Name: Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych organoidów jelitowych pochodzących z komórek macierzystych do badania i modyfikowania ochrony komórek nabłonka przed salmonellą i innymi patogenami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Poznaj metodę mikroinjekcji patogenów do ludzkich organoidów jelitowych pochodzących z hiPSC. Technika ta umożliwia szczegółowe badanie inwazji nabłonka jelitowego przez Salmonella Typhimurium i modyfikację odpowiedzi za pomocą cytokin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusze z The Wellcome Trust, The Gates Foundation i Cambridge Biomedical Research Centre. E.A.L. jest doktorantem klinicznym wspieranym przez Wellcome Trust.

1. Hodowla i pasażowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych
UWAGA: Wszystkie opisane tutaj metody wykorzystują komercyjnie dostępne ludzkie linie komórkowe. Wszystkie prace związane z hodowlą tkankową opisane poniżej powinny być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym klasy II. iPSC są rutynowo utrzymywane w pożywce do hodowli komórek macierzystych (patrz tabela materiałów), zgodnie z instrukcjami producenta, co pozwala na hodowlę iPSC bez weekendów. Komórki iPSC można stosunkowo łatwo zaadaptować z innych systemów hodowli iPSC.
<ol>
	<li>Przejdź przez komórki, gdy kolonie pokryją około 80%–90% powierzchni płytki.</li>
	<li>Przygotować płytki do przejścia 1 godzinę przed użyciem, dodając witronektynę 10 μg/ml rozcieńczoną w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej Dulbecco (DPBS; bez wapnia [Ca] i magnezu [Mg]) do płytek poddanych działaniu kultur tkankowych. Objętości do powlekania zależą od rozmiaru płyty i można je znaleźć w instrukcjach producenta. W tym czasie należy podgrzać pożywkę do hodowli komórek macierzystych do temperatury pokojowej (RT).</li>
	<li>Usunąć pożywkę z iPSC gotową do przejścia i przemyć komórki 2x DPBS (bez Ca lub Mg).</li>
	<li>Dodaj roztwór EDTA (patrz tabela materiałów) do płytek, upewniając się, że cała powierzchnia jest pokryta i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5–8 minut. Kiedy w środku kolonii iPSC zaczną pojawiać się, odessać i wyrzucić roztwór EDTA.</li>
	<li>Dodać pożywkę do hodowli komórek macierzystych do studzienek; usunąć iPSC, delikatnie myjąc kilkakrotnie pożywkę na powierzchni płytki. Komórki iPS są pasażowane w postaci grudek, a nie pojedynczych komórek, dlatego należy upewnić się, że roztwór EDTA nie jest pozostawiony zbyt długo. Przenieś wszystkie przemieszczone iPSC do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odessać witronektynę z wstępnie pokrytych płytek i zastąpić ją pożywką do hodowli komórek macierzystych. Odwróć zawiesinę iPSC kilka razy, aby upewnić się, że iPSC nie osiadły na dnie stożkowej probówki, i dodaj odpowiednią objętość zawiesiny, aby uzyskać rozcieńczenie komórek w stosunku 1:10 na nowej płytce. Współczynniki podziału można dostosować w zależności od tempa wzrostu iPSC, które może się różnić w zależności od linii iPSC.</li>
	<li>Kołysz płytką, aby rozproszyć iPSC na powierzchni i umieść ją w inkubatorze w temperaturze 37 °C/5% CO2 . Nakarm iPSC następnego dnia po pasażu.</li>
</ol>
2. Różnicowanie od iPSC do Hindgut
<ol>
	<li>W dniu 0 rozdzielić iPSC na 10-centymetrowym naczyniu poddanym hodowli tkankowej, wstępnie pokrytej witronektyną, jak opisano w kroku 1.2, na 10 ml pożywki do hodowli komórek macierzystych uzupełnionej aktywiną A (10 ng/ml) + podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF; 12 ng/ml). Dodaj czynniki wzrostu do pożywki bezpośrednio przed użyciem; Zrób to we wszystkich kolejnych krokach.</li>
	<li>W dniu 1 należy zmienić pożywkę (10 ml pożywki do hodowli komórek macierzystych z aktywiną A [10 ng/ml] + bFGF [12 ng/ml]).</li>
	<li>W dniu 2 należy rozpocząć różnicowanie od zmiany pożywki na 10 ml pożywki do hodowli komórek macierzystych uzupełnionej następującymi czynnikami wzrostu: aktywiną A (100 ng/mL), bFGF (100 ng/ml), białkiem morfogenetycznym kości 4 (BMP-4; 10 ng/ml), inhibitorem 3-kinazy fosfoinozytolu LY294002 (10 μM) i inhibitorem GSK3 CHIR99021 (3 μM).</li>
	<li>W dniu 3 zmień pożywkę na 10 ml pożywki do hodowli komórek macierzystych uzupełnionej aktywiną A (100 ng/ml), bFGF (100 ng/ml), BMP-4 (10 ng/ml) i LY294002 (10 μM). Specyfikacja endodermy wywołana przez tę pożywkę powinna skutkować widocznymi zmianami w morfologii kolonii iPSC w ciągu najbliższych 24 godzin.</li>
	<li>W dniu 4 zmień pożywkę na 10 ml pożywki RPMI/B27 uzupełnionej aktywiną A (100 ng/ml) i bFGF (100 ng/ml). 
	nuta: Pożywka RPMI/B27 zawiera 500 ml pożywki RPMI z suplementem L-glutaminy (patrz Tabela 1), 10 ml suplementu B27 (50x, bez surowicy) i 5 ml aminokwasów endogennych. Opcjonalnie: dodać 5 ml penicyliny-streptomycyny (10 000 U/ml). Filtruj - sterylizuj przed użyciem.</li>
	<li>W dniu 5 zmień pożywkę na 10 ml pożywki RPMI/B-27 uzupełnionej aktywiną A (50 ng/ml).</li>
	<li>W 6 dniu, aby rozpocząć modelowanie endodermy tylnej do jelita tylnego, zmień pożywkę na 10 ml pożywki RPMI/B27 uzupełnionej CHIR99021 (6 μM) + kwas retinowy (3 μM).</li>
	<li>W dniach 7, 8 i 9 powtórz krok 2.7. Podczas tych kroków powinny stać się widoczne struktury 3D jelita tylnego, pokrywające powierzchnię płytki.</li>
	<li>W dniu 10 osadź powstałe jelito tylne w macierzy błony podstawnej (patrz Tabela materiałów).</li>
</ol>
3. Osadzenie jelita tylnego w matrycy błony podstawnej
<ol>
	<li>Uzupełnić podłoże wzrostowe na bazie iHO (500 ml zaawansowanej pożywki Eagle's zmodyfikowanej Dulbecco [DMEM]/F12, 10 ml suplementu B27 [50x, bez surowicy], 5 ml suplementu N2 [100x, bez surowicy], 5 ml 1 M kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) i 5 ml aminokwasów endogennych [100x]. Opcjonalnie: dodać 5 ml penicyliny-streptomycyny [10 000 j./ml]; Filtruj - sterylizuj przed użyciem. Patrz Tabela 1).</li>
	<li>Usuń pożywkę z płytki tylnego jelita grubego i umyj płytkę 1x DPBS (bez Ca lub Mg). Dodać 5 ml roztworu kolagenazy do płytki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
	<ol>
		<li>Wyprodukuj roztwór kolagenazy, dodając 500 mg proszku kolagenazy dożylnej do 400 ml zaawansowanego DMEM/F12. Następnie dodać 100 ml substytutu surowicy (patrz Tabela materiałów), 5 ml L-glutaminy (200 mM) i 3,5 μl 2-merkaptoetanolu i zawirować roztwór do wymieszania. Przefiltrować i wysterylizować roztwór, gdy proszek kolagenazy całkowicie się rozpuści. 
		nuta: Można go przechowywać w temperaturze -20 °C do 6 miesięcy w mniejszych porcjach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dezaktywuj kolagenazę, dodając 5 ml pożywki wzrostowej iHO do płytki i zeskrob komórki jelita tylnego za pomocą skrobaka do komórek, zbierając zawiesinę jelita tylnego w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Wirować przy 240 x g przez 1 minutę i odpipetować z supernatantu.</li>
	<li>Dodać 10 ml pożywki, delikatnie pipetując jelito grube na mniejsze kawałki i ponownie odwirować przy 95 x g przez 1 minutę.</li>
	<li>Umyj komórki 2x w pożywce wzrostowej na bazie iHO, powtarzając krok 3.5. Ponownie zawiesić komórki w małej objętości zasadowej pożywki wzrostowej (~300–500 μl) i dodać około 100 μl tego roztworu do 1,5 ml macierzy błony podstawnej. W tym czasie matryca musi pozostać na lodzie, ponieważ zacznie szybko krzepnąć w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieścić 24-dołkową płytkę na podgrzewaczu płytkowym w temperaturze 37 °C i pobrać 60 μl do jednego dołka z płytki 24-dołkowej. Pozwól mu na chwilę zastygnąć i sprawdź gęstość pod mikroskopem.
	<ol>
		<li>W razie potrzeby stopniowo dodawać więcej roztworu jelita grubego do matrycy błony podstawnej, aż do osiągnięcia pożądanego stężenia, i umieścić roztwór w pozostałych studzienkach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut, następnie dodać 800 μl pożywki wzrostowej zasady iHO zawierającej czynniki wzrostu do każdej studzienki płytki 24-dołkowej w następujących stężeniach (patrz tabela 1): 500 ng/ml R-spondyny-1, 100 ng/ml Noggin, 100 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), 3 μM CHIR99021, 2,5 μM prostaglandyny E2, i 10 μM Y-27632 dichlorowodorek jednowodny (inhibitor ROCK).</li>
	<li>Zmieniaj podstawową pożywkę wzrostową iHO co 2-3 dni lub natychmiast, jeśli pożywka zacznie się odbarwiać. Po wstępnym wysiewie do macierzy błony podstawnej, pozwól iHo rozwijać się przez 7 dni przed ich rozszczepieniem. W dniach 3–4 w kulturze powinny być widoczne wyraźne sfery.
	<ol>
		<li>W przypadku samej zmiany podłoża należy pominąć Y-27632, ponieważ jest to wymagane tylko podczas dzielenia/wysiewu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Konserwacja i przejście iHO
<ol>
	<li>Aby umożliwić stopniowe rozmrażanie, należy umieścić wymaganą objętość matrycy błony podstawnej w zakrytym pojemniku na lód w temperaturze 4 °C na noc, 24 godziny przed rozszczepieniem.</li>
	<li>Usuń pożywkę z iHO i zastąp ją 500 μl roztworu do podnoszenia komórek (patrz Tabela materiałów) na studzienkę. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 40–50 minut, po czym iHO powinny unosić się w roztworze.
	<ol>
		<li>Opcjonalnie: użyj systemu obrazowania w masce, aby wybrać tylko iHO o pożądanej morfologii (patrz Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Delikatnie odpipetować zawiesinę roztworu iHO/cell do stożkowych probówek o pojemności 15 ml, starając się nie rozbijać iHO. Pozwól IHO osiąść na 3–5 minut i usuń supernatant i pojedyncze komórki.</li>
	<li>Ponownie zawiesić iHO w 5 ml pożywki wzrostowej na bazie iHO i delikatnie je odpipetować do umycia. Wirować przy 95 x g przez 2 min.</li>
	<li>Umieścić 24-dołkową płytkę na podgrzewaczu płytkowym w temperaturze 37 °C wewnątrz okapu.</li>
	<li>Usuń supernatant i ponownie zawieś iHO w ~300–500 μl podstawowej pożywki wzrostowej, używając pipety P1000, aby rozbić iHO na mniejsze kawałki. Należy pamiętać, że siła, którą należy przyłożyć, będzie się różnić w zależności od linii iHO i stanu dojrzewania, więc zacznij delikatnie, zwiększając siłę, jeśli jest to wymagane.</li>
	<li>Umieścić ~100 μl iHO (objętość zależy od gęstości roztworu) w 1,5 ml macierzy membrany podstawnej i krótko odpipetować do wymieszania.</li>
	<li>Umieścić 1 x 60 μl matrycy membrany podstawnej w jednym dołku płytki 24-dołkowej, pozostawić do zestalenia się na ~30 s, a następnie sprawdzić gęstość pod mikroskopem. Jeśli gęstość jest zbyt niska, dodaj więcej iHO do macierzy.</li>
	<li>Powtarzaj krok 4.8, aż uzyskasz prawidłową gęstość, a następnie umieść resztę matrycy na 24-dołkowej płytce.</li>
	<li>Umieścić go w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 10 minut, a następnie nałożyć na niego 800 μl podstawowej pożywki wzrostowej z czynnikami wzrostu, jak opisano w kroku 3.7.</li>
	<li>Aby przygotować iHO do eksperymentu z testem inwazji (opisanego poniżej), należy przejść iHO 4-5 dni przed eksperymentem, jak opisano w krokach 4.1-4.10, ale umieścić 120 μl roztworu iHO matrycy wygenerowanego w kroku 4.7 w 5-milimetrowych naczyniach do mikroiniekcji ze szklanym dnem.
	<ol>
		<li>Zamiast pozostawiać zawiesinę iHO w kropelce, jak w przypadku rutynowego pasażowania, rozprowadź kroplę na dnie naczynia, aby utworzyć cienką warstwę matrycy. Przykryj go 2,5 ml podstawowego podłoża wzrostowego plus czynniki wzrostu. 
		nuta: Jeśli w pożywce hodowlanej zastosowano antybiotyki, należy je usunąć i zastąpić pożywką uzupełnioną antybiotykami do eksperymentów z mikroiniekcjami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Prestymulacja iHO za pomocą rhIL-22
<ol>
	<li>Odessać pożywkę z iHo i zastąpić ją świeżą zasadową pożywką wzrostową (która nie może zawierać antybiotyków) 18 godzin przed testem inwazji.</li>
	<li>Dodać rhIL-22 do pożywek hodowlanych do końcowego stężenia 100 ng/ml.</li>
</ol>
6. Mikroiniekcja iHO i testy inwazji wewnątrzkomórkowej
<ol>
	<li>W dniu poprzedzającym eksperyment ustaw S. Hoduje się Typhimurium SL1344 w 10 ml bulionu Luria-Bertani i inkubuje w temperaturze 37 °C przez noc, wstrząsając.</li>
	<li>W dniu eksperymentu, jeżeli dostępny jest mikroskop z zamkniętą komorą grzewczą, należy go włączyć i pozwolić, aby temperatura osiągnęła 37 °C przed rozpoczęciem testu.</li>
	<li>Rozcieńczyć nocne kultury bakteryjne w DPBS (zawierającym Ca i Mg) do gęstości optycznej 2 przy 600 nm (OD600), a następnie wymieszać 1:1 z czerwienią fenolową.</li>
	<li>Załadować naczynie do mikroiniekcji zawierające iHo na stolik mikroskopu, zdjąć pokrywę i ustawić ostrość iHO, gotowe do rozpoczęcia wstrzykiwania.</li>
	<li>Włącz inżektor i stacje sterujące ramienia. Upewnij się, że wtryskiwacz jest ustawiony na ciśnienie 600 kPa i czas wtrysku 0.5 s. Jeśli nie jest jeszcze odsunięty od stolika mikroskopu, obróć ramię iniekcyjne, aby upewnić się, że tak jest.</li>
	<li>Ustawić końcówkę wiertła do mikroiniekcji 6 μm, zdejmując opakowanie i plastikowy cylinder z igły. Zdjąć głowicę uchwytu z ramienia iniekcyjnego.</li>
	<li>Załaduj końcówkę wiertła 10 μl inokulum, delikatnie chwytając końcówkę wiertła za jej koniec. Umieść końcówkę wiertła w głowicy uchwytu i ponownie przymocuj ją do ramienia do mikroiniekcji.</li>
	<li>Delikatnie przesunąć ramię na miejsce, tak aby igła znajdowała się 1–2 cm nad naczyniem do mikroiniekcji. Użyj elementu sterującego ramienia, aby ustawić końcówkę igły na środku naczynia i opuść ją, aż znajdzie się tuż nad powierzchnią podłoża.
	<ol>
		<li>Zaprogramuj stację sterowania ramienia tak, aby po wszystkich wstrzyknięciach ponownie ustawiła igłę w tym punkcie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw ostrość mikroskop na iHO i wybierz cel do wstrzyknięcia. Umieścić igłę tuż nad i po prawej stronie iHO, który ma zostać wstrzyknięty, a następnie przesunąć igłę w dół i na boki do światła iHO.</li>
	<li>Nacisnąć przycisk wstrzykiwania na mikrowstrzykiwaczu; z igły wyłoni się mieszanina bakteryjna zabarwiona fenolem. Wstrzyknąć każdy iHO 3x. Wstrzyknij co najmniej 30 iHo na warunek. 
	nuta: Ze względu na niejednorodność wielkości i struktury iHO w kulturze, konieczne jest wstrzyknięcie dużej liczby iHO w celu kontrolowania zmienności.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu wszystkich wymaganych iHo należy zdjąć płytkę do mikroiniekcji ze stolika, założyć pokrywkę i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 90 minut.</li>
	<li>Po 90 minutach odessać pożywkę wzrostową i zastąpić ją 3 ml roztworu do podnoszenia komórek; inkubować w temperaturze 4 °C przez 45 minut.</li>
	<li>Delikatnie przenieś roztwór iHO/do podnoszenia komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml DPBS. Upewnij się, że wszystkie wstrzyknięte iHO zostały usunięte z płytki (w razie potrzeby przepłukać płytkę 1 ml DPBS). Wirować przy 370 x g przez 3 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić iHO w pożywce wzrostowej zawierającej gentamycynę w dawce 0,1 mg/ml (dodać 1 ml pożywki; następnie użyć pipety P1000 ~50x, aby rozbić iHO, i dodać 4 ml dalszej pożywki).</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w celu zabicia bakterii zewnątrzkomórkowych.</li>
	<li>Odwirować iHo przy 370 x g przez 3 minuty i odessać supernatant, pozostawiając jak najmniej. Umyj iHO 1x za pomocą DPBS i ponownie odwiruj. 
	nuta: Ten krok usuwa gentamycynę, co jest ważne, ponieważ pozostała gentamycyna może zabijać bakterie wewnątrzkomórkowe po lizie komórek.</li>
	<li>Zawiesić iHO w 500 μl buforu do lizy (patrz Tabela Materiałów) i ręcznie oddzielić organoidy przez pipetowanie ~50x. Pozostawić tę mieszaninę na 5 minut w temperaturze suchej masy.</li>
	<li>Otrzymany roztwór należy rozcieńczyć seryjnie 10-krotnie w DPBS, aby uzyskać stężenia 10-1, 10-2 i 10-3. Odpipetować 3 x 20 μl kropelki czystych i rozcieńczonych roztworów na wstępnie podgrzane płytki agarowe LB.</li>
	<li>Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i przeprowadzić liczenie kolonii oraz obliczenie jednostek tworzących kolonie (CFU). Liczba kolonii będzie odzwierciedlać liczbę bakterii wewnątrzkomórkowych, które zostały uwolnione podczas procesu lizy komórek.</li>
</ol>
7. Zamrażanie i odzyskiwanie komórek
UWAGA: Jak wspomniano wcześniej, możliwe jest kriogeniczne przechowywanie iHO i rekonstytuowanie ich w razie potrzeby. Procesy zamrażania i rozmrażania opisano poniżej.
<ol>
	<li>Wybierz studzienki iHO, które chcesz zamrozić. Dodać roztwór do podnoszenia komórek do studzienek i inkubować przez 40–50 minut w temperaturze 4 °C. IHO powinny unosić się w roztworze.</li>
	<li>Delikatnie odpipetuj iHO do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i pozwól im się uspokoić. Usuń pożywkę i umyj iHO 1x bazową pożywką wzrostową (bez czynników wzrostu).</li>
	<li>Wirować przy 95 x g przez 2 minuty, usunąć supernatant i zastąpić go odpowiednią objętością pożywki do zamrażania komórek (patrz Tabela Materiałów; użyć pożywki zgodnie z instrukcjami producenta), dekantując iHO do fiolek kriogenicznych.
	<ol>
		<li>Przechowywać fiolki w zamrażarce w temperaturze -80 °C przez noc, aby umożliwić bardziej stopniowe zamrażanie; następnie przenieść je do magazynu ciekłego azotu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu rozpuszczenia iHO należy szybko rozmrozić fiolkę kriogeniczną w temperaturze 37 °C przy użyciu kąpieli wodno-perełkowej, a następnie delikatnie odpipetować jej zawartość do 10 ml bazowej pożywki wzrostowej (bez czynników wzrostu). Poczekaj, aż iHO osiądą i zastąp pożywkę ~300 μl świeżej pożywki wzrostowej na bazie.
	<ol>
		<li>NIE należy ręcznie rozdzielać operacji iHO. Dodaj iHO do matrycy błony podstawnej i umieść je w płytkach zgodnie z opisem w sekcji 3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%28%2Bve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li>
<li>Huch, M., Boj, S. F., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%28%2B%29+liver+stem+cells%2C+hepatic+organoids+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lgr5(+) liver stem cells, hepatic organoids and regenerative medicine.</a> Regenerative Medicine. 8 (4), 385-387 (2013).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Mariani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+cortical+development+in+vitro+using+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12770-12775 (2012).</li>
<li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> eLife. 4, (2015).</li>
<li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li>
<li>Matano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+colorectal+cancer+using+CRISPR-Cas9-mediated+engineering+of+human+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modeling colorectal cancer using CRISPR-Cas9-mediated engineering of human intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 21 (3), 256-262 (2015).</li>
<li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+cholangiocytes+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 33 (8), 853-861 (2015).</li>
<li>Leha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-content+platform+to+characterise+human+induced+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A high-content platform to characterise human induced pluripotent stem cell lines.</a> Methods. 96, 85-96 (2016).</li>
<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+cancer+mutations+in+cultured+human+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells.</a> Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).</li>
<li>Schreiber, F., Arasteh, J. M., Lawley, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen+Resistance+Mediated+by+IL-22+Signaling+at+the+Epithelial-Microbiota+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Pathogen Resistance Mediated by IL-22 Signaling at the Epithelial-Microbiota Interface.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3676-3682 (2015).</li>
<li>Sabat, R., Ouyang, W., Wolk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+opportunities+of+the+IL-22-IL-22R1+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Therapeutic opportunities of the IL-22-IL-22R1 system.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (1), 21-38 (2014).</li>
<li>Kotenko, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+functional+interleukin-22+%28IL-22%29+receptor+complex%3A+the+IL-10R2+chain+%28IL-10Rbeta+%29+is+a+common+chain+of+both+the+IL-10+and+IL-22+%28IL-10-related+T+cell-derived+inducible+factor%2C+IL-TIF%29+receptor+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of the functional interleukin-22 (IL-22) receptor complex: the IL-10R2 chain (IL-10Rbeta ) is a common chain of both the IL-10 and IL-22 (IL-10-related T cell-derived inducible factor, IL-TIF) receptor complexes.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2725-2732 (2001).</li>
<li>Forbester, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-22+promotes+phagolysosomal+fusion+to+induce+protection+against+Salmonella+enterica+Typhimurium+in+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Interleukin-22 promotes phagolysosomal fusion to induce protection against Salmonella enterica Typhimurium in human epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10118-10123 (2018).</li>
<li>Nozaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+with+intestinal+epithelial+organoids+allows+efficient+expansion+and+motility+analysis+of+intraepithelial+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Co-culture with intestinal epithelial organoids allows efficient expansion and motility analysis of intraepithelial lymphocytes.</a> Journal of Gastroenterology. 51 (3), 206-213 (2016).</li>
<li>Dijkstra, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Tumor-Reactive+T+Cells+by+Co-culture+of+Peripheral+Blood+Lymphocytes+and+Tumor+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids.</a> Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).</li>
<li>Schlaermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+human+gastric+primary+cell+culture+system+for+modelling+Helicobacter+pylori+infection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro.</a> Gut. 65 (2), 202-213 (2016).</li>
<li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li>
<li>Saxena, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Intestinal+Enteroids%3A+a+New+Model+To+Study+Human+Rotavirus+Infection%2C+Host+Restriction%2C+and+Pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology.</a> Journal of Virology. 90 (1), 43-56 (2016).</li>
<li>Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids+model+human+responses+to+infection+by+commensal+and+Shiga+toxin+producing+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and Shiga toxin producing Escherichia coli.</a> PLOS ONE. 12 (6), e0178966(2017).</li>
<li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+Cryptosporidium+infection+in+human+small+intestinal+and+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids.</a> Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).</li>
<li>Garcez, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+impairs+growth+in+human+neurospheres+and+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids.</a> Science. 352 (6287), 816-818 (2016).</li>
<li>Forbester, J. L., Hannan, N., Vallier, L., Dougan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Intestinal+Organoids+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Use+as+an+Infection+System%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Derivation of Intestinal Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells for Use as an Infection System.</a> Methods in Molecular Biology. , (2016).</li>
<li>Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+intestinal+organoid+model+of+non-invasive+enteric+pathogen-epithelial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions.</a> Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten przedstawia różnicowanie hiPSC na iHO i ich użyteczność jako modelu, w którym symuluje się infekcje jelitowe. Poniżej przedstawiamy krytyczne kroki w protokole oraz wszelkie modyfikacje lub ulepszenia, które wprowadziliśmy.
Protokół ten usprawnia proces różnicowania hiPSC w porównaniu z wcześniej opublikowanymi pracami25. Poprzednio stosowane metody wymagały przeniesienia hiPSC z innych systemów hodowli hiPSC (np. hodowli hiPSC zależnej od zasilania) do chemicznie zdefiniowanego medium – alkoholu poliwinylowego (CDM-PVA). To przeniesienie do CDM-PVA trwa zwykle 2-3 tygodnie i wymaga codziennego podawania hiPSC. Protokół ten również nie był konsekwentnie skuteczny, a niektóre zróżnicowania zawiodły; w związku z tym przeprowadziliśmy próbę różnicowania przy użyciu tych samych czynników wzrostu, ale zaczynając od hiPSC hodowanych w pożywce do hodowli komórek macierzystych (a nie CDM-PVA) i zastąpieniu CDM-PVA pożywką do hodowli komórek macierzystych w dniach różnicowania 0-3. Udało się to w przypadku pięciu niezależnych linii hiPSC, które zostały dotychczas przetestowane, dzięki czemu proces różnicowania jest znacznie szybszy i wydajniejszy. Pozwala to również na hodowlę hiPSC bez weekendów przed różnicowaniem, co pozwala na większą elastyczność w hodowli hiPSC. Linie iHO wytworzone tą metodą zostały fenotypowane pod kątem markerów nabłonka jelitowego, jak opisaliśmy wcześniej dla linii hiPSC Kolf2, Yemz1 i Lise116 i wydają się fenotypowo nie do odróżnienia od iHO wytworzonych przy użyciu poprzedniego protokołu.
Po wysianiu iHO wymagają co najmniej 1 miesiąca rutynowego pasażowania, z rozłupywaniem co 4–7 dni, aby ułatwić dojrzewanie. Należy zauważyć, że wystąpią pewne różnice w rozwoju iHO w zależności od użytej linii iPSC i gęstości początkowej hodowli. Podczas pierwszych kilku pasaży pojawią się widocznie zanieczyszczające komórki, które nie są iHO. W końcu umrą, pozostawiając czystą kulturę sferycznych i, po około 4 tygodniach, pączkujących iHO. Ponadto system obrazowania w masce może być używany do wybierania i przechodzenia tylko iHO o pożądanej morfologii. W miarę dojrzewania iHo będą wymagały dzielenia co 6–7 dni, w zależności od tempa wzrostu i gęstości. Jeśli wystąpi którakolwiek z poniższych sytuacji, iHo należy podzielić przed tym punktem: wnęki świetlne iHO zaczynają wypełniać się martwymi komórkami, macierz błony podstawnej zaczyna się rozpadać, iHO zaczynają wyrastać z macierzy błony podstawnej lub kultura jest zbyt gęsta i pożywka zaczyna bardzo szybko żółknąć.
Po ustaleniu hodowli iHO, jeśli w dowolnym momencie wygląd iHO zmieni się lub będzie inny niż oczekiwano (na przykład kultury pozostają kuliste, a nie pączkują), fenotypowanie za pomocą immunohistochemii i qPCR dla markerów komórkowych należy powtórzyć, aby zapewnić różnicowanie typów komórek w obrębie iHO (np. komórki kubkowe, Komórki Panetha) pozostaje nienaruszona. Jeśli iHO już się nie różnicują, należy je wyrzucić i ponownie zróżnicować lub wcześniejsze przejście iHO powinno zostać rozmrożone i ponownie odtworzone. Jeśli iHo przestają się różnicować, potencjalnymi przyczynami są wiek kultury (jeśli ma ponad 6 miesięcy), aktywność czynników wzrostu (upewnij się, że są one odtwarzane zgodnie z instrukcjami producenta i przechowywane w stanie zamrożonym w małych porcjach, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania), zbyt częste lub gwałtowne pasaże (ogólnie, Pasażowanie powinno odbywać się tylko raz w tygodniu, a jeśli iHO będą ręcznie rozdzielane zbyt energicznie w regularnych odstępach czasu, przestaną się w pełni różnicować).
Ustaliliśmy za pomocą sekwencjonowania RNA, że stymulacja IL-22 na 18 godzin przed infekcją zwiększa poziom genów przeciwdrobnoustrojowych i tych zaangażowanych w fenotyp obrony barierowej. Przed zastosowaniem nowego iHsO do testów obejmujących prestymulację rhIL-22 (lub alternatywną cytokiną, jeśli system jest do tego wykorzystywany), wskazane jest sprawdzenie aktywności genów, o których wiadomo, że są regulowane w górę przez cytokinę (w przypadku IL-22 zastosowaliśmy DUOX2 i LCN2) za pomocą qPCR po stymulacji iHOs, w celu zapewnienia ekspresji receptora i nienaruszonej sygnalizacji. Przed pierwszym zastosowaniem IL-22 przeprowadziliśmy również immunohistochemię w celu zlokalizowania receptora IL-22 na iHO, aby ustalić, że ekspresja receptora IL-22 była podstawowa, co oznacza, że prestymulację można osiągnąć po prostu przez dodanie rhIL-22 do pożywki hodowlanej iHO. Jeśli jednak receptor jest wyrażany wierzchołkowo, może być konieczne dostosowanie tego protokołu do wierzchołkowego dostarczania ligandów.
Pułapki związane z systemem mikroiniekcji są na ogół związane z delikatnością igieł wymaganych do wstrzyknięcia. W tym przypadku stosujemy dostępne na rynku końcówki wiertarskie o naświcie 6 μm. Możliwe jest wyciąganie igieł iniekcyjnych ze szklanych naczyń włosowatych26 , chociaż może to być mniej jednolite, co prowadzi do wycieków z końcówki igły lub wstrzykiwania niespójnych objętości do iHO. Ważne jest, aby mieć pewność, że wstrzyknięcie zostało wykonane do światła iHO, co jest jednym z powodów stosowania czerwieni fenolowej jako barwnika; iHo będą widocznie rozszerzać się i utrzymywać czerwone inokulum, co pozwoli mieć pewność, które iHO zostały wstrzyknięte. Czasami igły zatykają się zanieczyszczeniami ze ściany iHO; w takim przypadku należy wyjąć końcówkę igły z wnętrza iHO i nacisnąć przycisk CLEAN na systemie mikroiniekcji. Spowoduje to krótki okres wyższego ciśnienia powietrza, który powinien usunąć blokadę. Spowoduje to również pewien wyciek inokulum bakteryjnego na płytkę; Dlatego, jeśli tak się stanie, czyste działanie należy powtórzyć na wszystkich płytkach, aby zapewnić równość inokulum bakteryjnego na płytce. Jedną z dużych zalet iHO pochodzących z hiPSC jest ich rozmiar. Organoidy jelitowe myszy i pierwotne organoidy ludzkie są znacznie mniejsze (mierzą odpowiednio do ~100 μm i 100–300 μm,27, w porównaniu z 250–1500 μm dla iHo pochodzących z hiPSC), co oznacza, że wstrzykiwanie dużych ilości organoidów będzie wolniejsze. Pozwala to na testowanie eksperymentów iniekcyjnych na większą skalę w iHO pochodzących z hiPSC. Możliwe jest również badanie zawartości światła w iHo poprzez zbieranie ich po infekcji i ręczne dysocjowanie iHO do DPBS, uwalniając ich zawartość luminalną. Do mikroiniekcji zalecamy stosowanie wysokiego stężenia bakterii. Stwierdziliśmy, że niższe stężenia nie były wystarczające do wygenerowania odpowiedzi ze strony IEC składających się z iHO. Ponadto trudno było później zlokalizować zinternalizowane bakterie za pomocą mikroskopii. Inokulum może wymagać optymalizacji dla różnych szczepów bakterii.
Podsumowując, iHO pochodzące z hiPSC stanowią obiecujący model do bezpośredniego analizowania odpowiedzi nabłonka na infekcje jelitowe, czy to poprzez badanie liczby inwazji wewnątrzkomórkowych, obrazowanie, pomiar poziomu cytokin w supernatantach iHO, czy też zbieranie RNA w celu zbadania zmian transkrypcji po ekspozycji na patogeny. Ich przydatność będzie jeszcze bardziej widoczna w przyszłości w tworzeniu modeli infekcji dla patogenów ograniczonych do stosowania u ludzi oraz w wykorzystywaniu możliwości wykorzystania tej technologii do personalizacji badań poprzez badanie określonych mutacji genetycznych związanych z chorobą i odpowiedzi na leki.

W ostatnich latach badania interakcji gospodarz-patogen zostały wzbogacone o rozwój modeli 'organoidowych', w których trójwymiarowe reprezentacje nabłonka jelitowego mogą być wytwarzane z różnych progenitorów. 'Pierwotne' organoidy mogą być generowane bezpośrednio z jelitowych komórek macierzystych pobranych z biopsji jelitowych. Ponadto organoidy jelitowe mogą być generowane z hiPSC. To samo można powiedzieć o wielu tkankach, z gastric1, liver2, pancreatic3,4, brain5,6, lung7 i prostata8 organoidów używanych przez wielu badaczy do modelowania chorób. Istnieje wiele ekscytujących zastosowań systemu organoidowego, w tym modelowanie raka9 i badania przesiewowe leków10, ale tutaj skupiamy się na wykorzystaniu iHO jako modelu infekcji, przy użyciu S. enterica serowar Typhimurium (S. Typhimurium) jako przykładowy patogen i wstępne leczenie IL-22 jako terapia.
W tym badaniu, hiPSC używane do generowania iHO to iPSC 'Kolf2', generowane od zdrowej osoby i dostępne w Human Induced Pluripotent Stem Cells Initiative Consortium (HipSci; www.hipsci.org), ogólnodostępnym panelu referencyjnym charakteryzujących linie hiPSC11. Jedną z zalet stosowania hiPSC jako komórek progenitorowych organoidów jest to, że obecnie dostępne są obszerne banki zdrowych linii iPSC dawców, co oznacza, że wyniki można walidować w wielu liniach komórkowych o różnym pochodzeniu genetycznym. Ponadto, jeśli naukowcy chcą przyjrzeć się specyficznym polimorfizmom pojedynczego nukleotydu (SNP) związanym z chorobą, możliwe jest użycie CRISPR/Cas9 do inżynierii mutacji w zdrowej linii komórkowej, wytwarzając w ten sposób zarówno zmutowaną linię, jak i zachowując izogeniczną linię kontrolną dla porównania12. Z naszego doświadczenia wynika, że organoidy jelitowe pochodzące z hiPSC są większe niż ich pierwotne odpowiedniki i bardziej spójne w hodowli, co sprawia, że mikroiniekcja jest mniej trudna technicznie i potencjalnie pozwala na badanie bardziej zróżnicowanego zakresu patogenów. iHO mogą być konserwowane kriogenicznie, a my rozmnażamy kultury iHO przez okres do roku, aby wyprodukować materiał do eksperymentów.
In vivo, IEC odgrywają kluczową rolę w regulacji homeostazy jelit i mogą bezpośrednio hamować patogeny, chociaż mechanizmy, dzięki którym to się dzieje, nie są dobrze poznane. Wiadomo, że cytokina IL-22 odgrywa rolę w utrzymaniu bariery nabłonkowej jelit13 i bierze udział w indukcji i wydzielaniu peptydów i chemokin przeciwdrobnoustrojowych w odpowiedzi na infekcję14. Jest wytwarzany przez aktywowane limfocyty T (w szczególności komórki Th17), a także przez komórki NK (natural killer) i wiąże się z receptorem heterodimerycznym złożonym z podjednostek IL-22R1 i IL-10R215. Receptor dla IL-22 ulega ekspresji zasadniczo na IEC, co oznacza, że w modelu iHO możliwe jest wstępne traktowanie organoidów rhIL-22 po prostu przez dodanie go do pożywki hodowlanej16. Jedną z wad układu organoidowego jest to, że brakuje mu powiązanej odpowiedzi immunologicznej zwykle dostarczanej przez inne typy komórek odpornościowych; Pojawiają się jednak modele, które próbują połączyć organoidy z limfocytami jelitowymi, aby lepiej to przedstawić<klasa SUP = "xref">17,< klasa SUP = "xref">18.
Użycie systemu mikroiniekcji jest kluczowe dla symulacji infekcji w modelu iHO, ponieważ pozwala to na bezpośrednie dostarczanie patogenów na wierzchołkową powierzchnię nabłonka, co miałoby miejsce w przypadku infekcji in vivo. Dodanie czerwieni fenolowej do roztworu bakteryjnego wstrzykniętego do iHO oznacza te, które zostały zainfekowane, unikając w ten sposób wielokrotnych wstrzyknięć tego samego iHO. Organoidy jako naczynia do modelowania infekcji stają się coraz częściej używane, z patogenami takimi jak Helicobacter pylori,19 Norovirus,20 Rotavirus,21 Escherichia coli22, Cryptosporidium23 oraz wirus Zika24 wykazano, że są one w stanie przetrwać i replikować się w tych systemach. Technologia ta może być stosowana do szerszego zakresu patogenów, w szczególności do organizmów trudnych do hodowli, takich jak pierwotniaki lub patogeny ograniczone do ludzi, w celu uzyskania bezpośrednich informacji na temat reakcji ludzkiego nabłonka na zakażenie.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>5 mm szklane naczynia iniekcyjne z dnem</td><td>MatTek corporation</td><td>P50G-0-14-F</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 647 falloidyna</td><td>Life Technologies</td><td>A22287</td><td>Stosować w stężeniu 1:1,000</td></tr><tr><td>B27 suplement bez surowicy</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Stężenie wyjściowe 50x, stężenie końcowe 1x</td></tr><tr><td>BMP-4 rekombinowane białko ludzkie</td><td>R& D</td><td>PHC9534</td><td>Stężenie zapasów 10 &mu; g/mL, stężenie końcowe 10 ng/mL</td></tr><tr><td>Roztwór do odzyskiwania komórek (roztwór do liftingu komórek)</td><td>BD</td><td>354253</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>ab120890-5mg</td><td>Stężenie zapasowe 3 mM, stężenie końcowe 3 i mikro; M</td></tr><tr><td>Kolagenaza, proszek typu IV</td><td>Life Technologies</td><td>17104019</td><td>Rekonstytucja w 0,1%</td></tr> <tr><td>Fiolki kriogeniczne Corning</td><td>430487</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Costar TC traktowane 24-dołkowe płytki hodowlane</td><td>Corning</td><td>CLS3527</td><td></td></tr><tr><td>DAPI dilactate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564-10MG</td><td>Stosować przy stężeniu 10 nM</td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS (No MgCl2 lub CaCl2)</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS (z MgCl2 i CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu</td><td>R& D</td><td>236-EG-200</td><td>Stężenie zapasów 100 &mu; g/ml, stężenie końcowe 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Eppendorf TransferMan NK2 (system mikroiniekcji)</td><td>Eppendorf</td><td>920000011</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtojet express&nbsp; (system mikroiniekcji)</td><td>Eppendorf</td><td>5248 000.017</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw pożywki Essential 8 Flex (pożywka do hodowli komórek macierzystych)</td> <td>System</td><td></td> obrazowania Life Technologies A2858501 <td></td></tr><tr><td>EVOS XL (system obrazowania w kapturze)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Gentamycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1272-10ML</td><td>Stężenie podstawowe 10 mg / ml, stężenie końcowe 0,1 mg / ml</td></tr><tr><td>Kozia anty-Salmonella, CSA-1</td><td>Insight Biotechnology</td><td>02-91-99</td><td>Stosować w stężeniu 1:20</td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Life Technologies</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement (zamiennik setrum)</td><td>Suplement Gibco</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (suplement glutaminy</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>A2916801</td><td>Stężenie magazynowe 200 mM, stężenie końcowe 2 mM</td></tr><tr><td>LY294002</td><td>Promega UK</td><td>V1201</td><td>Stężenie magazynowe 50 mM, stężenie końcowe 10&mu; M</td></tr><tr><td>Matrigel, GFR, bez fenolu (matryca błony podstawnej)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminokwasy endogenne&nbsp; roztwór (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>Suplement bez surowicy N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td>Stężenie wyjściowe 100x, stężenie końcowe 1x</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15140163</td><td>Stężenie magazynowe 10 000 U/ml, stężenie końcowe 100 U/ml</td></tr><tr><td>Czerwień fenolowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Mysz z końcówką piezoelektryczną ICSI, kąt końcówki 25&stopni, 6 i mikro; m średnica wewnętrzna</td><td>Eppendorf</td><td>5195000087</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandyna E2</td><td>Sigma</td><td>P0409-1MG</td><td>Stężenie podstawowe 2,5 mM, stężenie końcowe 2,5 mM</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki FGF zasadowy</td><td>R& D</td><td>233-FB-025</td><td>Stężenie zapasów 100 &mu; g/mL, stężenie końcowe 100 ng/mL</td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka IL-22</td><td>R& D</td><td>6057-NG-100</td><td>Stężenie zapasów 100 &mu; g/mL, stężenie końcowe 100 ng/mL</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki Noggin</td><td>R& D</td><td>6057-NG-100</td><td>Stężenie zapasów 100 &mu; g/ml, stężenie końcowe 100 ng/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka R-spondyna1</td><td>R& D</td><td>4645-RS-025</td><td>Stężenie podstawowe 25 mg / ml, stężenie końcowe 500 ng / ml</td></tr><tr><td>Rekombinowana aktywina A u człowieka / myszy / szczura</td> R<td>& D</td><td>338-AC-050</td><td>Stężenie zapasów 100 &mu; g/mL, stężenie końcowe 100 ng/mL</td></tr><tr><td>Odzysk pożywki do zamrażania kultur komórkowych (pożywka do zamrażania komórek)</td><td>Gibco</td><td>12648010</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>R2625-50MG</td><td>Stężenie zapasów 3 i mu; M, stężenie końcowe 3 mM</td></tr><tr><td>Pożywka RPMI 1640 z suplementem Glutamax (Pożywka RPMI z suplementem L-glutaminy)</td><td>Life Technologies</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 (bufor do lizy komórek)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES9690T-A101X</td><td>Stosować w stężeniu 1%</td></tr><tr><td>Versene (roztwór EDTA)</td><td>Life Technologies</td><td>15040066</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin XF</td><td>Stemcell Technologies&nbsp;</td><td>7180</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dichlorowodorek jednowodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-1MG</td><td>Stężenie podstawowe 3 mM, stężenie końcowe 10 mM</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych organoidów jelitowych pochodzących z komórek macierzystych do badania i modyfikowania ochrony komórek nabłonka przed salmonellą i innymi patogenami

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

System 'organoidowy' jelitowy (iHO), w którym struktury 3-D reprezentatywne dla nabłonkowej wyściółki ludzkiego jelita mogą być wytwarzane z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) i utrzymywane w hodowli, stanowi ekscytującą okazję do ułatwienia modelowania odpowiedzi nabłonkowej na infekcje jelitowe. In vivo komórki nabłonka jelitowego (IEC) odgrywają kluczową rolę w regulacji homeostazy jelitowej i mogą bezpośrednio hamować patogeny, chociaż mechanizmy, za pomocą których to zachodzi, nie są w pełni wyjaśnione. Wykazano, że cytokina interleukina-22 (IL-22) odgrywa rolę w utrzymaniu i obronie bariery nabłonka jelitowego, w tym indukowaniu uwalniania peptydów przeciwdrobnoustrojowych i chemokin w odpowiedzi na infekcję.
Opisujemy różnicowanie zdrowych kontrolnych hiPSC na iHO poprzez dodanie specyficznych kombinacji cytokin do ich pożywki hodowlanej przed osadzeniem ich w systemie hodowli opartej na macierzy błony podstawnej. Po osadzeniu iHo są hodowane w pożywkach uzupełnionych Nogginem, R-spondyną-1, naskórkowym czynnikiem wzrostu (EGF), CHIR99021, prostaglandyną E2 i monohydratem dichlorowodorku Y-27632. Cotygodniowe przejścia przez ręczne zakłócanie ultrastruktury iHO prowadzą do powstawania pączkujących iHO, przy czym niektóre wykazują strukturę krypty/kosmków. Wszystkie iHO wykazują zróżnicowany nabłonek składający się z komórek kubkowych, komórek enteroendokrynnych, komórek Panetha i spolaryzowanych enterocytów, co można potwierdzić za pomocą barwienia immunologicznego dla określonych markerów każdego podzbioru komórek, transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) i ilościowego PCR (qPCR). Aby modelować zakażenie, serowar Salmonella enterica Typhimurium SL1344 jest mikrowstrzykiwany do światła iHo i inkubowany przez 90 minut w temperaturze 37 °C, a następnie przeprowadza się zmodyfikowany test ochrony gentamycyny w celu określenia poziomów wewnątrzkomórkowej inwazji bakterii. Niektóre iHo są również wstępnie leczone rekombinowaną ludzką IL-22 (rhIL-22) przed zakażeniem, aby ustalić, czy ta cytokina chroni przed zakażeniem Salmonellą.

Po rozpoczęciu procesu różnicowania komórki powinny przejść przez etap formowania definitywnej endodermy, a następnie wzorca jelita tylnego, przed osadzeniem w macierzy błony podstawnej. Powstaną sferoidy, a kultury zawierające duże ilości zanieczyszczeń oczyszczą się w ciągu kilku tygodni w miarę dojrzewania iHOs. Przykładowe obrazy procesu różnicowania, osadzania i pasażowania przedstawiono na Rysunku 1.
Konfiguracja systemu mikroiniekcji została przedstawiona na Rysunku 2. iHO są mikroiniekcyjne roztworem czerwieni fenolowej z bakteriami i zachowują czerwony kolor, co umożliwia identyfikację zainfekowanych iHO w celu zapobieżenia powtórnym iniekcjom. Liczenie wysianych bakterii wewnątrzkomórkowych przeprowadza się zgodnie z zmodyfikowanym testem ochrony gentamycyną; prestymulacja rhIL-22 ogranicza infekcję S. Typhimurium, co objawia się mniejszą liczbą zaobserwowanych bakterii wewnątrzkomórkowych po zastosowaniu rhIL-22 (Rysunek 3). Rutynowo poddajemy zainfekowane iHO również barwieniu immunocytochemicznemu lub TEM, aby ułatwić wizualizację interakcji bakterii z komórkami IEC gospodarza (Rysunek 4).
<img alt="Proces różnicowania komórek macierzystych; obrazy mikroskopowe; etapy hodowli komórkowej; rozwój z iPSC do iHO." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59478/59478fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Kierowane różnicowanie iPSC do iHO. Reprezentatywna sekwencja różnicowania z iPSC do iHO, prezentująca obserwowane zmiany morfologiczne oraz czynniki wzrostu niezbędne do wywołania tych zmian. Definitywna endoderma powstaje w 4. dniu różnicowania, po ekspozycji na specyficzne stężenia kombinacji activin A, FGF, BMP-4, LY294002 oraz CHIR99021. Po 8 dniach wzorowanie tej definitywnej endodermy przy użyciu specyficznych stężenia CHIR99021 i kwasu retinowego prowadzi do powstania jelita tylnego. Po osadzeniu obserwuje się tworzenie się sferoidów. Po długotrwałym pasażowaniu z użyciem wspomagającej macierzy błony podstawnej pokrytej pożywką uzupełnioną o prointestinalne czynniki proliferacyjne R-spondin 1, Noggin, EGF, CHIR99021 i prostaglandynę E2, sferoidy przekształcają się w pączkujące iHO. (Obrazy wykonano przy powiększeniu 4x–10x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59478/59478fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ mikroskopii fluorescencyjnej z systemem mikroiniekcji i obserwacją zainfekowanego organoidu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59478/59478fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Mikroiniekcja iHO z S. Typhimurium. (A) System mikroiniekcji (patrz Tabela Materiałów) umieszczony w komorze środowiskowej; umożliwia to iniekcję iHO w kontrolowanym środowisku (37 °C/5% CO2). (B) Inokulum bakteryjne jest wprowadzane bezpośrednio do światła iHO za pomocą mikrokapilary przymocowanej do systemu mikroiniekcji. (C) Dzięki zmieszaniu inokulów bakteryjnych z czerwienią fenolową wyraźnie widać, które iHO zostały zainfekowane, co pozwala uniknąć powtórnych iniekcji do tego samego iHO. Obrazy wykonano przy 10-krotnym powiększeniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59478/59478fig2v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres słupkowy liczby CFU/mL bakterii przedstawiający porównanie SL1344 i SL1344+IL22; zaznaczono istotność statystyczną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59478/59478fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Wstępna obróbka iHO pochodzących z linii komórkowej Kolf2 przy użyciu rhIL-22 ogranicza inwazję S. Typhimurium SL1344 do komórek nabłonka jelitowego. W testach z ochroną gentamycyną iHO traktowano 100 ng/mL rhIL-22 na 18 h przed infekcją lub pozostawiano nieleczone, a następnie inkubowano przez 90 min po infekcji. Dane przedstawiają średnie z trzech powtórzeń technicznych dla trzech powtórzeń biologicznych ± SEM. Do badania istotności zastosowano testy U Manna-Whitneya; ****p &lt; 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59478/59478fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej i mikrograf elektronowy ukazujące struktury komórkowe oraz obecność bakterii." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59478/59478fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Interakcja IEC z S. Typhimurium SL1344. Panele te przedstawiają iHO po wstrzyknięciu S. Typhimurium SL1344 i inkubacji przez 3 h, przed utrwaleniem i przygotowaniem do (A) immunofluorescencji lub (B) transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Na panelu A widoczne są bakterie w świetle iHO wchodzące w interakcje z nabłonkiem. Jądra komórkowe zabarwiono 4′,6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI) dilaktatem (niebieski), błony komórkowe faloidyną (czerwony), a bakterie CSA-1 (zielony). Obrazy wykonano przy 20-krotnym powiększeniu. Panel B przedstawia trzy różne wewnątrzkomórkowe szlaki przetwarzania Salmonella po inwazji; bakterie widoczne są (a) w wakuoli zawierającej Salmonella, (b) wolno w cytoplazmie oraz (c) podlegające autofagii. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59478/59478fig4v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>pożywka RPMI/B27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Komponent:</td>
			<td>Ilość:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pożywka RPMI 1640 z dodatkiem glutaminy</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suplement bezsurowiczy B27 50x</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>podstawowe podłoże wzrostowe iHO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Komponent:</td>
			<td>Ilość:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dodatek bezzserwatkowy B27 50x</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suplement N2 bezsurowiczy 100x</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamina 200 mM</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czynniki wzrostu do podstawowego medium wzrostowego iHO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Komponent:</td>
			<td>Ilość:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rekombinowana ludzka R-spondyna 1</td>
			<td>500 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rekombinowany ludzki Noggin</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermalny czynnik wzrostu (EGF)</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandyna E2</td>
			<td>2.5 µM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>3 µM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dichlorowodorek monohydrat</td>
			<td>10 µM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Składy pożywek.

Organoidy jelitowe pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) oferują ekscytujące możliwości modelowania chorób jelitowych in vitro. Wykazano różnicowanie hiPSC w organoidy jelitowe (iHO), stymulację tych iHO cytokinami oraz mikroiniekcję Salmonella Typhimurium do światła iHO, umożliwiając badanie inwazji nabłonka przez ten patogen.

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych organoidów jelitowych pochodzących z komórek macierzystych do badania i modyfikowania ochrony komórek nabłonka przed salmonellą i innymi patogenami

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Protokół ten demonstruje przydatność układu organoidów jelitowych pochodzących z komórek macierzystych do modelowania inwazji nabłonka przez patogeny jelitowe i modyfikacji tego procesu za pomocą cytokin. Mikroiniekcja umożliwia dostarczenie patogenu będącego przedmiotem zainteresowania bezpośrednio do jamy świetlnej organoidu, co pozwala na dokładniejsze odtworzenie procesu infekcji in vivo. Metoda ta może być stosowana do badania różnych patogenów jelitowych lub alternatywnych cytokin będących przedmiotem zainteresowania.Sugerowałbym wykonanie próbnej procedury z użyciem czerwieni fenolowej tylko w celu opanowania techniki mikroiniekcji przed użyciem patogenów. Drugiego dnia rozpocznij różnicowanie od zmiany pożywki na 10 mililitrów pożywki do hodowli komórek macierzystych, uzupełnionej czynnikami wzrostu. Szóstego dnia zmień pożywkę na 10 mililitrów pożywki RPMI-B27, uzupełnionej sześcioma CHIR99021 mikromolowymi oraz trzema mikromolowymi kwasami retinowymi, aby rozpocząć modelowanie tylnej części endodermy do jelita tylnego.W 10 dniu różnicowania osadź jelito tylne w macierzy błony podstawnej. Najpierw usuń pożywkę z płytki jelita tylnego i raz umyj płytkę DPPS bez wapnia i magnezu. Dodaj pięć mililitrów roztworu kolagenazy na płytkę i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.Następnie dezaktywuj kolagenazę, dodając do płytki pięć mililitrów pożywki wzrostowej na bazie organoidów. Komórki jelita tylnego powinny w tym momencie unosić się w powietrzu. Zbierz zawiesinę tylnego jelita w 15-mililitrowej stożkowej tubce.Następnie odwirować w temperaturze 240 razy G przez jedną minutę. Po odwirowaniu odpipetować supernatant, dodać 10 mililitrów pożywki wzrostowej na bazie organoidów, rozbić jelito tylne na mniejsze kawałki przez delikatne pipetowanie i ponownie odwirować przy 95-krotności G przez jedną minutę. Dwukrotnie umyj komórki w pożywce wzrostowej na bazie organoidów.Ponownie zawiesić komórki w 300 do 500 mikrolitrach podstawowej pożywki wzrostowej i dodać około 100 mikrolitrów tego roztworu do 1,5 mililitra matrycy błony podstawnej. Ustaw 24-dołkową płytkę na podgrzewaczu płytkowym w temperaturze 37 stopni Celsjusza. i znajdź 60 mikrolitrów mieszaniny macierzy komórek jelita tylnego w jednym dołku 24-dołkowej płytki.Pozwól mu na chwilę zastygnąć i sprawdź gęstość pod mikroskopem. Po wykryciu reszty matrycy na 24-dołkowej płytce, inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie dodaj 800 mikrolitrów podstawowej pożywki wzrostowej zawierającej czynniki wzrostu do każdego dołka 24-dołkowej płytki.Aby przejść organoidy, najpierw usuń z nich pożywkę i zastąp ją 500 mikrolitrami na studzienkę roztworu do podnoszenia komórek. Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 40 do 50 minut, po czym organoidy powinny unosić się w roztworze. Delikatnie odpipetować organoidy i roztwór do podnoszenia komórek do 15-mililitrowych stożkowych probówek, starając się nie rozbijać organoidów.Po pozostawieniu organoidów na osiadanie przez trzy do pięciu minut, usuń supernatant i pojedyncze komórki. Ponownie zawiesić organoidy w pięciu mililitrach podstawowej pożywki wzrostowej i delikatnie je odpipetować do umycia. Wirować w temperaturze 95 razy G przez dwie minuty.Następnie umieść 24-dołkową płytkę na podgrzewaczu płytkowym w temperaturze 37 stopni Celsjusza w kapturze i usuń supernatant z osadu organoidowego. Następnie, za pomocą pipety P1000, ponownie zawieś organoidy w 300 do 500 mikrolitrach podstawowej pożywki wzrostowej, aby rozbić organoidy na mniejsze kawałki. Umieścić około 100 mikrolitrów organoidów w 1,5 mililitra macierzy błony podstawnej i krótko odpipetować do wymieszania.Umieść 60 mikrolitrów matrycy membrany podstawnej w jednym dołku 24-dołkowej płytki. Po pozostawieniu do zestalenia się na 30 sekund sprawdź gęstość pod mikroskopem. Po umieszczeniu reszty matrycy na 24-dołkowej płytce, umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut, a następnie pokryj ją 800 mikrolitrami podstawowej pożywki wzrostowej z czynnikami wzrostu zgodnie z manuskryptem.W przypadku testów mikroiniekcji z rekombinowaną ludzką stymulacją wstępną IL-22, należy dodać rekombinowaną ludzką IL-22 do pożywki hodowlanej do końcowego stężenia 100 nanogramów na mililitr 18 godzin przed wstrzyknięciem. Załadować naczynie do mikroiniekcji zawierające organoidy na stolik mikroskopu, zdjąć pokrywkę i ustawić ostrość organoidów, przygotowując je do rozpoczęcia wstrzykiwania. Włącz wtryskiwacz i stacje sterujące ramienia.Upewnij się, że wtryskiwacz jest ustawiony na ciśnienie 600 kilopaskali i czas wtrysku wynosi 0.5 sekundy. Jeśli nie jest jeszcze odsunięty od stolika mikroskopu, obróć ramię iniekcyjne, aby upewnić się, że tak jest, i zdejmij jego głowicę uchwytu. Załaduj końcówkę wiertła 10 mikrolitrami inokulum, delikatnie chwytając końcówkę wiertła za jej koniec.Umieść końcówkę wiertła w głowicy uchwytu i ponownie przymocuj ją do ramienia mikroiniekcyjnego. Delikatnie przesuń ramię do pozycji, w której igła znajduje się od jednego do dwóch centymetrów nad naczyniem do mikroiniekcji. Użyj elementu sterującego ramienia, aby ustawić końcówkę igły na środku naczynia i opuść ją, aż znajdzie się tuż nad powierzchnią podłoża.Zaprogramować stację sterowania ramieniem tak, aby po wszystkich wstrzyknięciach ponownie ustawiła igłę w tym punkcie. Skoncentruj mikroskop na organoidach i wybierz cel do wstrzyknięcia. Umieścić igłę tuż nad i po prawej stronie organoidu, który ma zostać wstrzyknięty, a następnie przesunąć igłę w dół i na boki do światła organoidu.Naciśnij przycisk wstrzykiwania na mikrowstrzykiwaczu, aby mieszanina bakterii zabarwionych fenolem wydostała się z igły. I wstrzyknij każdy organoid trzy razy. Po wstrzyknięciu wszystkich wymaganych organoidów należy zdjąć płytkę do mikroiniekcji ze stolika, założyć pokrywkę i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 90 minut.Po inkubacji odessać pożywkę wzrostową i zastąpić ją trzema mililitrami roztworu do podnoszenia komórek. Następnie inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 45 minut. Następnie delikatnie przenieś organoidy i roztwór do podnoszenia komórek do 15-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej pięć mililitrów DPBS.Wirować w temperaturze 370 razy G przez trzy minuty. Usunąć supernatant i dodać jeden mililitr podstawowej pożywki wzrostowej zawierającej 0,1 miligrama na mililitr gentamycyny. Następnie, za pomocą P1000, pipetuj w górę iw dół około 50 razy, aby rozbić organoidy.Dodaj cztery mililitry więcej pożywki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, aby zabić bakterie zewnątrzkomórkowe. Następnie odwirować organoidy w temperaturze 370 razy G przez trzy minuty. Odessać supernatant, pozostawiając jak najmniej.Jednokrotnie umyć organoidy DPBS i ponownie odwirować. Dodaj 500 mikrolitrów buforu do lizy i pipetuj w górę iw dół około 50 razy, aby ręcznie oddzielić organoidy jelitowe człowieka. Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez pięć minut, szeregowo rozcieńczyć otrzymany roztwór dziesięciokrotnie w DPBS.Odpipetować trzy 20-mikronowe kropelki czystych i rozcieńczonych roztworów na wstępnie podgrzane płytki agarowe LB. Na koniec wysiaduj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc i przystąp do liczenia kolonii. Organoidy jelitowe człowieka poddano mikroiniekcjom roztworu bakterii czerwieni fenolowej.Zachowanie tego czerwonego koloru przez organoidy zapobiega podwójnym wstrzyknięciom. Wstępne traktowanie ludzkich organoidów jelitowych pochodzących z linii komórkowej COF-2 rekombinowaną ludzką IL-22 ogranicza inwazję S. typhimurium SL1344 do komórek nabłonka jelitowego. Zainfekowane organoidy poddano obróbce w celu barwienia immunologicznego lub transmisyjnej mikroskopii elektronowej, aby ułatwić wizualizację interakcji bakteryjnych IEC gospodarza.RNA można wyekstrahować z wstrzykniętych organoidów, aby przyjrzeć się odpowiedzi transkryptomicznej na infekcję. Mikroskopia fluorescencyjna i elektronowa mogą być również wykorzystywane do bardziej szczegółowej obserwacji interakcji patogenów gospodarza. Najważniejszą rzeczą do zapamiętania jest upewnienie się, że masz wystarczająco dużo praktyki na mikrowtryskiwaczu, aby móc szybko i skutecznie wykonać zastrzyki w celu uzyskania spójnych wyników.Końcówki wierteł do mikroiniekcji mają drobny, ostry czubek i należy zachować ostrożność podczas ich załadunku i rozładunku z mikrowtryskiwacza. Technika ta pozwala na badanie interakcji patogenów komórek nabłonkowych z wcześniej nieosiągalnymi szczegółami. Ten model infekcji będzie szczególnie przydatny dla osób badających patogeny specyficzne dla człowieka.

using-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived-intestinal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisujemy metodę tworzenia ludzkich enteroidów z krypt jelita cienkiego i kolonoidów z krypt jelita grubego pobranych zarówno z tkanek chirurgicznych, jak i z biopsji. W tym artykule metodologicznym przedstawiamy metody hodowli, które są niezbędne do pomyślnego wzrostu i utrzymania ludzkich enteroidów i okronoidów.

Ustalenie ludzkich enteroidów nabłonkowych i kolonoidów z całej tkanki i biopsja

Ten protokół opisuje pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w czasie rzeczywistym po leczeniu farmakologicznym w organoidach jelitowych człowieka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i mikroskopii żywych komórek.

Pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w organoidach jelitowych człowieka w czasie rzeczywistym

Ten protokół pozwala na różnicowanie ludzkich komórek pluripotencjalnych w organoidy jelitowe. Protokół naśladuje normalny rozwój człowieka poprzez różnicowanie komórek w populację ostatecznej endodermy, endodermy jelita tylnego, a następnie nabłonka jelitowego. To sprawia, że protokół nadaje się zarówno do badania rozwoju jelit, jak i zastosowań modelowania chorób.

Generowanie organoidów jelitowych pochodzących z hiPSC do zastosowań w modelowaniu rozwoju i choroby

Tutaj opisujemy przygotowanie monowarstw nabłonka jelitowego pochodzących od ludzkich organoidów do badania funkcji bariery jelitowej, przepuszczalności i transportu. Ponieważ organoidy reprezentują pierwotną reakcję tkanki nabłonkowej na bodźce zewnętrzne, modele te łączą zalety rozszerzalności linii komórkowych oraz znaczenie i złożoność tkanki pierwotnej.

Monowarstwa nabłonka pochodząca z organoidów: klinicznie istotny model in vitro dla funkcji bariery jelitowej

Tutaj prezentujemy dwa protokoły, które pozwalają na modelowanie interakcji specyficznych dla wierzchołka jelita. Monowarstwy jelitowe pochodzące z organoidów i kultury interfejsu powietrze-ciecz (ALI) ułatwiają wytwarzanie dobrze zróżnicowanego nabłonka dostępnego zarówno od strony luminalnej, jak i podstawnej, podczas gdy organoidy jelitowe z odwróconą polaryzacją odsłaniają swoją wierzchołkową stronę i są podatne na testy o wysokiej przepustowości.

Metody hodowli do badania interakcji specyficznych dla wierzchołka przy użyciu modeli organoidów jelitowych

W tym miejscu opisano szczegółowe metody generowania, utrzymywania i charakteryzowania ludzkich organoidów jelita cienkiego i okrężnicy pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Metody te mają na celu poprawę odtwarzalności, rozszerzenie skalowalności i skrócenie czasu pracy wymaganego do posiewu i pasażowania organoidów.

Wytwarzanie, utrzymanie i charakterystyka ludzkich organoidów jelitowych i okrężnicy pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół szczegółowo opisuje tworzenie enteroidów, trójwymiarowego modelu jelitowego, z tkanki jelitowej płodu. Do charakterystyki modelu wykorzystano obrazowanie immunofluorescencyjne biomarkerów nabłonkowych. Wierzchołkowa ekspozycja lipopolisacharydów, endotoksyny bakteryjnej, przy użyciu techniki mikroiniekcji indukowała przepuszczalność nabłonka w sposób zależny od dawki, mierzoną przez wyciek dekstranu fluorescencyjnego.

Badanie przepuszczalności nabłonka w enteroidach pochodzących z tkanek płodowych

Opisujemy protokół szczegółowo opisujący izolację mysich krypt okrężnicy w celu opracowania 3-wymiarowych kolonoidów. Ustalone okokrody mogą być następnie ostatecznie różnicowane, aby odzwierciedlić skład komórkowy nabłonka gospodarza przed otrzymaniem prowokacji zapalnej lub skierowaniem do utworzenia monowarstwy nabłonka.

Badanie nabłonkowego wpływu zapalenia jelit in vitro na ustalone mysie kolonoidy

Protokół łączy technologię organoidów jelitowych człowieka z analizą transkryptomiczną pojedynczej komórki, aby zapewnić znaczący wgląd w wcześniej niezbadaną biologię jelit.

Wykorzystanie organoidów jelitowych człowieka do zrozumienia nabłonka jelita cienkiego na poziomie transkrypcji pojedynczej komórki

Badanie przedstawia metodę badania in vitro infekcji bakteryjnej z wykorzystaniem organoidów pochodzenia tkankowego z komórek macierzystych. Protokół opisuje, jak hodować i różnicować organoidy w dwóch wymiarach, zakażać je adherentno-inwazyjnymi Escherichia coli oraz oceniać kluczowe odczyty, w tym przełamanie bariery nabłonkowej, obrazowanie infekcji oraz odpowiedź RNA nabłonkowego.

Dwuwymiarowa hodowla organoidów na inwazynie lub wyciągu z błony podstawowej do badania interakcji gospodarz-bakteria

Poznaj metodę mikroinjekcji patogenów do ludzkich organoidów jelitowych pochodzących z hiPSC. Technika ta umożliwia szczegółowe badanie inwazji nabłonka jelitowego przez Salmonella Typhimurium i modyfikację odpowiedzi za pomocą cytokin.

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych organoidów jelitowych pochodzących z komórek macierzystych do badania i modyfikowania ochrony komórek nabłonka przed salmonellą i innymi patogenami (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych organoidów jelitowych pochodzących z komórek macierzystych do badania i modyfikowania ochrony komórek nabłonka przed salmonellą i innymi patogenami

Przeglądaj więcej filmów