Ekspresja białek bezkomórkowych przy użyciu szybko rosnącej bakterii Vibrio natriegens

Nasz protokół ekspresji białek bezkomórkowych wykorzystuje wysoce aktywny surowy ekstrakt z szybko rosnącej bakterii Vibrio natriegens, który jest przygotowywany przy użyciu prostego i efektywnego czasowo dwuetapowego procesu sonikacji-wirowania. Przygotowanie surowego ekstraktu komórkowego i bezkomórkowa synteza białek mogą być osiągnięte w ciągu jednego do dwóch dni przez jednego użytkownika, co pozwala na łatwą integrację tej techniki z rurociągami do zastosowań w bioprodukcji lub biologii syntetycznej. Na początek umyj jeden mililitr nocnej kultury Vibrio natriegens, odwirowując ją w wirówce stołowej z prędkością 10 600 g przez jedną minutę.

Odessać supernatant bez naruszania osadu i ponownie zawiesić w jednym mililitrze świeżej pożywki LB-V2. Zaszczepić jeden mililitr przemytej kultury przez noc do jednego litra świeżej pożywki wzrostowej LB-V2 w autoklawowanej czterolitrowej kolbie Erlenmeyera z przegrodą i sterylną pokrywą, aby uzyskać rację rozcieńczenia od jednego do tysiąca. Uprawiaj kulturę w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wstrząsając do 225 obr./min.

Użyj spektrofotometru do monitorowania kultur OD 600. A kiedy osiągnie 1,0 plus minus 0,2, zbierz kulturę, odwirowując ją w dwóch 500-mililitrowych probówkach o temperaturze 3500 razy g przez 20 minut w czterech stopniach Celsjusza, a następnie umieść na lodzie. Odessać supernatant i natychmiast przetworzyć osad.

Przed rozpoczęciem procedury lizy komórek schłodzić świeżo przygotowany bufor do lizy S30 o pH 7,7 do około czterech stopni Celsjusza, użyj 10 mililitrów tego zimnego buforu do lizy S30, aby ponownie zawiesić wszystkie granulki powstałe z tej samej jednolitrowej hodowli. I przenieś zawieszenie do 50-mililitrowej rury. Odwirować tę zawiesinę w temperaturze 3 500 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie odessać supernatant bez naruszania osadu i umieścić go na lodzie.

Pracując w chłodni dodaj 500 mikrolitrów zimnego buforu do lizy S30 do granulatu w 50-mililitrowej probówce umieszczonej na lodzie. Użyj końcówki pipety o szerokim otworze, aby ponownie zawiesić granulkę i ostrożnie przenieś ją do dwumililitrowej tuby, również na lodzie. Aby wyprodukować bardzo aktywne ekstrakty surowe, musimy upewnić się, że komórki nie są nadmiernie rozcieńczone buforem S30, ale mają wystarczającą ilość płynu do skutecznej sonikacji.

Napełnij 600-mililitrową zlewkę lodem i umieść dwumililitrowy uchwyt na rurkę na wierzchu lodu. Krótko przekręć rurkę, aby homogenizować komórki. Przesuń, aby usunąć wszelkie komórki na spodzie nasadki i umieść w uchwycie probówki z otwartą nakrętką.

Opuść końcówkę sonikatora do zawiesiny ogniw w rurce, tak aby znajdowała się tuż pod powierzchnią cieczy. Przygotuj zestaw do sonikacji za pomocą sonikatora i sondy o średnicy końcówki 1/8 cala. Ustaw sonikator na częstotliwość 20 kiloherców i amplitudę 50%.

Czas włączenia impulsu wynosi 10 sekund i czas wyłączenia impulsu 60 sekund. Uruchom protokół sonizacji impulsowej przez trzy cykle. A następnie odwirować surowy ekstrakt komórkowy w temperaturze 16 000 razy g przez 30 do 45 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż lizat będzie wolny od jakichkolwiek zanieczyszczeń komórkowych.

Wizualna kontrola lizy komórek podczas sonikacji ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że sonikacja zadziałała zgodnie z oczekiwaniami. Pracując w chłodni, należy podać 50 mikrolitrów powstałych supernatantów do nowych dwumililitrowych probówek, uważając, aby nie naruszyć osadu. Aby błyskawicznie zamrozić te surowe ekstrakty komórkowe, umieść probówki w uchwycie probówki z dołączonym sznurkiem do zanurzania i zanurz w dewarze zawierającym ciekły azot i sprawdź, czy są zamrożone.

Aby przeprowadzić ekspresję białka bezkomórkowego za pomocą matrycy DNA, rozmrozić 10-krotną mieszankę wzorcową roztworu energetycznego, 4-krotną podwielokrotność głównej mieszanki aminokwasów i matrycę DNA w temperaturze pokojowej. Następnie wyjmij zapasy polimerazy RNA T7 i inhibitora RNAzy z zamrażarki o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i umieść na lodzie. Po rozmrożeniu matrycy DNA, 10-krotnej mieszanki wzorcowej roztworu energetycznego i 4-krotnej mieszanki głównej aminokwasów umieść na lodzie.

Przygotować bezkomórkową mieszankę wzorcową reakcji, dodając każdy składnik w dokładnej kolejności do dwumililitrowej probówki na lodzie i delikatnie przesuwać probówkę po każdym dodaniu do mieszanki wzorcowej. Usuń surowy lizat komórkowy Vibrio natriegens z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i umieść na lodzie na 10 do 20 minut, aż się rozmrozi. Dodać odpowiednią objętość rozmrożonego surowego ekstraktu komórkowego do bezkomórkowej mieszanki wzorcowej reakcji i delikatnie wymieszać za pomocą pipety.

Aby przeprowadzić końcową ekspresję białka bezkomórkowego za pomocą termocyklera, najpierw dodaj 10 mikrolitrów bezkomórkowej mieszanki wzorcowej reakcji na dołek dna 96-dołkowej płytki PCR, upewniając się, że mieszasz mieszankę główną, delikatnie przesuwając probówkę między każdym transferem na płytkę PCR. Odwirować płytkę o masie 1 000 g przez 10 sekund, aby zebrać wszelkie mieszanki wzorcowe, które mogły przykleić się do ścianek studzienek. A następnie uszczelnij studzienki klejem do płyt, aby zapobiec parowaniu.

Umieść płytkę w termocyklerze ustawionym na 26 stopni Celsjusza z podgrzewaną pokrywką ustawioną na 105 stopni Celsjusza. Po inkubacji reakcji na płytce PCR przez co najmniej trzy godziny, ekspresję białek można oczyścić, określić ilościowo i wykorzystać w dalszych procesach. Do monitorowania kinetyki ekspresji białek bezkomórkowych za pomocą czytnika płytek pipetować 10 mikrolitrów na studzienkę bezkomórkowej mieszanki wzorcowej reakcji na dno czarnej 384-dołkowej płytki testowej z przezroczystym szklanym dnem.

I uszczelnij studzienki przezroczystym klejem do płyt, aby zapobiec parowaniu. Umieścić płytkę testową w czytniku płytek ustawionym na 26 stopni Celsjusza i inkubować przez trzy do sześciu godzin, monitorując odpowiednie długości fal wzbudzenia/emisji fluorescencji odpowiadające wyrażonemu białku. Bezkomórkowy system ekspresji opisany w tym protokole osiąga najlepsze wyniki z matrycą plazmidowego DNA dającą znacznie większą ilość białka niż ta sama ilość liniowego DNA, jak wykazano w testach końcowych i kinetycznych.

Można również zastosować mRNA generowane w reakcjach transkrypcyjnych in vitro, ale wymagane są większe ilości mRNA. Na wydajność produkcji białka istotny wpływ miało stężenie jonów magnezu i potasu. W zoptymalizowanych warunkach stwierdzono, że optymalne stężenie jonów magnezu wynosi 3,5 milimola, a dla jonów potasu 80 milimolowych.

Tak więc odchylenia od tych optymalnych stężeń jonów mogą skutkować zmniejszoną zdolnością tego systemu ekspresji do wytwarzania znacznych plonów białek. Ważne jest, aby wszystkie odczynniki przechowywać na lodzie lub pracować w chłodni tak długo, jak to możliwe. Dodatkowo, właściwa i kompletna sonikacja ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego protokołu.

Zgodnie z tym protokołem użytkownicy będą mieli zdolność do ekspresji białek w formacie o wysokiej przepustowości, który może być wykorzystany do oczyszczania i badania przesiewowego pod kątem aktywności wielu różnych białek. Technika ta demonstruje wykorzystanie nowych organizmów o unikalnych właściwościach do ekspresji bezkomórkowej. Vibrio natriegens to halofilna, szybko rosnąca bakteria, która może oferować unikalne warunki do ekspresji białek lub małych cząsteczek, wcześniej niezbadanych w organizmach modelowych.