Połączenie nieredukcyjnej analizy SDS-PAGE i chemicznego sieciowania w celu wykrycia kompleksów multimerycznych stabilizowanych wiązaniami dwusiarczkowymi w komórkach ssaków w hodowli

Powszechnie wiadomo, że struktury wielu białek są stabilizowane w kowalencyjnych wiązaniach dwusiarczkowych. W ostatnich pracach wiązanie to zostało sklasyfikowane jako modyfikacja potranslacyjna. Dlatego ważne jest, aby móc zidentyfikować stabilizowane cysteiną kompleksy multimerów w żywych komórkach za pomocą metody, która jest szybka i prosta.

Główną zaletą tej techniki jest to, że wyniki można uzyskać i zinterpretować szybko, łatwo i przy minimalnych kosztach. Na początek hoduj komórki U-2 OS w naczyniu o powierzchni sześciu centymetrów kwadratowych w Minimum Essential Medium High Glucose, uzupełnionym 10% FBS i 1% pirogronianem sodu w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Przygotuj świeży zapas 10 milimolowego jodoacetamidu tuż przed użyciem.

Gdy komórki osiągną konfluencję od 50 do 60%, dodaj 0,1 milimolowego jodoacetamidu o końcowym stężeniu bezpośrednio do pożywki do hodowli komórkowej. Delikatnie kołysz naczyniem w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Następnie odessać pożywkę z komórek i trzykrotnie umyć komórki pięcioma mililitrami zimnego PBS.

Zassać końcowy roztwór płuczący PBS i dodać jeden mililitr zimnego PBS. Zeskrob komórki z dna naczynia za pomocą skrobaka do komórek. Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra narysuj PBS i zawiesinę komórek, a następnie dozuj cały płyn do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej.

Obracaj komórki w temperaturze 7 500 razy g w czterech stopniach Celsjusza przez trzy minuty. Odessać PBS, pozostawiając osad komórkowy. Osad komórkowy można przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu przetworzenia.

Aby wyekstrahować białko, przygotuj 100 mikrolitrów 1X buforu do lizy rozcieńczonego w podwójnie destylowanej wodzie. Dodać PMSF bezpośrednio przed użyciem do końcowego stężenia jednego milimola. Następnie dodaj 50 mikrolitrów buforu do lizy 1X bezpośrednio do osadu komórkowego i ponownie zawiesij.

Inkubować ekstrakt na lodzie przez pięć minut. Sonikuj przez osiem sekund w trybie stałego impulsu na poziomie 40%utrzymując ekstrakt na lodzie. Wiruj ekstrakt w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 16 000 razy g przez pięć minut.

W razie potrzeby wykonaj analizę Bradforda, aby określić stężenie białka. Aby przygotować próbkę, weź 10 mikrolitrów rozpuszczalnego ekstraktu białkowego i dodaj 10 mikrolitrów 1X buforu do próbek Laemmli SDS. Próbki należy przechowywać na lodzie.

Podgrzewać próbkę w temperaturze 85 stopni Celsjusza przez pięć minut przed uruchomieniem żelu. Aby rozpocząć sieciowanie formaldehydu, hoduj komórki U-2 OS w kolbie o powierzchni 175 centymetrów kwadratowych do 70 do 80% konfluencji. W dygestorium dodać utrwalacz formaldehydu bezpośrednio do podłoża do końcowego stężenia 1% i inkubować w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem przez 15 minut.

Aby ugasić reakcję, dodać 1,25 glicyny molowej do końcowego stężenia 0,125 mola i inkubować w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem na kołysku przez pięć minut. Umyj komórki pięcioma mililitrami zimnego PBS trzy razy. Zassać końcowy roztwór płuczący PBS i dodać 10 mililitrów PBS.

Zeskrobać komórki z dna kolby za pomocą skrobaka do komórek. Za pomocą 10-mililitrowej pipety narysuj PBS i zawiesinę komórkową, a następnie dozuj cały płyn do 15-mililitrowej stożkowej probówki wirówkowej. Wiruj komórki 500 razy g i cztery stopnie Celsjusza przez dwie minuty.

Odessać PBS, pozostawiając osad komórkowy. Przygotować 10 mililitrów buforu homogenizacyjnego, dodając 0,25 molowej sacharozy, jeden milimolowy EDTA, 10 milimolowy HEPES i 0,5% BSA przy pH 7,4. Bezpośrednio przed użyciem dodać PMSF do końcowego stężenia jednego milimola i trzech mililitrów buforu zawiesiny jąder.

Dodaj pięć mililitrów buforu homogenizacyjnego bezpośrednio do osadu komórkowego i całkowicie zawieś. Odwirować zawiesinę w temperaturze 500 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez dwie minuty. Po odwirowaniu wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach buforu homogenizacyjnego.

Następnie za pomocą ciasno dopasowanego szklanego homogenizatora teflonowego odbić homogenizuj komórki z prędkością 10 uderzeń na 500 obr./min i odwiruj zawiesinę przy 1,500 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Po odwirowaniu odrzucić supernatant. Zawiesić osad w jednym mililitrze buforu zawiesiny jąder i inkubować na lodzie przez 10 minut.

Po inkubacji odwirować 600 razy g przez 10 minut. Po odwirowaniu wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu zawiesiny jąder i ponownie odwirować. Ostatnim osadem będą izolowane jądra.

Wyekstrahuj białka zgodnie z opisem przed dodaniem 25 mikrolitrów buforu do lizy 1X bezpośrednio do osadu komórkowego. Następnie przygotuj dwie próbki do SDS PAGE, pobierając po 10 mikrolitrów rozpuszczalnego ekstraktu białkowego i dodając 10 mikrolitrów buforu do próbek 2X Laemmli SDS i jeden mikrolitr BME. Podgrzewaj jedną próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut, a drugą próbkę w temperaturze 98 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby odwrócić sieciowanie formaldehydu.

Przygotuj jeden litr buforu do biegania 1X Tris-glycine, mieszając 25 milimolowych Tris, 192 milimolowych glicyn i 0,1% masy na objętość SD. Następnie skonfiguruj urządzenie do biegania SDS PAGE. Otwórz 16% prefabrykowany pakiet TGX SDS-PAGE zgodnie z protokołem producenta i wyjmij kasetę. Usuń grzebień wyściełający studzienki i taśmę z dna kasety i umieść żel w działającym aparacie.

Napełnij komorę buforem biegowym 1X, aż studzienki zostaną zanurzone w cieczy. Za pomocą plastikowej pipety przepłucz studzienki działającym buforem. Załaduj próbki na żel wraz z 10 mikrolitrami wstępnie wybarwionego standardowego markera.

Na koniec uruchom żel pod napięciem 200 woltów, aż przód barwnika znajdzie się około jednego centymetra od dna żelu. Analiza western blot całkowitych ekstraktów komórkowych przy braku czynnika redukującego BME wykazała tworzenie się kompleksów multimerycznych w różnych populacjach komórek ludzkich. Kompleks zniknął wraz z dodaniem BME we wszystkich czterech badanych liniach komórkowych, co wskazuje na obecność wiązania dwusiarczkowego.

Monomeryczne potwierdzenie dUTPazy w komórkach ludzkich w czasie zbioru jest kombinacją co najmniej trzech izoform dUTPazy: izoformy mitochondrialnej, izoformy jądrowej i skróconej wersji odnotowanej w M24. Izoforma mitochondrialna zastosowana jako kontrola nie utworzyła wiązania dwusiarczkowego i migrowała do przewidywanej masy cząsteczkowej białka monomerycznego. Sieciowanie formaldehydu w jądrowej dUTPazie wykazało tworzenie kompleksów multimerycznych.

Kiedy usieciowanie zostało odwrócone przez inkubację próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 15 minut, kompleks został zdestabilizowany i można go było uwidocznić w stanie monomerycznym. Dodanie jodoacetamidu jest ważnym krokiem w tej procedurze w celu zablokowania wolnych reszt cysteiny i zapewnienia, że wiązania dwusiarczkowe nie są konsekwencją procedury ekstrakcji. Ważne jest, aby pamiętać, aby nie dodawać żadnych środków redukujących, takich jak BME lub DDT, do próbek SDS-PAGE, ponieważ zmniejszy to wszelkie wiązania dwusiarczkowe obecne w próbce.