Ukierunkowane badania z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej z blokiem szeregowym i mikroskopią elektronową ze zogniskowaną wiązką jonów

Każdy projekt z zakresu nauk przyrodniczych, który wymaga badania ultrastruktury 3D określonego obszaru zainteresowania w złożonej próbce biologicznej, może wykorzystywać tę technikę. Procedura przygotowania próbki jest taka sama dla dwóch metod obrazowania, tj. SBF/SEM i FIB-SEM. Zastosowanie kuchenki mikrofalowej znacznie przyspiesza proces przetwarzania próbki.

Chociaż pokazano tutaj dla wierzchołków korzeni, protokół ten może być używany dla dowolnego systemu modelu biologicznego przy minimalnych dostosowaniach. Przed użyciem tego przepływu pracy do korelacji SBF/SEM i FIB-SEM należy zapoznać się z poszczególnymi technologiami. Wykonanie pewnych kroków można łatwo zademonstrować, ale trudno je opisać w tekście pisanym.

Procedurę zademonstruje Peter Borghgraef, który jest technikiem w naszym laboratorium. Na początek odetnij końcówki korzeni utrwalonych sadzonek Arabidopsis thaliana na płytkach agarowych i umieść dwie do trzech końcówek w probówkach Eppendorfa zawierających ten sam utrwalacz przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Rano za pomocą pipety zastąp utrwalacz 0,1 molowym buforem fosforanowym o pH 6,8 w probówkach z probówkami na obrotowym stole z prędkością 100 obr./min i myj przez 10 minut.

Następnie powtórzyć mycie przy użyciu świeżego buforu fosforanowego pięć razy. W dygestorium utrwalić końcówki korzeni, zastępując bufor fosforanowy 2% tetratlenkiem osmu i 0,2% czerwienią rutenową w 0,1-molowym buforze fosforanowym o pH 6,8 z probówkami z otwartymi pokrywkami w kuchence mikrofalowej i uruchom program. Następnie wylej roztwór do probówek i umyj końcówki korzeni dwukrotnie podwójnie destylowaną wodą przez pięć minut każdy.

Do trzeciego i czwartego prania wodą podwójnie destylowaną użyj kuchenki mikrofalowej, aby wspomóc pranie. Po pierwszym 40-sekundowym myciu wodą podwójnie destylowaną wyjmij próbki końcówki korzenia z kuchenki mikrofalowej i zastąp podwójnie destylowaną wodę świeżą wodą podwójnie destylowaną. Włóż próbki z powrotem do kuchenki mikrofalowej i kontynuuj program.

Następnie przygotuj roztwór TCH, dodając 0,1 grama tiokarbohydrazydu do 10 mililitrów podwójnie destylowanej wody w 15-mililitrowej probówce. Umieść rurkę w piekarniku i podgrzewaj w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez godzinę, aby się rozpuściła. Następnie przefiltrować roztwór TCH za pomocą filtra strzykawkowego o średnicy 0,22 mikrometra.

Natychmiast zastąp roztwór w probówkach z próbką przefiltrowanym roztworem TCH i kontynuuj postępowanie zgodnie z protokołem. Teraz zanurz próbki w etanolu i umieść je w kuchence mikrofalowej w celu odwodnienia w stopniowanych krokach 50%70%90%, a następnie dwukrotnie po 100% obróbce etanolem. Po odwodnieniu tlenkiem propylenu dodaj 50% żywicy Spurr do probówek, aby rozpocząć infiltrację końcówek korzeni przez co najmniej dwie godziny.

Po końcowej inkubacji w żywicy 100%Spurr umieść końcówki korzeni w foremkach do zatapiania i wypełnij formy świeżą żywicą 100%Spurr i polimeryzuj w piekarniku w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 36 do 48 godzin. Najpierw użyj żyletki, aby z grubsza przyciąć spolimeryzowaną próbkę do cienkiego bloku. Stroną, której odsłonięta tkanka jest skierowana w dół, przymocuj próbkę do środka metalowej szpilki z przewodzącą żywicą epoksydową, aby tkanka dotykała metalowego kołka.

Umieść próbkę w piekarniku w temperaturze 65 stopni Celsjusza, aby utwardzić żywicę epoksydową przez noc. Rano załaduj metalową szpilkę do nośnika i użyj żyletki, aby usunąć nadmiar żywicy epoksydowej z próbki. Aby jeszcze bardziej wygładzić powierzchnię próbki, załaduj nośnik metalową szpilką w uchwycie ultramikrotomu.

W ultramikrotomie użyj noża szklanego lub diamentowego, aby wygładzić powierzchnię boków bloku tworzącego piramidę. Upewnij się, że przynajmniej część tkanki jest już odsłonięta na powierzchni bloku. Następnie umieść przycięty blok próbki w powlekarce do napylania i dostosuj ustawienia do platyny przy dwóch do pięciu nanometrach, aby pokryć próbkę cienką warstwą.

Włóż nośnik do mikroskopu SBF-SEM. Zbliż nóż diamentowy do powierzchni próbki i odetnij górną część próbki, aby usunąć warstwę platyny i odsłonić część tkanki. Następnie ustaw napięcie przyspieszające na 1,5 do 2 kilowoltów.

Uchwyć obraz tkanki i skonfiguruj przebieg obrazowania. Za pomocą oprogramowania Fiji wybierz plik, import, sekwencję obrazów i zlokalizuj stos obrazów, aby załadować obrazy. Po dostosowaniu obrazu zgodnie z rękopisem sprawdź wyrównanie, przewijając zestaw danych.

Użyj polecenia zapisz w menu pliku, aby zapisać wyrównany zestaw danych jako plik TIFF 3D. Dokładnie przeanalizuj zestaw danych, aby sprawdzić, czy uwzględniono w nim zwrot z inwestycji i czy zawiera on informacje potrzebne do odpowiedzi na pytanie biologiczne. Na ostatnim obrazie stosu, który jest bieżącą powierzchnią bloku w mikroskopie SBF-SEM, wybierz nowy zwrot z inwestycji dla FIB-SEM.

Po ponownym pokryciu platyną, załaduj próbkę do FIB-SEM i użyj wtórnego detektora elektronów o napięciu 15 kilowoltów i jednym nanoampero, aby zlokalizować ROI zidentyfikowany w SBF-SEM na powierzchni bloku. Przesuń i przechyl stolik, aby doprowadzić ROI próbki do punktu zbieżności belek FIB i SEM, za pomocą wiązki FIB i systemu wtrysku gazu. Umieść jednomikrometrową warstwę ochronną platyny na powierzchni nad ROI.

Następnie, używając niskiego prądu mielenia w zakresie od 50 do 100 pikoamperów, frezuj cienkie linie w osadzaniu platyny w celu automatycznego ustawiania ostrości i śledzenia 3D podczas procesu obrazowania. Następnie, używając wysokiego prądu mielenia wynoszącego 30 nanoamperów, wyfrezuj rów o grubości 30 mikrometrów przed ROI, tworząc powierzchnię obrazowania dla wiązki SEM. Po wygładzeniu powierzchni obrazu rozpocznij proces obrazowania i monitoruj stabilność procesu podczas pierwszych 50 do 100 sekcji.

Gdy system będzie działał płynnie, opuść pomieszczenie i upewnij się, że w pomieszczeniu jest jak najmniej zakłóceń. Obrazy z SBF-SEM zapewniają przegląd tkanki, dając wgląd w orientację przestrzenną komórek i połączenia wewnątrzkomórkowe. Późniejsze obrazowanie FIB-SEM w nowym regionie dodaje szczegóły o wysokiej rozdzielczości określonych komórek i struktur.

Dane SBF-SEM pokazują inne renderowanie wokseli nieizotropowych od danych wokseli izotropowych FIB-SEM. SBF-SEM przedstawia efekt schodów na powierzchni, podczas gdy dane FIB-SEM z pięcionanometrowymi sekcjami zapewniają, że renderowanie wydaje się znacznie gładsze, a poszczególne sekcje całkowicie wtapiają się w powierzchnię. Protokół ten opisuje obrazowanie unikalnego regionu w jednej próbce, a każde odchylenie od przepływu pracy może spowodować uszkodzenie próbki, uniemożliwiając przeniesienie obszaru zainteresowania.