Name: Obrazowanie dynamiki wapnia w subpopulacjach komórek wysp trzustkowych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Poznaj metodę obrazowania dynamiki wapnia w subpopulacjach komórek wysp trzustkowych myszy. Technika umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym z wysoką powtarzalnością danych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

AH otrzymał stypendium doktoranckie Diabetes UK, EV był wspierany przez OXION-Wellcome Trust Training Programme, AIT zorganizowało stypendium podoktoranckie Oxford Biomedical Research Council.

<ol><li>Elayat, A. A., el-Naggar, M. M., Tahir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunocytochemical+and+morphometric+study+of+the+rat+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">An immunocytochemical and morphometric study of the rat pancreatic islets.</a> Journal of Anatomy. 186, Pt 3 629(1995).</li>
<li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unique+cytoarchitecture+of+human+pancreatic+islets+has+implications+for+islet+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (7), 2334-2339 (2006).</li>
<li>Brereton, M. F., Vergari, E., Zhang, Q., Clark, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-%2C+delta-and+PP-cells%3A+are+they+the+architectural+cornerstones+of+islet+structure+and+co-ordination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Alpha-, delta-and PP-cells: are they the architectural cornerstones of islet structure and co-ordination.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 63 (8), 575-591 (2015).</li>
<li>Færch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+is+accompanied+by+increased+fasting+glucagon+and+delayed+glucagon+suppression+in+individuals+with+normal+and+impaired+glucose+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance is accompanied by increased fasting glucagon and delayed glucagon suppression in individuals with normal and impaired glucose regulation.</a> Diabetes. 65 (11), 3473-3481 (2016).</li>
<li>Dabrowski, M., Tarasov, A., Ashcroft, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+architecture+of+the+ATP-binding+site+of+the+KATP+channel+subunit+Kir6+2%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mapping the architecture of the ATP-binding site of the KATP channel subunit Kir6 2.</a> The Journal of Physiology. 557 (2), 347-354 (2004).</li>
<li>Liu, Y. J., Vieira, E., Gylfe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+store-operated+mechanism+determines+the+activity+of+the+electrically+excitable+glucagon-secreting+pancreatic+alpha-cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A store-operated mechanism determines the activity of the electrically excitable glucagon-secreting pancreatic alpha-cell.</a> Cell Calcium. 35 (4), 357-365 (2004).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca+2%2B+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca 2+ probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137(2001).</li>
<li>Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circularly+permuted+green+fluorescent+proteins+engineered+to+sense+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (6), 3197-3202 (2001).</li>
<li>Broussard, G. J., Liang, R., Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+activity+in+neural+circuits+with+genetically+encoded+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Monitoring activity in neural circuits with genetically encoded indicators.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 97(2014).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Rodriguez, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+and+glowing+toolbox+of+fluorescent+and+photoactive+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2017).</li>
<li>Tarasov, A. I., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTarasov%2C+AI+%22Methods+in+enzymology%22">Methods in enzymology</a>. 542, Elsevier. 289-311 (2014).</li>
<li>Tarasov, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency-dependent+mitochondrial+Ca%282%2B%29+accumulation+regulates+ATP+synthesis+in+pancreatic+%CE%B2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Frequency-dependent mitochondrial Ca(2+) accumulation regulates ATP synthesis in pancreatic β cells.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 465 (4), 543-554 (2013).</li>
<li>Smith, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Ca2%2B+indicators+directly+inhibit+the+Na%2C+K-ATPase+and+disrupt+cellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signal%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Ca2+ indicators directly inhibit the Na, K-ATPase and disrupt cellular functions.</a> Science Signal. 11 (515), 2039(2018).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expanded+palette+of+genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators.</a> Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+red+protein+calcium+indicators+for+imaging+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity.</a> Elife. 5, 12727(2016).</li>
<li>Theis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+Spike+Rate+Inference+in+Population+Calcium+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Benchmarking Spike Rate Inference in Population Calcium Imaging.</a> Neuron. 90 (3), 471-482 (2016).</li>
<li>Hamilton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenaline+Stimulates+Glucagon+Secretion+by+Tpc2-Dependent+Ca%282%2B%29+Mobilization+From+Acidic+Stores+in+Pancreatic+alpha-Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Adrenaline Stimulates Glucagon Secretion by Tpc2-Dependent Ca(2+) Mobilization From Acidic Stores in Pancreatic alpha-Cells.</a> Diabetes. 67 (6), 1128-1139 (2018).</li>
<li>Adriaenssens, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+profiling+of+pancreatic+alpha%2C+beta+and+delta+cell+populations+identifies+delta+cells+as+a+principal+target+for+ghrelin+in+mouse+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic profiling of pancreatic alpha, beta and delta cell populations identifies delta cells as a principal target for ghrelin in mouse islets.</a> Diabetologia. 59 (10), 2156-2165 (2016).</li>
<li>DiGruccio, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+alpha%2C+beta+and+delta+cell+transcriptomes+reveal+that+ghrelin+selectively+activates+delta+cells+and+promotes+somatostatin+release+from+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets.</a> Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).</li>
<li>Mourao, M., Satin, L., Schnell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+experimental+design+to+estimate+statistically+significant+periods+of+oscillations+in+time+course+data%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Optimal experimental design to estimate statistically significant periods of oscillations in time course data.</a> PloS One. 9 (4), 93826(2014).</li>
<li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).</li>
<li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+is+a+positive+autocrine+signal+for+glucagon+release%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Glutamate is a positive autocrine signal for glucagon release.</a> Cell Metabolism. 7 (6), 545-554 (2008).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Tarasov, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+real-time+hormone+release+kinetics+via+high-content+3-D+imaging+of+compensatory+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Monitoring real-time hormone release kinetics via high-content 3-D imaging of compensatory endocytosis.</a> Lab on a Chip. 18 (18), 2838-2848 (2018).</li>
<li>Knudsen, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+Glucagon+Secretion+by+Hyperglycemia-Induced+Sodium-Dependent+Reduction+of+ATP+Production%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of Glucagon Secretion by Hyperglycemia-Induced Sodium-Dependent Reduction of ATP Production.</a> Cell Metabolism. , (2018).</li>
<li>Adam, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fumarate+hydratase+deletion+in+pancreatic+%CE%B2+cells+leads+to+progressive+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Fumarate hydratase deletion in pancreatic β cells leads to progressive diabetes.</a> Cell Reports. 20 (13), 3135-3148 (2017).</li>
<li>Wills, Q. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+approaches+and+software+for+clustering+islet+cell+functional+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Statistical approaches and software for clustering islet cell functional heterogeneity.</a> Islets. 8 (2), 48-56 (2016).</li>
<li>Berggren, P. O., Ostenson, C. G., Petersson, B., Hellman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+divergent+glucose+effects+on+calcium+metabolism+in+pancreatic+beta-+and+alpha+2-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Evidence for divergent glucose effects on calcium metabolism in pancreatic beta- and alpha 2-cells.</a> Endocrinology. 105 (6), 1463-1468 (1979).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
<li>Longo, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillations+in+cytosolic+free+Ca2%2B%2C+oxygen+consumption%2C+and+insulin+secretion+in+glucose-stimulated+rat+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oscillations in cytosolic free Ca2+, oxygen consumption, and insulin secretion in glucose-stimulated rat pancreatic islets.</a> The Journal of Biological Chemistry. 266 (14), 9314-9319 (1991).</li>
<li>Johansson, H., Gylfe, E., Hellman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+raises+cytoplasmic+calcium+in+pancreatic+alpha+2-cells+by+mobilizing+calcium+incorporated+in+response+to+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP raises cytoplasmic calcium in pancreatic alpha 2-cells by mobilizing calcium incorporated in response to glucose.</a> Cell Calcium. 10 (4), 205-211 (1989).</li>
<li>Grapengiesser, E., Gylfe, E., Hellman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+types+of+cytoplasmic+Ca2%2B+oscillations+in+stimulated+pancreatic+%CE%B2-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Three types of cytoplasmic Ca2+ oscillations in stimulated pancreatic β-cells.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 268 (1), 404-407 (1989).</li>
<li>Okamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cytosolic+Ca2%2B+in+impaired+sensitivity+to+glucose+of+rat+pancreatic+islets+exposed+to+high+glucose+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Role of cytosolic Ca2+ in impaired sensitivity to glucose of rat pancreatic islets exposed to high glucose in vitro.</a> Diabetes. 41 (12), 1555-1561 (1992).</li>
<li>Gilon, P., Henquin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+membrane+potential+changes+on+cytoplasmic+Ca2%2B+concentration+in+an+electrically+excitable+cell%2C+the+insulin-secreting+pancreatic+B-cell%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Influence of membrane potential changes on cytoplasmic Ca2+ concentration in an electrically excitable cell, the insulin-secreting pancreatic B-cell.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (29), 20713-20720 (1992).</li>
<li>Valdeolmillos, M., Nadal, A., Soria, B., Garcia-Sancho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+digital+image+analysis+of+glucose-induced+%5BCa2%2B%5Di+oscillations+in+mouse+pancreatic+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Fluorescence digital image analysis of glucose-induced [Ca2+]i oscillations in mouse pancreatic islets of Langerhans.</a> Diabetes. 42 (8), 1210-1214 (1993).</li>
<li>Cheng, H., Lederer, W. J., Cannell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+sparks%3A+elementary+events+underlying+excitation-contraction+coupling+in+heart+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Calcium sparks: elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle.</a> Science. 262 (5134), 740-744 (1993).</li>
<li>Stout, A. L., Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evanescent+field+excitation+of+fluorescence+by+epi-illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Optics%22%5BJournal%5D)">Evanescent field excitation of fluorescence by epi-illumination microscopy.</a> Applied Optics. 28 (24), 5237-5242 (1989).</li>
<li>Stozer, A., Dolensek, J., Rupnik, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-stimulated+calcium+dynamics+in+islets+of+Langerhans+in+acute+mouse+pancreas+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices.</a> PloS One. 8 (1), 54638(2013).</li>
<li>Tian, G., Sandler, S., Gylfe, E., Tengholm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-+and+hormone-induced+cAMP+oscillations+in+alpha-+and+beta-cells+within+intact+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucose- and hormone-induced cAMP oscillations in alpha- and beta-cells within intact pancreatic islets.</a> Diabetes. 60 (5), 1535-1543 (2011).</li>
<li>Benninger, R. K., Zhang, M., Head, W. S., Satin, L. S., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction+coupling+and+calcium+waves+in+the+pancreatic+islet%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Gap junction coupling and calcium waves in the pancreatic islet.</a> Biophysical Journal. 95 (11), 5048-5061 (2008).</li>
<li>van Gurp, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+intravital+imaging+reveals+in+vivo+dynamics+of+pancreatic+tissue+transplanted+under+the+kidney+capsule+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Sequential intravital imaging reveals in vivo dynamics of pancreatic tissue transplanted under the kidney capsule in mice.</a> Diabetologia. 59 (11), 2387-2392 (2016).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W protokole istnieją trzy etapy, które mają kluczowe znaczenie dla ogólnego sukcesu. Udane wstrzyknięcie enzymu Liberazy do przewodu żółciowego decyduje nie tylko o sukcesie ilościowym procedury izolacji, ale także wpływa na jakość izolowanych wysp trzustkowych. Nienapompowana trzustka może powodować brak niektórych ważnych odpowiedzi metabolicznych w izolowanych wyspach trzustkowych. Po drugie, obciążenie barwnikiem/ekspresja czujnika określa stosunek sygnału do szumu w nagraniu poklatkowym. Sygnały są nieobecne lub tłu...

Celem metody jest obrazowanie zmian w czasie rzeczywistym stężenia cytozolowego wapnia ([Ca2+]cyt) w mniejszych subpopulacjach komórek wysp trzustkowych. Pozwala to na odkrycie mechanizmów rządzących wydzielaniem hormonów w tych komórkach, ujawnienie szczegółów na temat wzajemnych oddziaływań między różnymi typami komórek i, potencjalnie, wprowadzenie wymiaru populacyjnego do szerszego obrazu sygnalizacji wysp trzustkowych.
Wysepki składają się z kilku typów komórek. Oprócz bardziej znanych komórek β wydzielających insulinę, istnieją co najmniej dwie subpopulacje, które są również krytyczne w regulacji poziomu glukozy we krwi3. Komórki α (które stanowią około 17% komórek wysp trzustkowych) wydzielają glukagon, gdy poziom glukozy we krwi jest zbyt niski, co sygnalizuje uwolnienie glukozy do krwiobiegu z magazynów w wątrobie. Nadmierny poziom glukagonu (hiperglukagonemia) i upośledzona kontrola uwalniania glukagonu towarzyszą (i, technicznie, mogą się przyczyniać) stanowi przedcukrzycowemu z upośledzoną wrażliwością na insulinę4. Komórki δ (około 2%) wydzielają somatostatynę w odpowiedzi na zwiększenie poziomu glukozy. Ten wszechobecny hormon peptydowy prawdopodobnie występuje w wysokich stężeniach w pobliżu komórek α i β w wyspach trzustkowych, co ma silne działanie osłabiające za pośrednictwem receptora Gi zarówno na wydzielanie glukagonu, jak i insuliny.
α-komórki i δ-komórki dzielą dużą część maszynerii wykrywającej glukozę ze swoimi bliskimi krewnymi, komórkami β. Wszystkie trzy typy komórek są wyposażone w wrażliwe na ATP kanały K+, skomplikowane czujniki metaboliczne5, które kontrolują potencjał błony plazmatycznej tych pobudliwych komórek. W tym samym czasie wydzielanie insuliny, somatostatyny i glukagonu jest regulowane w różny sposób przez glukozę. Obrazowanie dynamiki Ca2 + w dwóch mniejszych subpopulacjach komórek wysp trzustkowych może zatem dostarczyć informacji na temat wzajemnych oddziaływań między poziomem glukozy we krwi a wydzielaniem wysp trzustkowych.
Wczesne próby monitorowania pobudliwości komórek α i δ za pomocą elektrofizjologii patch-clamp zostały wkrótce poprzedzone obrazowaniem Ca2+ w pojedynczych komórkach α i δ. Tożsamość komórek w tych eksperymentach zweryfikowano poprzez barwienie a posteriori przeciwciałami anty-glukagonem lub anty-somatostatyną. Wysiłki te były często utrudniane przez odkrycie, że komórki wysp trzustkowych zachowują się zupełnie inaczej w obrębie wyspy trzustkowej i jako pojedyncze komórki. Chociaż komórki β mogą wydawać się głównymi dobroczyńcami układu wysp trzustkowych (ze względu na ich przytłaczającą większość, która leży u podstaw ich silnego sprzężenia elektrycznego), główna rozbieżność została, co zaskakujące, znaleziona w komórkach α. W obrębie nienaruszonej wysepki komórki te są stale i uporczywie aktywowane przy niskim poziomie glukozy, co jest prawdą tylko w przypadku około 7% pojedynczych rozproszonych komórek α6. Uważa się zatem, że raportowanie aktywności komórek α i δ w nienaruszonych wysepkach stanowi bliższe przybliżenie warunków in vivo.
Ogólnie rzecz biorąc, istnieją dwa sposoby raportowania dynamiki Ca2+ z subpopulacji komórek α lub δ: (i) ekspresja genetycznie kodowanego czujnika Ca2+ za pomocą specyficznego dla tkanki promotora lub (ii) użycie związków markerowych. Bardziej eleganckie wcześniejsze podejście dodaje istotną zaletę prawdziwego obrazowania 3D, a tym samym badania rozmieszczenia komórek w obrębie wyspy trzustkowej. Nie można go jednak stosować do nienaruszonego materiału ludzkich wysp trzustkowych. Innym potencjalnym problemem jest "nieszczelność" promotora, szczególnie gdy występuje transdyferencjacja komórek β/α lub odpowiedź komórek α na wysoki poziom glukozy. To ostatnie podejście można zastosować w przypadku świeżo wyizolowanych tkanek, w tym próbek ludzkich lub hodowanych wysepek. Dane są jednak zbierane wyłącznie z obwodowej warstwy komórek wysp trzustkowych, ponieważ dostarczenie cząsteczki barwnika/markera do głębszych warstw bez zmiany architektury wysp trzustkowych jest trudne. Nieoczekiwaną zaletą tego drugiego podejścia jest kompatybilność z trybem obrazowania szerokokątnego, który pozwala na skalowanie eksperymentów do jednoczesnego obrazowania dziesiątek lub setek wysepek (tj. tysięcy do kilkudziesięciu tysięcy komórek).
Wapń jest obrazowany in vivo za pomocą genetycznie kodowanych GCaMP7 (lub pericam8) czujników rodziny, które są wariantami cyklicznie permutowanego białka zielonej fluorescencji (GFP) połączonego z białkiem wiążącym wapń kalmoduliną i jego sekwencją docelową, M13 fragment kinazy łańcucha lekkiego miozyny7,9. GCaMPs charakteryzują się doskonałym stosunkiem sygnału do szumu w zakresie stężeń nanomolowych Ca2+ i wysokim przekrojem 2-fotonowym, co czyni je idealnym wyborem do pracy in vivo 10,11. Wyzwaniem związanym ze stosowaniem czujników rekombinowanych jest ich dostarczanie do komórek. Ekspresja heterologiczna wymaga użycia wektora wirusowego i wielogodzinnej hodowli ex vivo, co często budzi obawy dotyczące potencjalnego odróżnicowania lub pogorszenia funkcji komórek. Chociaż modele myszy wstępnie zaprojektowane do wyrażania GCaMP rozwiązują ten problem, dodają nowe wyzwania, znacznie wydłużając czas realizacji i ograniczając pracę do modelu innego niż ludzki. Bardzo wysoka wrażliwość na zmiany wewnątrzkomórkowego pH to kolejna niekorzystna strona czujników opartych na białkach12, co stanowi jednak mniejszy problem w wykrywaniu sygnałów oscylacyjnych, takich jak Ca2+.
Zaletą barwników do wychwytywania (takich jak zielona fluorescencyjna Fluo4) jest to, że można je załadować do świeżo wyizolowanej tkanki w ciągu około godziny. Jak można się spodziewać, barwniki wychwytywane mają niższy stosunek sygnału do szumu i (znacznie) niższą fotostabilność niż ich rekombinowane odpowiedniki. Nie możemy potwierdzić13 doniesień o toksyczności barwników wychwytywanych przez sup14, jednak częstym problemem jest przeciążenie barwnikiem.
Czerwone rekombinowane czujniki Ca2+ oparte na permutacji kołowej szybko się rozwijają od 2011 roku15, a najnowsze osiągnięcia stanowią silną konkurencję dla GCaMPs16 dla obrazowania tkanek, biorąc pod uwagę większą głębokość penetracji światła czerwonego. Dostępne na rynku czerwone barwniki wychwytywane mogą być niezawodnie stosowane do obrazowania pojedynczych komórek, ale na poziomie tkanek nie mogą dobrze konkurować z zielonymi analogami.
Najwyraźniej jest bardzo mały wybór technologii obrazowania do eksperymentów na tkankach, gdzie nieostre światło staje się krytycznym problemem. System konfokalny zapewnia akceptowalną rozdzielczość pojedynczej komórki poprzez anulowanie nieostrego światła z dowolnym obiektywem na NA powyżej 0,3 (w przypadku GCaMP6) lub 0,8 (barwnik wychwytywalny). W sensie technicznym konwencjonalny mikroskop konfokalny może być używany do jednoczesnego obrazowania [Ca2+]cyt z setek (GCaMP) lub dziesiątek wysp trzustkowych (barwnik pułapkowy). Jedyną realistyczną alternatywą dla trybu konfokalnego w przypadku ekspresji 3D czujnika w tkance jest być może mikroskopia świetlna.
Sprawy mają się nieco inaczej w przypadku, gdy czujnik jest wyrażony w obwodowej warstwie komórek w tkance wysp trzustkowych. W przypadku jasnych czujników rekombinowanych, które mają żywy wewnątrzkomórkowy wzorzec ekspresji, użycie trybu obrazowania szerokokątnego z obiektywem o niskim NA, może zapewnić wystarczającą jakość i nagrodzić badacza znacznym wzrostem pola widzenia, a tym samym przepustowości. System szerokokątny zapewnia gorszą rozdzielczość przestrzenną, ponieważ nieostre światło nie jest anulowane; dlatego obrazowanie tkanki z obiektywami o wysokiej NA (niskiej głębi ostrości) jest mniej pouczające, ponieważ sygnał pojedynczej komórki jest znacznie zanieczyszczony przez sąsiednie komórki. Zanieczyszczenie jest znacznie mniejsze w przypadku obiektywów o niskiej NA (dużej głębi ostrości).
Są jednak zadania, dla których wysoka przepustowość i/lub częstotliwość próbkowania stają się krytyczną zaletą. α- i δ-komórki wykazują znaczną niejednorodność, co stwarza zapotrzebowanie na duże rozmiary próbek, aby ujawnić wkład subpopulacji. Obrazowanie szerokokątne jest szybkie i bardziej czułe, a system dużego pola widzenia na skalę przemysłową obrazuje setki (GCaMP) lub dziesiątki (Fluo4) wysepek przy tym samym stosunku sygnału do szumu, co eksperymenty konfokalne odpowiednio na dziesięciu lub jednej wysepce. Ta różnica w przepustowości sprawia, że system szerokokątny jest korzystny dla obrazowania populacyjnego z rozdzielczością pojedynczej komórki, co może być szczególnie krytyczne w przypadku małych subpopulacji, takich jak δ-komórkowa. Podobnie, próby rekonstrukcji aktywności elektrycznej na podstawie Ca2+ spiking17 skorzystałyby na wyższej częstotliwości próbkowania zapewnianej przez tryb obrazowania szerokokątnego. Jednocześnie kilka "niszowych" problemów, takich jak aktywność komórek α trzustki po stymulacji dominującej subpopulacji komórek β, wymaga zastosowania systemu konfokalnego. Czynnikiem wpływającym na decyzję o zastosowaniu trybu konfokalnego jest obecność znacznego sygnału zanieczyszczającego z subpopulacji komórek β.
Chociaż nadal możliwe jest stosowanie barwienia przeciwciałami specyficznymi dla hormonów w celu weryfikacji tożsamości komórek po eksperymentach obrazowych, mniejsze subpopulacje komórek można zidentyfikować za pomocą funkcjonalnych związków markerowych, takich jak adrenalina i grelina, które wykazały, że selektywnie stymulują dynamikę Ca2+ w α-18 i δ-cells19,20.
Analiza danych obrazowania poklatkowego ma na celu dostarczenie informacji wykraczających poza trywialną farmakologię, takich jak niejednorodność populacji, korelacja i interakcja różnych sygnałów. Tradycyjnie dane obrazowe są analizowane jako intensywność w funkcji czasu i normalizowane do początkowej fluorescencji (F/F0). Często potrzebna jest korekta linii bazowej ze względu na bielenie sygnału fluoroforu lub zanieczyszczenie zmianami autofluorescencji lub pH (zwykle indukowane przez milimolowe poziomy glukozy12). Dane Ca2+ mogą być analizowane na wiele różnych sposobów, ale trzy główne trendy to pomiar zmian w częstotliwości skoków, frakcji plateau lub powierzchni pod krzywą, obliczonych w zależności od czasu. Uznaliśmy, że to drugie podejście jest korzystne, zwłaszcza w przypadku mocno niedostatecznie próbkowanych danych konfokalnych. Zaletą metryki pAUC jest jej czułość zarówno na zmiany częstotliwości sygnału, jak i amplitudy, podczas gdy obliczanie częstotliwości wymaga znacznej liczby oscylacji21, co jest trudne do osiągnięcia przy użyciu konwencjonalnego obrazowania. Czynnikiem ograniczającym analizę pAUC jest jej wysoka wrażliwość na zmiany linii bazowej.

<table><tbody><tr>Obiektyw <td></td><td></td><td></td><td>40x/1,3</td></tr><tr><td>Emisja</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikroskopu</td><td></td><td></td><td></td>Axiovert 200</tr><tr><td>Pobudzenie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Sigma-Aldrich</td><td>F7524-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Fluo4</td><td>Thermo Fisher (Life Technologies)</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>GCaMP6f, in (typ ludzki 5) wektor adenowirusowy</td><td>Vector Biolabs</td><td>1910</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Hanksa</td><td>Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liberase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>penicylina/streptomycyna</td><td>Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium</td><td>Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies)</td><td>61870044</td><td></td></tr><tr><td>System konfokalny Zeiss LSM510-META</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie dynamiki wapnia w subpopulacjach komórek wysp trzustkowych myszy

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Hormony wysp trzustkowych regulują homeostazę glukozy we krwi. Zmiany stężenia glukozy we krwi wywołują oscylacje cytozolowego wapnia w komórkach wysp trzustkowych, które wyzwalają wydzielanie trzech głównych hormonów: insuliny (z komórek β), glukagonu (komórki α) i somatostatyny (komórki δ). Komórki β, które stanowią większość komórek wysp trzustkowych i są ze sobą sprzężone elektrycznie, reagują na bodziec glukozowy jako jedna jednostka. Pobudliwość mniejszych subpopulacji, komórek α i komórek δ (stanowiących odpowiednio około 20% (30%) i 4% (10%) całkowitej liczby komórek wysepek gryzoni1 (human2) jest mniej przewidywalna i dlatego ma szczególne znaczenie.
Czujniki wapnia są dostarczane do obwodowej warstwy komórek wewnątrz izolowanej wysepki. Wysepka lub grupa wysepek jest następnie unieruchamiana i obrazowana za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Wybór trybu obrazowania to wyższa przepustowość (szerokie pole) i lepsza rozdzielczość przestrzenna (konfokalna). Tradycyjnie laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna jest stosowana do obrazowania tkanek, ponieważ zapewnia najlepszą separację sygnału między sąsiednimi komórkami. System szerokokątny może być również wykorzystany, jeśli zminimalizowany zostanie zanieczyszczający sygnał z dominującej populacji komórek β.
Po zarejestrowaniu dynamiki wapnia w odpowiedzi na określone bodźce, dane są wyrażane w formie liczbowej jako intensywność fluorescencji w funkcji czasu, znormalizowane do początkowej fluorescencji i skorygowane o linię wyjściową, aby usunąć efekty związane z bieleniem fluoroforu. Zmiany częstości skoków lub częściowego pola pod krzywą (pAUC) są obliczane w zależności od czasu, aby określić ilościowo obserwowane efekty. pAUC jest bardziej czuły i dość wytrzymały, podczas gdy częstotliwość skoków dostarcza więcej informacji na temat mechanizmu wzrostu wapnia.
Mniejsze subpopulacje komórek można zidentyfikować za pomocą funkcjonalnych odpowiedzi na związki markerowe, takie jak adrenalina i grelina, które wywołują zmiany w cytozolowym wapniu w określonych populacjach komórek wysp trzustkowych.

Wyspy ładują się całkiem dobrze za pomocą barwników pułapkujących (Rysunek 1A), chyba że skład lipidowy błony uległ zmianie (np. w wyniku przewlekłej ekspozycji na kwasy tłuszczowe). Wektor ludzkiego adenowirusa typu 5 (Ad5) również celuje we wszystkie komórki wysp (Rysunek 1B). Problemy mogą wystąpić, gdy w tej samej komórce ekspresjonowanych jest więcej niż jeden rekombinowany sensor. Co więcej, wyspy są zazwyczaj bardzo dobrz...

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania i ilościowego oznaczania dynamiki wapnia w heterogenicznych populacjach komórek, takich jak komórki wysp trzustkowych. Reportery fluorescencyjne są dostarczane do obwodowej warstwy komórek w obrębie wyspy trzustkowej, która jest następnie unieruchamiana i obrazowana, a także przeprowadzana jest analiza dynamiki intensywności fluorescencji dla poszczególnych komórek.

Obrazowanie dynamiki wapnia w subpopulacjach komórek wysp trzustkowych myszy

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

Protokół umożliwia szybkie izolowanie funkcji małych subpopulacji komórek w obrębie wysp trzustkowych Langerhansa. Do zalet tej techniki należy charakter w czasie rzeczywistym i wysoka moc statystyczna, a co za tym idzie wysoka odtwarzalność pozyskanych danych. Aby unieruchomić wysepki do obrazowania, należy zamontować komorę obrazowania dla mikroskopu odwróconego i umieścić w komorze szklaną szkiełko osłonowe.Upewnij się, że interfejs szklanej komory jest wodoszczelny i upewnij się, że szkiełko nakrywkowe znajduje się w zasięgu obiektywu mikroskopu. Następnie wytnij kwadraty o wymiarach 20 na 20 milimetrów o drobnych i grubych oczkach i użyj 45 do 50 mikrometrowych kawałków grubej taśmy klejącej, aby utworzyć dwie ścianki dystansowe na kawałku drobnej siatki. Zanurz grubą siatkę i odważnik w 35-milimetrowej szalce Petriego z roztworem do obrazowania i umieść drobną siatkę pod mikroskopem preparacyjnym.Obróć drobną siatkę ze ściankami dystansowymi do góry nogami i przekładkami skierowanymi do góry. I użyj pipety p20, aby przenieść kilka wysepek między dwoma przekładkami. Za pomocą kleszczyków zegarmistrzowskich umieść siatkę do góry nogami w komorze obrazowania mikroskopu odwróconego, tak aby przekładki były skierowane w dół, aby przylegać bezpośrednio do szkiełka nakrywkowego komory, zatrzymując wysepki między przekładkami a siatką pośrodku szkiełka nakrywkowego.Należy upewnić się, że siatka jest dobrze nawodniona i nie zawiera nadmiernych objętości roztworu, które mogłyby spowodować ruch poprzeczny próbki. Następnie umieść grubą siatkę i ciężarek na wierzchu drobnej siatki w komorze i dodaj roztwór do obrazowania do komory. Po unieruchomieniu wysp trzustkowych wybierz tryb obrazowania i obiektyw w mikroskopie odwróconym, a następnie umieść komorę z wyspami na stoliku mikroskopu z kontrolowaną temperaturą.Po ustawieniu perfuzji należy ustawić dopływ poniżej odpływu w komorze i ustawić strumień odpływu na większy niż strumień dopływu. Upewnij się, że odpływ ma minimalny kontakt z roztworem, tak aby usuwał roztwór w wielu sekwencyjnych małych kropelkach, unikając długich przerw ciągłego usuwania roztworu. Następnie rozpocznij perfuzję roztworem do obrazowania zawierającym trzy milimolowe glukozy i wybierz ścieżkę światła oraz filtry do obrazowania zielonych fluoroforów.Następnie uruchom obrazowanie na żywo, aby skonfigurować parametry obrazowania i dostosować widok, aby uchwycić interesujące nas wysepki. Aby zoptymalizować stosunek sygnału do szumu obrazu, dostosuj intensywność światła wzbudzenia, czas ekspozycji i bining, upewniając się, że ustawienia umożliwiają wyraźną wizualizację każdej komórki w wysepkach przy minimalnym możliwym natężeniu światła i ekspozycji. Następnie zobrazuj wysepki z częstotliwością od 0,1 do pięciu herców, sprawdzając jakość pozyskanych danych w trakcie ich przechwytywania.Gdy aktywność komórek alfa jest wykrywalna, użyj wykresu dynamiki sygnału online w oprogramowaniu do akwizycji i dodaj adrenalinę lub glutaminian do roztworu kąpieli przez dwie do pięciu minut. Zaobserwuje się szybki skok wapnia, po którym nastąpi spowolnienie lub anulowanie oscylacji komórek alfa. Następnie dodaj grelinę, która, jak ostatnio doniesiono, selektywnie aktywuje komórki delta.Szybki odwracalny wzrost wapnia będzie obserwowany w małej subpopulacji komórek wysp trzustkowych. Następnie dodaj 10 milimolowych glukoz. Zaobserwowana zostanie skoordynowana odpowiedź oscylacyjna w subpopulacji komórek beta.Zwróć również uwagę na reakcje komórek, które były wcześniej aktywowane przez adrenalinę lub glutaminian i grelinę. Po zapisaniu obrazów zaimportuj dane do odpowiedniego programu do analizy danych i znormalizuj surowe dane dotyczące intensywności fluorescencji do początkowej wartości fluorescencji. Jeśli zestaw danych o intensywności fluorescencji zmienności między komórkami jest nadal znaczny, zdefiniuj region kontrolny dla zakresu czasu, w którym zastosowano roztwór kontrolny.Jeżeli obszar kontrolny ma wyraźny sygnał nieoscylacyjny, należy założyć, że intensywność fluorescencji powraca do wartości wyjściowej po każdym zastosowaniu roztworu kontrolnego. Aby skorygować dane poklatkowe dla każdej komórki, podziel dane na segmenty oddzielone punktami, w których dodano roztwór kontrolny, i zastosuj korekcję liniową do każdego segmentu. Jeśli zakres sterowania ma wyraźne oscylacje lub występują dodatkowe czynniki, należy użyć algorytmu wykrywania skoków.Aby zmierzyć częstotliwość skoków wapnia i odpowiedź na dodanie agonistów i antagonistów, podziel zapis na równe przedziały czasowe, policz skoki w przedziale i znormalizuj do czasu trwania interwału, aby obliczyć przebieg czasowy częściowej częstotliwości. Alternatywnie można ustawić próg i obliczyć frakcję plateau dla każdego z interwałów. Ułamek wskazuje procent czasu w przedziale, który komórka spędziła w stanie wzbudzonym.Lub oblicz częściowy obszar pod krzywą dla każdego z interwałów. O ile nie wpłynęło to na skład lipidowy błony, wysepki dość dobrze obciążają się barwnikami tropikalnymi. Ludzki wektor adenowirusa typu 5 również z powodzeniem atakuje komórki wysp trzustkowych.Skok wapnia w komórkach alfa można łatwo wykryć przy niskim poziomie glukozy i istnieje wysoka korelacja między aktywnością przy niskim poziomie glukozy a reakcją na adrenalinę i glutaminian. Grelina aktywuje niektóre komórki reagujące na adrenalinę przy niskim poziomie glukozy, ale nie ma wpływu na dynamikę wapnia w większości komórek, które są aktywowane przez niski poziom glukozy. Analizowane pod kątem częściowej częstotliwości, komórki stymulowane adrenaliną lub greliną wykazują znaczny wzrost w warunkach "wszystko albo nic", chociaż ogólne zmiany między podstawowym wzrostem a efektem adrenaliny są subtelne.W przeciwieństwie do tego, częściowy obszar pod krzywą jest wrażliwy na zmiany wprowadzane przez adrenalinę we wszystkich komórkach, nawet gdy podstawowa aktywność jest wysoka. Upewnij się, że wszystkie siatki stykają się z roztworem do obrazowania i należy uważać, aby ułożyć tkankę dość gęsto, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Metodę można rozszerzyć o sztuczną inteligencję do różnicowania typów komórek.Markery farmakologiczne można zastąpić technologią rozpoznawania wzorców, skracając w ten sposób czas nagrywania.

imaging-calcium-dynamics-subpopulations-mouse-pancreatic-islet

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Poniższy protokół przedstawia proces wycinania trzustki do obrazowania wirtualnych przekrojów oraz następującą po nim kwantyfikację wszystkich komórek beta znakowanych GFP w całej trzustce.

Ilościowe oznaczanie masy komórek beta trzustki u myszy in situ

Opisano nowatorskie metody wspomagane komputerowo w zakresie wielkoskalowego pozyskiwania i analizy preparatów trzustki barwionych immunohistochemicznie: (1) rejestracja wirtualnych przekrojów (Virtual Slice) całego preparatu; (2) masowa analiza danych w dużej skali; (3) rekonstrukcja 2D wirtualnych przekrojów; (4) mapowanie 3D wysepek trzustkowych oraz (5) analiza matematyczna.

Komputerowa wizualizacja i kwantyfikacja na dużą skalę masy wysepek trzustkowych, ich rozkładu wielkości oraz architektury

Ten film opisuje technikę obrazowania komórek wysp trzustkowych w czasie rzeczywistym, w celu zbadania zmian w stężeniu wapnia cytozolowego w mniejszych subpopulacjach komórek wysp trzustkowych. Mniejsze subpopulacje komórek można zidentyfikować za pomocą funkcjonalnych odpowiedzi na związki markerowe, takie jak adrenalina i grelina, które indukują zmiany w cytozolowym wapniu w określonych populacjach komórek wysp trzustkowych. Może to zapewnić wgląd w wzajemne oddziaływanie między poziomem...

Obrazowanie dynamiki wapnia w komórkach trzustki: technika badania zmian w czasie rzeczywistym stężenia wapnia cytozolowego w wyspach trzustkowych

Badanie in vitro funkcji komórek β przy użyciu izolowanych mysich wysepek Langerhansa jest ważnym elementem badań nad patofizjologią i terapią cukrzycy. Chociaż dostępnych jest wiele dalszych zastosowań, protokół ten szczegółowo opisuje pomiar wewnątrzkomórkowego cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP) jako podstawowego parametru określającego funkcję komórek β.

Metoda izolacji wysp trzustkowych myszy i wewnątrzkomórkowego oznaczania cAMP

Prezentujemy tutaj protokół izolacji wysp trzustkowych z mysiego modelu cukrzycy typu 2, Leprdb oraz szczegóły testu żywych komórek do pomiaru wydzielania insuliny z nienaruszonych wysp trzustkowych, który wykorzystuje mikroskopię 2-fotonową.

Mysi model cukrzycy typu 2 Leprdb: izolacja wysp trzustkowych i obrazowanie 2-fotonowe żywych komórek nienaruszonych wysp trzustkowych

Funkcjonalność komórek beta jest ważna dla homeostazy glukozy we krwi, która jest oceniana w rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą genetycznie zakodowanego reportera dla napływu wapnia.

Analiza funkcji komórek beta za pomocą obrazowania wapnia w rozdzielczości pojedynczej komórki na wysepkach danio pręgowanego

To badanie przedstawia zastosowanie żywych wycinków tkanki trzustki do badania fizjologii wysp trzustkowych i interakcji między komórkami odpornościowymi wysp trzustkowych.

Obserwacja funkcji wysp trzustkowych i interakcji między wyspami trzustkowymi a komórkami układu odpornościowego w żywych wycinkach tkanki trzustkowej

Prezentujemy przygotowanie ostrych wycinków tkanki trzustkowej i ich zastosowanie w konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej do jednoczesnego badania dynamiki wapnia w dużej liczbie żywych komórek, przez długie okresy czasu i z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną.

Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa dynamiki wapnia w ostrych wycinkach tkanki trzustkowej myszy

Obrazowanie in vivo trzustki w wysokiej rozdzielczości było ułatwione dzięki oknu obrazowania przyżyciowego trzustki.

Stabilizowana podłużna wizualizacja trzustki na poziomie komórkowym in vivo w modelu mysim z oknem obrazowania przyżyciowego trzustki

Ten protokół opisuje, jak generować ludzkie wycinki trzustki od zmarłych dawców narządów w celu badania funkcji komórek w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. To innowacyjne podejście umożliwia badanie normalnych i strukturalnie uszkodzonych wysp trzustkowych oraz skomplikowanych interakcji między przedziałami endokrynnymi i zewnątrzwydzielniczymi.

Generowanie wycinków ludzkiej tkanki trzustki w celu badania fizjologii endokrynnej i zewnątrzwydzielniczej trzustki

Poznaj metodę obrazowania dynamiki wapnia w subpopulacjach komórek wysp trzustkowych myszy. Technika umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym z wysoką powtarzalnością danych.

Obrazowanie dynamiki wapnia w subpopulacjach komórek wysp trzustkowych myszy

Przeglądaj więcej filmów