Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych organoidów jelitowych pochodzących z komórek macierzystych do badania i modyfikowania ochrony komórek nabłonka przed salmonellą i innymi patogenami

Protokół ten demonstruje przydatność układu organoidów jelitowych pochodzących z komórek macierzystych do modelowania inwazji nabłonka przez patogeny jelitowe i modyfikacji tego procesu za pomocą cytokin. Mikroiniekcja umożliwia dostarczenie patogenu będącego przedmiotem zainteresowania bezpośrednio do jamy świetlnej organoidu, co pozwala na dokładniejsze odtworzenie procesu infekcji in vivo. Metoda ta może być stosowana do badania różnych patogenów jelitowych lub alternatywnych cytokin będących przedmiotem zainteresowania.

Sugerowałbym wykonanie próbnej procedury z użyciem czerwieni fenolowej tylko w celu opanowania techniki mikroiniekcji przed użyciem patogenów. Drugiego dnia rozpocznij różnicowanie od zmiany pożywki na 10 mililitrów pożywki do hodowli komórek macierzystych, uzupełnionej czynnikami wzrostu. Szóstego dnia zmień pożywkę na 10 mililitrów pożywki RPMI-B27, uzupełnionej sześcioma CHIR99021 mikromolowymi oraz trzema mikromolowymi kwasami retinowymi, aby rozpocząć modelowanie tylnej części endodermy do jelita tylnego.

W 10 dniu różnicowania osadź jelito tylne w macierzy błony podstawnej. Najpierw usuń pożywkę z płytki jelita tylnego i raz umyj płytkę DPPS bez wapnia i magnezu. Dodaj pięć mililitrów roztworu kolagenazy na płytkę i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Następnie dezaktywuj kolagenazę, dodając do płytki pięć mililitrów pożywki wzrostowej na bazie organoidów. Komórki jelita tylnego powinny w tym momencie unosić się w powietrzu. Zbierz zawiesinę tylnego jelita w 15-mililitrowej stożkowej tubce.

Następnie odwirować w temperaturze 240 razy G przez jedną minutę. Po odwirowaniu odpipetować supernatant, dodać 10 mililitrów pożywki wzrostowej na bazie organoidów, rozbić jelito tylne na mniejsze kawałki przez delikatne pipetowanie i ponownie odwirować przy 95-krotności G przez jedną minutę. Dwukrotnie umyj komórki w pożywce wzrostowej na bazie organoidów.

Ponownie zawiesić komórki w 300 do 500 mikrolitrach podstawowej pożywki wzrostowej i dodać około 100 mikrolitrów tego roztworu do 1,5 mililitra matrycy błony podstawnej. Ustaw 24-dołkową płytkę na podgrzewaczu płytkowym w temperaturze 37 stopni Celsjusza. i znajdź 60 mikrolitrów mieszaniny macierzy komórek jelita tylnego w jednym dołku 24-dołkowej płytki.

Pozwól mu na chwilę zastygnąć i sprawdź gęstość pod mikroskopem. Po wykryciu reszty matrycy na 24-dołkowej płytce, inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie dodaj 800 mikrolitrów podstawowej pożywki wzrostowej zawierającej czynniki wzrostu do każdego dołka 24-dołkowej płytki.

Aby przejść organoidy, najpierw usuń z nich pożywkę i zastąp ją 500 mikrolitrami na studzienkę roztworu do podnoszenia komórek. Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 40 do 50 minut, po czym organoidy powinny unosić się w roztworze. Delikatnie odpipetować organoidy i roztwór do podnoszenia komórek do 15-mililitrowych stożkowych probówek, starając się nie rozbijać organoidów.

Po pozostawieniu organoidów na osiadanie przez trzy do pięciu minut, usuń supernatant i pojedyncze komórki. Ponownie zawiesić organoidy w pięciu mililitrach podstawowej pożywki wzrostowej i delikatnie je odpipetować do umycia. Wirować w temperaturze 95 razy G przez dwie minuty.

Następnie umieść 24-dołkową płytkę na podgrzewaczu płytkowym w temperaturze 37 stopni Celsjusza w kapturze i usuń supernatant z osadu organoidowego. Następnie, za pomocą pipety P1000, ponownie zawieś organoidy w 300 do 500 mikrolitrach podstawowej pożywki wzrostowej, aby rozbić organoidy na mniejsze kawałki. Umieścić około 100 mikrolitrów organoidów w 1,5 mililitra macierzy błony podstawnej i krótko odpipetować do wymieszania.

Umieść 60 mikrolitrów matrycy membrany podstawnej w jednym dołku 24-dołkowej płytki. Po pozostawieniu do zestalenia się na 30 sekund sprawdź gęstość pod mikroskopem. Po umieszczeniu reszty matrycy na 24-dołkowej płytce, umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut, a następnie pokryj ją 800 mikrolitrami podstawowej pożywki wzrostowej z czynnikami wzrostu zgodnie z manuskryptem.

W przypadku testów mikroiniekcji z rekombinowaną ludzką stymulacją wstępną IL-22, należy dodać rekombinowaną ludzką IL-22 do pożywki hodowlanej do końcowego stężenia 100 nanogramów na mililitr 18 godzin przed wstrzyknięciem. Załadować naczynie do mikroiniekcji zawierające organoidy na stolik mikroskopu, zdjąć pokrywkę i ustawić ostrość organoidów, przygotowując je do rozpoczęcia wstrzykiwania. Włącz wtryskiwacz i stacje sterujące ramienia.

Upewnij się, że wtryskiwacz jest ustawiony na ciśnienie 600 kilopaskali i czas wtrysku wynosi 0.5 sekundy. Jeśli nie jest jeszcze odsunięty od stolika mikroskopu, obróć ramię iniekcyjne, aby upewnić się, że tak jest, i zdejmij jego głowicę uchwytu. Załaduj końcówkę wiertła 10 mikrolitrami inokulum, delikatnie chwytając końcówkę wiertła za jej koniec.

Umieść końcówkę wiertła w głowicy uchwytu i ponownie przymocuj ją do ramienia mikroiniekcyjnego. Delikatnie przesuń ramię do pozycji, w której igła znajduje się od jednego do dwóch centymetrów nad naczyniem do mikroiniekcji. Użyj elementu sterującego ramienia, aby ustawić końcówkę igły na środku naczynia i opuść ją, aż znajdzie się tuż nad powierzchnią podłoża.

Zaprogramować stację sterowania ramieniem tak, aby po wszystkich wstrzyknięciach ponownie ustawiła igłę w tym punkcie. Skoncentruj mikroskop na organoidach i wybierz cel do wstrzyknięcia. Umieścić igłę tuż nad i po prawej stronie organoidu, który ma zostać wstrzyknięty, a następnie przesunąć igłę w dół i na boki do światła organoidu.

Naciśnij przycisk wstrzykiwania na mikrowstrzykiwaczu, aby mieszanina bakterii zabarwionych fenolem wydostała się z igły. I wstrzyknij każdy organoid trzy razy. Po wstrzyknięciu wszystkich wymaganych organoidów należy zdjąć płytkę do mikroiniekcji ze stolika, założyć pokrywkę i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 90 minut.

Po inkubacji odessać pożywkę wzrostową i zastąpić ją trzema mililitrami roztworu do podnoszenia komórek. Następnie inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 45 minut. Następnie delikatnie przenieś organoidy i roztwór do podnoszenia komórek do 15-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej pięć mililitrów DPBS.

Wirować w temperaturze 370 razy G przez trzy minuty. Usunąć supernatant i dodać jeden mililitr podstawowej pożywki wzrostowej zawierającej 0,1 miligrama na mililitr gentamycyny. Następnie, za pomocą P1000, pipetuj w górę iw dół około 50 razy, aby rozbić organoidy.

Dodaj cztery mililitry więcej pożywki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, aby zabić bakterie zewnątrzkomórkowe. Następnie odwirować organoidy w temperaturze 370 razy G przez trzy minuty. Odessać supernatant, pozostawiając jak najmniej.

Jednokrotnie umyć organoidy DPBS i ponownie odwirować. Dodaj 500 mikrolitrów buforu do lizy i pipetuj w górę iw dół około 50 razy, aby ręcznie oddzielić organoidy jelitowe człowieka. Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez pięć minut, szeregowo rozcieńczyć otrzymany roztwór dziesięciokrotnie w DPBS.

Odpipetować trzy 20-mikronowe kropelki czystych i rozcieńczonych roztworów na wstępnie podgrzane płytki agarowe LB. Na koniec wysiaduj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc i przystąp do liczenia kolonii. Organoidy jelitowe człowieka poddano mikroiniekcjom roztworu bakterii czerwieni fenolowej.

Zachowanie tego czerwonego koloru przez organoidy zapobiega podwójnym wstrzyknięciom. Wstępne traktowanie ludzkich organoidów jelitowych pochodzących z linii komórkowej COF-2 rekombinowaną ludzką IL-22 ogranicza inwazję S. typhimurium SL1344 do komórek nabłonka jelitowego. Zainfekowane organoidy poddano obróbce w celu barwienia immunologicznego lub transmisyjnej mikroskopii elektronowej, aby ułatwić wizualizację interakcji bakteryjnych IEC gospodarza.

RNA można wyekstrahować z wstrzykniętych organoidów, aby przyjrzeć się odpowiedzi transkryptomicznej na infekcję. Mikroskopia fluorescencyjna i elektronowa mogą być również wykorzystywane do bardziej szczegółowej obserwacji interakcji patogenów gospodarza. Najważniejszą rzeczą do zapamiętania jest upewnienie się, że masz wystarczająco dużo praktyki na mikrowtryskiwaczu, aby móc szybko i skutecznie wykonać zastrzyki w celu uzyskania spójnych wyników.

Końcówki wierteł do mikroiniekcji mają drobny, ostry czubek i należy zachować ostrożność podczas ich załadunku i rozładunku z mikrowtryskiwacza. Technika ta pozwala na badanie interakcji patogenów komórek nabłonkowych z wcześniej nieosiągalnymi szczegółami. Ten model infekcji będzie szczególnie przydatny dla osób badających patogeny specyficzne dla człowieka.