Generowanie hydrożeli 3D na bazie kolagenu do analizy wzrostu i zachowania aksonów podczas rozwoju układu nerwowego

Metoda ta jest przydatna do analizy roli niektórych cząsteczek w kierowaniu aksonami i migracji neuronów podczas rozwoju układu nerwowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że analiza wyników jest szybka i prosta oraz nie wymaga skomplikowanego oprogramowania, co oznaczałoby wiele szkoleń dla badaczy. Procedurę zademonstruje Mirian Segura-Feliu, technik z naszego laboratorium i ja.

Na początek umieść 200 000 komórek COS-1 na 35-milimetrowych szalkach Petriego i inkubuj z kompletną pożywką w inkubatorze do hodowli komórkowych, aby odczytać 70 do 80% konfluencji przez noc. Następnego dnia należy przeprowadzić transfekcję komórek COS-1 z DNA kodującym cząsteczkę kandydującą przy użyciu metody transfekcji opartej na liposomach. Najpierw wymieszaj 250 mikrolitrów wolnej pożywki z surowicy i od jednego do 2 mikrogramów DNA w 1,5 mililitrowej probówce wirówkowej i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Aby przygotować probówkę liposomalną, dodaj 240 mikrolitrów wolnej pożywki z surowicy i 10 mikrolitrów odczynnika do transfekcji liposomalnej i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po inkubacji dodać zawartość probówki DNA do probówki lipsomalnej. Delikatnie wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut.

Zastąp pożywkę na hodowanych komórkach 1,5 mililitra pożywki wolnej od surowicy. Powoli dodawaj mieszaninę liposomów DNA i wkraplaj mądrze do komórek. Inkubować w inkubatorze do hodowli komórkowych dwutlenku węgla przez trzy godziny.

Po zakończeniu inkubacji należy zastąpić pożywkę kompletną pożywką hodowlaną i inkubować przez noc w inkubatorze. Następnego dnia przepłucz komórki 0,1-molowym PBS Dulbecco. Dodaj 800 mikrolitrów trypsyny EDTA na każde danie i inkubuj przez pięć do 15 minut w inkubatorze dwutlenku węgla.

Zebrać oderwane komórki z dwoma mililitrami kompletnej pożywki hodowlanej do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i dodać 10 mililitrów tej samej pożywki. Odwiruj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza 130 razy g przez pięć minut. Usunąć supernatant i zakonserwować osad zawierający komórki COS-1 na lodzie.

Po przygotowaniu mieszaniny roboczej kolagenu dodaj 100 do 150 mikrolitrów mieszanki kolagenowej do osadu transfekowanych komórek i delikatnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół. Rozprowadź od 45 do 50 mikrolitrów mieszaniny granulek komórek kolagenowych na 35-milimetrowej szalce Petriego, aby utworzyć jednolity pas komórek kolagenowych o długości około jednego do 1,5 centymetra. Umieść naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aż do momentu zaobserwowania żelowania.

Przygotować drugi pasek zawierający komórki kontrolne w drugim naczyniu hodowlanym i umieścić go w inkubatorze. Po zakończeniu żelowania dodaj trzy do czterech mililitrów kompletnej pożywki hodowlanej COS-1 o temperaturze 37 stopni Celsjusza do każdego naczynia zawierającego zżelowane paski komórek kolagenowych i umieść je w inkubatorze. Użyj cienkiego skalpela lub rozdrabniacza do tkanek, aby przeciąć paski komórek kolagenu, aby uzyskać małe kwadratowe kawałki o długości od 400 do 500 mikrometrów.

Przenieś wszystkie skrawki z tego samego stanu transfekcji na szalkę Petriego zawierającą od trzech do 3,5 mililitrów pożywki do hodowli neuronów. Sprawdź pod mikroskopem preparacyjnym jakość kawałków i umieść naczynia w inkubatorze. Za pomocą nożyczek odciąć rogi zarodka w 16,5 dniu embrionalnym z jamy brzusznej ciężarnej samicy szczura złożonej w ofierze i umieścić je na dużej szalce Petriego zawierającej zimny bufor HBSSg.

Umieść naczynie w okapie z przepływem laminarnym i za pomocą prostych kleszczy wyekstrahuj zarodki i umieść je w nowym naczyniu zawierającym zimny HBBSg. Za pomocą małych kleszczy usuń skórę, a następnie zakrzywionymi i prostymi kleszczami ostrożnie wypreparuj mózg i umieść w naczyniu zawierającym zimny HBSSg. Pod mikroskopem preparacyjnym, używając skalpela lub cienkich nożyczek, przeciąć mózg na pół wzdłuż linii środkowej, aby oddzielić obie półkule.

Następnie usuń międzymózgowie i za pomocą cienkich kleszczy usuń opony mózgowe i naczynia krwionośne z części mózgu. Użyj 100% etanolu do czyszczenia wszystkich części rozdrabniacza tkanek, zwłaszcza płyty tnącej PTFE i żyletki, a następnie trzymaj rozdrabniacz tkanek w okapie ze strumieniem laminarnym w świetle UV przez 15 minut. Przenieś każdy kawałek tkanki na płytę tnącą rozdrabniacza tkanek.

Po rozdrobnieniu tkanki przenieś kawałki z 35-milimetrowych szalek Petriego wypełnionych trzema do czterech mililitrami kompletnego NCM. Za pomocą cienkich igieł wolframowych zakończ sekcję tkanek w pełnym NCM. Sprawdź jakość uzyskanych plastrów pod mikroskopem preparacyjnym, upewniając się, że warstwy są wyraźnie rozpoznawalne w optyce ciemnego pola i wypreparuj obszar zainteresowania za pomocą igieł wolframowych.

Trzymaj dobrej jakości kawałki w kompletnym podłożu NCM w inkubatorze dwutlenku węgla. Demonstracja wizualna ma kluczowe znaczenie na etapach związanych z przygotowaniem współkultur, co ułatwia słowom zrozumienie procesu. Umieścić kilka sterylnych czterodołkowych płytek hodowlanych w okapie z przepływem laminarnym i przygotować roboczą mieszaninę kolagenu, jak poprzednio.

Dodaj 15 do 20 mikrolitrów mieszanki hydrożelowej na dno każdej studzienki, aby uzyskać okrągłą bazę kolagenową. Umieść szalki w inkubatorze, aż do całkowitego zżelowania. I sprawdź jakość żelowanego kolagenu.

Za pomocą pipety przenieś mały kawałek agregatu komórkowego COS-1 na bazę hydrożelową, a następnie za pomocą pipety umieść kawałek tkanki na tej samej podstawie, blisko kawałka agregacji komórek w odległości jednego rozmiaru eksplantu. Po przygotowaniu nowej działającej mieszaniny kolagenu na lodzie, delikatnie odpipetuj 15 do 20 mikrolitrów tej nowej mieszanki, aby pokryć eksplant i agregat komórkowy, tworząc kanapkę przypominającą kulturę hydrożelową. Użyj cienkiej igły wolframowej, aby zmienić orientację eksplantatu tak, aby był skierowany w stronę agregatu komórkowego na głębokości od 500 do 600 mikrometrów.

Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze, aż zaobserwuje się żelowanie, a następnie dodaj 0,5 mililitra kompletnego NCM uzupełnionego suplementem 2% B27 i trzymaj kultury przez 36 do 48 godzin w inkubatorze. Kiedy aksony hipokampa zostały skonfrontowane z Netrin-1, rosły preferencyjnie w kierunku źródła Netrin-1, co wskazuje, że Netrin-1 działa jako cząsteczka atrakcyjna chemioterapeutycznie dla tych aksonów. W warunkach kontrolnych, czyli pozorowanej transfekcji, wszystkie aksony rosły promieniście, bez żadnych preferencji kierunkowych.

Kiedy aksony hipokampa zostały skonfrontowane z komórkami wydzielającymi Sema3E, większość z nich rosła naprzeciwko agregatu komórkowego, co wskazuje, że Sema3E działa jako cząsteczka odpychająca chemioterapię dla tych aksonów. To schematyczne przedstawienie odpowiedzi aksonalnej i metody kwantyfikacji pokazuje, że w warunkach kontrolnych aksony były równomiernie rozmieszczone zarówno w proksymalnych, jak i dystalnych kwadrantach, wykazując się promieniowym wyrostkiem. Wskazywało to na stosunek proksymalnej dystalnej lub PD wynoszący jeden.

Gdy eksplantaty wykazywały zwiększoną liczbę aksonów w proksymalnym kwadrancie w porównaniu z dystalnym, co wskazuje na przyciąganie chemioterapii, stosunek PD był większy niż jeden. Gdy liczba aksonów była wyższa w kwadrancie dystalnym niż w bliższym, co wskazuje na odpychanie chemioterapii, stosunek PD był mniejszy niż jeden. Podążając tą metodą, naukowcy mogą uzyskać niezbędne informacje na temat roli niektórych cząsteczek podczas rozwoju neuronów, co pozwala nam ustalić punkt wyjścia do dalszego badania funkcji.

Chociaż technika ta jest przydatna w rozwoju neuronów, może być również stosowana w badaniach farmakologicznych, angiogenezie i inżynierii tkankowej jako strategie.