Name: Ekspresja białek bezkomórkowych przy użyciu szybko rosnącej bakterii Vibrio natriegens (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Poznaj ekspresję białek bezkomórkowych z wykorzystaniem szybko rosnącej bakterii Vibrio natriegens. Ta metoda umożliwia szybką syntezę białek z różnych szablonów DNA i mRNA w ciągu jednego do dwóch dni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez National Institute of General Medical Sciences 1U01GM110714-01 oraz Departament Energii DE-FG02-02ER63445. Autorzy chcieliby podziękować dr Richardowi Kohmanowi, dr Jenny Tam i dr Edgarowi Goluchowi za pomocne rady dotyczące konstruowania sekcji protokołu w tym manuskrypcie.

<ol><li>Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663(2015).</li>
<li>Schoborg, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-free+platform+for+rapid+synthesis+and+testing+of+active+oligosaccharyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">A cell-free platform for rapid synthesis and testing of active oligosaccharyltransferases.</a> Biotechnology and Bioengineering. 115 (3), 739-750 (2018).</li>
<li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+2.3+mg%2Fml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li>
<li>Henrich, E., Hein, C., Dötsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+production+in+Escherichia+coli+cell-free+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates.</a> FEBS Letters. 589 (15), 1713-1722 (2015).</li>
<li>Li, J., Wang, H., Kwon, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+high+yielding+streptomyces%E2%80%90based+cell%E2%80%90free+protein+synthesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Establishing a high yielding streptomyces‐based cell‐free protein synthesis system.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114 (6), 1343-1353 (2017).</li>
<li>Moore, S. J., Lai, H. E., Needham, H., Polizzi, K. M., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptomyces+venezuelae+TX-TL--a+next+generation+cell-free+synthetic+biology+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Streptomyces venezuelae TX-TL--a next generation cell-free synthetic biology tool.</a> Biotechnology Journal. 12 (4), 1600678(2017).</li>
<li>Wang, H., Li, J., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Pseudomonas+putida+cell-free+protein+synthesis+platform+for+rapid+screening+of+gene+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of a Pseudomonas putida cell-free protein synthesis platform for rapid screening of gene regulatory elements.</a> Synthetic Biology. 3 (1), ysy003(2018).</li>
<li>Kelwick, R., Webb, A. J., MacDonald, J. T., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Bacillus+subtilis+cell-free+transcription-translation+system+for+prototyping+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Development of a Bacillus subtilis cell-free transcription-translation system for prototyping regulatory elements.</a> Metabolic Engineering. 38, 370-381 (2016).</li>
<li>Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+Cell-Free+Vibrio+natriegens+Expression+System%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Establishing a Cell-Free Vibrio natriegens Expression System.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (10), 2475-2479 (2018).</li>
<li>Des Soye, B. J., Davidson, S. R., Weinstock, M. T., Gibson, D. G., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+High-Yielding+Cell-Free+Protein+Synthesis+Platform+Derived+from+Vibrio+natriegens%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Establishing a High-Yielding Cell-Free Protein Synthesis Platform Derived from Vibrio natriegens.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2245-2255 (2018).</li>
<li>Failmezger, J., Scholz, S., Blombach, B., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Free+Protein+Synthesis+From+Fast-Growing+Vibrio+natriegens%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cell-Free Protein Synthesis From Fast-Growing Vibrio natriegens.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1146(2018).</li>
<li>Moore, S. J., MacDonald, J. T., Wienecke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+acquisition+and+model-based+analysis+of+cell-free+transcription-translation+reactions+from+nonmodel+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid acquisition and model-based analysis of cell-free transcription-translation reactions from nonmodel bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), E4340-E4349 (2018).</li>
<li>Eagon, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+natriegens%2C+a+marine+bacterium+with+a+generation+time+of+less+than+10+minutes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas natriegens, a marine bacterium with a generation time of less than 10 minutes.</a> Journal of Bacteriology. 83, 736-737 (1962).</li>
<li>Weinstock, M. T., Hesek, E. D., Wilson, C. M., Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+natriegens+as+a+fast-growing+host+for+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology.</a> Nature Methods. 13 (10), 849-851 (2016).</li>
<li>Lee, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+natriegens%2C+a+new+genomic+powerhouse%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Vibrio natriegens, a new genomic powerhouse.</a> bioRxiv. , 058487(2016).</li>
<li>Lee, H. H., Ostrov, N., Gold, M. A., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombineering+in+Vibrio+natriegens%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Recombineering in Vibrio natriegens.</a> bioRxiv. , 130088(2017).</li>
<li>Schleicher, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+natriegens+as+Host+for+Expression+of+Multisubunit+Membrane+Protein+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Vibrio natriegens as Host for Expression of Multisubunit Membrane Protein Complexes.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2537(2018).</li>
<li>Fernández-Llamosas, H., Castro, L., Blázquez, M. L., Díaz, E., Carmona, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speeding+up+bioproduction+of+selenium+nanoparticles+by+using+Vibrio+natriegens+as+microbial+factory%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Speeding up bioproduction of selenium nanoparticles by using Vibrio natriegens as microbial factory.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16046(2017).</li>
<li>Aiyar, S. E., Gaal, T., Gourse, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rRNA+promoter+activity+in+the+fast-growing+bacterium+Vibrio+natriegens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">rRNA promoter activity in the fast-growing bacterium Vibrio natriegens.</a> Journal of Bacteriology. 184 (5), 1349-1358 (2002).</li>
<li>Hoffart, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+substrate+uptake+rates+empower+Vibrio+natriegens+as+production+host+for+industrial+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">High substrate uptake rates empower Vibrio natriegens as production host for industrial biotechnology.</a> Applied and Environmental Microbiology. 83, e01614-e01617 (2017).</li>
<li>Long, C. P., Gonzalez, J. E., Cipolla, R. M., Antoniewicz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+the+fast-growing+bacterium+Vibrio+natriegens+elucidated+by+13C+metabolic+flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Metabolism of the fast-growing bacterium Vibrio natriegens elucidated by 13C metabolic flux analysis.</a> Metabolic Engineering. 44, 191-197 (2017).</li>
<li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+Coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of Biological Engineering. 4, 8(2010).</li>
<li>Sitaraman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cell-free+protein+synthesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A novel cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).</li>
<li>Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+DNA+for+rapid+prototyping+of+synthetic+biological+circuits+in+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an Escherichia coli based TX-TL cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).</li>
<li>Seki, E., Matsuda, N., Yokoyama, S., Kigawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+system+from+Escherichia+coli+cells+cultured+at+decreased+temperatures+improves+productivity+by+decreasing+DNA+template+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis system from Escherichia coli cells cultured at decreased temperatures improves productivity by decreasing DNA template degradation.</a> Analytical Biochemistry. 377 (2), 156-161 (2008).</li>
<li>Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+from+non-growing%2C+stressed+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16524(2017).</li>
<li>Shirokov, V. A., Simonenko, P. N., Biryukov, S. V., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous-Flow+and+Continuous-Exchange+Cell-Free+Translation+Systems+and+Reactors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell-Free+Translation+Systems%22%5BJournal%5D)">Continuous-Flow and Continuous-Exchange Cell-Free Translation Systems and Reactors.</a> Cell-Free Translation Systems. , 91-107 (2002).</li>
<li>Michel-Reydellet, N., Woodrow, K., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+PCR+fragment+stability+and+protein+yields+in+a+cell-free+system+with+genetically+modified+Escherichia+coli+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Increasing PCR fragment stability and protein yields in a cell-free system with genetically modified Escherichia coli extracts.</a> Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 9 (1), 26-34 (2005).</li>
<li>Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+biological+applications+using+cell-free+metabolic+engineering%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview.</a> Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).</li>
</ol>

DJW, NO i GMC złożyły wniosek patentowy związany z tą pracą.

Protokół ten został zoptymalizowany pod kątem natriegenów typu dzikiego i pożywek rozwojowych bakterii składających się z LB uzupełnionego solami V2 (Tabela materiałów). Inne szczepy V. natriegens mogą być hodowane w podobny sposób w celu wytworzenia surowych ekstraktów komórkowych do reakcji bezkomórkowych; Ich zastosowanie wymaga jednak dodatkowej optymalizacji tego protokołu. Dodatkowo, ten bezkomórkowy system ekspresji białek został zoptymalizowany przy użyciu kwasu 3-fosfoglicerynowego (3-PGA) jako podstawowego źródła regeneracji energii. Można stosować inne źródła odzyskiwania energii; Jednak optymalizacja odczynników i kalibracja będą prawdopodobnie wymagane do uzyskania wysokowydajnej ekspresji białka10,11.
Zwrócenie szczególnej uwagi na kilka kluczowych etapów w tym protokole zapewni maksymalną wydajność ekstraktu w celu uzyskania wysokiej wydajności produkcji białek bezkomórkowych. Po pierwsze, surowy ekstrakt komórkowy musi być przygotowany z kultur komórkowych V. natriegens zebranych w środkowej fazie wykładniczej wzrostu; Wydajność białka jest maksymalna, gdy kultury osiągną OD600 = 1,0 ± 0,2. Podczas gdy bezkomórkowa produkcja białek jest możliwa z komórek zebranych w różnym zakresie gęstości optycznej, wcześniej odkryliśmy, że komórki zebrane w wykładniczym stanie wzrostu dają znacznie więcej białka9. Zaobserwowany wpływ gęstości optycznej na wydajność surowego ekstraktu komórkowego jest zgodny z tymi zgłoszonymi dla innych bezkomórkowych systemów ekspresji pochodzących z komórek hodowanych w warunkach hodowli okresowej1. Ponieważ V. natriegens rośnie w szybkim tempie, kluczowe znaczenie ma ścisłe monitorowanie gęstości optycznej kultur. Ogólnie rzecz biorąc, oczekuje się, że kultury V. natriegens powinny w sposób powtarzalny osiągnąć OD600 wynoszący 1,0 w ciągu 1−1,5 godziny przy użyciu tego protokołu; Jednak indywidualne warunki wzrostu, takie jak użycie kolb z przegrodami i bez przegrody, które wpływają na napowietrzenie, lub inkubacja powietrze kontra woda, która wpływa na szybkość i stabilność temperatury inkubacji, mogą zmienić czas wzrostu. Ponadto ogólnie zaleca się hodowlę co najmniej 250 ml V. natriegens w kolbie z przegrodami o pojemności 1 l, aby zapewnić osad o dużych komórkach podczas zbioru, co ułatwia manipulację i przenoszenie. To znacznie poprawia skuteczność przygotowania surowego ekstraktu komórkowego, a także zwiększa całkowitą objętość ekstraktu wytwarzanego z osadu. W przypadku stosowania preparatu na mniejszą skalę, warunki hodowli i odczynniki można odpowiednio dostosować. W przypadku fermentacji na dużą skalę może być wymagana dalsza optymalizacja warunków hodowli. Wreszcie, aby zapewnić wysoką wydajność białka, bardzo ważne jest, aby granulki komórkowe były przetwarzane natychmiast po zbiorze lub w ciągu 1-2 dni od przechowywania w temperaturze -80 °C.
Właściwa liza osadu komórkowego za pomocą sonikacji impulsowej ma kluczowe znaczenie dla powodzenia ekspresji białek bezkomórkowych i jest często najtrudniejszym aspektem tego protokołu dla nowych użytkowników. Zazwyczaj dobrze zlizowany granulat daje znaczną ilość płynnego ekstraktu, który jest wolny od zanieczyszczeń. Ekstrakt powinien być lekko lepki, ale można go łatwo pipetować podczas porcjowania do probówek do przechowywania przed błyskawicznym zamrożeniem w ciekłym azocie. Rysunek 3 przedstawia przedstawienie dobrze zlizywanego osadu (rysunek 3A) w porównaniu ze słabo zlizowanym osadem (rysunek 3B) po etapie wirowania po lizie. Główną wskazówką całkowitej lizy komórek jest całkowite stężenie białka w surowym ekstrakcie komórkowym > 20 mg/ml, określone za pomocą testu białka całkowitego (krok 2.13). Nadmierna sonikacja lub nadmierne podgrzanie surowego ekstraktu komórkowego spowoduje uszkodzenie maszynerii komórkowej, czego nie można określić bez przeprowadzenia reakcji bezkomórkowej. W związku z tym bardzo korzystne jest przetestowanie wydajności ekstraktu z reakcją kontrolną przed poświęceniem znacznej ilości czasu i wysiłku na dalsze zastosowania ekspresji białek. Chociaż dodatkowa optymalizacja może być konieczna dla różnych urządzeń do sonikacji, opisane etapy sonikacji impulsowej są wysoce powtarzalne w naszych rękach.
Zastosowanie liniowej matrycy DNA pochodzącej z amplifikacji PCR, trawienia enzymów restrykcyjnych lub komercyjnej syntezy genów może znacznie zwiększyć zdolność do wysokoprzepustowej i szybkiej produkcji białek w bezkomórkowych systemach ekspresji24. Chociaż wykazano produkcję białka z amplifikowanej matrycy liniowej z amplifikacją PCR, wydajność tych reakcji jest około 13,5 razy niższa w porównaniu z reakcjami z użyciem matrycy plazmidowego DNA w proporcjach równomolowych9. Wynika to przede wszystkim z niestabilności liniowej matrycy DNA, która prawdopodobnie ulega degradacji przez endogenne nukleazy obecne w surowym ekstrakcie komórkowym V. natriegens. Podczas gdy białko lambda faga GamS było wcześniej używane do ochrony liniowej matrycy DNA24,25, okazało się, że jest niekompatybilne z ekstraktami V. natriegens 9. Ponadto, podczas gdy zwiększenie stężenia liniowej matrycy DNA może pozwolić na wyższą wydajność białka, jego szybka degradacja w surowym ekstrakcie komórkowym nadal będzie poważnym problemem.
Rozwiązaniem problemu liniowej degradacji matrycy DNA może być uzupełnienie reakcji bezkomórkowych matrycą mRNA wygenerowaną z transkrypcji in vitro liniowego DNA. Z drugiej strony, zastosowanie inhibitora RNazy zapewnia znaczną ochronę przed degradacją transkryptu mRNA, a znaczne plony białka można uzyskać w 10 μl bezkomórkowej reakcji (ryc. 5A,B). Klonowanie liniowego DNA do okrągłej matrycy poprzez ligację TA, klonowanie TOPO, montaż Golden Gate lub inne metody rekombinacji mogą być stosowane w celu obejścia degradacji matrycy. Niemniej jednak konieczne będą dalsze podejścia do hamowania aktywności nukleazy w celu efektywnej ekspresji białek przy użyciu liniowej matrycy DNA.
Do tej pory zaproponowano kilka różnych podejść do przygotowania surowego ekstraktu do bezkomórkowej ekspresji białek 9,10,11,26. Opracowując ten protokół, staraliśmy się zmaksymalizować dostępność dla użytkowników, obniżyć ogólne koszty i zminimalizować czasochłonne kroki. Na przykład, wysoka wydajność białka jest osiągana przy użyciu prostego, dwuetapowego procesu sonikacji-wirowania i nie wymaga homogenizatorów komórkowych, długich etapów dializy ani reakcji spływu. Jest prosty do wykonania w krótkim czasie i nie wymaga wysokiego poziomu wiedzy laboratoryjnej. W związku z tym może ułatwić ekspresję bezkomórkową jako standard dla translacyjnych badań akademickich i projektowania procesów przemysłowych.
Protokół ten rozszerza zestaw narzędzi dostępnych do badania i użyteczności V. natriegens, niemodelowego organizmu o unikalnych właściwościach biologicznych. Wyższą wydajność białka można osiągnąć poprzez zastosowanie pół- lub w pełni ciągłych reakcji bezkomórkowych, aby umożliwić regenerację energii, ponowne dostarczenie aminokwasów i usunięcie produktów przemiany materii 3,5,27. Co więcej, inżynieria V. natriegens typu dzikiego w celu wytwarzania szczepów z niedoborem DNAse lub RNAse, usunięcie szkodliwych i konkurencyjnych szlaków metabolicznych oraz ekspresja dodatkowych tRNA może znacznie zwiększyć produkcję białek w tym systemie28,29. W miarę jak odkrywamy biologię leżącą u podstaw jego szybkiego wzrostu, dalszy rozwój systemów bezkomórkowych V. natriegens może przyspieszyć możliwości bioprodukcyjne i umożliwić solidną ekspresję peptydów terapeutycznych, małych cząsteczek i materiałów syntetycznych.

Bezkomórkowa synteza białek to wszechstronna i opłacalna metoda ekspresji cennych białek lub peptydów1,2,3,4. Historycznie rzecz biorąc, bezkomórkową syntezę białek przeprowadzano przy użyciu systemów ekspresji Escherichia coli; Jednak ostatnio nastąpił gwałtowny wzrost wykorzystania alternatywnych, niemodelowych organizmów o nowych właściwościach jako podwozia do ekspresji bez komórek5,6,7,8,9,10,11,12. Organizmy o unikalnych profilach metabolicznych są głównymi kandydatami jako alternatywa dla systemów bezkomórkowych E. coli. Na przykład bakteria morska Vibrio natriegens jest najszybciej rosnącym ze wszystkich znanych organizmów, z obserwowanym czasem podwojenia poniżej 10 min13. To przyciągnęło znaczną uwagę V. natriegens jako nowego żywiciela mikrobiologicznego dla badań i biotechnologii14,15,16,17,18. Biorąc pod uwagę, że szybkie tempo wzrostu V. natriegens zostało powiązane z wysokimi wskaźnikami syntezy białek i wydajnością metaboliczną19,20,21, wykorzystanie jego maszynerii komórkowej do syntezy bezkomórkowej może znacznie rozszerzyć zestaw narzędzi do szybkiej produkcji białek i wysokoprzepustowych badań przesiewowych.
Ostatnio zademonstrowano bezkomórkowy system ekspresji >V. natriegens, który jest w stanie wytworzyć super folder GFP (sfGFP) w stężeniach > 260 μg/mL w ciągu 3 godzin z promotorem T79. Ogólnym celem opracowania tej metody było zapewnienie użytkownikom wysoce dostępnego, opłacalnego, powtarzalnego i wysokowydajnego systemu ekspresji białek bez komórek, który można przygotować przy użyciu zwykłego sprzętu laboratoryjnego w krótkim czasie. Protokół ten wykorzystuje hodowle 1 l w kolbach wstrząsowych, lizę komórek za pomocą sonikacji impulsowej oraz reakcje wsadowe na małą skalę w formacie 96- lub 384-dołkowym, aby zmaksymalizować zrównoleglenie i przepustowość badań przesiewowych. Długotrwała, trwała ekspresja białka jest możliwa dzięki suplementacji kwasu 3-fosfoglicerynowego (3-PGA) jako źródła energii8,22,23. Po pomyślnym ukończeniu tego protokołu użytkownik będzie miał możliwość ekspresji pożądanego białka lub zestawu białek w formacie bezkomórkowym przy użyciu surowego ekstraktu komórkowego V. natriegens.
Zaczynając od glicerolu, surowe ekstrakty komórkowe V. natriegens są przygotowywane z komórek zebranych w gęstości optycznej przy 600 nm (OD600) wynoszącej 1,0. Hodowla o pojemności 1 litra da około 2-3 ml ekstraktu, co wystarcza do przeprowadzenia ponad 800 reakcji bezkomórkowych przy 25% surowym ekstrakcie komórkowym. Białka mogą być wyrażane za pomocą plazmidowego DNA, liniowego DNA lub matrycy mRNA; jednak liniowa degradacja matrycy DNA przez endogenne nukleazy pozostaje główną wadą w przypadku stosowania dzikiego typu V. natriegens cell-free system9. Począwszy od kultur V. natriegens, białko nadające się do dalszych zastosowań może być osiągnięte przez jednego użytkownika w ciągu 1-2 pełnych dni.

<table><tbody><tr><td>Probówki 15 ml</td><td>Corning</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>384-dołkowe czarne płytki testowe</td><td>Corning</td><td>3544</td><td></td></tr><tr><td>384-dołkowe płytki PCR</td><td>Eppendorf</td><td>951020702</td><td></td></tr><tr><td>50 ml</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki do PCR</td><td>Eppendorf</td><td>30129300</td><td></td></tr><tr><td>Monohydrat soli sodowej adenozyny 3',5'-cyklicznego monofosforanu</td><td>Sigma</td><td>A6885</td><td></td></tr><tr><td>Adenozyno-5'-trifosforan - 100 mM</td><td>NEB</td><td>N0450L</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler</td><td>ThermoFisher</td><td>4388444</td><td></td></tr><tr><td>Assay Plate Adhesives</td><td></td><td>BioRad MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-nikotynamidoadenina hydrat dinukleotydu (NAD)</td><td>Sigma/Roche</td><td>10127965001</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat koenzymu A</td><td>Sigma</td><td>C4283</td><td></td></tr><tr><td>5'-trifosforan cytydyny - 100 mM</td><td>NEB</td><td>N0450L</td><td></td></tr><tr><td>Sól disodowa kwasu D-(-)-3-fosfoglicerynowego (3-PGA)</td><td>Sigma</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>Dewar Flask - 4L</td><td>ThermoScientific</td><td>10-194-100C</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór DL-ditiotreitolu - 1 M</td><td>Sigma</td><td>42816</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat soli wapniowej kwasu folinowego</td><td>Sigma</td><td>47612</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>5'-trifosforan guanozyny - 100 mM</td><td>NEB</td><td>N0450L</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrat soli hemimagnezowej kwasu L-glutaminowego</td><td>Sigma</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>Monohydrat soli potasowej kwasu L-glutaminowego</td><td>Sigma</td><td>G1149</td><td></td></tr><tr><td>LB Rosół (Miller)</td><td>Sigma</td><td>L3522</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2)</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid pJL1-sfGFP</td><td>Addgene</td><td>69496</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Plus Maxi zestaw</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td></td></tr><tr><td>Poli(glikol etylenowy) (PEG)-8000</td><td>Sigma</td><td>89510</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Granulki wodorotlenku potasu</td><td>Sigma/Roche</td><td>1050121000</td><td></td></tr><tr><td>Q125 Sonicator i sonda CL-18 z końcówką cala ?-calowego</td><td>Qsonica</td><td>4422</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do czyszczenia i koncentratora RNA</td><td>Zymo</td><td>R1013</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy, mysi</td><td>NEB</td><td>M0314</td><td></td></tr><tr><td>Próbnik aminokwasów RTS</td><td>Biotechrabbit</td><td>BR1401801</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Spermidyna</td><td>Sigma</td><td>S0266</td><td></td></tr><tr><td>T7 Polimeraza RNA</td><td>NEB</td><td>M0251</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Tris (pH 8,0) - 1 M</td><td>Invitrogen</td><td>AM9856</td><td></td></tr><tr><td>tRNA z E. coli MRE 600</td><td>Sigma/Roche</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>5'-trifosforan urydyny - 100 mM</td><td>NEB</td><td>N0450L</td><td></td></tr><tr><td>Vibrio natriegens (typ dziki) Liofilizowany materiał</td><td>ATCC</td><td>14048</td><td></td></tr></tbody></table>

ekspresja białek bezkomórkowych przy użyciu szybko rosnącej bakterii vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Morska bakteria Vibrio natriegens zyskała znaczną uwagę jako nowy mikrobiologiczny gospodarz dla biotechnologii ze względu na szybkie tempo wzrostu. Opisano ogólny protokół przygotowania surowych ekstraktów komórkowych V. natriegens przy użyciu powszechnie używanego sprzętu laboratoryjnego. Ten wysokowydajny protokół został specjalnie zoptymalizowany pod kątem dostępności dla użytkownika i obniżenia kosztów. Bezkomórkowa synteza białek (CFPS) może być przeprowadzana w małych reakcjach wsadowych 10 μl w formacie 96- lub 384-dołkowym i w sposób powtarzalny daje stężenia > 260 μg/ml super foldera GFP (sfGFP) w ciągu 3 godzin. Ogólnie rzecz biorąc, przygotowanie surowego ekstraktu komórkowego i CFPS może być osiągnięte w ciągu 1-2 pełnych dni przez jednego użytkownika. Protokół ten można łatwo zintegrować z istniejącymi procesami syntezy białek, aby ułatwić postęp w zastosowaniach bioprodukcji i biologii syntetycznej.

Bezkomórkowe systemy ekspresji są potężnymi i opłacalnymi narzędziami do wysokoprzepustowej syntezy i badań przesiewowych ważnych białek. W tym miejscu opisujemy przygotowanie bezkomórkowego systemu ekspresji białek przy użyciu natriegenów Vibrio do szybkiej produkcji białek przy użyciu plazmidowego DNA, liniowego DNA i matrycy mRNA.

Ekspresja białek bezkomórkowych przy użyciu szybko rosnącej bakterii Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

Nasz protokół ekspresji białek bezkomórkowych wykorzystuje wysoce aktywny surowy ekstrakt z szybko rosnącej bakterii Vibrio natriegens, który jest przygotowywany przy użyciu prostego i efektywnego czasowo dwuetapowego procesu sonikacji-wirowania. Przygotowanie surowego ekstraktu komórkowego i bezkomórkowa synteza białek mogą być osiągnięte w ciągu jednego do dwóch dni przez jednego użytkownika, co pozwala na łatwą integrację tej techniki z rurociągami do zastosowań w bioprodukcji lub biologii syntetycznej. Na początek umyj jeden mililitr nocnej kultury Vibrio natriegens, odwirowując ją w wirówce stołowej z prędkością 10 600 g przez jedną minutę.Odessać supernatant bez naruszania osadu i ponownie zawiesić w jednym mililitrze świeżej pożywki LB-V2. Zaszczepić jeden mililitr przemytej kultury przez noc do jednego litra świeżej pożywki wzrostowej LB-V2 w autoklawowanej czterolitrowej kolbie Erlenmeyera z przegrodą i sterylną pokrywą, aby uzyskać rację rozcieńczenia od jednego do tysiąca. Uprawiaj kulturę w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wstrząsając do 225 obr./min.Użyj spektrofotometru do monitorowania kultur OD 600. A kiedy osiągnie 1,0 plus minus 0,2, zbierz kulturę, odwirowując ją w dwóch 500-mililitrowych probówkach o temperaturze 3500 razy g przez 20 minut w czterech stopniach Celsjusza, a następnie umieść na lodzie. Odessać supernatant i natychmiast przetworzyć osad.Przed rozpoczęciem procedury lizy komórek schłodzić świeżo przygotowany bufor do lizy S30 o pH 7,7 do około czterech stopni Celsjusza, użyj 10 mililitrów tego zimnego buforu do lizy S30, aby ponownie zawiesić wszystkie granulki powstałe z tej samej jednolitrowej hodowli. I przenieś zawieszenie do 50-mililitrowej rury. Odwirować tę zawiesinę w temperaturze 3 500 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie odessać supernatant bez naruszania osadu i umieścić go na lodzie.Pracując w chłodni dodaj 500 mikrolitrów zimnego buforu do lizy S30 do granulatu w 50-mililitrowej probówce umieszczonej na lodzie. Użyj końcówki pipety o szerokim otworze, aby ponownie zawiesić granulkę i ostrożnie przenieś ją do dwumililitrowej tuby, również na lodzie. Aby wyprodukować bardzo aktywne ekstrakty surowe, musimy upewnić się, że komórki nie są nadmiernie rozcieńczone buforem S30, ale mają wystarczającą ilość płynu do skutecznej sonikacji.Napełnij 600-mililitrową zlewkę lodem i umieść dwumililitrowy uchwyt na rurkę na wierzchu lodu. Krótko przekręć rurkę, aby homogenizować komórki. Przesuń, aby usunąć wszelkie komórki na spodzie nasadki i umieść w uchwycie probówki z otwartą nakrętką.Opuść końcówkę sonikatora do zawiesiny ogniw w rurce, tak aby znajdowała się tuż pod powierzchnią cieczy. Przygotuj zestaw do sonikacji za pomocą sonikatora i sondy o średnicy końcówki 1/8 cala. Ustaw sonikator na częstotliwość 20 kiloherców i amplitudę 50%.Czas włączenia impulsu wynosi 10 sekund i czas wyłączenia impulsu 60 sekund. Uruchom protokół sonizacji impulsowej przez trzy cykle. A następnie odwirować surowy ekstrakt komórkowy w temperaturze 16 000 razy g przez 30 do 45 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż lizat będzie wolny od jakichkolwiek zanieczyszczeń komórkowych.Wizualna kontrola lizy komórek podczas sonikacji ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że sonikacja zadziałała zgodnie z oczekiwaniami. Pracując w chłodni, należy podać 50 mikrolitrów powstałych supernatantów do nowych dwumililitrowych probówek, uważając, aby nie naruszyć osadu. Aby błyskawicznie zamrozić te surowe ekstrakty komórkowe, umieść probówki w uchwycie probówki z dołączonym sznurkiem do zanurzania i zanurz w dewarze zawierającym ciekły azot i sprawdź, czy są zamrożone.Aby przeprowadzić ekspresję białka bezkomórkowego za pomocą matrycy DNA, rozmrozić 10-krotną mieszankę wzorcową roztworu energetycznego, 4-krotną podwielokrotność głównej mieszanki aminokwasów i matrycę DNA w temperaturze pokojowej. Następnie wyjmij zapasy polimerazy RNA T7 i inhibitora RNAzy z zamrażarki o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i umieść na lodzie. Po rozmrożeniu matrycy DNA, 10-krotnej mieszanki wzorcowej roztworu energetycznego i 4-krotnej mieszanki głównej aminokwasów umieść na lodzie.Przygotować bezkomórkową mieszankę wzorcową reakcji, dodając każdy składnik w dokładnej kolejności do dwumililitrowej probówki na lodzie i delikatnie przesuwać probówkę po każdym dodaniu do mieszanki wzorcowej. Usuń surowy lizat komórkowy Vibrio natriegens z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i umieść na lodzie na 10 do 20 minut, aż się rozmrozi. Dodać odpowiednią objętość rozmrożonego surowego ekstraktu komórkowego do bezkomórkowej mieszanki wzorcowej reakcji i delikatnie wymieszać za pomocą pipety.Aby przeprowadzić końcową ekspresję białka bezkomórkowego za pomocą termocyklera, najpierw dodaj 10 mikrolitrów bezkomórkowej mieszanki wzorcowej reakcji na dołek dna 96-dołkowej płytki PCR, upewniając się, że mieszasz mieszankę główną, delikatnie przesuwając probówkę między każdym transferem na płytkę PCR. Odwirować płytkę o masie 1 000 g przez 10 sekund, aby zebrać wszelkie mieszanki wzorcowe, które mogły przykleić się do ścianek studzienek. A następnie uszczelnij studzienki klejem do płyt, aby zapobiec parowaniu.Umieść płytkę w termocyklerze ustawionym na 26 stopni Celsjusza z podgrzewaną pokrywką ustawioną na 105 stopni Celsjusza. Po inkubacji reakcji na płytce PCR przez co najmniej trzy godziny, ekspresję białek można oczyścić, określić ilościowo i wykorzystać w dalszych procesach. Do monitorowania kinetyki ekspresji białek bezkomórkowych za pomocą czytnika płytek pipetować 10 mikrolitrów na studzienkę bezkomórkowej mieszanki wzorcowej reakcji na dno czarnej 384-dołkowej płytki testowej z przezroczystym szklanym dnem.I uszczelnij studzienki przezroczystym klejem do płyt, aby zapobiec parowaniu. Umieścić płytkę testową w czytniku płytek ustawionym na 26 stopni Celsjusza i inkubować przez trzy do sześciu godzin, monitorując odpowiednie długości fal wzbudzenia/emisji fluorescencji odpowiadające wyrażonemu białku. Bezkomórkowy system ekspresji opisany w tym protokole osiąga najlepsze wyniki z matrycą plazmidowego DNA dającą znacznie większą ilość białka niż ta sama ilość liniowego DNA, jak wykazano w testach końcowych i kinetycznych.Można również zastosować mRNA generowane w reakcjach transkrypcyjnych in vitro, ale wymagane są większe ilości mRNA. Na wydajność produkcji białka istotny wpływ miało stężenie jonów magnezu i potasu. W zoptymalizowanych warunkach stwierdzono, że optymalne stężenie jonów magnezu wynosi 3,5 milimola, a dla jonów potasu 80 milimolowych.Tak więc odchylenia od tych optymalnych stężeń jonów mogą skutkować zmniejszoną zdolnością tego systemu ekspresji do wytwarzania znacznych plonów białek. Ważne jest, aby wszystkie odczynniki przechowywać na lodzie lub pracować w chłodni tak długo, jak to możliwe. Dodatkowo, właściwa i kompletna sonikacja ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego protokołu.Zgodnie z tym protokołem użytkownicy będą mieli zdolność do ekspresji białek w formacie o wysokiej przepustowości, który może być wykorzystany do oczyszczania i badania przesiewowego pod kątem aktywności wielu różnych białek. Technika ta demonstruje wykorzystanie nowych organizmów o unikalnych właściwościach do ekspresji bezkomórkowej. Vibrio natriegens to halofilna, szybko rosnąca bakteria, która może oferować unikalne warunki do ekspresji białek lub małych cząsteczek, wcześniej niezbadanych w organizmach modelowych.

cell-free-protein-expression-using-rapidly-growing-bacterium-vibrio

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Źródło: Watson, D. C., et.al. Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje izolację i koncentrację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z zewnętrznej błony genetycznie zmodyfikowanych bakterii. Proces ten obejmuje hodowlę bakterii w celu uwolnienia EV, a następnie sekwencyjne etapy wirowania i filtracji w celu usunięcia komórek i zanieczyszczeń. Wreszcie, ultrafiltracja jest stosowana...

Izolacja i wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z błony zewnętrznej od bakterii

Źródło: Wiegand, D. J., Lee i in., Ekspresja białek bez komórek przy użyciu szybko rosnącej bakterii Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (2019)Ten film pokazuje uprawę i zbiór Vibrio natriegens, szybko rosnącej bakterii, w napowietrzanych warunkach w celu przygotowania granulek bakteryjnych do wytwarzania surowego ekstraktu.

Hodowla szybko rozwijającej się bakterii Vibrio natriegens

Źródło: Wiegand, D. J., et al. Ekspresja białek bezkomórkowych przy użyciu szybko rosnącej bakterii Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje przygotowanie ekstraktu komórkowego z Vibrio natriegens, szybko rosnącej bakterii znanej z wysokiej szybkości syntezy białek. Osad bakteryjny jest myty i ponownie zawieszany w buforze do lizy przed sonikacją na lodzie, aby zapobiec degradacji komórek. Lizat jest odwirowywany w celu oddzielenia nierozpuszczalnych szczątków komórkowych, a...

Przygotowanie surowego ekstraktu komórkowego z Vibrio natriegens

Źródło: Wiegand, D. J., et al. Ekspresja białek bezkomórkowych przy użyciu szybko rosnącej bakterii Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (2019).Ten film demonstruje zastosowanie bakteryjnego, bezkomórkowego systemu ekspresji białek opartego na surowym lizacie Vibrio natriegens do przeprowadzenia sprzężonej transkrypcji i translacji in vitro. Skupia się na przygotowaniu głównej mieszanki z niezbędnymi składnikami i stopniowej syntezie funkcjonalnych białek z matrycy DNA.

Ekspresja białek bezkomórkowych przy użyciu ekstraktu z surowych komórek bakteryjnych

Elektroporacja jest powszechnie stosowaną metodą wprowadzania DNA do bakterii w procesie znanym jako transformacja. Tradycyjne protokoły przygotowania ogniw elektrokompetentnych są czasochłonne i pracochłonne. W artykule opisano alternatywną, szybką i wydajną metodę przygotowania ogniw elektrokompetentnych, obecnie stosowaną przez niektóre laboratoria.

Szybki protokół przygotowania elektrokompetentnych Escherichia coli i Vibrio cholerae

Opisujemy metodę charakterystyki transporterów błonowych napędzanych protonami w preparatach pęcherzyków błonowych wytwarzanych przez heterologiczną ekspresję w E. coli i lizę komórek za pomocą prasy francuskiej.

Charakterystyka transporterów błonowych przez ekspresję heterologiczną u E. coli i wytwarzanie pęcherzyków błonowych

Ten protokół opisuje szybką i prostą metodę produkcji lizatu bakteryjnego do ekspresji genów bez komórek, przy użyciu zmodyfikowanego szczepu Escherichia coli i wymagającego jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Szybka, niedroga i nieskomplikowana produkcja lizatu bezkomórkowego

Ta praca opisuje przygotowanie ekstraktu komórkowego z Escherichia coli (E. coli), po którym następują reakcje syntezy białek bez komórek (CFPS) w czasie krótszym niż 24 godziny. Wyjaśnienie protokołu autoindukcji bezkomórkowej (CFAI) zawiera szczegółowe informacje o ulepszeniach wprowadzonych w celu zmniejszenia nadzoru badaczy i zwiększenia ilości uzyskiwanego ekstraktu komórkowego.

Od komórek do bezkomórkowej syntezy białek w ciągu 24 godzin dzięki bezkomórkowemu przepływowi pracy

Bakterie wydzielają nanometrowe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przenoszące bioaktywne cząsteczki biologiczne. Badania nad EV koncentrują się na zrozumieniu ich biogenezy, roli w interakcjach i chorobach między drobnoustrojami a gospodarzem-mikroorganizmem, a także na ich potencjalnych zastosowaniach terapeutycznych. Przedstawiono proces pracy do skalowalnej izolacji pojazdów elektrycznych od różnych bakterii, aby ułatwić standaryzację badań nad pojazdami elektrycznymi.

Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii

Obecny protokół opisuje szczegółową metodę produkcji przez bakterie białek rekombinowanych, w tym zazwyczaj nierozpuszczalnych lub zawierających wiązania dwusiarczkowe, upakowanych wewnątrz pęcherzyków związanych z błoną zewnątrzkomórkową. Ma to potencjał do zastosowania w różnych obszarach badań naukowych, w tym w biotechnologii stosowanej i medycynie.

Zoptymalizowana produkcja i analiza rekombinowanych pęcherzyków wypełnionych białkiem E. coli

W artykule opisano metodologię nadekspresji rekombinowanej Nsp15, toksycznej nukleazy, w systemie ekspresji C41(DE3), a następnie oczyszczania znakowanego białka za pomocą chromatografii wykluczania powinowactwa i wielkości. Protokoły te można dostosować do innych trudnych toksycznych białek.

Nadekspresja i oczyszczanie toksycznej nukleazy z Escherichia coli

Poznaj ekspresję białek bezkomórkowych z wykorzystaniem szybko rosnącej bakterii Vibrio natriegens. Ta metoda umożliwia szybką syntezę białek z różnych szablonów DNA i mRNA w ciągu jednego do dwóch dni.

Ekspresja białek bezkomórkowych przy użyciu szybko rosnącej bakterii Vibrio natriegens

Przeglądaj więcej filmów