Name: Generowanie hydrożeli 3D na bazie kolagenu do analizy wzrostu i zachowania aksonów podczas rozwoju układu nerwowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Poznaj metodę generowania hydrożeli 3D na bazie kolagenu do analizy wzrostu aksonów i migracji neuronów. Technika wykorzystuje komórki COS-1 i tkanki mózgu szczura, umożliwiając badanie wpływu cząsteczek na rozwój układu nerwowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Tomowi Yohannanowi za porady redakcyjne i M. Segura-Feliu za pomoc techniczną. Praca ta została sfinansowana przez program CERCA oraz przez Komisję ds. Uniwersytetów i Badań Departamentu Innowacji, Uniwersytetów i Przedsiębiorstw Generalitat de Catalunya (SGR2017-648). Prace te zostały sfinansowane przez hiszpańskie Ministerstwo Badań, Innowacji i Szkolnictwa Wyższego (MEICO) za pośrednictwem BFU2015-67777-R i RTI2018-099773-B-100, Hiszpańskiej Sieci Prionów (Prionet Hiszpania AGL2017-90665-REDT) oraz Instytutu Carlos III, CIBERNED (PRY-2018-2).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i protokołami Komitetu Etycznego ds. Eksperymentów na Zwierzętach (CEEA) Uniwersytetu w Barcelonie, a protokół użycia gryzoni w tym badaniu został sprawdzony i zatwierdzony przez CEEA Uniwersytetu w Barcelonie (zatwierdzenie CEEA #276/16 i 141/15). 
1. Oczyszczanie kolagenu z ogona szczura
<ol>
	<li>Zbierz dorosłe ogony szczurów Sprague-Dawley (w wieku 8-9 tygodni) po złożeniu zwierzęcia w ofierze zgodnie z wytycznymi etycznymi i spłucz 95% etanolem. Umieść 2-4 ogony na lodzie (4 °C) i utrzymuj je przykryte lodem podczas tego procesu.  </li>
	<li>Aby uzyskać ścięgna ogonowe, przymocuj ogon do najbardziej ogonowych kręgów ogona za pomocą hemostatu i ściśnij ogon drugim hemostatem umieszczonym około 5-7 mm od pierwszego. Złam ogon, skręcając go ostro obiema hemostatami. Aby to zrobić, złóż/rozłóż kręgi kilka razy, aż pękną.</li>
	<li>Powoli pociągnij kręgi hemostatem, aby odłączyć ścięgna od ich pochewki, gdy wychodzi. W tym momencie przetnij ścięgna małymi nożyczkami. Trzymaj te kawałki ścięgien na sterylnej szalce Petriego o średnicy 100 mm na lodzie.</li>
	<li>Powtórz zaciskanie i przesuwanie reszty ogona, aż ścięgna zostaną całkowicie usunięte.</li>
	<li>Powtórz kroki 1.2-1.4 dla wszystkich uzyskanych ogonów.</li>
	<li>Obserwuj ścięgna pod mikroskopem. Odrzuć naczynia krwionośne, przecinając je małymi nożyczkami i przytrzymując prostymi cienkimi kleszczami, aby poprawić czystość ścięgna i spłucz ścięgna 3 razy ultraczystą wodą.</li>
	<li>Zbierz 3-4 g mokrych ścięgien. Rozpuścić ścięgna w 150 ml 3% lodowatego kwasu octowego w temperaturze 4 °C w szklanej kolbie stożkowej o pojemności 200-250 ml przez 24-36 godzin, delikatnie mieszając.</li>
	<li>Wirować przy 20 000 x g przez 1 godzinę. Równolegle należy przygotować membranę rurki dializowej, wycinając kawałek o długości około 10-15 cm i gotować go w ultraczystej wodzie zawierającej 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) przez 15 minut. Następnie delikatnie przepłukać membranę dializacyjną ultraczystą wodą.</li>
	<li>Po odwirowaniu zebrać supernatant w membranie rurki dializacyjnej przez dekantację. Osad zawiera kwaśny materiał nierozpuszczalny (białka niekolagenowe), a supernatant zawiera rozpuszczalne białka kolagenowe.</li>
	<li>Zdializować supernatant w 2 litrach sterylnego 0,1x Minimum Essential Medium Eagle (MEM), pH 4,0 w szklanej zlewce o pojemności 2-5 l. Dializuj przez 3 dni. Zmieniaj 0,1 x roztwór MEM co najmniej dwa razy dziennie, sprawdzając pH przy każdej zmianie przed użyciem. Jeśli pH zmieniło się na podstawowe, zmodyfikuj je kilkoma kroplami 0,1 M kwasu octowego, aż pH osiągnie 4,0.</li>
	<li>Po dializie dodać antybiotyki (1,5 ml penicyliny/streptomycyny (Pen-Strep)) do dializowanego roztworu kolagenu. Przygotować 5 ml porcji roztworu podstawowego kolagenu i przechowywać w temperaturze 4 °C. 
	nuta: Od tego momentu wszystkie procedury manipulacyjne muszą być wykonywane w sterylnych warunkach w okapie z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Kontynuuj test żelowania przygotowanego roztworu podstawowego kolagenu, postępując zgodnie z kolejnymi krokami.
	<ol>
		<li>Ponieważ kolagen podstawowy jest zwykle zbyt skoncentrowany, przygotuj 3 robocze rozcieńczenia (75%, 50% i 25% roztwór kolagenu), rozcieńczając bulion w 0,1x MEM, pH 4,0. Ostateczna objętość zalecana dla każdego rozcieńczenia roboczego wynosi 5 ml. W każdym stanie sprawdź stężenie białka za pomocą testu kolorymetrycznego białek.</li>
		<li>Umieść na lodzie kilka pustych stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml (po jednej na każde robocze rozcieńczenie), 10 probówek MEM, 7,5% roztworu wodorowęglanu sodu i różne robocze rozcieńczenia kolagenu. Poczekaj, aż ostygną.</li>
		<li>Dodać 40-50 μl 10x MEM do zimnej (4 °C) probówki wirówkowej. Następnie delikatnie wymieszaj go z 7-8 μl roztworu wodorowęglanu sodu.</li>
		<li>Dodaj 310-330 μl jednego z różnych rozcieńczeń kolagenu do tej probówki i delikatnie wymieszaj pipetą, unikając tworzenia się pęcherzyków. Mieszaninę kolagenu, MEM i wodorowęglanu sodu należy przechowywać na lodzie (4 °C) przez co najmniej 5 minut.</li>
		<li>Odpipetować 10-25 μl mieszaniny na szalkę Petriego o średnicy 35 mm.</li>
		<li>Umieścić szalkę Petriego w inkubatorze CO2 ustawionym w temperaturze 37 °C do momentu zaobserwowania żelowania hydrożelu (± 15–20 min).</li>
		<li>Powtórzyć kroki 1.12.3-1.12.6 dla pozostałych rozcieńczeń kolagenu na różnych szalkach Petriego.</li>
		<li>Wybierz rozcieńczenie robocze kolagenu, które daje najlepsze rezultaty. 
		nuta: Najlepszy hydrożel w żelu powinien mieć jednolitą półprzezroczystą konsystencję, szary kolor i nie powinien być grudkowaty ani żylasty. Z naszego doświadczenia wynika, że rozcieńczenie 3:1 (Kolagen: 0,1x MEM) daje najlepsze wyniki eksperymentalne.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie agregacji komórkowych (COS1) modyfikowanych genetycznie w celu wydzielania cząsteczki kandydującej w hydrożelach kolagenowych 3D
<ol>
	<li>Umieść 2 x 106 komórek COS1 na szalkach Petriego o średnicy 35 mm i inkubuj z kompletną pożywką hodowlaną składającą się ze 100 ml D-MEM zawierającej 10% (obj./obj.) inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej, 0,5% (wag./obj.) glutaminy i 1% (wag./obj.) Pen/Strep w inkubatorze do hodowli komórkowych, w celu osiągnięcia 70-80% konfluencji przez noc. Przygotować jedną szalkę Petriego do każdej procedury transfekcji.</li>
	<li>Następnego dnia transfekować komórki COS1 z DNA kodującym cząsteczkę kandydującą (Netrin-1 lub Sema3E) przy użyciu metody transfekcji opartej na liposomach zgodnie z instrukcjami producenta.
	<ol>
		<li>Aby to zrobić, wymieszaj 250 μl pożywki bez surowicy i DNA (1-2 μg na warunek) z probówką wirówkową o pojemności 1,5 ml (probówka DNA) i wymieszaj. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut. Przygotować drugą probówkę (probówkę liposomalną), dodając 240 μl pożywki wolnej od surowicy i 10 μl odczynnika do transfekcji liposomalnej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
		<li>Po inkubacji dodaj zawartość probówki DNA do probówki liposomalnej i delikatnie wymieszaj. Teraz inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Zastąp pożywkę na hodowanych komórkach 1,5 ml pożywki bez surowicy i powoli dodawaj mieszaninę DNA-liposomów do szalki Petriego. Inkubować przez 3 godziny w inkubatorze do hodowli komórkowychCO2</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Po 3 godzinach inkubacji transfekcji należy zastąpić pożywkę kompletną pożywką hodowlaną i inkubować przez noc w inkubatorze.</li>
	<li>Następnego dnia przepłukać komórki 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco (D-PBS), potraktować kultury Trypsin-EDTA (800 μl na każdą szalkę przez 5-15 minut w inkubatorzeCO2) i zebrać oderwane komórki 15 ml kompletnej pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze 4 °C przy 130 x g przez 5 minut. Po odwirowaniu usunąć pożywkę i zakonserwować osad zawierający komórki COS1 na lodzie.</li>
	<li>Powtórz kroki 1.12.3-1.12.6, aby przygotować mieszaninę roboczą kolagenu.</li>
	<li>Dodać 100-150 μl mieszaniny kolagenu do osadu transfekowanych komórek i delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół, a następnie rozprowadzić 45-50 μl tej mieszaniny na szalce Petriego (średnica 35 mm), aby utworzyć jednolity pas komórek kolagenowych o długości około 1-1,5 cm. Umieścić naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 °C (5% CO2 ) do momentu zaobserwowania żelowania (± 15-20 min).</li>
	<li>Przygotować drugi pasek zawierający komórki kontrolne (pozorowana transfekcja) w drugim naczyniu hodowlanym i umieścić go na talerzu w inkubatorze (± 15-20 min), a po zakończeniu żelowania dodać 3-4 ml ogrzanej (37 °C) kompletnej pożywki hodowlanej COS1 do każdej pożywki zawierającej zżelowane paski komórek kolagenowych i przechowywać je w inkubatorze do hodowli komórek CO2 . Następnie pokrój paski komórek kolagenowych, aby uzyskać małe kwadratowe kawałki (o długości od 400 do 500 μm) za pomocą cienkiego skalpela lub rozdrabniacza do tkanek.</li>
	<li>Przenieść wszystkie skrawki z tego samego stanu transfekcji na szalkę Petriego zawierającą 3-3,5 ml pożywki do hodowli neuronów (NCM) i sprawdzić pod mikroskopem preparacyjnym jakość kawałków. Ponownie trzymaj je w inkubatorze hodowli komórkowych CO2 . 
	nuta: Pożywka do hodowli neuronów składa się z pożywki neurobazalnej zawierającej 1-5% (vol/vol) inaktywowanej termicznie surowicy końskiej, 2 mM glutaminy, 0,5% (wt/vol) glukozy, 1% (wt/vol) roztworu Pen-Strep i 0,044% (wt/vol) NaHCO3. Upewnij się, że pH mieści się w przedziale 7,2-7,3.</li>
</ol>
3. Wytwarzanie eksplantatu embrionalnego do hodowli
<ol>
	<li>Wysterylizuj narzędzia chirurgiczne (nożyczki, rękojeść ostrza skalpela, kleszcze proste i zakrzywione) przez autoklawowanie zgodnie z rutynowymi wytycznymi dotyczącymi sterylizacji. Równolegle przygotuj 500 ml zbilansowanego roztworu soli i buforu glukozowego Hanka i 4-5 szalek Petriego (o średnicy 100 mm) zawierających 10 ml HBSS-G. Umieść te talerze na lodzie (4 °C).</li>
	<li>Ciężarną samicę szczura (16,5 dzień zarodkowy) należy umieścić w uśmierceniu poza sterylnym obszarem, postępując zgodnie z zatwierdzonymi procedurami etycznymi. Wytnij rogi zarodka nożyczkami z jamy brzusznej i umieść je na dużej szalce Petriego zawierającej zimny HBSS-G.</li>
	<li>Umieść naczynie w okapie z przepływem laminarnym i usuń zarodki prostymi kleszczami. Umieść je w nowym naczyniu zawierającym zimny HBSS-G. Następnie usuń skórę zarodka za pomocą małych kleszczy i ostrożnie wypreparuj mózg za pomocą zakrzywionych i prostych kleszczy. Umieść je w naczyniu zawierającym zimny HBSS-G.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym przeciąć mózg na pół wzdłuż linii środkowej, aby oddzielić obie półkule skalpelem lub cienkimi nożyczkami i usunąć międzymózgowie, opony mózgowe i naczynia krwionośne z kawałków mózgu za pomocą cienkich kleszczy.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.3-3.4 z resztą zarodków. Nie należy zwlekać z sekcją na dłużej niż 2 godziny, aby zachować jakość tkanki.</li>
	<li>Wyczyść wszystkie części rozdrabniacza tkanek 100% etanolem (zwłaszcza płytkę tnącą z politetrafluoroetylenu (PTFE) i żyletkę). Trzymaj rozdrabniacz do tkanek w okapie ze strumieniem laminarnym w świetle UV przez 15 minut.</li>
	<li>Przenieś każdy fragment tkanki (np. korę z hipokampem) na płytkę tnącą rozdrabniacza tkanek. W przypadku hipokampa umieść go prostopadle do żyletki i uzyskaj skrawki tkanki o grubości 450-500 μm.</li>
	<li>Przygotuj kilka szalek Petriego o średnicy 35 mm z 3-4 ml kompletnego NCM i przenieś kawałki tkanek z płytki rozdrabniacza tkanek na szalki Petriego. Podczas analizowania interesujących obszarów może być potrzebnych wiele potraw.</li>
	<li>Zakończ sekcję tkanek w pełnym NCM za pomocą cienkich igieł wolframowych. Sprawdź jakość uzyskanych plastrów pod mikroskopem preparacyjnym. Upewnij się, że warstwy są wyraźnie rozpoznawalne w optyce ciemnego pola i przeanalizuj obszar zainteresowania (np. region CA hipokampa) za pomocą igieł wolframowych. Wyrzuć uszkodzone plasterki. Eksplantaty hipokampa należy przechowywać w kompletnym podłożu NCM w inkubatorze CO2 .</li>
</ol>
4. Przygotowanie kokultur 3D w hydrożelach kolagenowych
<ol>
	<li>Umieścić kilka sterylnych 4-dołkowych płytek hodowlanych w okapie z przepływem laminarnym i przygotować roboczą mieszaninę kolagenu, jak wskazano wcześniej w krokach 1.12.2-1.12.6.</li>
	<li>Umieść 15-20 μl mieszaniny hydrożelu na dnie studzienki, aby uzyskać okrągłą bazę kolagenową. Powtórz ten krok dla pozostałych studzienek. Nie należy przygotowywać więcej niż pięciu płytek jednocześnie, aby uniknąć nadmiernego parowania płynu z bazy hydrożelowej.</li>
	<li>Trzymaj szalki w inkubatorze do momentu zaobserwowania całkowitego żelowania (± 15-20 min) i wyjmij płytki z inkubatora dopiero po zakończeniu żelowania. Sprawdź jakość żelowanego kolagenu.</li>
	<li>Przenieś mały kawałek agregatu komórkowego COS1 za pomocą pipety. Umieść go na hydrożelowej podstawie i umieść kawałek tkanki na tej samej podstawie za pomocą pipety blisko kawałka komórek skupionego w jednym rozmiarze eksplantu.</li>
	<li>Przygotuj nową działającą mieszaninę kolagenu na lodzie, jak w krokach 1.12.2-1.12.6.</li>
	<li>Delikatnie odpipetować 15-20 μl tej nowej mieszanki i przykryć eksplant i agregat komórkowy. Obserwowana będzie kultura hydrożelu przypominająca kanapkę. W tym momencie ponownie zorientowaj eksplant za pomocą cienkiej igły wolframowej (nie dotykaj agregatu komórkowego COS1!), tak aby był skierowany w stronę agregatu komórkowego na ± 500-600 μm.</li>
	<li>Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze, aż do zaobserwowania żelowania (± 10-15 min), a następnie 0,5 ml kompletnego NCM uzupełnionego 2% suplementem witaminy B27 i przechowywać kultury przez 36 do 48 godzin w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 min).</li>
</ol>
5. Utrwalanie kokultur agregatów komórek eksplantatywnych i procedura immunocytochemiczna
<ol>
	<li>Po 36-48 godzinach inkubacji usunąć pożywkę i przepłukać 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o pH 7,3. Następnie utrwalić kultury przez 1 godzinę 4% paraformaldehydem w 0,1 M buforze fosforanowym (PB), pH 7,3, w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć utrwalacz i delikatnie wypłukać kultury 3-4 razy (po 10-15 minut) w 0,1 M PB o pH 7,3.</li>
	<li>Odłącz kanapkę hydrożelową od dna studzienki za pomocą szpatułki lub kleszczy. Przenieś blok kolagenowy za pomocą cienkiego pędzla na 6-dołkową płytkę hodowlaną zawierającą 0,1 M PBS z 0,5% niejonowym detergentem.</li>
	<li>Swobodnie pływające hydrożele inkubować w roztworze blokującym (10% surowicy, 0,5% niejonowego środka powierzchniowo czynnego i 0,2% żelatyny w 0,1 M PBS) przez 2-3 godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Spłukać 3 razy (po 10-15 min) 0,1 M PBS zawierającym 0,5% niejonowego środka powierzchniowo czynnego.</li>
	<li>Inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem rozcieńczonym w PBS zawierającym 5% surowicy, 0,5% niejonowego środka powierzchniowo czynnego, 0,2% żelatyny i 0,02% azydku sodu. Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym przez 36-48 godzin w temperaturze 4 °C na wytrząsarce. 
	nuta: Zwykle przeciwciało przeciwko β-tubulinie klasy III (α-TUJ-1) (rozcieńczone 1:2,000) jest używane do określenia wzrostu aksonów w kulturach hydrożelowych 3D.</li>
	<li>Po inkubacji spłukać jak w kroku 5.5.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym przez 4 godziny w temperaturze pokojowej (lub 6-7 godzin w temperaturze 4 °C) na wytrząsarce rozcieńczonej w 5% surowicy, 0,5% niejonowym środku powierzchniowo czynnym i 0,2% żelatyny. W tym eksperymencie stosuje się biotynylowane przeciwciało przeciwko myszom (rozcieńczone w stosunku 1:200).</li>
	<li>Wypłukać kultury jak w 5.5.</li>
	<li>Inkubować kultury przez 2 dni w temperaturze 4 °C z roztworem kompleksu awidyny-biotyny (ABC) w stosunku 1:100 rozcieńczonym w PBS zawierającym 5% surowicy, 0,5% niejonowego środka powierzchniowo czynnego i 0,2% żelatyny. Alternatywnie należy użyć streptawidyny znakowanej peroksydazą chrzanową (HRP) (rozcieńczoną w stosunku 1:300-400) w tym samym buforze.</li>
	<li>Wypłukać kultury bakterii zgodnie z opisem w ppkt 5.5.</li>
	<li>Przepłukać kultury kilkakrotnie 0,1 M buforem Tris-HCl o pH 7,6 przez 1 godzinę.</li>
	<li>Inkubować kultury z 0,03% roztworem tetrachlorowodorku 3,3′-diaminobenzydyny (DAB) w 0,1 M Tris-HCl, pH 7,6.</li>
	<li>Dodać 5-8 μL 1% H2O2 i odczekać 10-15 min. Monitoruj rozwój DAB pod mikroskopem za pomocą obiektywu 4-10x.</li>
	<li>Zatrzymać reakcję, usuwając roztwór DAB z 0,1 M buforem Tris-HCl o pH 7,6.</li>
	<li>Płucz kultury w PBS przez 30 minut (kilka zmian).</li>
	<li>Zamontuj hydrożele na szkiełkach podstawowych za pomocą wodnych mediów montażowych.</li>
	<li>Analizuj długość i rozmieszczenie aksonów wewnątrz hydrożelu za pomocą wtyczki analitycznej Sholl lub wtyczki NeuriteJ dla oprogramowania ImageJ30.</li>
</ol>

<ol><li>Ramón y Cajal, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRam%C3%B3n+y+Cajal%2C+S+%22Les+nouvelles+id%C3%A9es+sur+la+structure+du+syst%C3%A8me+nerveux+chez+l%27homme+et+chez+les+vert%C3%A9br%C3%A9s%22">Les nouvelles idées sur la structure du système nerveux chez l'homme et chez les vertébrés</a>. , (1894).</li>
<li>Ramón y Cajal, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRam%C3%B3n+y+Cajal%2C+S+%22Nuevo+concepto+de+la+histolog%C3%ADa+de+los+centros+nerviosos%22">Nuevo concepto de la histología de los centros nerviosos</a>. , (1893).</li>
<li>Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guiding+neuronal+cell+migrations%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Guiding neuronal cell migrations.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), 001834(2010).</li>
<li>Tessier-Lavigne, M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of axon guidance.</a> Science. 274 (5290), 1123-1133 (1996).</li>
<li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).</li>
<li>Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+molecules+of+neuronal+wiring%3A+a+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (6), 001727(2011).</li>
<li>Rosentreter, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+retinal+ganglion+cell+axons+to+striped+linear+gradients+of+repellent+guidance+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Response of retinal ganglion cell axons to striped linear gradients of repellent guidance molecules.</a> Journal of Neurobiology. 37 (4), 541-562 (1998).</li>
<li>Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stripe+assay+to+examine+axonal+guidance+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1216-1224 (2007).</li>
<li>von Philipsborn, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone+navigation+in+substrate-bound+ephrin+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Growth cone navigation in substrate-bound ephrin gradients.</a> Development. 133 (13), 2487-2495 (2006).</li>
<li>Chen, H., He, Z., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+guidance+mechanisms%3A+semaphorins+as+simultaneous+repellents+and+anti-repellents%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Axon guidance mechanisms: semaphorins as simultaneous repellents and anti-repellents.</a> Nature Neuroscience. 1 (6), 436-439 (1998).</li>
<li>Jessell, T. M., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development.+The+decade+of+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Development. The decade of the developing brain.</a> Current Opinion in Neurobiology. 10 (5), 599-611 (2000).</li>
<li>Serafini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+netrins+define+a+family+of+axon+outgrowth-promoting+proteins+homologous+to+C.+elegans+UNC-6%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6.</a> Cell. 78 (3), 409-424 (1994).</li>
<li>Charron, F., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+brain+wiring+functions+for+classical+morphogens%3A+a+role+as+graded+positional+cues+in+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance.</a> Development. 132 (10), 2251-2262 (2005).</li>
<li>Fournier, M. F., Sauser, R., Ambrosi, D., Meister, J. J., Verkhovsky, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+transmission+in+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Force transmission in migrating cells.</a> Journal of Cell Biology. 188 (2), 287-297 (2010).</li>
<li>Dent, E. W., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+dynamics+and+transport+in+growth+cone+motility+and+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance.</a> Neuron. 40 (2), 209-227 (2003).</li>
<li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trip+of+the+tip%3A+understanding+the+growth+cone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The trip of the tip: understanding the growth cone machinery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).</li>
<li>Castellani, V. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCastellani%2C+VB+%22Protocols+for+Neuronal+Cell+Culture%22">Protocols for Neuronal Cell Culture</a>. , Humana Press Inc. (2001).</li>
<li>Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li>
<li>Bornstein, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituted+rattail+collagen+used+as+substrate+for+tissue+cultures+on+coverslips+in+Maximow+slides+and+roller+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes.</a> Laboratory Investigation. 7 (2), 134-137 (1958).</li>
<li>Billings-Gagliardi, S., Wolf, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+examining+organotypic+CNS+cultures+with+Nomarski+optics%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">A simple method for examining organotypic CNS cultures with Nomarski optics.</a> In Vitro. 13 (6), 371-377 (1977).</li>
<li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li>
<li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Earliest+sensory+nerve+fibres+are+guided+to+peripheral+targets+by+attractants+other+than+nerve+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Earliest sensory nerve fibres are guided to peripheral targets by attractants other than nerve growth factor.</a> Nature. 306 (5945), 786-788 (1983).</li>
<li>Chedotal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorins+III+and+IV+repel+hippocampal+axons+via+two+distinct+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Semaphorins III and IV repel hippocampal axons via two distinct receptors.</a> Development. 125 (21), 4313-4323 (1998).</li>
<li>Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrins+are+diffusible+chemotropic+factors+for+commissural+axons+in+the+embryonic+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord.</a> Cell. 78 (3), 425-435 (1994).</li>
<li>Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eph%2Fephrin+signaling+in+morphogenesis%2C+neural+development+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Eph/ephrin signaling in morphogenesis, neural development and plasticity.</a> Current Opinion in Cell Biology. 16 (5), 580-589 (2004).</li>
<li>Wang, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+purification+of+a+mammalian+slit+protein+as+a+positive+regulator+of+sensory+axon+elongation+and+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching.</a> Cell. 96 (6), 771-784 (1999).</li>
<li>Emonard, H., Grimaud, J. A., Nusgens, B., Lapiere, C. M., Foidart, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituted+basement-membrane+matrix+modulates+fibroblast+activities+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Reconstituted basement-membrane matrix modulates fibroblast activities in vitro.</a> Journal of Cell Physiology. 133 (1), 95-102 (1987).</li>
<li>Knapp, D. M., Helou, E. F., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fibrin+or+collagen+gel+assay+for+tissue+cell+chemotaxis%3A+assessment+of+fibroblast+chemotaxis+to+GRGDSP%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A fibrin or collagen gel assay for tissue cell chemotaxis: assessment of fibroblast chemotaxis to GRGDSP.</a> Experimental Cell Research. 247 (2), 543-553 (1999).</li>
<li>Kapur, T. A., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilized+concentration+gradients+of+nerve+growth+factor+guide+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Immobilized concentration gradients of nerve growth factor guide neurite outgrowth.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 68 (2), 235-243 (2004).</li>
<li>Torres-Espin, A., Santos, D., Gonzalez-Perez, F., del Valle, J., Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite-J%3A+an+image-J+plug-in+for+axonal+growth+analysis+in+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Neurite-J: an image-J plug-in for axonal growth analysis in organotypic cultures.</a> Journal of Neuroscience Methods. 236, 26-39 (2014).</li>
<li>Balestrini, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+biology+of+decellularized+lung+matrix%3A+Implications+of+species+mismatch+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine.</a> Biomaterials. 102, 220-230 (2016).</li>
<li>Qian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+Analysis+of+the+Digestion+of+Bovine+Type+I+Collagen+Telopeptides+with+Porcine+Pepsin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin.</a> Journal of Food Science. 81 (1), 27-34 (2016).</li>
<li>Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. J., Kim, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+3-hydroxyproline+%283Hyp%29-rich+motif+marks+the+triple-helical+C+terminus+of+tendon+type+I+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A novel 3-hydroxyproline (3Hyp)-rich motif marks the triple-helical C terminus of tendon type I collagen.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 7732-7736 (2011).</li>
<li>Garnotel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+blood+monocytes+interact+with+type+I+collagen+through+alpha+x+beta+2+integrin+%28CD11c-CD18%2C+gp150-95%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human blood monocytes interact with type I collagen through alpha x beta 2 integrin (CD11c-CD18, gp150-95).</a> Journal of Immunology. 164 (11), 5928-5934 (2000).</li>
<li>Montolio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semaphorin+3A+inhibitor+blocks+axonal+chemorepulsion+and+enhances+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Biology%22%5BJournal%5D)">A semaphorin 3A inhibitor blocks axonal chemorepulsion and enhances axon regeneration.</a> Chemistry and Biology. 16 (7), 691-701 (2009).</li>
<li>Garcia-Gareta, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+gels+and+the+%27Bornstein+legacy%27%3A+from+a+substrate+for+tissue+culture+to+cell+culture+systems+and+biomaterials+for+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Collagen gels and the 'Bornstein legacy': from a substrate for tissue culture to cell culture systems and biomaterials for tissue regeneration.</a> Experimental Dermatology. 23 (7), 473-474 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wzrost rozwijających się aksonów jest głównie inwazyjny i obejmuje degradację i przebudowę ECM. Korzystając z przedstawionej tutaj procedury, naukowcy mogą uzyskać jednorodną matrycę 3D utworzoną przez naturalny kolagen typu I, w której aksony (lub komórki) mogą reagować na gradient chemiczny wydzielany przez genetycznie zmodyfikowane komórki, tak jak robią to in vivo. Różne reakcje aksonalne na gradienty sygnałów przyciągających lub hamujących (białka, lipidy itp.) można łatwo porównać ze specyficzną kontrolą (pozorowan...

Aksony neuronalne, zakończone stożkami wzrostu aksonów, migrują na duże odległości przez macierz zewnątrzkomórkową (ECM) zarodka określonymi drogami, aby dotrzeć do odpowiednich celów. Stożek wzrostu jest dystalną częścią aksonu i specjalizuje się w wyczuwaniu fizycznego i molekularnego środowiska komórki1,2. Z molekularnego punktu widzenia stożki wzrostu są kierowane przez co najmniej cztery różne mechanizmy molekularne: przyciąganie kontaktowe, chemoprzyciąganie, odpychanie kontaktowe i chemorepulsję wyzwalane przez różne aksonalne wskazówki naprowadzania3,4,5,6. Procesy kontaktowe mogą być częściowo monitorowane w dwuwymiarowych (2D) kulturach na podłożach z mikrowzorami (np. z paskami7,8 lub spots9 zawierających cząsteczki). Jednak aksony mogą nawigować do swojego celu w sposób niedyfuzyjny, wykrywając kilka przyciągających i odpychających cząsteczek z komórek drogowskazu w środowisku4,5,10. W tym miejscu opisujemy prostą metodę hodowli 3D, aby sprawdzić, czy wydzielana cząsteczka wywołuje efekty chemorepulsywne lub chemoatrakcyjne na rozwijające się aksony.
Najwcześniejsze badania miały na celu określenie wpływu wskazówek naprowadzania aksonów, wykorzystywały hodowle eksplantatów w trójwymiarowych (3-D) matrycach do generowania gradientów symulujących warunki in vivo11,12. Podejście to, wraz z eksperymentami in vivo, pozwoliło na zidentyfikowanie czterech głównych rodzin wskazówek naprowadzających: Netrins, Slits, Semaphorins i Ephrins4,5,6. Te sygnały molekularne i inne czynniki13 są integrowane przez rosnące aksony, wyzwalając dynamikę kompleksów adhezyjnych i przenosząc siły mechaniczne przez cytoszkielet14,15,16. Aby wygenerować gradienty molekularne w kulturach 3D do nawigacji aksonalnej, pionierscy badacze wykorzystali substraty skrzepów plazmy17, który był również używany do organotypowych preparatów plastrów18. Jednak w 1958 roku zgłoszono nowy protokół generowania hydrożeli kolagenowych 3D do badań za pomocą urządzeń Maximow19, platforma hodowlana, używana w kilku badaniach odpowiednich do obserwacji mikroskopowych20. Inne pionierskie badanie wykazało, że żel kolagenowy jest narzędziem do osadzania ludzkich fibroblastów do badania różnicowania fibroblastów w miofibroblastach w procesach gojenia się ran21. Równolegle Lumsden i Davies zastosowali kolagen z bydlęcej skóry właściwej, aby przeanalizować przypuszczalny wpływ czynnika wzrostu nerwów (NGF) na prowadzenie czuciowych włókien nerwowych22. Wraz z rozwojem nowych platform hodowlanych (np. płytek wielodołkowych) przez różne firmy i laboratoria, kultury kolagenowe zostały dostosowane do tych nowych urządzeń6,23,24,25,26. Równolegle ekstrakt materiału ECM pochodzącego z linii komórek nowotworowych Engelbreth-Holm-Swarm został udostępniony na rynku w celu rozszerzenia tych badań27.
Ostatnio opracowano kilka protokołów do generowania gradientów molekularnych z domniemanymi rolami w prowadzeniu aksonów za pomocą hydrożeli 3D (np. kolagenu, fibryny itp.)28. Alternatywnie, cząsteczka kandydująca może być unieruchomiona w różnym stężeniu w porowatej matrycy (np. NGF29) lub wygenerowana przez hodowlę w małym obszarze agregatów komórek hydrożelowych 3D, wydzielających cząsteczkę w celu wygenerowania gradientu radialnego4,23,24,25,26. Ostatnia możliwość zostanie wyjaśniona w niniejszym protokole.
Przedstawiona tutaj procedura jest łatwą, szybką i wysoce powtarzalną metodą opartą na analizie wzrostu aksonów w 3-D kulturach hydrożelowych embrionalnego mózgu myszy. W porównaniu z innymi metodami, protokół jest odpowiedni dla nieprzeszkolonych badaczy i może być w pełni opracowany po krótkim szkoleniu (1-2 tygodnie). W tym protokole najpierw izolujemy kolagen z ogonów dorosłych szczurów, aby dalej generować matryce 3D, w których genetycznie zmodyfikowane agregaty komórkowe są hodowane przed embrionalną tkanką neuronalną. Te agregaty komórkowe tworzą promieniste gradienty chemiczne cząsteczki kandydującej, która wywołuje odpowiedź dla rosnących aksonów. Wreszcie, ocenę wpływu cząsteczki na rosnące aksony można łatwo przeprowadzić za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym lub, alternatywnie, metod immunocytochemicznych.

<table><tbody><tr><td>Materiał</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-Tetrachlorowodorek diaminoferydyny 10 mg tabletki (DAB)</td><td>Sigma</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>Dorosłe szczury Sprague-Dawley (w wieku od 8 do 9 tygodni)&nbsp;</td><td>Criffa-Credo, Lyon, Francja</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kompleks awidyna-biotyna-peroksydaza (ABC)</td><td>Vector Labs</td><td>PK-4000</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement bez surowicy 50x&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek kwasu bicunchoninowego (BCA)</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>wektory plazmidowe cDNA linie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>komórkowe COS1</td><td>ATTC</td><td>CRL-1570</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>Sigma</td><td>16325</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glukoza (45% roztwór w wodzie) dla kompletnego podłoża neurobazalnego</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) do pożywki hodowlanej COS1</td><td>Invitrogen</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami 10x (bez Ca2+ i Mg2++) (D-PBS) do hodowli</td><td>Invitrogen</td><td>14200</td><td></td></tr><tr><td>Etanol&nbsp;</td><td>merck</td><td>108543</td><td></td></tr><tr><td>Sól disodowa (EDTA) dwuwodnego kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjne podłoże montażowe (np. Fluoromount-G lub podobne)</td><td>Mikroskopia elektronowa (EMS)</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna w proszku&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy (Panreac, nr kat. 211008)</td><td>Panreac</td><td>211008</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Zrównoważony roztwór soli&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>24020083</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10108-165</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie surowica końska&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru (H2O2, 32 do 33% w wodzie)</td><td>Sigma</td><td>316989</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina roztwór 200 mM (100x) do kompletnego podłoża Neurobasel i COS1</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Samica myszy w ciąży (dzień embrionalny od 12,5 do 16,5; E12.5-16.5)&nbsp;</td><td>Criffa-Credo, Lyon, Francja</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane minimum niezbędne podłoże Eagle (MEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11012-044</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne przeciwko klasie III &beta;-tubuliny (klon TUJ-1)</td><td>Biolegend</td><td>801201</td><td></td></tr><tr><td>suplement N-2 100x&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże neuropodstawne&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Merck</td><td>1 040 051 000</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny/streptomycyny 100x&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15140-22</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami 10x (PBS) do immunocytochemii</td><td>Invitrogen</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe: biotynylowany anty-mysz dla koni&nbsp;</td><td>Vector Labs</td><td>BA-2000</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka bez serum (Opti-MEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu&nbsp;</td><td>Panreac</td><td>162712</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wodorowęglanu sodu 7,5%&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna klasa hodowli H2O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>TritonTM X-100&nbsp;</td><td>Podstawa Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Trizma&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (Trypsyna (0,05% (wag./obj.) z EDTA (1x)</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr>1 <tr><td>duże i 1 mały zakrzywiony nożyczki do preparacji&nbsp;</td><td>Narzędzia precyzyjne Instrumenty lub podobne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml&nbsp;</td>Stożkowe probówki wirówkowe <td>Eppendorf lub podobne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml&nbsp;</td><td>Corning lub podobne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 hemostaty&nbsp; &nbsp;</td><td>Narzędzia drobne Narzędzia lub podobne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 małe proste nożyczki preparacyjne</td><td>Narzędzia drobne Narzędzia lub podobne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>probówki wirówkowe o pojemności 200 ml do wirowania</td><td>Nalgene lub podobne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolby</td><td></td><td></td><td></td>stożkowe ze szkła sterylnego o pojemności 200 ml</tr><tr><td>Zlewka</td><td></td><td></td><td></td>szklana o pojemności 2 l</tr><tr><td>Płytki hodowlane 4- i 6-dołkowe&nbsp;</td><td>Nunc</td><td>176740 i 140675</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczne pompki do pipet oraz jednorazowe sterylne pipety plastikowe o pojemności 10 ml i 25 ml z filtrem zawierającym filtr.</td><td>Gilson, Brand, Eppendorf lub podobne&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety automatyczne, sterylne końcówki filtrujące i obecnie sterylne końcówki&nbsp;</td><td>Gilson, Eppendorf lub podobny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka stołowa z wirnikiem kątowym&nbsp;</td><td>Eppendorf, Beckman Coulter lub podobny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa z chłodzeniem z wirnikiem uchylnym (z adapterami probówek 1,5, 15 i 50 ml)</td><td>Eppendorf, Beckman Coulter lub podobny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>inkubator do hodowli komórkowych przy 37 stopniach; C, 5% CO2 i 95% powietrza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membrana celulozowa rurki do dializy</td><td>Sigma</td><td>D9402</td><td></td></tr><tr><td>Zamknięcia węży do dializy&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Z37101-7</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety szklane Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>preparacyjny z optyką ciemnego pola&nbsp;</td><td>Olympus SZ51 lub podobny&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szybkoobrotowa wirówka Beckman Coulter z chłodzeniem lub podobna z wirnikiem kątowym o stałym natężeniu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Okap</td><td></td><td></td><td></td>z przepływem laminarnym</tr><tr><td>Duże 100 mm, 60 mm i małe 35 mm &Oslash; Naczynia do hodowli komórkowych&nbsp;</td><td>Nut</td><td>&nbsp; 150679, 150288 i 150318, odpowiednio</td><td></td>:</tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne i magnetyczne pręty spinowe</td><td>IKA lub podobne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rozdrabniacz tkanek McIlwain</td><td>Mickle Inżynieria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>laboratoryjna Jedna para cienkich kleszczy prostych i jedna para kleszczy zakrzywionych&nbsp;</td><td>Drobne narzędzia Instrumenty lub podobne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Żyletki do rozdrabniacza</td><td></td><td></td><td></td>tkanek</tr><tr><td>Skalpele (numer 15 i 11)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dwie pary cienkich szpatułek do przenoszenia kolagenu i kawałków tkanek</td><td>Drobne narzędzia Instrumenty lub podobne</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie hydrożeli 3d na bazie kolagenu do analizy wzrostu i zachowania aksonów podczas rozwoju układu nerwowego

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

Ten protokół wykorzystuje naturalny kolagen typu I do generowania trójwymiarowego (3-D) hydrożelu do monitorowania i analizy wzrostu aksonów. Protokół koncentruje się na hodowli małych fragmentów embrionalnych lub wczesnopourodzeniowych mózgów gryzoni w hydrożelu 3D utworzonym przez kolagen typu I o określonej porowatości pochodzący ze ścięgna ogona szczura. Fragmenty tkanek są hodowane wewnątrz hydrożelu i konfrontowane z określonymi fragmentami mózgu lub genetycznie zmodyfikowanymi agregatami komórkowymi w celu wytworzenia i wydzielania cząsteczek odpowiednich do tworzenia gradientu wewnątrz porowatej matrycy. Kroki tego protokołu są proste i powtarzalne, ale obejmują krytyczne kroki, które należy dokładnie rozważyć podczas jego opracowywania. Co więcej, zachowanie rosnących aksonów może być monitorowane i analizowane bezpośrednio za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym lub mono/wielofotonowego mikroskopu fluorescencyjnego po utrwaleniu metodami immunocytochemicznymi.

W niniejszej pracy prezentujemy powszechnie dostępną metodologię badania wzrostu aksonów w trójwymiarowych (3-D) kulturach hydrożelu kolagenowego z układu nerwowego zarodka myszy. W tym celu wyizolowaliśmy kolagen z ogonów dorosłych szczurów, aby wytworzyć macierze 3-D, w których hodowaliśmy genetycznie zmodyfikowane agregaty komórkowe wykazujące ekspresję Netrin-1 lub Sema3E w kontakcie z tkanką neuronalną zarodka (np. obszarem CA hipokampa). Agregaty komórkowe te utworzyły wewnątrz macierzy kolagenowej radialnie rozłoż...

Tutaj udostępniamy metodę analizy zachowania rosnących aksonów w matrycach 3D, naśladując ich naturalny rozwój.

Generowanie hydrożeli 3D na bazie kolagenu do analizy wzrostu i zachowania aksonów podczas rozwoju układu nerwowego

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Metoda ta jest przydatna do analizy roli niektórych cząsteczek w kierowaniu aksonami i migracji neuronów podczas rozwoju układu nerwowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że analiza wyników jest szybka i prosta oraz nie wymaga skomplikowanego oprogramowania, co oznaczałoby wiele szkoleń dla badaczy. Procedurę zademonstruje Mirian Segura-Feliu, technik z naszego laboratorium i ja.Na początek umieść 200 000 komórek COS-1 na 35-milimetrowych szalkach Petriego i inkubuj z kompletną pożywką w inkubatorze do hodowli komórkowych, aby odczytać 70 do 80% konfluencji przez noc. Następnego dnia należy przeprowadzić transfekcję komórek COS-1 z DNA kodującym cząsteczkę kandydującą przy użyciu metody transfekcji opartej na liposomach. Najpierw wymieszaj 250 mikrolitrów wolnej pożywki z surowicy i od jednego do 2 mikrogramów DNA w 1,5 mililitrowej probówce wirówkowej i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Aby przygotować probówkę liposomalną, dodaj 240 mikrolitrów wolnej pożywki z surowicy i 10 mikrolitrów odczynnika do transfekcji liposomalnej i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po inkubacji dodać zawartość probówki DNA do probówki lipsomalnej. Delikatnie wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut.Zastąp pożywkę na hodowanych komórkach 1,5 mililitra pożywki wolnej od surowicy. Powoli dodawaj mieszaninę liposomów DNA i wkraplaj mądrze do komórek. Inkubować w inkubatorze do hodowli komórkowych dwutlenku węgla przez trzy godziny.Po zakończeniu inkubacji należy zastąpić pożywkę kompletną pożywką hodowlaną i inkubować przez noc w inkubatorze. Następnego dnia przepłucz komórki 0,1-molowym PBS Dulbecco. Dodaj 800 mikrolitrów trypsyny EDTA na każde danie i inkubuj przez pięć do 15 minut w inkubatorze dwutlenku węgla.Zebrać oderwane komórki z dwoma mililitrami kompletnej pożywki hodowlanej do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i dodać 10 mililitrów tej samej pożywki. Odwiruj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza 130 razy g przez pięć minut. Usunąć supernatant i zakonserwować osad zawierający komórki COS-1 na lodzie.Po przygotowaniu mieszaniny roboczej kolagenu dodaj 100 do 150 mikrolitrów mieszanki kolagenowej do osadu transfekowanych komórek i delikatnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół. Rozprowadź od 45 do 50 mikrolitrów mieszaniny granulek komórek kolagenowych na 35-milimetrowej szalce Petriego, aby utworzyć jednolity pas komórek kolagenowych o długości około jednego do 1,5 centymetra. Umieść naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aż do momentu zaobserwowania żelowania.Przygotować drugi pasek zawierający komórki kontrolne w drugim naczyniu hodowlanym i umieścić go w inkubatorze. Po zakończeniu żelowania dodaj trzy do czterech mililitrów kompletnej pożywki hodowlanej COS-1 o temperaturze 37 stopni Celsjusza do każdego naczynia zawierającego zżelowane paski komórek kolagenowych i umieść je w inkubatorze. Użyj cienkiego skalpela lub rozdrabniacza do tkanek, aby przeciąć paski komórek kolagenu, aby uzyskać małe kwadratowe kawałki o długości od 400 do 500 mikrometrów.Przenieś wszystkie skrawki z tego samego stanu transfekcji na szalkę Petriego zawierającą od trzech do 3,5 mililitrów pożywki do hodowli neuronów. Sprawdź pod mikroskopem preparacyjnym jakość kawałków i umieść naczynia w inkubatorze. Za pomocą nożyczek odciąć rogi zarodka w 16,5 dniu embrionalnym z jamy brzusznej ciężarnej samicy szczura złożonej w ofierze i umieścić je na dużej szalce Petriego zawierającej zimny bufor HBSSg.Umieść naczynie w okapie z przepływem laminarnym i za pomocą prostych kleszczy wyekstrahuj zarodki i umieść je w nowym naczyniu zawierającym zimny HBBSg. Za pomocą małych kleszczy usuń skórę, a następnie zakrzywionymi i prostymi kleszczami ostrożnie wypreparuj mózg i umieść w naczyniu zawierającym zimny HBSSg. Pod mikroskopem preparacyjnym, używając skalpela lub cienkich nożyczek, przeciąć mózg na pół wzdłuż linii środkowej, aby oddzielić obie półkule.Następnie usuń międzymózgowie i za pomocą cienkich kleszczy usuń opony mózgowe i naczynia krwionośne z części mózgu. Użyj 100% etanolu do czyszczenia wszystkich części rozdrabniacza tkanek, zwłaszcza płyty tnącej PTFE i żyletki, a następnie trzymaj rozdrabniacz tkanek w okapie ze strumieniem laminarnym w świetle UV przez 15 minut. Przenieś każdy kawałek tkanki na płytę tnącą rozdrabniacza tkanek.Po rozdrobnieniu tkanki przenieś kawałki z 35-milimetrowych szalek Petriego wypełnionych trzema do czterech mililitrami kompletnego NCM. Za pomocą cienkich igieł wolframowych zakończ sekcję tkanek w pełnym NCM. Sprawdź jakość uzyskanych plastrów pod mikroskopem preparacyjnym, upewniając się, że warstwy są wyraźnie rozpoznawalne w optyce ciemnego pola i wypreparuj obszar zainteresowania za pomocą igieł wolframowych.Trzymaj dobrej jakości kawałki w kompletnym podłożu NCM w inkubatorze dwutlenku węgla. Demonstracja wizualna ma kluczowe znaczenie na etapach związanych z przygotowaniem współkultur, co ułatwia słowom zrozumienie procesu. Umieścić kilka sterylnych czterodołkowych płytek hodowlanych w okapie z przepływem laminarnym i przygotować roboczą mieszaninę kolagenu, jak poprzednio.Dodaj 15 do 20 mikrolitrów mieszanki hydrożelowej na dno każdej studzienki, aby uzyskać okrągłą bazę kolagenową. Umieść szalki w inkubatorze, aż do całkowitego zżelowania. I sprawdź jakość żelowanego kolagenu.Za pomocą pipety przenieś mały kawałek agregatu komórkowego COS-1 na bazę hydrożelową, a następnie za pomocą pipety umieść kawałek tkanki na tej samej podstawie, blisko kawałka agregacji komórek w odległości jednego rozmiaru eksplantu. Po przygotowaniu nowej działającej mieszaniny kolagenu na lodzie, delikatnie odpipetuj 15 do 20 mikrolitrów tej nowej mieszanki, aby pokryć eksplant i agregat komórkowy, tworząc kanapkę przypominającą kulturę hydrożelową. Użyj cienkiej igły wolframowej, aby zmienić orientację eksplantatu tak, aby był skierowany w stronę agregatu komórkowego na głębokości od 500 do 600 mikrometrów.Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze, aż zaobserwuje się żelowanie, a następnie dodaj 0,5 mililitra kompletnego NCM uzupełnionego suplementem 2% B27 i trzymaj kultury przez 36 do 48 godzin w inkubatorze. Kiedy aksony hipokampa zostały skonfrontowane z Netrin-1, rosły preferencyjnie w kierunku źródła Netrin-1, co wskazuje, że Netrin-1 działa jako cząsteczka atrakcyjna chemioterapeutycznie dla tych aksonów. W warunkach kontrolnych, czyli pozorowanej transfekcji, wszystkie aksony rosły promieniście, bez żadnych preferencji kierunkowych.Kiedy aksony hipokampa zostały skonfrontowane z komórkami wydzielającymi Sema3E, większość z nich rosła naprzeciwko agregatu komórkowego, co wskazuje, że Sema3E działa jako cząsteczka odpychająca chemioterapię dla tych aksonów. To schematyczne przedstawienie odpowiedzi aksonalnej i metody kwantyfikacji pokazuje, że w warunkach kontrolnych aksony były równomiernie rozmieszczone zarówno w proksymalnych, jak i dystalnych kwadrantach, wykazując się promieniowym wyrostkiem. Wskazywało to na stosunek proksymalnej dystalnej lub PD wynoszący jeden.Gdy eksplantaty wykazywały zwiększoną liczbę aksonów w proksymalnym kwadrancie w porównaniu z dystalnym, co wskazuje na przyciąganie chemioterapii, stosunek PD był większy niż jeden. Gdy liczba aksonów była wyższa w kwadrancie dystalnym niż w bliższym, co wskazuje na odpychanie chemioterapii, stosunek PD był mniejszy niż jeden. Podążając tą metodą, naukowcy mogą uzyskać niezbędne informacje na temat roli niektórych cząsteczek podczas rozwoju neuronów, co pozwala nam ustalić punkt wyjścia do dalszego badania funkcji.Chociaż technika ta jest przydatna w rozwoju neuronów, może być również stosowana w badaniach farmakologicznych, angiogenezie i inżynierii tkankowej jako strategie.

generation-3-d-collagen-based-hydrogels-to-analyze-axonal-growth

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano metodę przygotowania trójwymiarowej macierzy składającej się z kolagenu typu I oraz pierwotnych ludzkich fibroblastów. Ten żel organotypowy służy jako przydatny substrat do oceny inwazyjnej migracji komórek, ponieważ naśladuje podstawowe cechy stromy tkanki i nadaje się do wielu form mikroskopii.

Organotypowy test z kolagenem typu I: elastyczna platforma do oceny zachowania komórek w kontekście trójwymiarowym

Demonstrujemy sposób wycinania i hodowli eksplantów zwoju statoakustycznego w dniu E4 oraz rdzenia kręgowego w dniu E6 zarodka kurczaka. Eksplanty są hodowane w warunkach bezsurowiczych w trójwymiarowych żelach kolagenowych przez 24 godziny. Reaktywność neurytów jest badana przy użyciu pożywki uzupełnionej o czynniki wzrostu oraz koralików pokrytych białkiem.

Disekcja i hodowla eksplantów zrazustatoakustycznego i rdzenia kręgowego kurczaka w żelach kolagenowych do testów wzrostu neurytów

Eksplanty z układu dopaminergicznego śródmózgowia oraz prążkowia są wykorzystywane w teście z matrycą kolagenową do analizy in vitro rozwoju szlaków mezostriatalnych i striatonigralnych. W tym teście wzrost i prowadzenie aksonów mogą być manipulowane oraz kwantyfikowane. Metodę tę można również zmodyfikować w celu oceny innych obszarów lub sygnałów molekularnych.

Disekcja i hodowla eksplantów dopaminergicznych i prążkowiowych myszy w trójwymiarowych testach w matrycy kolagenowej

Ten film demonstruje metodę generowania trójwymiarowych rusztowań astrocytów w mikrokolumnach hydrożelowych. Wnętrze mikrokolumn pokryte jest kolagenem. Wprowadzane są astrocyty, które przylegają do kolagenu i przy dalszej inkubacji samoorganizują się w trójwymiarowe rusztowanie.

Metoda in vitro do generowania rusztowań astrocytów w mikrokolumnach hydrożelowych

W tej pracy prezentujemy technikę szybkiego wytwarzania żywych tkanek naczyniowych poprzez bezpośrednią hodowlę kolagenu, komórek mięśni gładkich i komórek śródbłonka. Ponadto opisano nowy protokół charakterystyki mechanicznej zmodyfikowanych tkanek naczyniowych.

Inżynieria 3D cellularnych żeli kolagenowych do regeneracji tkanki naczyniowej

Wgląd w złożone działania mózgu wymaga zaawansowanych narzędzi badawczych. Tutaj demonstrujemy nowatorski, oparty na jedwabnym kolagenie, zaprojektowany w 3D model tkanki nerwowej przypominający architekturę przypominającą mózg. Model może być wykorzystany do badania budowy sieci neuronalnej, prowadzenia aksonów, interakcji komórka-komórka i aktywności elektrycznej.

Zaprojektowany model 3D spolaryzowanej tkanki nerwowej oparty na jedwabiu

Kolagen jest kluczowym składnikiem ECM i dostarcza niezbędnych wskazówek dla kilku procesów komórkowych, począwszy od migracji, a skończywszy na różnicowaniu i proliferacji. Poniżej przedstawiono protokół osadzania komórek w hydrożelach kolagenowych 3D oraz bardziej zaawansowaną technikę generowania losowych lub wyrównanych matryc kolagenowych przy użyciu mikrokanałów PDMS.

Przygotowanie żeli kolagenowych 3D i mikrokanalików do badania oddziaływań 3D in vivo

Prezentujemy rozwój samoorganizujących się, trójwymiarowych wiązek podłużnie wyrównanych somatów astrocytarnych i procesów w nowej obudowie z biomateriału. Te zaprojektowane "żywe rusztowania", wykazujące średnicę w skali mikronów, a jednocześnie wydłużające się na centymetry, mogą służyć jako stanowiska testowe do badania mechanizmów neurorozwojowych lub ułatwiać neuroregenerację poprzez kierowanie migracją neuronów i/lub odnajdywaniem ścieżek aksonalnych.

Trójwymiarowe, wyrównane sieci astrocytów oparte na inżynierii tkankowej w celu podsumowania mechanizmów rozwojowych i ułatwienia regeneracji układu nerwowego

Tutaj prezentujemy protokół hodowli 3D komórek glejowych pochodzących z mózgu szczura, w tym astrocytów, mikrogleju i oligodendrocytów. Pokazujemy pierwotną hodowlę komórkową, syntezę hydrożelu metakrylowanego kwasu hialuronowego (HAMA), fotopolimeryzację HAMAfotopolimeryzację i enkapsulację komórek oraz przetwarzanie próbek do konfokalnego i skaningowego obrazowania mikroskopem elektronowym.

Ulepszone hodowle hydrożelowe 3D pierwotnych komórek glejowych do modelowania in vitro zapalenia układu nerwowego

W tym manuskrypcie demonstrujemy przygotowanie biohybrydowego hydrożelowego biotuszu zawierającego grafen do użycia w inżynierii tkanek obwodowych. Za pomocą tego biohybrydowego materiału 3D przeprowadzany jest protokół różnicowania neuronalnego komórek macierzystych. Może to być ważny krok w kierunku wprowadzenia podobnych biomateriałów do kliniki.

Przygotowanie i charakterystyka biohybrydowego biotuszu hydrożelowego 3D na bazie grafenu do neuroinżynierii obwodowej

Ten protokół demonstruje użycie kanału mikroprzepływowego o zmieniającej się geometrii wzdłuż kierunku przepływu płynu do generowania naprężeń rozciągających (rozciągających) w celu wyrównania włókien w hydrożelu kolagenowym 3D (&lt;250 μm grubości). Wynikowe wyrównanie rozciąga się na kilka milimetrów i ma na nie wpływ szybkość odkształcania rozciągającego.

Mikroinżynieryjne hydrożele kolagenowe 3D z wyrównaniem włókien dalekiego zasięgu

Poznaj metodę generowania hydrożeli 3D na bazie kolagenu do analizy wzrostu aksonów i migracji neuronów. Technika wykorzystuje komórki COS-1 i tkanki mózgu szczura, umożliwiając badanie wpływu cząsteczek na rozwój układu nerwowego.

Generowanie hydrożeli 3D na bazie kolagenu do analizy wzrostu i zachowania aksonów podczas rozwoju układu nerwowego

Przeglądaj więcej filmów