Obrazowanie napięcia integryny i siły komórkowej w rozdzielczości submikronowej za pomocą zintegrowanego czujnika napięcia

Ten oparty na DNA integracyjny czujnik napięcia (ITS), który lokalnie przekształca sygnał siły na fluorescencję, umożliwia bezpośrednie obrazowanie siły komórkowej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. ITS charakteryzuje się wysoką rozdzielczością przestrzenną i wysoką czułością. Próg aktywacji jest regulowany, co pozwala na selektywny obraz napięcia integryny na różnych poziomach.

Po otrzymaniu dostosowanego jednoniciowego DNA lub ssDNA, będącego przedmiotem zainteresowania, w celu sprzężenia peptydu RGD z tiolowanym wygaszaczem ssDNA, najpierw dodaj 100 mikrolitrów 0,5-molowego EDTA w 400 mikrolitrach wody do około 450 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu TCEP. Następnie dodaj 10 mikrolitrów roztworu TCEP-EDTA do 20 mikrolitrów jednomilimolowego tiolowego wygaszacza DNA w PBS na 30-minutową inkubację w temperaturze pokojowej. Aby sprzęgnąć aminę RGD z sulfo-SMCC, dodaj 40 mikrolitrów świeżo przygotowanego 23-milimolowego sulfo-SMCC do 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego 11-milimolowego roztworu aminy RGD na 20-minutową inkubację w temperaturze pokojowej.

Aby sprzęgnąć RGD aminę SMCC z tiolowanym wygaszaczem ssDNA, należy wymieszać całą objętość tiolowanego roztworu wygaszającego ssDNA z całą objętością roztworu RGD aminy SMCC przez jedną godzinę inkubacji w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji przenieś roztwór do przechowywania w temperaturze czterech stopni Celsjusza na noc. Następnego ranka wymieszaj trzymolowy chlorek sodu z roztworem DNA sprzężonym z tiolem i schłodzonym, 100% etanolem o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w stosunku 1 do 10 do 25 i umieść reakcję w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na około 30 minut.

Gdy DNA się wytrąci, zebrać DNA przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w PBS w celu pomiaru stężenia DNA na spektrometrze. W celu syntezy z czujnikiem napięcia integracyjnego lub ITS należy wymieszać roztwory górnej i dolnej nici DNA w stosunku 1,1 do jednego mola i inkubować reakcję przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed umieszczeniem podwielokrotności mieszaniny w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w celu długotrwałego przechowywania. W celu unieruchomienia ITS pokryj szalkę Petriego o średnicy 29 milimetrów i szklanym dnie 200 mikrolitrami biotynylowanej albuminy surowicy bydlęcej o średnicy 0,1 miligrama na mililitr lub biotyny BSA przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Gdy biotyna BSA fizycznie zaadsorbuje się na powierzchni szkła, umyj naczynie trzykrotnie 200 mikrolitrami świeżego PBS na mycie, a następnie inkubuj z 200 mikrolitrami po 50 mikrogramów na mililitr białka awidyny przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji umyć naczynie trzykrotnie PBS, jak pokazano, i dodać 200 mikrolitrów 0,1-mikromolowego ITS na kolejną 30-minutową inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji umyć naczynie trzykrotnie PBS, pozostawiając ostatnie płukanie w naczyniu aż do posiewu komórek.

Aby zainicjować hodowlę keratocytów ryb, użyj pęsety z płaską końcówką, aby zerwać kawałek łuski z ryby i delikatnie dociśnij łuskę do studzienki niezmodyfikowanej szalki Petriego ze szklanym dnem, tak aby wewnętrzna strona skali stykała się ze szkłem. Odczekaj około 30 sekund, aż rybia łuska przylgnie do szklanej powierzchni naczynia, a następnie pokryj wagę jednym milimetrem kompletnego zmodyfikowanego podłoża Dulbecco firmy Iscove. Następnie inkubuj wagę w ciemnym i wilgotnym pudełku przez sześć do 48 godzin w temperaturze pokojowej.

Aby umieścić keratocyty na powierzchni ITS, zastąp pożywkę z naczynia do hodowli keratocytów roztworem do odłączania komórek 1X na trzyminutową inkubację w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji zastąpić odłączający roztwór świeżą, kompletną pożywką i rozdzielić komórki za pomocą delikatnego pipetowania. Następnie dostosuj komórki do odpowiedniego stężenia do posiewu i umieść je na naczyniu pokrytym ITS przez 30 minut w temperaturze pokojowej przed obrazowaniem.

W przypadku obrazowania napięcia integryny w czasie quasi-rzeczywistym w żywych komórkach, przenieś komórki do etapu mikroskopu fluorescencyjnego i wybierz obiektyw 40 lub 100 razy. W oprogramowaniu do obrazowania ustaw czas naświetlania na jedną sekundę, a interwał klatek na 20 sekund, aby uzyskać wideo z obrazów ITS. Następnie użyj odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu, aby odjąć poprzednią klatkę wideo ITS od bieżącej klatki, aby obliczyć sygnał ITS nowo wyprodukowany w ostatnim interwale klatek.

Nowo wytworzony sygnał ITS reprezentuje napięcie integryny wygenerowane w ostatnim interwale ramki, raportując w ten sposób siłę komórkową w sposób quasi-rzeczywisty. W tym przypadku mapowanie napięcia integryny pokazuje indukcję napięcia integryny na dwóch torach sił podczas migracji keratocytów. Rozdzielczość mapy sił można następnie skalibrować na 0,4 mikrometra.

Wysokie napięcie integryny koncentruje się na tylnym brzegu w ruchliwych keratocytach ryb. W komórkach nieruchliwych powstaje specyficzny wzorzec napięcia integryny, który jest zupełnie inny niż obserwowany w szybko migrujących keratocytach. Zrosty ogniskowe i napięcie integryny keratocytów ryb mogą być obrazowane razem w celu oceny związku między napięciem integryny a strukturą komórkową w komórkach będących przedmiotem zainteresowania.

Dzięki ITS siła adhezji komórek staje się widoczna z rozdzielczością i czułością porównywalną z obrazowaniem strukturalnym komórek. Technika ta toruje drogę do badania wzajemnego oddziaływania siła-struktura w komórkach.