Name: Zapis elektroretinogramu u larw danio pręgowanego przy użyciu nowatorskiej elektrody gąbczastej w kształcie stożka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Poznaj uproszczoną metodę pomiaru elektroretinogramów u larw Danio rerio przy użyciu nowatorskiej elektrody gąbczastej. Technika umożliwia wielokrotne badania bez uszkadzania oczu i wspiera badania nad rozwojem wzroku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie tego projektu zostało zapewnione przez grant z Melbourne Neuroscience Institute (dla PTG, PRJ & BVB).

Wszystkie procedury elektroretinogramu (ERG) zostały wykonane zgodnie z postanowieniami kodeksu postępowania Australijskiej Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych w zakresie opieki i użytkowania zwierząt i zostały zatwierdzone przez instytucjonalną komisję etyki zwierząt na Uniwersytecie w Melbourne.
1. Przygotowanie bufora
<ol>
	<li>Przygotuj 10x bufor Ringera złotej rybki (1,25 M NaCl, 26 mM KCl, 25 mm CaCl2, 10 mM MgCl2, 100 mM glukozy, 100 mM HEPES) za pomocą wody z odwróconej osmozy (RO). Dostosuj bufor do pH 7,8 i wysterylizuj bufor za pomocą filtra 0,22 μm. Przechowywać bufor 10x w temperaturze 4 °C jako roztwór stock3. 
	nuta: Bufor 10x Ringera powinien być zużyty w ciągu 3 miesięcy.</li>
	<li>W dniu eksperymentu przygotuj 1x bufor Ringera złotej rybki, rozcieńczając 10x bufor złotej rybki Ringera za pomocą wody z odwróconej osmozy. 
	nuta: 1x bufor Ringera złotej rybki służy do nasycania gąbki PVA, w tym gąbki używanej do umieszczania larw danio pręgowanego oraz gąbki na końcówce elektrody rejestrującej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie elektrody
<ol>
	<li>Przygotuj elektrodę rejestrującą w kształcie stożka z gąbki.
	<ol>
		<li>Odetnij męski koniec z przedłużenia elektrody platynowej i usuń z końca 10 mm zewnętrznej powłoki izolacyjnej z politetrafluoroetylenu za pomocą ostrza skalpela. Uważaj, aby nie uszkodzić wewnętrznego przewodu elektrody.</li>
		<li>Wytnij srebrny drut o długości 40 mm (średnica 0.3 mm) i bezpiecznie przymocuj go do przewodu elektrody, splatając srebrny drut z odsłoniętym drutem wewnętrznym. Owiń złącze taśmą izolacyjną, pozostawiając odsłonięty drut srebrny o długości ~15 mm (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
		<li>Odsłonięty srebrny drut należy pogalwanizować chlorkiem za pomocą źródła 9 V DC przez 60 s, aby poprawić przewodzenie sygnału. Zanurz odsłoniętą srebrną końcówkę w zwykłej soli fizjologicznej i podłącz drugi koniec do dodatniego bieguna akumulatora. Podłącz kolejny przewód do ujemnego zacisku akumulatora i zanurz drugi koniec przewodu w soli fizjologicznej2. 
		nuta: Alternatywnie, chloruj srebrny drut, mocząc go przez 1 godzinę w roztworze wybielacza (substancja czynna 42 g/l podchlorynu sodu).</li>
		<li>Wytnij kwadrat gąbki PVA o wymiarach ~20 mm x 20 mm za pomocą nożyczek, aby uzyskać stożek (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Nasącz gąbkę za pomocą 1x bufora Ringera. Pod mikroskopem ze skalą na okularze użyj ostrza skalpela, aby ukształtować wierzchołek stożka do średnicy ~40 μm. Wysuszyć na powietrzu gąbkę w kształcie stożka na chłonnej chusteczce papierowej, aż stanie się twarda. 
		nuta: Gąbka PVA znacznie się rozszerza po nasyceniu, dlatego ważne jest, aby gąbka została najpierw nasycona solą fizjologiczną przed ukształtowaniem wierzchołka stożka.</li>
		<li>Po chlorowaniu wysuszyć drut srebrny na powietrzu na chusteczce chłonnej przez 5 minut. Włóż srebrny drut do wysuszonej, solidnej gąbki PVA w kształcie stożka przez podstawę stożka. Zaizoluj nadmiar odsłoniętego metalu za pomocą taśmy maskującej, aby zmniejszyć artefakty fotowoltaiczne (Rysunek 1B-C). 
		nuta: Po każdej sesji eksperymentalnej wyjmij gąbkę ze srebrnego drutu. Umyj gąbkę wodą z odwróconej osmozy i wysusz na powietrzu do ponownego użycia. Aby zapewnić optymalne zbieranie sygnału, zaleca się jednorazowe użycie srebrnego drutu. Gąbek PVA nie należy używać ponownie więcej niż 5 razy.</li>
		<li>W dniu eksperymentu zanurz gąbkową końcówkę elektrody nagrywającej w buforze 1x Ringera na co najmniej 15 minut, aby w pełni nasycić gąbkę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj elektrody referencyjne zgodnie z powyższym opisem, ale bez zakładania końcówki gąbki.</li>
	<li>Elektrodę uziemiającą należy zaopatrzyć się komercyjnie.</li>
</ol>
3. Przygotowanie danio pręgowanego
<ol>
	<li>Larwy danio pręgowanego w ciemności przystosowują się przez noc (>8 godzin) przed nagraniami, umieszczając danio pręgowanego w probówce o pojemności 15 ml (<20 larw na probówkę) owiniętej folią aluminiową w ciemnym inkubatorze. Zdejmij pokrywę, aby zapewnić odpowiedni dopływ tlenu.</li>
	<li>W dniu nagrania dokręć pokrywkę do owiniętej folią probówki sokoła zawierającej larwy i upewnij się, że probówka jest światłoszczelna. Transport larw do laboratorium ERG.</li>
	<li>Wlej rybę na szalki Petriego w ciemności przy pomocy słabego czerwonego oświetlenia z diody elektroluminescencyjnej (LED; 17,4 cd.m-2,λ max 600 nm). Przykryj szalki Petriego ręcznikami odpornymi na światło, aby zminimalizować ekspozycję na światło.</li>
</ol>
4. Przygotowanie platformy gąbczastej
<ol>
	<li>Wytnij prostokąt suchej gąbki PVA, aby dokładnie pasował do szalki Petriego o średnicy 35 mm. Upewnij się, że grubość gąbki powinna być mniej więcej równa głębokości szalki Petriego.</li>
	<li>Wykonaj małe nacięcie pionowo przez jeden koniec gąbki, aby pomieścić srebrny drut elektrody referencyjnej.</li>
	<li>Namocz gąbkę PVA w 1x buforze złotej rybki Ringera, aż będzie nasycona. Następnie umieść gąbkę na czystej szalce Petriego o średnicy 35 mm. Użyj ręcznika papierowego, aby wchłonąć dodatkowy płyn, aż roztwór nie będzie wyciekał z gąbki w odpowiedzi na lekkie naciśnięcie palca.</li>
</ol>
5. Pozycjonowanie zwierząt i elektrod
<ol>
	<li>Znieczulić larwy za pomocą 0,02% trikainy rozcieńczonej w 1x buforze Ringera złotej rybki.</li>
	<li>Za pomocą pipety Pasteura o pojemności 3 ml przenieś znieczuloną larwę na kwadrat ręcznika papierowego (~3 cm2).</li>
	<li>Umieść ręcznik papierowy zawierający larwę na wilgotnej platformie z gąbki za pomocą kleszczy. Użyj cienkiej szczoteczki nasączonej buforem Ringera, aby dostosować pozycję larwy. Upewnij się, że jedno oko jest skierowane do góry, odizolowane od wszelkich pobliskich płynów na kwadracie ręcznika papierowego pod larwą.</li>
	<li>Ciało larwy, z wyłączeniem głowy, należy polać nawilżającym żelem pod oczy, aby larwa była wilgotna przez cały czas trwania zapisu ERG.</li>
	<li>Umieść szalkę Petriego z platformą z gąbką na małej platformie podgrzewanej wodą przed bodźcem świetlnym miski Ganzfelda umieszczonym wewnątrz klatki Faradaya (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1D). 
	nuta: Utrzymanie temperatury gąbki i ciała larwy zapewnia stabilne sygnały ERG.</li>
	<li>Włóż elektrodę referencyjną do nacięcia wykonanego w gąbce platformy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D).</li>
	<li>Podłącz uzyskaną w handlu elektrodę uziemiającą do klatki Faradaya.</li>
	<li>Przymocuj elektrodę rejestrującą do uchwytu elektrody i przymocuj uchwyt do ramienia stereotaktycznego mikromanipulatora (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D). Użyj pipety Pasteura o pojemności 3 ml, aby wlać jedną kroplę 1x roztworu Ringera na gąbczastą końcówkę elektrody w celu ponownego nasycenia.</li>
	<li>Umieść mikroskop w klatce Faradaya nad platformą ERG w celu umieszczenia elektrody. 
	nuta: Oświetlenie powinno być zapewnione przez przyciemnioną czerwoną diodę LED (17,4 cd.m-2,λ max 600 nm), aby umożliwić obserwację larwy i umiejscowienie elektrody aktywnej, przy zachowaniu adaptacji do ciemności.</li>
	<li>Dostosuj położenie platformy gąbki, aby umożliwić obserwację larwy pod mikroskopem. Następnie za pomocą chusteczki chłonnej usuń nadmiar płynu z końcówki gąbki elektrody.</li>
	<li>Ustaw aktywną elektrodę tak, aby delikatnie dotykała środkowej powierzchni rogówki oka larwy danio pręgowanego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E).</li>
	<li>Przesuń miskę Ganzfelda w kierunku platformy z gąbką i upewnij się, że larwa jest przykryta miską.</li>
	<li>Zamknij klatkę Faradaya, aby zredukować zewnętrzny szum elektromagnetyczny.</li>
</ol>
6. Zapis elektroretinogramu
<ol>
	<li>Użyj oprogramowania komputerowego danego systemu ERG (szczegółowe informacje można znaleźć w Tabeli materiałów), aby wyzwolić bodziec i uzyskać dane w oparciu o ustawienia zalecane poniżej2.
	<ol>
		<li>Ustaw częstotliwość próbkowania systemu na 4 kHz w oknie nagrywania 650 ms (2 560 punktów) w oprogramowaniu do akwizycji.</li>
		<li>Ustaw wzmocnienie systemu na 1,000×.</li>
		<li>Ustaw filtrowanie pasmowo-przepustowe systemu na 1–300 Hz.</li>
		<li>Użyj filtra wycinającego, aby zredukować szumy 60 Hz (lub 50 Hz, w zależności od lokalnej częstotliwości użytkowej). 
		nuta: Idealny poziom hałasu nie powinien przekraczać ±10 μV.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpocznij zbieranie danych, postępując zgodnie z procedurą opisaną poniżej.
	<ol>
		<li>Użyj pojedynczego błysku testowego (0,06 log cd.s/m2), aby zmierzyć odpowiedź testową oka w celu oceny położenia elektrod. 
		nuta: Taka intensywność badanego błysku powinna skutkować amplitudą fali b większą niż 25 μV u larw 4 dpf. Jeśli nie można zmierzyć solidnej odpowiedzi, zmień położenie elektrod i wykonaj kolejny błysk testowy, aby potwierdzić, że elektrody są dobrze ustawione.</li>
		<li>Po błysku testowym pozwól zwierzęciu przystosować się do ciemności przez 3 minuty w całkowitej ciemności przed nagraniami.</li>
		<li>Obecne błyski od ciemniejszego do jaśniejszego natężenia światła.</li>
		<li>Średnia liczba sygnałów w powtórzeniach zgodnie z poziomem sygnału do szumu. 
		nuta: Ogólnie rzecz biorąc, uśredniaj więcej sygnałów przy ciemniejszych poziomach światła (nie mniej niż 3 powtórzenia) i mniej przy jaśniejszych poziomach światła (zwykle 1 powtórzenie). Stopniowo wydłużaj interwał między bodźcami od 10 do 60 s od najciemniejszego do najjaśniejszego poziomu światła. Przykładowy protokół przedstawiono w tabeli 1.</li>
		<li>Po nagraniach humanitarnie zabić larwy za pomocą 0,1% tricainy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Analiza
<ol>
	<li>Zmierz amplitudę fali a od linii podstawowej do ujemnego dołka fali a oraz amplitudę fali b od ujemnej doliny fali a do dodatniego szczytu fali b.</li>
	<li>Zmierz niejawne czasy fali a i b od początku bodźca do dołka fali a i szczytu fali b, odpowiednio.</li>
</ol>

<ol><li>Roper, C., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoper%2C+C+%22Handbook+of+Developmental+Neurotoxicology+%28Second+Edition%29%22">Handbook of Developmental Neurotoxicology (Second Edition)</a>. Slikker, W., Paule, M. G., Wang, C. , Academic Press. 143-151 (2018).</li>
<li>Nguyen, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Recording+of+Electroretinography+and+Visual+Evoked+Potentials+in+Anesthetized+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. , e54158(2016).</li>
<li>Chrispell, J. D., Rebrik, T. I., Weiss, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroretinogram+analysis+of+the+visual+response+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+expriment%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Electroretinogram analysis of the visual response in zebrafish larvae.</a> Journal of visualized expriment: JoVE. (97), (2015).</li>
<li>Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganzfeld+ERG+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Documenta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Ganzfeld ERG in zebrafish larvae.</a> Documenta Ophthalmologica. 104 (1), 57-68 (2002).</li>
<li>Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroretinogram+%28ERG%29+Measurements+in+Larval+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb prot4973 (2008).</li>
<li>Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+and+functionality+at+the+cone+terminal+of+the+developing+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiololgy%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity and functionality at the cone terminal of the developing zebrafish retina.</a> Developmental Neurobiololgy. 56 (3), 222-236 (2003).</li>
<li>Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+visual+system+of+zebrafish+and+its+use+to+model+human+ocular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiololgy%22%5BJournal%5D)">The visual system of zebrafish and its use to model human ocular diseases.</a> Developmental Neurobiololgy. 72 (3), 302-327 (2012).</li>
<li>Saszik, S., Bilotta, J., Givin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERG+assessment+of+zebrafish+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ERG assessment of zebrafish retinal development.</a> Visual Neuroscience. 16 (5), 881-888 (1999).</li>
<li>Niklaus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+accumulation+in+zebrafish+eyes+leads+to+augmented+amplitudes+in+the+electroretinogram%5BTitle%5D)+AND+%22Matters%22%5BJournal%5D)">Cocaine accumulation in zebrafish eyes leads to augmented amplitudes in the electroretinogram.</a> Matters. 3 (6), e201703000003(2017).</li>
<li>Tanvir, Z., Nelson, R. F., DeCicco-Skinner, K., Connaughton, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+month+of+hyperglycemia+alters+spectral+responses+of+the+zebrafish+photopic+ERG%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+models+%26+mechanisms%22%5BJournal%5D)">One month of hyperglycemia alters spectral responses of the zebrafish photopic ERG.</a> Disease models & mechanisms. , dmm. 035220 (2018).</li>
<li>Kakiuchi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillatory+potentials+in+electroretinogram+as+an+early+marker+of+visual+abnormalities+in+vitamin+A+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+medicine+reports%22%5BJournal%5D)">Oscillatory potentials in electroretinogram as an early marker of visual abnormalities in vitamin A deficiency.</a> Molecular medicine reports. 11 (2), 995-1003 (2015).</li>
<li>Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+larvae+lose+vision+at+night%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Zebrafish larvae lose vision at night.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2010).</li>
<li>Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inexpensive+device+for+non-invasive+electroretinography+in+small+aquatic+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates.</a> Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 205-210 (2004).</li>
<li>Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod+contributions+to+the+electroretinogram+of+the+dark-adapted+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 222 (4), 564-570 (2001).</li>
<li>Cameron, M. A., Barnard, A. R., Lucas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electroretinogram+as+a+method+for+studying+circadian+rhythms+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+genetics%22%5BJournal%5D)">The electroretinogram as a method for studying circadian rhythms in the mammalian retina.</a> Journal of genetics. 87 (5), 459-466 (2008).</li>
<li>Bui, B. V., Armitage, J. A., Vingrys, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+modelling+of+oscillatory+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Documenta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Extraction and modelling of oscillatory potentials.</a> Documenta Ophthalmologica. 104 (1), 17-36 (2002).</li>
<li>Bui, B. V., Fortune, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglion+cell+contributions+to+the+rat+full-field+electroretinogram%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram.</a> The Journal of Physiology. 555 (1), 153-173 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie posiadają żadnych ujawnień związanych z tą pracą.

Odczyty funkcjonalne, takie jak ERG, stają się coraz ważniejsze w zestawie narzędzi wykorzystywanych do badania larw danio pręgowanego 8,9,12,14. Ze względu na niewielki rozmiar oka larwy danio pręgowanego, szklane mikropipety zostały przystosowane jako elektrody rejestrujące w większości opublikowanych protokołów 3,4,5,8,9,12,13,14.<s...

Danio rerio danio pręgowany (Danio rerio) stał się szeroko stosowanym genetycznym modelem kręgowców, włączając w to badania neuronauk wizualnych. Rosnąca popularność tego gatunku może być przypisana zaletom, takim jak łatwość manipulacji genetycznej, wysoce zachowany układ wzrokowy kręgowców (typy neuronów, anatomiczna morfologia i organizacja oraz podstawowa genetyka), wysoka płodność i niższe koszty hodowli w porównaniu z modelami ssaków1. Nieinwazyjny elektroretinogram (ERG) jest od dawna stosowany klinicznie do oceny funkcji wzrokowych człowieka, a w warunkach laboratoryjnych do ilościowego określania widzenia u wielu dużych i małych gatunków, w tym gryzoni i larw danio pręgowanego2,3,4,5. Najczęściej analizowanymi składowymi ERG są załamki a i b, pochodzące odpowiednio z fotoreceptorów wyczuwających światło i interneuronów dwubiegunowych. U larw danio pręgowanego wyraźne warstwy siatkówki powstają po 3 dniach od zapłodnienia (dpf), a morfologia synaps końcowych stożków fotoreceptorów dojrzewa przed 4 dpf6,7. Zewnętrzna funkcja siatkówki larw danio pręgowanego jest zatem ustalana przed 4 dpf, co oznacza, że ERG można zmierzyć od tak wczesnego wieku. Ze względu na krótki cykl eksperymentalny i wysokoprzepustowość modelu, ERG został zastosowany do larw danio pręgowanego do oceny funkcjonalnej modeli chorobowych, analizy widzenia kolorów i rozwoju siatkówki, badania wizualnych rytmów okołodobowych i testowania leków8,9,10,11,12.
Jednak obecne podejścia do larw danio pręgowanego ERG mają pewne zawiłości, które mogą utrudnić jego adaptację. Opublikowane protokoły ERG larw danio pręgowanego powszechnie używają szklanej mikropipety wypełnionej cieczą przewodzącą jako elektrody rejestrującej3,4,5,13, co wymaga wysokiej jakości końcówki do mikropipety3. Do ich produkcji wymagany jest specjalistyczny sprzęt, taki jak ściągacz do mikropipet, a w niektórych przypadkach mikrokuźnia. Może to stanowić wyzwanie dla laboratoriów o ograniczonych zasobach i prowadzić do dodatkowych kosztów, nawet w przypadku dostosowania dostępnych systemów ERG dla małych zwierząt do pomiaru funkcji wzrokowych larw danio pręgowanego. Ostra końcówka mikropipety może nawet po wygładzeniu uszkodzić powierzchnię oka larwy. Dodatkowo, dostępne na rynku uchwyty do mikropipet do elektrofizjologii są zbudowane ze stałego srebrnego drutu. Te stałe przewody ulegają pasywacji po wielokrotnym użytkowaniu, co wymaga zakupu nowych uchwytów, co prowadzi do zwiększenia kosztów konserwacji.
Tutaj opisujemy metodę ERG wykorzystującą elektrodę rejestrującą w kształcie stożka z gąbką, która jest szczególnie przydatna do adaptacji ustalonych ustawień ERG dla małych zwierząt do pomiarów ERG larw danio pręgowanego. Elektrodę można łatwo wykonać przy użyciu zwykłej gąbki z polioctanu winylu (PVA) i cienkiego drutu srebrnego bez żadnego innego specjalistycznego sprzętu. Nasze dane pokazują, że ta nowatorska elektroda jest wystarczająco czuła i niezawodna, aby zademonstrować funkcjonalny rozwój obwodów nerwowych siatkówki u larw danio pręgowanego w zakresie od 4 do 7 dpf. Ta ekonomiczna i praktyczna elektroda z gąbkową końcówką może być przydatna dla naukowców tworzących nowe systemy ERG lub modyfikujących istniejące systemy dla małych zwierząt do badań nad danio pręgowanymi.

<table><tbody><tr><td>0,22 &mikro; m filtr</td><td>Millex GP</td><td>SLGP033RS</td><td>Filtruje 10&razy; bufor dzwonka złotej rybki do sterylizacji</td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>Terumo</td><td>DVR-5175</td><td>Z 30G &times; &frac12; " do dodawania kropli soli fizjologicznej do końcówki gąbki elektrody, aby zapobiec wysuszeniu i zwiększonemu szumowi w sygnałach ERG.</td></tr><tr><td>30 G & razy; &frac12; " igła</td><td>Terumo</td><td>NN*3013R</td><td>Do dodawania soli fizjologicznej do elektrody z końcówką soli fizjologicznej.</td></tr><tr><td>Instrumenty biowzmacniacza</td><td></td><td>ML135</td><td>Do wzmacniania sygnałów ERG.</td></tr><tr><td>Roztwór wybielacza&nbsp;</td><td>King White</td><td>9333441000973</td><td>Alternatywna metoda chlorowania elektrod srebrnych. Substancja czynna: 42 g/l podchlorynu sodu.</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>cyrkulacyjna Lauda-Ko?nigshoffen</td><td>MGW Lauda</td><td>Służy do wykonania podgrzewanej wodą platformy.</td></tr><tr><td></td><td>Grass Telefactor</td><td>F-E2-30</td><td>Platinum do łączenia elektrod z drutem srebrnym do wzmacniacza.</td></tr><tr>Międzynarodowe rozwiązanie fotometryczne <td>Faradaya</td><td>Cage'a&nbsp;</td><td></td><td>Do utrzymania adaptacji do ciemności i zamknięcia konfiguracji Ganzfeld w celu poprawy stosunku sygnału do szumu.</td></tr><tr>Rozwiązanie fotometryczne <td>Ganzfeld Bowl</td><td>International&nbsp;</td><td></td><td>Specjalnie zaprojektowany stymulator światła: średnica 36 mm, rozmiar apertury 13 cm.</td></tr><tr><td>Luksusowe diody LED</td><td>Phillips Light Co.</td><td></td><td>Do stymulacji światłem dwadzieścia diod LED o mocy 5 W i jedna o mocy 1 W.</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Aparat Harvard</td><td>BS4 50-2625</td><td>Trzyma elektrodę rejestrującą podczas eksperymentów.</td></tr><tr><td>Microsoft Office Excel</td><td>Microsoft</td><td>wersja 2010</td><td>Arkusz kalkulacyjny do analizy danych.</td></tr><tr><td>Nawilżający żel pod oczy</td><td>GenTeal Gel</td><td>9319099315560</td><td>Służy do pokrywania larw danio pręgowanego podczas nagrań, aby uniknąć odwodnienia. Składnik aktywny: 0,3 % hypromeloza i 0,22 % karbomer 980.</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura</td><td>Copan</td><td>200C</td><td>Służy do ostrożnego przenoszenia larw danio pręgowanego.</td></tr><tr><td>System akwizycji danych Powerlab</td><td>ADInstruments</td><td>ML785</td><td>Steruje diodami LED w celu generowania bodźców.</td></tr><tr><td>Gąbka PVA</td><td>MeiCheLe</td><td>R-1675</td><td>Do umieszczania larw danio pręgowanego i wytwarzania elektrody w kształcie stożka ti</td></tr><tr><td>Roztwór soli</td><td>fizjologicznej Aaxis Pacific</td><td>13317002</td><td>Do galwanizacji elektrody srebrnej.</td></tr><tr><td>Scope Software</td><td>ADInstruments</td><td>wersja 3.7.6</td><td>Jednocześnie wyzwala bodziec przez system Powerlab i zbiera dane</td></tr><tr><td>Srebro (cienki drut okrągły)</td><td>A& E metal</td><td>0,3 mm</td><td>Służy do wykonywania elektrod rejestrujących i referencyjnych ERG.</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy&nbsp;</td><td>Leica</td><td>M80</td><td>Służy do kształtowania i mierzenia wierzchołka gąbki w kształcie stożka (z paskiem skali na okularze). Umieszczony w klatce Faradaya w celu umieszczenia elektrody.</td></tr><tr><td>Trikaina&nbsp;</td><td>Sigma-aldrich</td><td>E10521-50G</td><td>Do znieczulania larw danio pręgowanego.</td></tr><tr><td>Podgrzewana wodą platforma</td><td>wykonana na</td><td></td> zamówienie <td>Do utrzymywania temperatury platformy gąbki i ciała larwalnego podczas zapisów ERG</td></tr></tbody></table>

zapis elektroretinogramu u larw danio pręgowanego przy użyciu nowatorskiej elektrody gąbczastej w kształcie stożka

Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode

Danio rerio (Danio rerio) jest powszechnie używany jako model kręgowców w badaniach rozwojowych i jest szczególnie odpowiedni do neuronauki wizualnej. Elektroretinografia (ERG) jest idealną nieinwazyjną metodą do pomiarów funkcjonalnych sprawności wzrokowej, która ma ugruntowaną pozycję u wyższych gatunków kręgowców. Podejście to jest coraz częściej stosowane do badania funkcji wzrokowych u danio pręgowanego, w tym we wczesnych stadiach rozwojowych larwalnych. Jednak do tej pory najczęściej stosowaną elektrodą rejestrującą dla larw danio pręgowanego jest szklana elektroda do mikropipet, która wymaga specjalistycznego sprzętu do jej produkcji, co stanowi wyzwanie dla laboratoriów o ograniczonych zasobach. W tym miejscu przedstawiamy protokół ERG larw danio pręgowanego przy użyciu elektrody z gąbką w kształcie stożka. Nowatorska elektroda jest łatwiejsza w produkcji i obsłudze, bardziej ekonomiczna i mniej podatna na uszkodzenie oka larwalnego niż szklana mikropipeta. Podobnie jak wcześniej opublikowane metody ERG, obecny protokół może oceniać funkcję zewnętrznej siatkówki poprzez odpowiedzi fotoreceptorów i komórek dwubiegunowych, odpowiednio załamek A i B. Protokół może wyraźnie zilustrować udoskonalenie funkcji wzrokowych we wczesnym okresie rozwoju larw danio pręgowanego, wspierając użyteczność, czułość i niezawodność nowej elektrody. Uproszczona elektroda jest szczególnie przydatna przy tworzeniu nowego systemu ERG lub modyfikowaniu istniejącego aparatu ERG dla małych zwierząt do pomiaru danio pręgowanego, pomagając naukowcom zajmującym się neuronaukami wizualnymi w korzystaniu z organizmu modelowego danio pręgowanego.

W tej sekcji przedstawiono reprezentatywne wyniki pomiarów ERG wykonywanych codziennie od 4 do 7 dpf. Od 4 dpf odpowiedzi ERG wykazują wyraźne komponenty fali a i b, które pochodzą odpowiednio z fotoreceptorów i komórek dwubiegunowych. W każdym badanym wieku amplituda fali b zwiększała się wraz z intensywnością światła (Rysunek 2; Rysunek 3). Co istotne, czułość siatkówki larw zebrafish na słabsze błyski wzrastała wraz z wiekiem. Fale a i b n...

Tutaj prezentujemy protokół, który upraszcza pomiar odpowiedzi elektroretinogramu wywołanego światłem od larw danio pręgowanego. Nowatorska elektroda w kształcie stożka z końcówką gąbki może pomóc w łatwiejszym do osiągnięcia badaniu rozwoju wzrokowego u larw danio pręgowanego za pomocą elektroretinogramu ERG, zapewniając wiarygodne wyniki i obniżając koszty.

Zapis elektroretinogramu u larw danio pręgowanego przy użyciu nowatorskiej elektrody gąbczastej w kształcie stożka

The zebrafish (Danio rerio) is commonly used as a vertebrate model in developmental studies and is particularly suitable for visual neuroscience. For ...

Protokół ten pomaga uprościć pomiary elektroretinogramów lub ERG u larw danio pręgowanego, co zapewnia ważny funkcjonalny odczyt rozwoju wzrokowego i modeli chorób genetycznych. Miękkie gąbczaste końcówki elektrod rejestrujących używane w tym protokole są łatwe do wyprodukowania przy użyciu ekonomicznych i łatwo dostępnych materiałów i pozwalają uniknąć potencjalnego uszkodzenia oczu larw. Bardziej miękka elektroda z gąbką może ułatwić wielokrotne pomiary ERG tego samego oka.Osoby, które nie mają doświadczenia w tej procedurze, mogą mieć trudności z pracą w słabym czerwonym oświetleniu, które jest używane podczas całej procedury. Ale ważne jest, aby adaptacja do ciemności została utrzymana. Aby przygotować elektrodę rejestrującą z gąbki w kształcie stożka, odetnij koniec z przedłużenia elektrody platynowej i za pomocą skalpela usuń 10 milimetrów zewnętrznej powłoki izolacyjnej z politetrafluoroetylenu z nowego końca przedłużenia.Wytnij 40-milimetrowy kawałek srebrnego drutu o średnicy 0,3 milimetra i spleć srebrny drut z odsłoniętym drutem wewnętrznym, aby bezpiecznie przymocować drut do przewodu elektrody. Owiń złącze taśmą izolacyjną, pozostawiając odsłonięty srebrny drut o długości około 15 milimetrów. Podłącz kolejny przewód do ujemnego zacisku akumulatora i zanurz drugi koniec przewodu w soli fizjologicznej.Zanurz odsłonięty srebrny drut w zwykłej soli fizjologicznej i podłącz drugi koniec do dodatniego zacisku dziewięciowoltowego źródła prądu stałego. Po 60 sekundach umieść drut na chłonnej tkance do wyschnięcia. W międzyczasie wytnij kwadrat gąbki z polioctanu winylu o wymiarach 20 na 20 milimetrów w kształt stożka i nasącz gąbkę jednorazowo w buforze Ringera.Pod mikroskopem świetlnym ze skalą na okularze użyj ostrza skalpela, aby ukształtować wierzchołek stożka do średnicy około 40 mikrometrów. Wysuszyć gąbkę w kształcie stożka na chłonnej bibułce, aż stanie się twarda. Przed włożeniem srebrnego drutu do wysuszonej gąbki z polioctanu winylu w kształcie stałego stożka przez podstawę stożka, użyj taśmy maskującej, aby zaizolować nadmiar odsłoniętego metalu w celu zmniejszenia artefaktów fotowoltaicznych.W dniu eksperymentu zanurz elektrodę z końcówką gąbki w buforze Ringera na 15 minut, aby w pełni nasycić gąbkę. Co najmniej osiem godzin przed nagraniami umieść nie więcej niż 20 larw danio pręgowanego w jednej 15-mililitrowej probówce bez pokrywki i owiniętych folią aluminiową w ciemnym inkubatorze. Pod koniec inkubacji wlej przystosowanego do ciemności danio pręgowanego na szalkę Petriego przy słabym czerwonym oświetleniu diody elektroluminescencyjnej.Aby przygotować platformę z biszkoptu, wytnij kawałek gąbki z polioctanu winylu o grubości mniej więcej równej głębokości 35-milimetrowej szalki Petriego, aby gąbka dobrze przylegała do naczynia. Wykonaj małe nacięcie pionowo przez jeden koniec gąbki, aby pomieścić srebrny drut elektrody referencyjnej i zanurz gąbkę w buforze złotej rybki Ringera, aż gąbka zostanie nasycona. Następnie umieść gąbkę na czystej szalce Petriego o grubości 35 milimetrów i użyj ręcznika papierowego, aby wchłonąć nadmiar płynu, aż żaden roztwór nie będzie wydzielał się z gąbki w odpowiedzi na lekkie naciśnięcie palca.Aby ustawić zwierzę do eksperymentu, użyj trzymilimetrowej pipety Pasteura, aby przenieść znieczuloną larwę na kwadrat ręcznika papierowego o wymiarach trzy na trzy centymetry i użyj kleszczy, aby umieścić kwadrat na zwilżonej gąbce. Za pomocą cienkiej szczoteczki nasączonej buforem Ringera dostosuj pozycję larwy z jednym okiem skierowanym do góry, z dala od wszelkich płynów na ręczniku pod larwą. Pokryj ciało larwy nawilżającym żelem pod oczy, aby zwierzę było nawodnione przez cały zapis elektroretinogramu.I umieść naczynie na małej, podgrzewanej wodą platformie przed bodźcem świetlnym miski Ganzfelda umieszczonym w klatce Faradaya. Włóż elektrodę referencyjną do nacięcia wykonanego w gąbce platformowej. I podłącz komercyjnie uzyskaną elektrodę uziemiającą do klatki Faradaya.Przymocuj elektrodę nagrywającą do uchwytu elektrody i przymocuj uchwyt do ramienia stereotaktycznego mikromanipulatora. Za pomocą trzymilimetrowej pipety Pasteura ponownie nasącz gąbkową końcówkę elektrody jedną kroplą roztworu Ringera i umieść mikroskop w klatce Faradaya nad platformą elektroretinogramu. Za pomocą końcówki chłonnej chusteczki usuń nadmiar płynu z końcówki gąbki elektrody i pod mikroskopem ustaw aktywną elektrodę tak, aby końcówka gąbki delikatnie dotykała środkowej powierzchni rogówki oka larwy danio pręgowanego.Następnie przesuń miskę Ganzfelda w kierunku platformy gąbki, uważając, aby larwa była przykryta miską i zamknij klatkę, aby zredukować zewnętrzny szum elektromagnetyczny. Wrażliwość siatkówki larwy danio pręgowanego na ciemniejsze błyski wzrasta wraz z wiekiem. Ponieważ fale a i b nie są rozpoznawalne przy intensywności niższej niż minus 1,61 logarytmu kandeli na metr kwadratowy po czterech dniach od zapłodnienia, podczas gdy wyraźne sygnały są wykrywalne przy tych intensywnościach u starszych larw.Amplituda załamka b wzrasta wyraźnie między czterema a piątymi po zapłodnieniu. Po siedmiu dniach sygnał o wartości 2,48 log kandeli na metr kwadratowy jest większy w porównaniu z piątym i szóstym dniem po zapłodnieniu. Niejawny czas fali A i B staje się znacznie szybszy po pięciu dniach od zapłodnienia.Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te wskazują na dojrzewanie funkcji siatkówki danio pręgowanego między czterema a siedmioma dniami po zapłodnieniu. Aby skutecznie wykonać ten protokół, ważne jest, aby gąbki były w pełni nasycone płynem, co pomaga utrzymać przewodność elektrody rejestrującej i obniża poziom szumów. Jeśli załamek A jest szczególnie interesujący, można zastosować leczenie farmakologiczne w celu zablokowania składowej załamka B, odsłaniając w ten sposób pełny załamek A.

electroretinogram-recording-larval-zebrafish-using-novel-cone-shaped

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Przedstawimy sposób rejestracji odpowiedzi na błysk z pojedynczych czopków mysich przy użyciu elektrody ssącej.

Rejestracje metodą ssania z pojedynczych komórek fotoreceptorów czopkowych myszy

Opisujemy stosunkowo prostą metodę rejestracji transretinalnego elektroretinogramu (ERG) w celu uzyskania odpowiedzi fotoreceptorowych pręcików i czopków z nienaruszonej siatkówki myszy. Podejście to wykorzystuje blokadę przekaźnictwa synaptycznego z fotoreceptorów w celu wyizolowania ich odpowiedzi na światło i zarejestrowania ich za pomocą elektrod polowych umieszczonych w poprzek wyizolowanej, rozłożonej płasko siatkówki.

Rejestracja transretinalnego ERG z siatkówki myszy: fotoreakcje czopków i pręcików

Ten film pokazuje, jak wykonać pomiary elektrokardiografii (EKG lub EKG), testu, który mierzy aktywność elektryczną serca, u danio pręgowanego.

Elektrokardiografia danio pręgowanego (EKG): minimalnie inwazyjny test do oceny czynności serca

Protokół opisuje procedurę wykonywania elektrofizjologii u dorosłych ryb danio pręgowanych. Metodę tę można wykorzystać do pomiaru aktywności neuronalnej in vivo.

Elektrofizjologia dorosłego danio pręgowanego: metoda pomiaru zewnątrzkomórkowej aktywności elektrycznej neuronów in vivo

Ten film demonstruje rejestrację sygnałów elektrycznych z neuronów doprowadzających u sparaliżowanej larwy danio pręgowanego poprzez umieszczenie mikropipety w pobliżu zwoju linii bocznej i utworzenie luźnej uszczelki do przechwytywania sygnału. Roztwór zewnątrzkomórkowy utrzymuje żywotność neuronów podczas tego procesu.

Monitorowanie sygnałów elektrycznych z neuronów aferentnych w unieruchomionej larwie danio pręgowanego

Opisana jest prosta metoda rejestrowania potencjałów pola zewnątrzkomórkowego w przodomózgowiu larwy danio pręgowanego. Metoda ta zapewnia solidny odczyt in vivo aktywności podobnej do napadowej. Technika ta może być stosowana w przypadku genetycznie zmodyfikowanych larw danio pręgowanego będących nosicielami genów związanych z padaczką lub napadów wywołanych podawaniem leków przeciwdrgawkowych.

Zapis elektrofizjologiczny przodomózgowia u larw danio pręgowanego

Ten artykuł opisuje, jak dorosły danio pręgowany może zostać unieruchomiony, zaintubowany i wykorzystany do eksperymentów elektrofizjologicznych in vivo, aby umożliwić rejestrację i manipulację aktywnością neuronalną u nienaruszonego zwierzęcia.

Zapis elektrofizjologiczny w mózgu nienaruszonego dorosłego danio pręgowanego

Prezentujemy metodę analizy elektroretinograficznej (ERG) larw danio pręgowanego z wykorzystaniem technik mikromanipulacji i elektroretinografii. Jest to prosta i nieskomplikowana metoda oznaczania funkcji wzrokowych larw danio pręgowanego in vivo.

Elektroretinogram Analiza odpowiedzi wzrokowej u larw danio pręgowanego

Ten manuskrypt opisuje metody zapisów elektrofizjologicznych z neuronów rdzeniowych zarodków i larw danio pręgowanego. Preparat utrzymuje neurony in situ i często wiąże się z minimalnym rozwarstwieniem. Metody te pozwalają na badanie elektrofizjologiczne różnych neuronów rdzeniowych, od początkowego nabycia pobudliwości elektrycznej do wczesnych stadiów larwalnych.

Przygotowanie rdzenia kręgowego danio pręgowanego in situ do zapisów elektrofizjologicznych z rdzeniowych neuronów czuciowych i ruchowych

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i charakterystyki epilepsji u danio pręgowanego, wynikającej z przejściowego zahamowania genu DEPDC5.

Analiza behawioralna i fizjologiczna w modelu padaczki danio pręgowanego

Opisujemy protokół monitorowania zmian w aktywności neuronu doprowadzającego podczas poleceń motorycznych w modelowym systemie komórek rzęsatych kręgowców.

Aktywność neuronów aferentnych tylnej linii bocznej podczas pływania u danio pręgowanego

Poznaj uproszczoną metodę pomiaru elektroretinogramów u larw Danio rerio przy użyciu nowatorskiej elektrody gąbczastej. Technika umożliwia wielokrotne badania bez uszkadzania oczu i wspiera badania nad rozwojem wzroku.

Zapis elektroretinogramu u larw danio pręgowanego przy użyciu nowatorskiej elektrody gąbczastej w kształcie stożka

Przeglądaj więcej filmów