pokazują wpływ stresu fizycznego i masażu. Nasz lokalny system cyklicznego uzupełniania jest znacznie prostszy.

Konwencjonalne metody nie są wymagane do lokalnego wstawiania. Przyłóż taśmę chirurgiczną do obustronnych kończyn tylnych w pozycji leżącej z wyprostowanymi stawami kolanowymi i zgiętymi podeszwowo stawami skokowymi. Umieść drut aluminiowy na tułowiu na poziomie kręgosłupa L4-5 i zwiń drut w konfiguracji spiralnej wokół tylnych kończyn z pięciomilimetrowymi odstępami między każdym zwojem spirali.

Aby zminimalizować możliwość ucieczki z okablowania, należy ręcznie wyregulować konfigurację przewodów, aby unieruchomić stawy biodrowe w pozycji odwodzenia pod kątem 90 stopni. Następnie umieść mysz z powrotem w klatce domowej z monitorowaniem aż do pełnego wyzdrowienia. Aby zmierzyć domięśniowe ciśnienie mięśnia brzuchatego łydki, umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej i ogol, wydepiluj i częściowo wysterylizuj skórę tylnej części łydki.

Za pomocą skalpela wykonaj dwumilimetrowe nacięcie w zdezynfekowanej skórze. I włóż igłę o rozmiarze 20 do mięśnia brzuchatego łydki pod kątem od 150 do 170 stopni do powierzchni skóry. Następnie, używając plastikowej osłonki igły jako prowadnicy, umieść czujnik telemetru ciśnienia krwi w środkowej części brzucha mięśnia brzuchatego łydki.

Owiń skórę nylonowym szwem 4-O. Następnie użyj kilku różnych cylindrycznych odważników jednostkowych, aby zastosować miejscową cylindryczną kompresję na mięsień łydki przez jedną minutę. I monitoruj ciśnienie śródmięśniowe za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy sygnałów biologicznych.

W celu miejscowego cyklicznego leczenia uciskowego odłącz znieczuloną mysz od przewodu kończyny tylnej. I ułóż zwierzę w pozycji leżącej. Wyreguluj kończyny tylne tak, aby stawy kolanowe były wyprostowane, a stawy skokowe zgięte podeszwowo z łydkami skierowanymi do góry.

I przesuwaj pionowo cylindryczną jednostkę ciężaru, pokrytą amortyzowaną podkładką, po mięśniu łydki z częstotliwością jednego herca przez 30 minut dziennie przez siedem dni. Po każdym codziennym napadzie ucisku przeprogramuj tylne kończyny myszy przed powrotem zwierzęcia do jego domowej klatki. Pod koniec eksperymentu należy wykonać depilację tylnej powierzchni łydki i wykonać nacięcie skóry, aby umożliwić oddzielenie mięśni brzuchatych łydek od kości piszczelowo-strzałkowej.

Szybko zamroź pobraną tkankę mięśniową w roztworze związku o optymalnej temperaturze cięcia. I użyj kriostatu, aby uzyskać odcinki mięśni brzuchatego łydki na szkiełkach podstawowych. W celu znakowania immunohistochemicznego rozmrozić i odwodnić skrawki poprzez suszenie na powietrzu w temperaturze pokojowej przed użyciem pisaka hydrofobowego do narysowania pierścienia wokół odcinków tkanki na każdym szkiełku.

Następnie umieść szkiełka w komorze wilgotnościowej. I dodaj 100 mikrolitrów buforu blokującego z każdej strony. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej przepłukać szkiełka dwoma 5-minutowymi płukaniami w PBS-T, a następnie oznaczyć skrawki 100 mikrolitrami podstawowego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania przez noc w temperaturze pokojowej.

Następnego ranka umyj szkiełka 3 razy w PBS-T przez 5 minut na mycie. I oznaczyć próbki odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Pod koniec inkubacji umyć szkiełka 3 razy w świeżym PBS-T, jak pokazano.

I barwić jądra 100 mikrolitrami DAPI przez trzy minuty w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie umyj szkiełko jeszcze trzy razy. I zamontuj próbki za pomocą kompatybilnego podłoża montażowego i szkiełek nakrywkowych.

W celu analizy histomorfometrycznej umieść preparaty na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego i obejrzyj próbki pod subiektywnym 20-X w odpowiednich filtrach. Następnie w oprogramowaniu do analizy obrazu zmierz pole przekroju poprzecznego każdego włókna mięśniowego i policz liczbę komórek wyrażających interesujące nas markery eksperymentalne. Pole przekroju poprzecznego mięśnia brzuchatego łydki jest znacznie zmniejszone przez unieruchomienie kończyn tylnych.

Co więcej, analiza barwienia immunofluorescencyjnego ujawnia, że komórki wyrażające MCP-1 i TNF-alfa są znacznie zwiększone w tkankach mięśniowych brzuchatego łydki unieruchomionych kończyn tylnych. Wraz ze wzrostem liczby komórek pozytywnie wybarwionych F4/80, unieruchomienie kończyn tylnych wydaje się inicjować zanik mięśni łydek, obejmujący miejscowe reakcje zapalne, w tym akumulację makrofagów. Spośród kilku różnych lokalnych cyklicznych wielkości kompresji testowanych przez zmianę masy jednostki cylindrycznej, kompresja odpowiadająca 50 mililitrom międzymięśniowych fal ciśnienia rtęci wydaje się najskuteczniej łagodzić wywołany unieruchomieniem spadek pola przekroju poprzecznego włókien mięśniowych i zwiększać akumulację makrofagów w mięśniach brzuchatych łydki.

Miejscowa cykliczna kompresja o wadze 66 gramów, stosowana z częstotliwością 1 Hz przez 30 minut dziennie przez 7 dni, znacznie łagodzi obserwowane zmniejszenie powierzchni przekroju poprzecznego mięśni brzuchatych łydki wywołane unieruchomieniem. Co więcej, miejscowa cykliczna kompresja częściowo łagodzi unieruchomienie wywołane spadkiem siły skurczu mięśni trójgłowych łydki. Ponadto lokalna cykliczna kompresja łagodzi wzrost komórek F4/80 dodatnich, TNF-alfa-dodatnich i MCP-1 one w tkance mięśniowej mięśnia brzuchatego łydki unieruchomionych kończyn tylnych.

Nasze podejście zapewni naukowe podstawy do wzrostu masy mięśniowej u pacjenta i naszą potencjalną strategię postępowania prewencyjnego. Szczur stwierdził, że brak aktywności fizycznej jest ograniczony. Korzystając z naszego systemu, zaczęliśmy oceniać większość pacjentów, u których brakuje mechaniki mięśniowej.

Umiarkowany lokalny przemysłowy sposób, aby to zrobić, sprawia, że atrofia mięśni wywołana unieruchomieniem.