Name: Połączenie nieredukcyjnej analizy SDS-PAGE i chemicznego sieciowania w celu wykrycia kompleksów multimerycznych stabilizowanych wiązaniami dwusiarczkowymi w komórkach ssaków w hodowli (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Poznaj metodę analizy kompleksów multimerycznych stabilizowanych wiązaniami dwusiarczkowymi w komórkach ssaków przy użyciu nieredukcyjnej SDS-PAGE i chemicznego sieciowania. Technika ta umożliwia szybką i ekonomiczną identyfikację białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wdzięcznie doceniamy wysiłki włożone przez dr Jennifer Fischer w oczyszczenie przeciwciała poliklonalnego dUTPazy oraz Kerri Ciccaglione za wszystkie jej wysiłki w celu pomocy w edycji tego manuskryptu. Badania te były częściowo wspierane przez grant New Jersey Health Foundation (Grant #PC 11-18).

1. Blokowanie wolnych reszt cysteiny za pomocą jodoacetamidu
<ol>
	<li>Hoduj komórki U-2 OS w naczyniu o średnicy 6cm2 do 50%-60% zbiegu w minimalnej niezbędnej pożywce o wysokiej zawartości glukozy zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% pirogronianu sodu w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
	<li>Przygotuj świeży zapas 10 mM jodoacetamidu tuż przed użyciem, a następnie wyrzuć niewykorzystany odczynnik.</li>
	<li>Dodać 0,1 mM jodoacetamidu o stężeniu końcowym bezpośrednio do pożywki do hodowli komórkowych. Delikatnie kołysz naczyniem w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.</li>
</ol>
2. Zbieranie komórek
<ol>
	<li>Odessać pożywkę z komórek.</li>
	<li>Umyj komórki trzykrotnie 5 ml zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Odessać końcowy roztwór płuczący PBS, a następnie dodać 1 ml zimnego PBS.</li>
	<li>Zeskrob komórki z dna naczynia za pomocą skrobaka do komórek. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml pobrać PBS i zawiesinę komórek, a następnie dozować cały płyn do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Wirować komórki w temperaturze 7 500 x g przez trzy minuty w temperaturze 4 °C. Odessać PBS, pozostawiając osad komórkowy. Osad komórkowy może być przechowywany w temperaturze -80 °C do czasu przetworzenia</li>
</ol>
3. Ekstrakcja białka
<ol>
	<li>Przygotować 100 μl 1x buforu do lizy rozcieńczonego w ddH2O (patrz tabela materiałów). Dodać fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF) bezpośrednio przed użyciem do końcowego stężenia 1 mM.</li>
	<li>Dodaj 50 μl 1x buforu do lizy bezpośrednio do osadu komórkowego i zawiesić. Inkubuj to na lodzie przez 5 minut.</li>
	<li>Sonikować przez 8 s w trybie stałego impulsu na poziomie 40% (patrz Tabela Materiałów dla sonikatora; dostosować w razie potrzeby dla różnych sonikatorów), utrzymując ekstrakt na lodzie.</li>
	<li>Wirować ekstrakt w temperaturze 4 °C przez 5 minut w temperaturze 16 000 x g. Supernatantem jest rozpuszczalna frakcja białkowa. W razie potrzeby można przeprowadzić analizę Bradforda w celu określenia stężenia białka.</li>
</ol>
4. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Weź 10 μl rozpuszczalnego ekstraktu białkowego i dodaj 10 μl 1x buforu do próbek Laemmli SDS (4% SDS, 20% glicerol, 0,004% błękitu bromofenolowego i 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8). Nie dodawaj żadnych odczynników redukujących.</li>
	<li>Próbki należy przechowywać na lodzie, jeżeli tego dnia ma być przeprowadzona analiza SDS PAGE; w przypadku długotrwałego przechowywania właściwe jest -20 °C. Bezpośrednio przed uruchomieniem żelu należy podgrzewać próbkę przez 5 minut w temperaturze 85 °C.</li>
</ol>
5. Sieciowanie in vivo formaldehydu białek endogennych w komórkach U-2 OS
<ol>
	<li>Hoduj komórki U-2 OS w kolbie o średnicy 175cm2 do 70%-80% zbiegu (patrz sekcja 1).</li>
	<li>Przeprowadź reakcję sieciowania formaldehydu
	<ol>
		<li>W dygestorium podamy porcję 37% roztworu formaldehydu zakupionego ze źródeł komercyjnych. Utrwalacz formaldehydu dodać bezpośrednio do podłoża do końcowego stężenia 1% i inkubować w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem przez 15 minut.</li>
		<li>Aby wygasić reakcję, dodać 1,25 M glicyny do końcowego stężenia 0,125 M i inkubować w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem na kołysku przez 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj komórki trzykrotnie 5 ml zimnego PBS. Zassać końcowy roztwór płuczący PBS i dodać 10 ml PBS. Zeskrobać komórki z dna kolby za pomocą skrobaka do komórek.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 10 ml pobrać PBS i zawiesinę komórek, a następnie dozować cały płyn do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować komórki w temperaturze 500 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Odessać PBS, pozostawiając osad komórkowy.</li>
</ol>
6. Frakcjonowanie jąder
<ol>
	<li>Przygotować 10 ml buforu homogenizacyjnego: 0,25 M sacharozy, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES i 0,5% BSA przy pH 7,4. Dodać PMSF bezpośrednio przed użyciem do 1 mM końcowego stężenia i 3 ml buforu zawiesiny jąder (0,1% Triton X-100 w PBS).</li>
	<li>Dodać 5 ml buforu homogenizacyjnego bezpośrednio do osadu komórkowego i całkowicie zawiesić. Odwirować zawiesinę o sile 500 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 5 ml buforu homogenizacyjnego. Użyj ciasno dopasowanego homogenizatora szklano-teflonowego, odbić homogenizuj komórki przy 10 uderzeniach / 500 obr./min.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę o stężeniu 1 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić supernatant. 
	nuta: Użyć supernatantu do izolacji mitochondriów przez odwirowanie przy 10 000 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Zawiesić osad w 1 ml buforu zawiesiny jąder i inkubować na lodzie przez 10 minut.</li>
	<li>Wirować przy 600 x g przez 10 min. Wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 1 ml buforu zawiesiny jąder i ponownie odwirować. Odrzucić supernatant. Ostatnim osadem będą izolowane jądra.</li>
</ol>
7. Ekstrakcja białka
<ol>
	<li>Powtórzyć sekcję 4, z wyjątkiem dodania 25 μl 1x buforu do lizy bezpośrednio do osadu komórkowego, a następnie zawieszenia.</li>
</ol>
8. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Przygotować dwie próbki do SDS-PAGE, pobierając po 10 μl rozpuszczalnego ekstraktu białkowego i dodając 10 μl 2x buforu do próbek Laemmli SDS i 1 μl 2-merkaptoetanolu (BME).</li>
	<li>Ogrzewać jedną próbkę przez 5 minut w temperaturze 37 °C, a drugą próbkę przez 15 minut w temperaturze 98 °C w celu odwrócenia usieciowania formaldehydu.</li>
</ol>
9. Analiza SDS-PAGE
<ol>
	<li>Przygotuj 1 l 1x buforu do biegania Tris-glicyna (25 mM Tris, 192 mM glicyny, 0,1% (w/v) SDS).</li>
	<li>Skonfiguruj urządzenie do uruchamiania SDS-PAGE. 
	UWAGA: Ten protokół wykorzystuje 16% prefabrykowaną stronę SDS TGX. Warto zauważyć, że można użyć dowolnego żelu procentowego.
	<ol>
		<li>Zgodnie z protokołem producenta otwórz opakowanie, w którym przechowywany jest żel, i wyjmij kasetę.</li>
		<li>Usuń grzebień wyściełający studzienki i taśmę z dna kasety.</li>
		<li>Umieść żel w aparacie do biegania.</li>
		<li>Napełnij komorę 1x działającym buforem, aż studzienki zostaną zanurzone w cieczy. Za pomocą plastikowej pipety przepłukać studzienki za pomocą uruchomionego buforu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załaduj próbki na żel wraz z 10 μl wstępnie wybarwionego markera standardowego.</li>
	<li>Uruchom żel pod napięciem 200 V, aż przód barwnika znajdzie się około 1 cm od dna żelu.</li>
</ol>
10. Western Blot
<ol>
	<li>Przygotować 1 l 1x buforu transferowego (25 mM Tris, 192 mM glicyny, 20% metanolu) i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij żel i otwórz kasetę. Za pomocą brzytwy ostrożnie pokrój i wyrzuć żel do układania. Nabierz żel za pomocą jednego rogu i umieść go na tacy z buforem transferowym, pozwalając mu delikatnie kołysać się przez 5 minut.</li>
	<li>Podczas kołysania żelu umieścić blok lodu (przechowywany w temperaturze -20 °C) w zbiorniku transferowym i dodać bufor transferowy do 3/4 wysokości.</li>
	<li>Zwilż membranę z polifluorku winylidenu (PVDF), mocząc ją w 100% metanolu przez 30 s.</li>
	<li>Po upływie 5 minut przygotuj się do skonfigurowania transferu w zasobniku z buforem transferu. Bufor transferowy powinien wystarczyć do całkowitego zanurzenia kleksa. Ustaw transfer blot w następujący sposób: na dole, spód uchwytu kasety (); następnie gruba gąbka, bardzo gruba bibuła, żel poliakrylamidowy, membrana PVDF, bardzo gruba bibuła i gruba gąbka; następnie w końcu górna część uchwytu kasety (biała) u góry.</li>
	<li>Zablokuj kasetę i umieść urządzenie w zbiorniku transferowym z membraną PVDF skierowaną w stronę anody dodatniej, a żelem w kierunku ujemnej. Uzupełnij urządzenie buforem transferowym, aż transfer zostanie całkowicie zanurzony.</li>
	<li>Umieść urządzenie na talerzu do mieszania. Dodaj mieszadło do urządzenia i rozpocznij mieszanie z prędkością 125 obr./min.</li>
	<li>Praca pod napięciem 100 V przez 60 minut.</li>
	<li>Podczas przenoszenia przygotuj roztwór 5% mleka w proszku rozpuszczonego w soli fizjologicznej buforowanej Tris, o Tween-20, pH 7,5 (TBST).</li>
	<li>Zdemontuj urządzenie i zdejmij membranę, zwracając uwagę na to, która strona miała kontakt z żelem; upewnij się, że ta strona pozostaje na tacy przez pozostałe kroki.</li>
	<li>Moczyć membranę przez 2 minuty w soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS), a następnie zablokować błonę przez inkubację w 5 ml 5% roztworu mleka-TBST przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zastąp mleko świeżym 4 ml 5% roztworu mleka-TBST i dodaj przeciwciało pierwszorzędowe we właściwym rozcieńczeniu (w tym przypadku nasze rozcieńczenie wynosi 1:2,000 dla przeciwciała dUTPazy) i inkubuj przez noc z delikatnym kołysaniem w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Następnego dnia usunąć blot z bujaczka o temperaturze 4 °C do kołyski o temperaturze pokojowej, odrzucając roztwór przeciwciała pierwszorzędowego.</li>
	<li>Wykonaj trzy szybkie prania za pomocą TBST, używając wystarczającej ilości płynu, aby całkowicie zanurzyć plamę, a następnie 3 prania po 5 minut każde, powoli kołysząc.</li>
	<li>Po ostatnim praniu dodaj 5 ml 5% roztworu mleka TBST i kołysz blek przez 15 minut, a następnie wyrzuć.</li>
	<li>Dodać przeciwciało drugorzędowe rozcieńczone w 5% mleku-TBST w pożądanym stężeniu. (W tym przypadku rozcieńczenie 1:5 000 koziego środka anty-króliczego rozcieńczone w 5 ml 5% roztworu TBST mleka)</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej, kołysząc przez 1 godzinę, a następnie wyrzucić roztwór.</li>
	<li>Wykonaj trzy szybkie prania z TBST, a następnie 3 prania po 5 minut każde, powoli kołysząc, a następnie wyrzuć ostatnie pranie i dodaj 5 ml TBS.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę chemiluminescencyjnych roztworów detekcyjnych ECL w stosunku 1:1 (1 ml każdego odczynnika na końcową objętość 2 ml) i dodać ją bezpośrednio do blot inkubującego przez 1 minutę.</li>
	<li>Usuń membranę za pomocą pęsety i przetrzyj róg chusteczką laboratoryjną, usuwając nadmiar roztworu. Umieść membranę w folii termokurczliwej i umieść białko stroną do góry w kasecie rentgenowskiej.</li>
	<li>Wystaw membranę na działanie kliszy rentgenowskiej. Czas ekspozycji będzie się różnił.</li>
</ol>

<ol><li>Klomsiri, C., Karplus, P. A., Poole, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine-based+redox+switches+in+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Cysteine-based redox switches in enzymes.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1065-1077 (2011).</li>
<li>Antelmann, H., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-based+redox+switches+and+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Thiol-based redox switches and gene regulation.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1049-1063 (2011).</li>
<li>Brandes, N., Schmitt, S., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-based+redox+switches+in+eukaryotic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Thiol-based redox switches in eukaryotic proteins.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 11 (5), 997-1014 (2009).</li>
<li>Groitl, B., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-based+redox+switches%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Thiol-based redox switches.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1844 (8), 1335-1343 (2014).</li>
<li>Stern, B. D., Wilson, M., Jagus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+nonreducing+SDS-PAGE+for+monitoring+renaturation+of+recombinant+protein+synthesis+initiation+factor%2C+eIF-4+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Use of nonreducing SDS-PAGE for monitoring renaturation of recombinant protein synthesis initiation factor, eIF-4 alpha.</a> Protein Expression and Purification. 4 (4), 320-327 (1993).</li>
<li>Gorman, J. J., Wallis, T. P., Pitt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+disulfide+bond+determination+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Protein disulfide bond determination by mass spectrometry.</a> Mass Spectrometry Reviews. 21 (3), 183-216 (2002).</li>
<li>Li, X., Yang, X., Hoang, V., Liu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Protein+Disulfide+Linkages+by+MS+In-Source+Dissociation+Comparing+to+CID+and+ETD+Tandem+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Characterization of Protein Disulfide Linkages by MS In-Source Dissociation Comparing to CID and ETD Tandem MS.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. , (2018).</li>
<li>Kelly, S. M., Price, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+circular+dichroism+in+the+investigation+of+protein+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protein+and+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">The use of circular dichroism in the investigation of protein structure and function.</a> Current Protein and Peptide Science. 1 (4), 349-384 (2000).</li>
<li>Klockenbusch, C., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+formaldehyde+cross-linking+for+protein+interaction+analysis+of+non-tagged+integrin+beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 927585(2010).</li>
<li>Gavrilov, A., Razin, S. V., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+formaldehyde+cross-linking%3A+it+is+time+for+black+box+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">In vivo formaldehyde cross-linking: it is time for black box analysis.</a> Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 163-165 (2015).</li>
<li>Rotoli, S. M., Jones, J. L., Caradonna, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine+residues+contribute+to+the+dimerization+and+enzymatic+activity+of+human+nuclear+dUTP+nucleotidohydrolase+%28nDut%29%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Cysteine residues contribute to the dimerization and enzymatic activity of human nuclear dUTP nucleotidohydrolase (nDut).</a> Protein Science. , (2018).</li>
<li>Caradonna, S., Muller-Weeks, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+of+enzymes+involved+in+uracil-DNA+repair%3A+isoform+characteristics+of+proteins+responsible+for+nuclear+and+mitochondrial+genomic+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protein+and+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">The nature of enzymes involved in uracil-DNA repair: isoform characteristics of proteins responsible for nuclear and mitochondrial genomic integrity.</a> Current Protein and Peptide Science. 2 (4), 335-347 (2001).</li>
<li>Macpherson, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noxious+compounds+activate+TRPA1+ion+channels+through+covalent+modification+of+cysteines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Noxious compounds activate TRPA1 ion channels through covalent modification of cysteines.</a> Nature. 445 (7127), 541-545 (2007).</li>
<li>Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation (ChIP).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów z treścią niniejszego manuskryptu.

Opisana tutaj metoda daje prosty protokół analizy kompleksów multimerycznych stabilizowanych wiązaniami dwusiarczkowymi. Protokół ten można łatwo dostosować do innych linii hodowli komórkowych, tkanek i organizmów, co pozwala na szeroki zakres zastosowań.
Ważnym krokiem w tej procedurze jest upewnienie się, że wiązania dwusiarczkowe nie są konsekwencją procedury ekstrakcji. Wszelkie wolne reszty cysteiny można zablokować za pomocą jodoacetamidu13. Ten środek alkilujący ...

Od dawna wiadomo, że wiązania dwusiarczkowe stabilizują strukturę wielu białek. W ostatnich pracach wiązanie to zostało również sklasyfikowane jako odwracalna modyfikacja potranslacyjna, działająca jako oparty na cysteinie "przełącznik redoks", który pozwala na modulację funkcji, lokalizacji i interakcji białka1,2,3,4. Dlatego ważne jest, aby móc przestudiować tę modyfikację. Prostą metodą analizy tych stabilizowanych cysteiną kompleksów multimerycznych jest nieredukcyjna analiza SDS-PAGE5. Analiza SDS-PAGE jest techniką stosowaną w wielu laboratoriach, gdzie wyniki można uzyskać i zinterpretować szybko, łatwo i przy minimalnych kosztach, i jest korzystna w porównaniu z innymi technikami stosowanymi do identyfikacji wiązań dwusiarczkowych, takimi jak spektrometria mas6,7 i dichroizm kołowy8.
Jednym ważnym krokiem w ustaleniu, czy ta metoda jest odpowiednią techniką do pomocy w badaniu, jest dokładne zbadanie pierwotnej sekwencji interesującego białka, aby upewnić się, że są tam obecne reszty cysteiny. Kolejnym pomocnym krokiem jest zbadanie wszelkich wcześniej opublikowanych struktur krystalicznych lub użycie aplikacji bioinformatycznej do zbadania trójwymiarowej struktury białka będącego przedmiotem zainteresowania, aby zwizualizować, gdzie mogą znajdować się reszty cysteiny. Jeśli pozostałości są obecne na powierzchni zewnętrznej, mogą być lepszym kandydatem do utworzenia wiązania dwusiarczkowego, a nie reszty cysteiny zakopanej wewnątrz struktury. Należy jednak zauważyć, że białka mogą ulegać zmianom strukturalnym w wyniku interakcji substratów lub interakcji białko-białko, dzięki czemu te reszty mogą być następnie wystawione na działanie środowiska.
Zidentyfikowane kompleksy multimeryczne mogą być następnie zweryfikowane za pomocą chemicznego sieciowania przy użyciu formaldehydu. Formaldehyd jest idealnym środkiem sieciującym dla tej techniki weryfikacji ze względu na wysoką przepuszczalność komórek i krótki zakres sieciowania wynoszący ~2-3 A, zapewniając wykrywanie specyficznych interakcji białko-białko9,10. Tutaj metoda ta jest zilustrowana analizą izoformy jądrowej dUTPazy z ludzkiej linii komórkowej kostniakomięsaka kości U-2 OS11. Jednak protokół ten można dostosować do innych linii komórkowych, tkanek i organizmów.

<table><tbody><tr><td>16% prefabrykowane żele TGX</td><td>ThermoFisher</td><td>Xp00160</td><td></td></tr><tr><td>175 cm2 Kolba</td><td>Cell star</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>18CO</td><td>ATCC</td><td>CRL-1459</td><td></td></tr><tr><td>6 cm2</td><td>talerz VWR</td><td>10861-588</td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Amersham ECL zestaw detekcyjny</td><td>GE</td><td></td><td></td>16817200</tr><tr><td>Aparat do przenoszenia plam</td><td>Biorad</td><td>153BR76789</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik białkowy Bradford</td><td>Biorad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol Blue</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA Sygnalizacja</td><td>komórkowa</td><td>99985</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy komórek</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>9803</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendor</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Wiertarka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M101</td><td></td></tr><tr><td>Aparat do elektroforezy</td><td>Invitrogen</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>Bardzo gruba bibuła zachodnia</td><td>ThermoFisher</td><td>88610</td><td></td></tr><tr><td>Płod Surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>1932693</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>ThermoFisher</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator</td><td></td><td></td><td></td>szklano-teflonowy</tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>65516</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>RPI</td><td>636050</td><td></td></tr><tr><td>Blok grzewczy</td><td>Denville</td><td>10285-D</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0527</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>VWR</td><td>2018010431</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>ThermoFisher</td><td>90034</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Pharmco</td><td>339000000</td><td></td></tr><tr><td>Beztłuszczowe mleko w proszku</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>99995</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>329-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Rurka Posi-click</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz</td><td>Biorad</td><td>200120</td><td></td></tr><tr><td>Marker wstępnie barwiony</td><td>ThermoFisher</td><td>26619</td><td></td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Biorad</td><td>162-0177</td><td></td></tr><tr><td>Rocker</td><td>Reliable Scientific</td><td>55</td><td></td></tr><tr><td>Saos2</td><td>ATCC</td><td>HTB-85</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Biorad</td><td>161-0302</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>70748</td><td></td></tr><tr><td>Skrobak do małych komórek</td><td>Tygon</td><td>S-50HL klasa VI</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>RPI</td><td>S23020</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>450</td><td></td></tr><tr><td>Gąbka do bibuły</td><td>Invitrogen</td><td>E19051</td><td></td></tr><tr><td>Płytka mieszająca</td><td>Corning</td><td>PC353</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-1888</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>RPI</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buforowana sól fizjologiczna, z Tween 20, pH 7,5</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SRE0031</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycine bufor do biegania</td><td>VWR</td><td>J61006</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>U-2 OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>Folia rentgenowska</td><td>ThermoFisher</td><td>34090</td><td></td></tr></tbody></table>

połączenie nieredukcyjnej analizy sds-page i chemicznego sieciowania w celu wykrycia kompleksów multimerycznych stabilizowanych wiązaniami dwusiarczkowymi w komórkach ssaków w hodowli

Combining Non-reducing SDS-PAGE Analysis and Chemical Crosslinking to Detect Multimeric Complexes Stabilized by Disulfide Linkages in Mammalian Cells in Culture

Struktury wielu białek są stabilizowane przez kowalencyjne wiązania dwusiarczkowe. W ostatnich pracach wiązanie to zostało również sklasyfikowane jako modyfikacja potranslacyjna. Dlatego ważne jest, aby móc badać tę modyfikację w żywych komórkach. Prostą metodą analizy tych stabilizowanych cysteiną kompleksów multimerycznych jest dwuetapowa metoda nieredukcyjnej analizy SDS-PAGE i sieciowania formaldehydu. Ta dwuetapowa metoda jest korzystna jako pierwszy krok do odkrycia kompleksów multimerycznych stabilizowanych wiązaniami dwusiarczkowymi ze względu na łatwość techniczną i niski koszt eksploatacji. W tym przypadku ludzka linia komórkowa kostniakomięsaka U-2 OS jest używana do zilustrowania tej metody poprzez specyficzną analizę izoformy jądrowej dUTPazy.

Jądrowa dUTPaza tworzy międzycząsteczkowe wiązanie dwusiarczkowe, tworząc stabilną konfigurację dimeru poprzez oddziaływanie dwóch reszt cysteiny znajdujących się na trzeciej pozycji aminokwasowej każdego białka monomerowego11. Zostało to przedstawione na Rysunku 1A,B. Aby upewnić się, że wiązanie dwusiarczkowe nie było niespecyficznym oddziaływaniem wynikającym z nieprawidłowości migracji w środowisku nieredukującym, ...

Od dawna wiadomo, że wiązania dwusiarczkowe stabilizują strukturę wielu białek. Prostą metodą analizy kompleksów multimerycznych stabilizowanych przez te wiązania jest nieredukcyjna analiza SDS-PAGE. Tutaj metoda ta jest zilustrowana poprzez analizę izoformy jądrowej dUTPazy z ludzkiej linii komórkowej kostniakomięsaka U-2 OS.

Połączenie nieredukcyjnej analizy SDS-PAGE i chemicznego sieciowania w celu wykrycia kompleksów multimerycznych stabilizowanych wiązaniami dwusiarczkowymi w komórkach ssaków w hodowli

The structures of many proteins are stabilized through covalent disulfide linkages. In recent work, this bond has also been classified as a ...

Powszechnie wiadomo, że struktury wielu białek są stabilizowane w kowalencyjnych wiązaniach dwusiarczkowych. W ostatnich pracach wiązanie to zostało sklasyfikowane jako modyfikacja potranslacyjna. Dlatego ważne jest, aby móc zidentyfikować stabilizowane cysteiną kompleksy multimerów w żywych komórkach za pomocą metody, która jest szybka i prosta.Główną zaletą tej techniki jest to, że wyniki można uzyskać i zinterpretować szybko, łatwo i przy minimalnych kosztach. Na początek hoduj komórki U-2 OS w naczyniu o powierzchni sześciu centymetrów kwadratowych w Minimum Essential Medium High Glucose, uzupełnionym 10% FBS i 1% pirogronianem sodu w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Przygotuj świeży zapas 10 milimolowego jodoacetamidu tuż przed użyciem.Gdy komórki osiągną konfluencję od 50 do 60%, dodaj 0,1 milimolowego jodoacetamidu o końcowym stężeniu bezpośrednio do pożywki do hodowli komórkowej. Delikatnie kołysz naczyniem w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Następnie odessać pożywkę z komórek i trzykrotnie umyć komórki pięcioma mililitrami zimnego PBS.Zassać końcowy roztwór płuczący PBS i dodać jeden mililitr zimnego PBS. Zeskrob komórki z dna naczynia za pomocą skrobaka do komórek. Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra narysuj PBS i zawiesinę komórek, a następnie dozuj cały płyn do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej.Obracaj komórki w temperaturze 7 500 razy g w czterech stopniach Celsjusza przez trzy minuty. Odessać PBS, pozostawiając osad komórkowy. Osad komórkowy można przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu przetworzenia.Aby wyekstrahować białko, przygotuj 100 mikrolitrów 1X buforu do lizy rozcieńczonego w podwójnie destylowanej wodzie. Dodać PMSF bezpośrednio przed użyciem do końcowego stężenia jednego milimola. Następnie dodaj 50 mikrolitrów buforu do lizy 1X bezpośrednio do osadu komórkowego i ponownie zawiesij.Inkubować ekstrakt na lodzie przez pięć minut. Sonikuj przez osiem sekund w trybie stałego impulsu na poziomie 40%utrzymując ekstrakt na lodzie. Wiruj ekstrakt w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 16 000 razy g przez pięć minut.W razie potrzeby wykonaj analizę Bradforda, aby określić stężenie białka. Aby przygotować próbkę, weź 10 mikrolitrów rozpuszczalnego ekstraktu białkowego i dodaj 10 mikrolitrów 1X buforu do próbek Laemmli SDS. Próbki należy przechowywać na lodzie.Podgrzewać próbkę w temperaturze 85 stopni Celsjusza przez pięć minut przed uruchomieniem żelu. Aby rozpocząć sieciowanie formaldehydu, hoduj komórki U-2 OS w kolbie o powierzchni 175 centymetrów kwadratowych do 70 do 80% konfluencji. W dygestorium dodać utrwalacz formaldehydu bezpośrednio do podłoża do końcowego stężenia 1% i inkubować w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem przez 15 minut.Aby ugasić reakcję, dodać 1,25 glicyny molowej do końcowego stężenia 0,125 mola i inkubować w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem na kołysku przez pięć minut. Umyj komórki pięcioma mililitrami zimnego PBS trzy razy. Zassać końcowy roztwór płuczący PBS i dodać 10 mililitrów PBS.Zeskrobać komórki z dna kolby za pomocą skrobaka do komórek. Za pomocą 10-mililitrowej pipety narysuj PBS i zawiesinę komórkową, a następnie dozuj cały płyn do 15-mililitrowej stożkowej probówki wirówkowej. Wiruj komórki 500 razy g i cztery stopnie Celsjusza przez dwie minuty.Odessać PBS, pozostawiając osad komórkowy. Przygotować 10 mililitrów buforu homogenizacyjnego, dodając 0,25 molowej sacharozy, jeden milimolowy EDTA, 10 milimolowy HEPES i 0,5% BSA przy pH 7,4. Bezpośrednio przed użyciem dodać PMSF do końcowego stężenia jednego milimola i trzech mililitrów buforu zawiesiny jąder.Dodaj pięć mililitrów buforu homogenizacyjnego bezpośrednio do osadu komórkowego i całkowicie zawieś. Odwirować zawiesinę w temperaturze 500 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez dwie minuty. Po odwirowaniu wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach buforu homogenizacyjnego.Następnie za pomocą ciasno dopasowanego szklanego homogenizatora teflonowego odbić homogenizuj komórki z prędkością 10 uderzeń na 500 obr./min i odwiruj zawiesinę przy 1,500 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Po odwirowaniu odrzucić supernatant. Zawiesić osad w jednym mililitrze buforu zawiesiny jąder i inkubować na lodzie przez 10 minut.Po inkubacji odwirować 600 razy g przez 10 minut. Po odwirowaniu wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu zawiesiny jąder i ponownie odwirować. Ostatnim osadem będą izolowane jądra.Wyekstrahuj białka zgodnie z opisem przed dodaniem 25 mikrolitrów buforu do lizy 1X bezpośrednio do osadu komórkowego. Następnie przygotuj dwie próbki do SDS PAGE, pobierając po 10 mikrolitrów rozpuszczalnego ekstraktu białkowego i dodając 10 mikrolitrów buforu do próbek 2X Laemmli SDS i jeden mikrolitr BME. Podgrzewaj jedną próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut, a drugą próbkę w temperaturze 98 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby odwrócić sieciowanie formaldehydu.Przygotuj jeden litr buforu do biegania 1X Tris-glycine, mieszając 25 milimolowych Tris, 192 milimolowych glicyn i 0,1% masy na objętość SD. Następnie skonfiguruj urządzenie do biegania SDS PAGE. Otwórz 16% prefabrykowany pakiet TGX SDS-PAGE zgodnie z protokołem producenta i wyjmij kasetę. Usuń grzebień wyściełający studzienki i taśmę z dna kasety i umieść żel w działającym aparacie.Napełnij komorę buforem biegowym 1X, aż studzienki zostaną zanurzone w cieczy. Za pomocą plastikowej pipety przepłucz studzienki działającym buforem. Załaduj próbki na żel wraz z 10 mikrolitrami wstępnie wybarwionego standardowego markera.Na koniec uruchom żel pod napięciem 200 woltów, aż przód barwnika znajdzie się około jednego centymetra od dna żelu. Analiza western blot całkowitych ekstraktów komórkowych przy braku czynnika redukującego BME wykazała tworzenie się kompleksów multimerycznych w różnych populacjach komórek ludzkich. Kompleks zniknął wraz z dodaniem BME we wszystkich czterech badanych liniach komórkowych, co wskazuje na obecność wiązania dwusiarczkowego.Monomeryczne potwierdzenie dUTPazy w komórkach ludzkich w czasie zbioru jest kombinacją co najmniej trzech izoform dUTPazy: izoformy mitochondrialnej, izoformy jądrowej i skróconej wersji odnotowanej w M24. Izoforma mitochondrialna zastosowana jako kontrola nie utworzyła wiązania dwusiarczkowego i migrowała do przewidywanej masy cząsteczkowej białka monomerycznego. Sieciowanie formaldehydu w jądrowej dUTPazie wykazało tworzenie kompleksów multimerycznych.Kiedy usieciowanie zostało odwrócone przez inkubację próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 15 minut, kompleks został zdestabilizowany i można go było uwidocznić w stanie monomerycznym. Dodanie jodoacetamidu jest ważnym krokiem w tej procedurze w celu zablokowania wolnych reszt cysteiny i zapewnienia, że wiązania dwusiarczkowe nie są konsekwencją procedury ekstrakcji. Ważne jest, aby pamiętać, aby nie dodawać żadnych środków redukujących, takich jak BME lub DDT, do próbek SDS-PAGE, ponieważ zmniejszy to wszelkie wiązania dwusiarczkowe obecne w próbce.

combining-non-reducing-sds-page-analysis-chemical-crosslinking-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Przepuszczalny przez błony komórkowe czynnik sieciujący DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizuje przejściowe i nietrwałe oddziaływania in vivo, co umożliwia ich izolację przy użyciu rygorystycznych technik oczyszczania kompleksów białkowych. W niniejszym materiale przedstawiamy technikę sieciowania komórek hodowlanych, a następnie izolacji kompleksów białkowych metodą immunoprecypitacji.

Izolacja nietrwałych kompleksów wielobiałkowych za pomocą kontrolowanego sieciowania komórkowego in vivo oraz immunomagnetycznej chromatografii powinowactwa

Związki wychwytujące (Capture Compounds) to trifunkcyjne małe cząsteczki służące do redukcji złożoności proteomu poprzez funkcjonalną, odwracalną oddziaływanie małej cząsteczki z białkiem, a następnie fotousieciowanie i oczyszczanie. W niniejszej procedurze wykorzystujemy związek wychwytujący z funkcją selektywności wiązania S-adenozylo-L-homocysteiny w celu wyizolowaniay metylotransferaz z lizatu całych komórek Escherichia coli oraz ich identyfikacji metodą MS.

Profilowanie metylotransferaz i innych białek wiążących S-adenozylo- L-homocysteinę za pomocą spektrometrii mas z wykorzystaniem związków wychwytujących (CCMS)

Ten film opisuje multimeryczną STRONĘ do oddzielania natywnych kompleksów białkowych od homogenatów tkankowych. Technika ta jest hybrydą niebieskich technik native-page i SDS-PAGE. Oddzielone kompleksy można scharakteryzować i zbadać pod kątem ich roli w funkcjonowaniu komórki.

Multimer-PAGE do separacji natywnych kompleksów białkowych: hybrydowa technika separacji składająca się z Blue native-PAGE i SDS-PAGE w celu oddzielenia nienaruszonych białek multimerycznych od lizatu tkankowego

Ten film opisuje technikę rozdzielania próbek białek za pomocą nieredukującego SDS-PAGE w celu analizy kompleksów białek multimerycznych. Technika ta zachowuje podjednostki multimeru białka utrzymywane przez wiązania dwusiarczkowe, które można później analizować za pomocą western blot.

Nieredukująca SDS PAGE: Metoda analizy wielomerycznych kompleksów białkowych połączonych dwusiarczkiem

Biofizyczne i biochemiczne badania interakcji między domenami białek osadzonych w błonie napotykają wiele wyzwań technicznych, z których pierwszym jest uzyskanie odpowiedniego materiału do badań. W artykule opisano protokół wytwarzania i oczyszczania stabilizowanych dwusiarczkiem transbłonowych kompleksów peptydowych, które nadają się do analizy strukturalnej za pomocą roztworu magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i innych zastosowań analitycznych.

Wytwarzanie stabilizowanych dwusiarczkiem transbłonowych kompleksów peptydowych do badań strukturalnych

Ten artykuł opisuje prosty i szybki protokół oceny oligomerycznego stanu białka GTPase MxA podobnego do dynaminy z lizatów komórek ludzkich przy użyciu kombinacji niedenaturującego PAGE z analizą western blot.

Charakterystyka wielopodjednostkowych kompleksów białkowych ludzkiego MxA przy użyciu niedenaturującej elektroforezy żelowej poliakryloamidu

Przedstawiono metodę stabilizacji i separacji natywnych kompleksów białkowych z niemodyfikowanego lizatu tkankowego za pomocą aminowo-reaktywnego białka sieciującego sprzężonego z nowatorskim dwuwymiarowym systemem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE).

Multimer-PAGE: Metoda wychwytywania i rozdzielania kompleksów białkowych w próbkach biologicznych

Architektura kompleksów białkowych jest niezbędna dla ich funkcjonowania. Połączenie różnych technik spektrometrii mas okazało się skuteczne w badaniu ich składania. Udostępniamy protokoły sieciowania chemicznego i natywnej spektrometrii mas oraz pokazujemy, w jaki sposób te uzupełniające się techniki pomagają wyjaśnić architekturę wielopodjednostkowych zespołów białkowych.

Połączenie chemicznego sieciowania i spektrometrii mas nienaruszonych kompleksów białkowych w celu zbadania architektury wielopodjednostkowych zespołów białkowych

Tutaj opisujemy wykorzystanie Grafix (Gradient Fixation), wirowania gradientu glicerolu w obecności środka sieciującego, do identyfikacji interakcji między czynnikami splicingowymi, które przejściowo wiążą się z kompleksem spliceosomów.

Wykorzystanie Grafixu do wykrywania przejściowych interakcji podkompleksów spliceosomów Saccharomyces cerevisiae

Obecny protokół podkreśla zmodyfikowaną metodę wykrywania i ilościowego oznaczania wiązań krzyżowych DNA-białko (DPC) oraz ich modyfikacji potranslacyjnych (PTM), w tym ubikwitylacji, SUMOylacji i ADP-rybozylacji indukowanej przez inhibitory topoizomerazy i formaldehyd, umożliwiając tym samym badanie powstawania i naprawy DPC i ich PTM.

Ilościowe wykrywanie wiązań krzyżowych DNA-białko i ich modyfikacji potranslacyjnych

Poznaj metodę analizy kompleksów multimerycznych stabilizowanych wiązaniami dwusiarczkowymi w komórkach ssaków przy użyciu nieredukcyjnej SDS-PAGE i chemicznego sieciowania. Technika ta umożliwia szybką i ekonomiczną identyfikację białek.

Połączenie nieredukcyjnej analizy SDS-PAGE i chemicznego sieciowania w celu wykrycia kompleksów multimerycznych stabilizowanych wiązaniami dwusiarczkowymi w komórkach ssaków w hodowli (Wideo) | JoVE Journal

Połączenie nieredukcyjnej analizy SDS-PAGE i chemicznego sieciowania w celu wykrycia kompleksów multimerycznych stabilizowanych wiązaniami dwusiarczkowymi w komórkach ssaków w hodowli

Przeglądaj więcej filmów