Obrazowanie dynamiki wapnia w subpopulacjach komórek wysp trzustkowych myszy

Protokół umożliwia szybkie izolowanie funkcji małych subpopulacji komórek w obrębie wysp trzustkowych Langerhansa. Do zalet tej techniki należy charakter w czasie rzeczywistym i wysoka moc statystyczna, a co za tym idzie wysoka odtwarzalność pozyskanych danych. Aby unieruchomić wysepki do obrazowania, należy zamontować komorę obrazowania dla mikroskopu odwróconego i umieścić w komorze szklaną szkiełko osłonowe.

Upewnij się, że interfejs szklanej komory jest wodoszczelny i upewnij się, że szkiełko nakrywkowe znajduje się w zasięgu obiektywu mikroskopu. Następnie wytnij kwadraty o wymiarach 20 na 20 milimetrów o drobnych i grubych oczkach i użyj 45 do 50 mikrometrowych kawałków grubej taśmy klejącej, aby utworzyć dwie ścianki dystansowe na kawałku drobnej siatki. Zanurz grubą siatkę i odważnik w 35-milimetrowej szalce Petriego z roztworem do obrazowania i umieść drobną siatkę pod mikroskopem preparacyjnym.

Obróć drobną siatkę ze ściankami dystansowymi do góry nogami i przekładkami skierowanymi do góry. I użyj pipety p20, aby przenieść kilka wysepek między dwoma przekładkami. Za pomocą kleszczyków zegarmistrzowskich umieść siatkę do góry nogami w komorze obrazowania mikroskopu odwróconego, tak aby przekładki były skierowane w dół, aby przylegać bezpośrednio do szkiełka nakrywkowego komory, zatrzymując wysepki między przekładkami a siatką pośrodku szkiełka nakrywkowego.

Należy upewnić się, że siatka jest dobrze nawodniona i nie zawiera nadmiernych objętości roztworu, które mogłyby spowodować ruch poprzeczny próbki. Następnie umieść grubą siatkę i ciężarek na wierzchu drobnej siatki w komorze i dodaj roztwór do obrazowania do komory. Po unieruchomieniu wysp trzustkowych wybierz tryb obrazowania i obiektyw w mikroskopie odwróconym, a następnie umieść komorę z wyspami na stoliku mikroskopu z kontrolowaną temperaturą.

Po ustawieniu perfuzji należy ustawić dopływ poniżej odpływu w komorze i ustawić strumień odpływu na większy niż strumień dopływu. Upewnij się, że odpływ ma minimalny kontakt z roztworem, tak aby usuwał roztwór w wielu sekwencyjnych małych kropelkach, unikając długich przerw ciągłego usuwania roztworu. Następnie rozpocznij perfuzję roztworem do obrazowania zawierającym trzy milimolowe glukozy i wybierz ścieżkę światła oraz filtry do obrazowania zielonych fluoroforów.

Następnie uruchom obrazowanie na żywo, aby skonfigurować parametry obrazowania i dostosować widok, aby uchwycić interesujące nas wysepki. Aby zoptymalizować stosunek sygnału do szumu obrazu, dostosuj intensywność światła wzbudzenia, czas ekspozycji i bining, upewniając się, że ustawienia umożliwiają wyraźną wizualizację każdej komórki w wysepkach przy minimalnym możliwym natężeniu światła i ekspozycji. Następnie zobrazuj wysepki z częstotliwością od 0,1 do pięciu herców, sprawdzając jakość pozyskanych danych w trakcie ich przechwytywania.

Gdy aktywność komórek alfa jest wykrywalna, użyj wykresu dynamiki sygnału online w oprogramowaniu do akwizycji i dodaj adrenalinę lub glutaminian do roztworu kąpieli przez dwie do pięciu minut. Zaobserwuje się szybki skok wapnia, po którym nastąpi spowolnienie lub anulowanie oscylacji komórek alfa. Następnie dodaj grelinę, która, jak ostatnio doniesiono, selektywnie aktywuje komórki delta.

Szybki odwracalny wzrost wapnia będzie obserwowany w małej subpopulacji komórek wysp trzustkowych. Następnie dodaj 10 milimolowych glukoz. Zaobserwowana zostanie skoordynowana odpowiedź oscylacyjna w subpopulacji komórek beta.

Zwróć również uwagę na reakcje komórek, które były wcześniej aktywowane przez adrenalinę lub glutaminian i grelinę. Po zapisaniu obrazów zaimportuj dane do odpowiedniego programu do analizy danych i znormalizuj surowe dane dotyczące intensywności fluorescencji do początkowej wartości fluorescencji. Jeśli zestaw danych o intensywności fluorescencji zmienności między komórkami jest nadal znaczny, zdefiniuj region kontrolny dla zakresu czasu, w którym zastosowano roztwór kontrolny.

Jeżeli obszar kontrolny ma wyraźny sygnał nieoscylacyjny, należy założyć, że intensywność fluorescencji powraca do wartości wyjściowej po każdym zastosowaniu roztworu kontrolnego. Aby skorygować dane poklatkowe dla każdej komórki, podziel dane na segmenty oddzielone punktami, w których dodano roztwór kontrolny, i zastosuj korekcję liniową do każdego segmentu. Jeśli zakres sterowania ma wyraźne oscylacje lub występują dodatkowe czynniki, należy użyć algorytmu wykrywania skoków.

Aby zmierzyć częstotliwość skoków wapnia i odpowiedź na dodanie agonistów i antagonistów, podziel zapis na równe przedziały czasowe, policz skoki w przedziale i znormalizuj do czasu trwania interwału, aby obliczyć przebieg czasowy częściowej częstotliwości. Alternatywnie można ustawić próg i obliczyć frakcję plateau dla każdego z interwałów. Ułamek wskazuje procent czasu w przedziale, który komórka spędziła w stanie wzbudzonym.

Lub oblicz częściowy obszar pod krzywą dla każdego z interwałów. O ile nie wpłynęło to na skład lipidowy błony, wysepki dość dobrze obciążają się barwnikami tropikalnymi. Ludzki wektor adenowirusa typu 5 również z powodzeniem atakuje komórki wysp trzustkowych.

Skok wapnia w komórkach alfa można łatwo wykryć przy niskim poziomie glukozy i istnieje wysoka korelacja między aktywnością przy niskim poziomie glukozy a reakcją na adrenalinę i glutaminian. Grelina aktywuje niektóre komórki reagujące na adrenalinę przy niskim poziomie glukozy, ale nie ma wpływu na dynamikę wapnia w większości komórek, które są aktywowane przez niski poziom glukozy. Analizowane pod kątem częściowej częstotliwości, komórki stymulowane adrenaliną lub greliną wykazują znaczny wzrost w warunkach "wszystko albo nic", chociaż ogólne zmiany między podstawowym wzrostem a efektem adrenaliny są subtelne.

W przeciwieństwie do tego, częściowy obszar pod krzywą jest wrażliwy na zmiany wprowadzane przez adrenalinę we wszystkich komórkach, nawet gdy podstawowa aktywność jest wysoka. Upewnij się, że wszystkie siatki stykają się z roztworem do obrazowania i należy uważać, aby ułożyć tkankę dość gęsto, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Metodę można rozszerzyć o sztuczną inteligencję do różnicowania typów komórek.

Markery farmakologiczne można zastąpić technologią rozpoznawania wzorców, skracając w ten sposób czas nagrywania.