Zapis elektroretinogramu u larw danio pręgowanego przy użyciu nowatorskiej elektrody gąbczastej w kształcie stożka
27 marca 2019
Tutaj prezentujemy protokół, który upraszcza pomiar odpowiedzi elektroretinogramu wywołanego światłem od larw danio pręgowanego. Nowatorska elektroda w kształcie stożka z końcówką gąbki może pomóc w łatwiejszym do osiągnięcia badaniu rozwoju wzrokowego u larw danio pręgowanego za pomocą elektroretinogramu ERG, zapewniając wiarygodne wyniki i obniżając koszty.
Protokół ten pomaga uprościć pomiary elektroretinogramów lub ERG u larw danio pręgowanego, co zapewnia ważny funkcjonalny odczyt rozwoju wzrokowego i modeli chorób genetycznych. Miękkie gąbczaste końcówki elektrod rejestrujących używane w tym protokole są łatwe do wyprodukowania przy użyciu ekonomicznych i łatwo dostępnych materiałów i pozwalają uniknąć potencjalnego uszkodzenia oczu larw. Bardziej miękka elektroda z gąbką może ułatwić wielokrotne pomiary ERG tego samego oka.
Osoby, które nie mają doświadczenia w tej procedurze, mogą mieć trudności z pracą w słabym czerwonym oświetleniu, które jest używane podczas całej procedury. Ale ważne jest, aby adaptacja do ciemności została utrzymana. Aby przygotować elektrodę rejestrującą z gąbki w kształcie stożka, odetnij koniec z przedłużenia elektrody platynowej i za pomocą skalpela usuń 10 milimetrów zewnętrznej powłoki izolacyjnej z politetrafluoroetylenu z nowego końca przedłużenia.
Wytnij 40-milimetrowy kawałek srebrnego drutu o średnicy 0,3 milimetra i spleć srebrny drut z odsłoniętym drutem wewnętrznym, aby bezpiecznie przymocować drut do przewodu elektrody. Owiń złącze taśmą izolacyjną, pozostawiając odsłonięty srebrny drut o długości około 15 milimetrów. Podłącz kolejny przewód do ujemnego zacisku akumulatora i zanurz drugi koniec przewodu w soli fizjologicznej.
Zanurz odsłonięty srebrny drut w zwykłej soli fizjologicznej i podłącz drugi koniec do dodatniego zacisku dziewięciowoltowego źródła prądu stałego. Po 60 sekundach umieść drut na chłonnej tkance do wyschnięcia. W międzyczasie wytnij kwadrat gąbki z polioctanu winylu o wymiarach 20 na 20 milimetrów w kształt stożka i nasącz gąbkę jednorazowo w buforze Ringera.
Pod mikroskopem świetlnym ze skalą na okularze użyj ostrza skalpela, aby ukształtować wierzchołek stożka do średnicy około 40 mikrometrów. Wysuszyć gąbkę w kształcie stożka na chłonnej bibułce, aż stanie się twarda. Przed włożeniem srebrnego drutu do wysuszonej gąbki z polioctanu winylu w kształcie stałego stożka przez podstawę stożka, użyj taśmy maskującej, aby zaizolować nadmiar odsłoniętego metalu w celu zmniejszenia artefaktów fotowoltaicznych.
W dniu eksperymentu zanurz elektrodę z końcówką gąbki w buforze Ringera na 15 minut, aby w pełni nasycić gąbkę. Co najmniej osiem godzin przed nagraniami umieść nie więcej niż 20 larw danio pręgowanego w jednej 15-mililitrowej probówce bez pokrywki i owiniętych folią aluminiową w ciemnym inkubatorze. Pod koniec inkubacji wlej przystosowanego do ciemności danio pręgowanego na szalkę Petriego przy słabym czerwonym oświetleniu diody elektroluminescencyjnej.
Aby przygotować platformę z biszkoptu, wytnij kawałek gąbki z polioctanu winylu o grubości mniej więcej równej głębokości 35-milimetrowej szalki Petriego, aby gąbka dobrze przylegała do naczynia. Wykonaj małe nacięcie pionowo przez jeden koniec gąbki, aby pomieścić srebrny drut elektrody referencyjnej i zanurz gąbkę w buforze złotej rybki Ringera, aż gąbka zostanie nasycona. Następnie umieść gąbkę na czystej szalce Petriego o grubości 35 milimetrów i użyj ręcznika papierowego, aby wchłonąć nadmiar płynu, aż żaden roztwór nie będzie wydzielał się z gąbki w odpowiedzi na lekkie naciśnięcie palca.
Aby ustawić zwierzę do eksperymentu, użyj trzymilimetrowej pipety Pasteura, aby przenieść znieczuloną larwę na kwadrat ręcznika papierowego o wymiarach trzy na trzy centymetry i użyj kleszczy, aby umieścić kwadrat na zwilżonej gąbce. Za pomocą cienkiej szczoteczki nasączonej buforem Ringera dostosuj pozycję larwy z jednym okiem skierowanym do góry, z dala od wszelkich płynów na ręczniku pod larwą. Pokryj ciało larwy nawilżającym żelem pod oczy, aby zwierzę było nawodnione przez cały zapis elektroretinogramu.
I umieść naczynie na małej, podgrzewanej wodą platformie przed bodźcem świetlnym miski Ganzfelda umieszczonym w klatce Faradaya. Włóż elektrodę referencyjną do nacięcia wykonanego w gąbce platformowej. I podłącz komercyjnie uzyskaną elektrodę uziemiającą do klatki Faradaya.
Przymocuj elektrodę nagrywającą do uchwytu elektrody i przymocuj uchwyt do ramienia stereotaktycznego mikromanipulatora. Za pomocą trzymilimetrowej pipety Pasteura ponownie nasącz gąbkową końcówkę elektrody jedną kroplą roztworu Ringera i umieść mikroskop w klatce Faradaya nad platformą elektroretinogramu. Za pomocą końcówki chłonnej chusteczki usuń nadmiar płynu z końcówki gąbki elektrody i pod mikroskopem ustaw aktywną elektrodę tak, aby końcówka gąbki delikatnie dotykała środkowej powierzchni rogówki oka larwy danio pręgowanego.
Następnie przesuń miskę Ganzfelda w kierunku platformy gąbki, uważając, aby larwa była przykryta miską i zamknij klatkę, aby zredukować zewnętrzny szum elektromagnetyczny. Wrażliwość siatkówki larwy danio pręgowanego na ciemniejsze błyski wzrasta wraz z wiekiem. Ponieważ fale a i b nie są rozpoznawalne przy intensywności niższej niż minus 1,61 logarytmu kandeli na metr kwadratowy po czterech dniach od zapłodnienia, podczas gdy wyraźne sygnały są wykrywalne przy tych intensywnościach u starszych larw.
Amplituda załamka b wzrasta wyraźnie między czterema a piątymi po zapłodnieniu. Po siedmiu dniach sygnał o wartości 2,48 log kandeli na metr kwadratowy jest większy w porównaniu z piątym i szóstym dniem po zapłodnieniu. Niejawny czas fali A i B staje się znacznie szybszy po pięciu dniach od zapłodnienia.
Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te wskazują na dojrzewanie funkcji siatkówki danio pręgowanego między czterema a siedmioma dniami po zapłodnieniu. Aby skutecznie wykonać ten protokół, ważne jest, aby gąbki były w pełni nasycone płynem, co pomaga utrzymać przewodność elektrody rejestrującej i obniża poziom szumów. Jeśli załamek A jest szczególnie interesujący, można zastosować leczenie farmakologiczne w celu zablokowania składowej załamka B, odsłaniając w ten sposób pełny załamek A.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół pomaga uprościć pomiary elektroretinogramów (ERG) u larw danio pręgowanego, zapewniając istotny odczyt funkcjonalny rozwoju wzroku oraz modeli chorób genetycznych. Zastosowanie nowatorskiej elektrody z gąbkową końcówką w kształcie stożka ułatwia uzyskanie wiarygodnych wyników, pozostając jednocześnie rozwiązaniem kosztowo efektywnym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Rozwój wzroku
Wprowadzenie
- Elektroretinogramy (ERG) są kluczowe dla oceny funkcji wzrokowych.
- Larwy danio pręgowanego służą jako model do badania rozwoju wzroku.
- Tradycyjne metody mogą wiązać się z ryzykiem uszkodzenia delikatnych oczu larw.
- Miękkie elektrody z gąbkową końcówką mogą zminimalizować to ryzyko.
Cel badania
- Uproszczenie pomiaru ERG u larw danio pręgowanego.
- Zapewnienie niezawodnej metody badania rozwoju wzroku.
- Umożliwienie wielokrotnych pomiarów bez wyrządzania szkody badanym osobnikom.
Zastosowane metody
- Przygotowanie stożkowych gąbkowych elektrod rejestrujących.
- Zastosowanie słabego czerwonego oświetlenia w celu utrzymania adaptacji do ciemności.
- Wytwarzanie elektrod z materiałów ekonomicznych.
- Wielokrotna rejestracja ERG z tego samego oka.
Główne wyniki
- Elektrody z gąbkową końcówką są łatwe w wykonaniu i użytkowaniu.
- Zapobiegają one uszkodzeniom oczu larw zebrafish.
- Ułatwione powtórne pomiary ERG dają spójne wyniki.
- Utrzymanie adaptacji do ciemności jest kluczowe dla uzyskania dokładnych odczytów.
Wnioski
- Protokół zapewnia wiarygodną i kosztowo efektywną metodę pomiarów ERG.
- Usprawnia on badanie rozwoju wzroku u danio pręgowanych.
- Przyszłe badania mogą odnieść korzyść z zastosowania tego uproszczonego podejścia.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół przedstawia kostu-efektywną, powtarzalną metodę funkcjonalnej oceny rozwoju wzroku u larw zebrafish, kluczowego modelu w walidacji celów w procesie odkrywania leków w neurobiologii. Nowoczesna elektroda z gąbkową końcówką redukuje bariery techniczne oraz uszkodzenia tkanek, umożliwiając wiarygodne odczyty ERG, które wspierają mechanisticyczną minimalizację ryzyka w badaniach szlaków siatkówki. Prostota tej metody ułatwia standaryzację testów pomiędzy laboratoriami, zwiększając pewność prognostyczną we wczesnych etapach przesiewowych funkcji wzrokowych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie szlaków funkcji siatkówki poprzez pomiary fali a i b, co wspiera testowanie hipotez w obrębie neuronauki wzroku.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje ekonomiczne, łatwo dostępne materiały, aby obniżyć bariery w ustanawianiu testów ERG w procesach walidacji celów.
- Wartość prognostyczna: Zapewnia ilościowe, powtarzalne odczyty elektrofizjologiczne, które pomagają zminimalizować ryzyko związane z założeniami mechanistycznymi dotyczącymi wpływu genów lub związków na przetwarzanie w siatkówce.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje spójne amplitudy i czasy utajenia fal a i b jako ilościowe biomarkery dojrzewania i funkcji siatkówki.
- Wartość operacyjna: Łatwość wykonania i obsługi elektrody wspiera powtarzalność testu oraz skalowalność w badaniach przesiewowych o średniej przepustowości.
- Gotowość do analizy: Umożliwia wiarygodną ocenę związków poprzez zapewnienie stabilnych, nieinwazyjnych pomiarów odpowiednich do badań podłużnych prowadzonych na tym samym oku larwy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wspiera modelowanie istotne dla przebiegu chorób poprzez śledzenie funkcjonalnego dojrzewania wzroku od 4. do 7. dnia po zapłodnieniu, co jest zgodne z krytycznymi oknami w modelach chorób genetycznych.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia farmakologiczną izolację komponentów fali a w celu rozdzielenia wkładu fotoreceptorów i komórek bipolarnych, co poprawia specyficzność celu.
- Użyteczność przedkliniczna: Zapewnia czułą detekcję zmian funkcjonalnych w różnych etapach rozwoju, pomagając w ocenie zależności dawka-odpowiedź oraz przebiegu czasowego.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania – od walidacji celu po ocenę przedkliniczną – stanowiąc funkcjonalny pomost między manipulacją genetyczną a wynikiem fenotypowym w badaniach nad układem wzrokowym.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez pomiar odpowiedzi elektrofizjologicznych siatkówki na bodźce świetlne, wyjaśniając aktywność szlaków w rozwijających się danio pręgowanych.
- Przesiew: Dostarcza zestandaryzowane wyniki ERG o niskim poziomie szumów, co umożliwia porównania między różnymi warunkami genetycznymi lub terapeutycznymi.
- Analityka: Dostarcza mierzalne zmienne zależne (amplituda fali a, amplituda fali b, czasy utajenia) do statystycznego porównania funkcji siatkówki.
- Badania translacyjne: Łączy rozwojowe zmiany elektrofizjologiczne z modelami chorób, wspierając dopasowanie biomarkerów w zaburzeniach widzenia.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku, niskokosztową platformę do testów ERG, która może być współdzielona w projektach badających geny siatkówki, toksyny lub potencjalne leki.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez bezpośredni, funkcjonalny pomiar aktywności neuronów siatkówki.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i redukuje zmienność dzięki standaryzowanemu przygotowaniu elektrod oraz warunkom rejestracji w ciemności.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczenie wczesnych danych funkcjonalnych na temat integralności układu wzrokowego, co zmniejsza ryzyko niepowodzenia na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków lub celów genetycznych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o obiektywne wyniki funkcjonalne narządu wzroku.
Kwestie implementacyjne
- Wymagana jest wiedza z zakresu elektrofizjologii oraz doświadczenie w pracy z danio pręgowanym w celu zachowania integralności sygnału.
- Konieczność wykorzystania podstawowego sprzętu elektronicznego i mikroskopowego do wykonania elektrod oraz akwizycji sygnału.
- Wymagane jest stosowanie ustandaryzowanych protokołów adaptacji do ciemności oraz perfuzji solnej przez wszystkich użytkowników w celu zapewnienia porównywalności wyników.
- Kwestie adaptacyjne obejmują dostosowanie rozmiaru elektrod i składu soli fizjologicznej do różnych grup wiekowych larw lub gatunków.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wrażliwość na poziomy nasycenia elektrod oraz światło otoczenia, które musi być kontrolowane w celu zminimalizowania szumów.
