Name: Sztuczne kompleksy elongacyjne polimerazy II RNA do analizy zdarzeń przetwarzania kotranskrypcyjnego RNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Poznaj metodę składania sztucznych kompleksów elongacyjnych polimerazy II RNA przy użyciu syntetycznych oligonukleotydów DNA i RNA. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów kotranskrypcyjnego przetwarzania RNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy S. Shumanowi za dostarczenie ssaczego enzymu cDNA. Prace te były częściowo wspierane przez grant dla Stowers Institute for Medical Research z Helen Nelson Medical Research Fund w Greater Kansas City Community Foundation. Oryginalne dane leżące u podstaw tego manuskryptu można uzyskać w Stowers Original Data Repository pod adresem http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.

1. Montaż kompleksów sztucznego wydłużenia i chodzenie Pol II
<ol>
	<li>Unieruchomić 1 nmol nieszablonowego oligo DNA zawierającego cząsteczkę biotyny 3' na kulkach magnetycznych. 
	UWAGA: Poniższe kroki można wykonać z wyprzedzeniem, aby przygotować się do przyszłych eksperymentów. Wszystkie sekwencje oligonukleotydów użyte w niniejszym protokole przedstawiono w tabeli 1. Oligonukleotydy RNA są syntetyzowane z modyfikacjami 5'-trifosforanu.
	<ol>
		<li>Dodaj 200 μl kulek magnetycznych (10 mg/ml) do probówki o pojemności 1,5 ml wiążącej białka, a następnie umieść na stojaku magnetycznym na 2 minuty.</li>
		<li>Gdy rurka znajduje się na stojaku magnetycznym, usuń płyn z tuby, nie naruszając kulek. Aby umyć kulki, wyjmij probówkę ze stojaka, dodaj 1 ml 5 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, włóż probówkę z powrotem do stojaka i usuń roztwór myjący po 2 minutach.</li>
		<li>Powtórz mycie jeszcze 2 razy, używając 200 μl tego samego buforu.</li>
		<li>Zawieś kulki magnetyczne w 400 μl 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, bufor. Następnie zmieszać z 380 μlH2Oi 20 μL 10 μM nieszablonowego biotynylowanego oligonylowirusa DNA. Umieść probówkę na nutatorze i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przemyć unieruchomiony nieszablonowy oligo DNA 3 razy 200 μl 5 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, a następnie 3 razy 200 μL 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glicerolu, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej.</li>
		<li>Pozostaw probówkę na noc w temperaturze 4 °C, aby zakończyć blokowanie kulek za pomocą BSA.</li>
		<li>Następnego dnia umieść probówkę w stojaku magnetycznym, wyjmij i wyrzuć płyn, a następnie ponownie zawieś kulki w 200 μl 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glicerolu, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej i przenieś do nowej probówki. Dla tej matrycy DNA końcowe stężenie wynosi około 5 μM. 
		nuta: Czas inkubacji i stężenie oligonukleotydów muszą być określone empirycznie dla każdego oligonukleotydowanego DNA. Matryca ta powinna wystarczyć na 200 reakcji i wystarczyć na co najmniej 6 miesięcy, jeśli jest przechowywana w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyżarzane oligonukleotydy oligonukleotydów nici matrycowej DNA w stosunku molowym 2:1 (odpowiednio 20 i 10 pmol) w celu uzyskania dupleksu DNA:RNA.
	<ol>
		<li>Ustawić 10 μl mieszanki do wyżarzania zgodnie z opisem w tabeli 2. 
		UWAGA: 10 μL mieszanki do wyżarzania wystarcza na 10 reakcji. Mieszankę do wyżarzania można w razie potrzeby zwiększyć, jeśli ma być wykonanych więcej testów.</li>
		<li>Przeprowadzić reakcje wyżarzania w termocyklerze za pomocą następującego programu: 5 min w temperaturze 45 °C, a następnie 12 cykli po 2 min każdy, zaczynając od 43 °C i zmniejszając temperaturę o 2 °C na cykl. Na biegu jałowym w temperaturze 4 °C. 
		nuta: Jest to elastyczny punkt czasowy. Wyżarzanie kończy się w ciągu ~30 minut, ale można je pozostawić w temperaturze 4 °C na dłuższy czas. W laboratorium mieszaniny do wyżarzania pozostawiono na okres do 4 godzin, nie obserwując spadku wydajności reakcji.</li>
		<li>Podczas wyżarzania RNA do matrycowej nici DNA, przygotuj do późniejszych etapów protokołu. Składniki potrzebne do przygotowania każdego buforu do pojedynczej reakcji z każdym buforem są wymienione w tabelach 2–8. Skaluj receptury w górę o współczynnik [Y(X+1) + 1] dla mycia i (X+1) dla wszystkich innych. X = liczba reakcji, które należy przygotować; Y = liczba wymaganych etapów prania (minimum 3). 
		UWAGA: Przygotuj wszystkie świeże w dniu eksperymentu. Nie umieszczaj probówek na lodzie po dodaniu PVA do. Dodaj Pol II lub nukleotydy do tuż przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załaduj oczyszczoną polimerazę RNA II do hybrydy DNA:RNA.
	<ol>
		<li>Zmieszać 1 pmol (1 μL) dupleksu DNA:RNA z 13 μl buforu Pol II (z tabeli 3).</li>
		<li>Dodać ~0,02 jednostki oczyszczonego RNA Pol II (1 μL) do mieszaniny z kroku 1.3.1 i mieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół oraz mieszając końcówką pipety, bez wprowadzania pęcherzyków. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 30 °C. 
		nuta: Odtąd podawane objętości dotyczą pojedynczej reakcji; Skaluj w górę zgodnie z potrzebami dla liczby reakcji w eksperymencie. W tym przykładzie użyto RNA Pol II oczyszczonego z wątroby szczura zgodnie z opisem10; jednak można również użyć RNA Pol II oczyszczonego z innych źródeł, w tym hodowanych komórek ssaków lub drożdży3,4,5,11,12,13.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzupełnij kompleks elongacyjny przez dodanie biotynylowanego DNA bez matrycy.
	<ol>
		<li>Dodać 5 pmol (1 μl) unieruchomionego oligo DNA bez matrycy do 14 μl buforu DNA bez matrycy (z tabeli 4), dodać do probówki z kroku 1.3.2 i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Umieścić próbkę w stojaku magnetycznym na 2 minuty. Przemyć 1x 30 μl buforu do przemywania (z tabeli 7) w celu usunięcia nieinkaskorowanego Pol II i oligonukleotydów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generowanie kompleksów elongacyjnych zawierających znakowane radioaktywnie RNA 23mery.
	<ol>
		<li>Wykonać wszystkie dalsze inkubacje w temperaturze 30 °C. Dodać 1 μL 15 μM ATP i 10 μCi (1 μL) [α-32P] UTP (3 000 Ci/mmol) do 23 μL buforu impulsowego i użyć go do ponownego zawieszenia umytych kulek magnetycznych. 
		ostrożność: Materiały radioaktywne są niebezpieczne. Upewnij się, że nosisz odpowiedni sprzęt ochronny i przestrzegasz wszystkich wytycznych laboratoryjnych dotyczących bezpiecznego użytkowania i usuwania materiałów radioaktywnych. 
		nuta: Zastąp znakowany radioaktywnie UTP 15 μM UTP, gdy znakowane radioaktywnie RNA nie jest potrzebne, na przykład w eksperymentach z western blot.</li>
		<li>Inkubować reakcję przez 10 minut, aby umożliwić syntezę znakowanych radioizotopowo 23merów.</li>
		<li>Dodać 1,5 μl roztworu zawierającego 100 μM ATP i 100 μM mieszanki UTP do 3,5 μl buforu pościgowego, dodać do probówki zawierającej wstępnie złożone kompleksy elongacyjne i inkubować przez 5 minut, aby przegonić wszystkie powstające transkrypty do 23merów.</li>
		<li>Umieścić próbkę w stojaku magnetycznym na 2 minuty, usunąć supernatant, przemyć raz 30 μl buforu do przemywania w celu usunięcia niewbudowanych nukleotydów i ponownie zawiesić w 30 μl buforu do przemywania .</li>
		<li>Dodać 94 μl mieszanki stop z proteinazą K i glikogenem (Tabela 9) w celu zakończenia reakcji lub przejść do sekcji 1.6 w celu wytworzenia kompleksów elongacyjnych z dłuższymi transkryptami lub sekcji 2 w celu przeprowadzenia testów cappingu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>(Opcjonalnie) Spacer Pol II, aby utworzyć 23, 25 i 29 transkryptów nukleotydowych
	<ol>
		<li>Postępuj zgodnie z procedurą opisaną w krokach od 1.2.1 do 1.5.4, aby przygotować kompleksy elongacyjne zawierające znakowane radioizotopowo 23mery. Zwiększ 4-krotnie, aby wygenerować 120 μl przemytych kompleksów wydłużających, co wystarcza na 4 reakcje.</li>
		<li>Oznacz 3 nowe tuby "23mer", "25mer" i "29mer". Przenieść 30 μl przemytych kompleksów wydłużających do probówki "23mer" i dodać 94 μl mieszanki zatrzymanej z proteinazą K i glikogenem.</li>
		<li>Umieścić probówkę zawierającą pozostałe 90 μl przemytych kompleksów wydłużających w stojaku magnetycznym na 2 minuty, usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w 90 μl BTB uzupełnionych po 1,2 μl 1,5 mM ATP i 1,5 mM CTP. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 30 °C.</li>
		<li>Po jednokrotnym przemyciu 90 μl buforu do przemywania i ponownym wymieszaniu w 90 μl buforu do przemywania zgodnie z opisem w kroku 1.5.4, przenieść 30 μl kompleksów wydłużających do probówki "25mer" i dodać 94 μl mieszanki zatrzymanej z proteinazą K i glikogenem.</li>
		<li>Umieść probówkę zawierającą pozostałe 60 μl kompleksów wydłużających w stojaku magnetycznym na 2 minuty, usuń supernatant i ponownie zawieś kulki w 60 μl BTB uzupełnionym po 0,8 μl 1,5 mM ATP i 1,5 mM CTP.</li>
		<li>Inkubować przez 10 minut w temperaturze 30 °C, przemyć raz 60 μl buforu do przemywania zgodnie z ppkt 1.5.5 i ponownie zawiesić w 60 μl buforu do przemywania wodą.</li>
		<li>Przenieść 30 μl z 2x próbki do probówki "29mer" i dodać 94 μl mieszanki stop z proteinazą K i glikogenem lub przejść do sekcji 2 w celu przeprowadzenia testów zamykania.</li>
		<li>Przejdź do oczyszczania i analizy RNA (sekcja 3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wykorzystanie sztucznych kompleksów elongacyjnych do oznaczania kotranskrypcyjnego cappingu
<ol>
	<li>Wygeneruj przemyte kompleksy elongacyjne zawierające 23mers, zwiększając procedurę opisaną w krokach od 1.2.1 do 1.5.5 13-krotnie. To wystarczy na 12 reakcji + 1 dodatkowy.</li>
	<li>Fosforylacja CTD Pol II
	<ol>
		<li>Umieść probówkę zawierającą przemyte kompleksy wydłużające w stojaku magnetycznym na 2 minuty, usuń supernatant i ponownie zawieś kulki w 377 μl BTB uzupełnionym 13 μl 1,5 mM ATP.</li>
		<li>Przygotuj dwie nowe probówki, oznaczone odpowiednio +H i -H. Do probówki oznaczonej +H dodać 3 μL ~300 ng/μL TFIIH, a do probówki oznaczonej -H dodać 9 μL 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glicerolu, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej. 
		nuta: Zazwyczaj używamy TFIIH oczyszczonego z wątroby szczura, ale uzyskaliśmy podobne wyniki przy użyciu ~0,6 μg/reakcję komercyjnie dostępnego rekombinowanego Cdk7/Cykliny H/MAT1 (CAK, który jest modułem kinazy z TFIIH). Więcej informacji można znaleźć w Tabeli materiałów.</li>
		<li>Dodać 87 μl przemytych kompleksów wydłużających z kroku 2.2.1 do probówki oznaczonej +H i 270 μl przemytych kompleksów wydłużających do probówki oznaczonej -H. Inkubować 10 minut w temperaturze 30 °C.</li>
		<li>Umieść próbkę w stojaku magnetycznym na 2 minuty. Aby usunąć nadmiar nukleotydów i niezwiązanego białka, należy przemyć kompleksy elongacyjne w reakcjach +H i -H odpowiednio 90 μl lub 270 μl buforu do przemywania wodą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamykanie RNA
	<ol>
		<li>Zawiesić kompleksy wydłużające w probówce oznaczonej +H w 87 μl mieszanki zamykającej (BTB uzupełnionej 50 μM GTP (Tabela 10). Zawiesić kompleksy wydłużające w probówce oznaczonej -H w 261 μl mieszanki zamykającej.</li>
		<li>Przygotuj 4 nowe probówki oznaczone 5 ng CE+H, 5 ng CE, 15 ng CE, 45 ng CE. Rozcieńczyć enzym zamykający (CE) w 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glicerolu, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej w celu przygotowania roztworów zawierających 5 ng CE/μL, 15 ng CE/μL lub 45 ng CE/μL i dozować 3 μL odpowiedniego roztworu do każdej z 4 probówek.</li>
		<li>Przygotować 12 nowych probówek z 94 μl buforu zatrzymującego (2.1.1) dodanymi do każdej.</li>
		<li>Każdą reakcję zamykania należy rozpocząć od dodania 87 μl kompleksu wydłużającego potraktowanego TFIIH lub nie, do znakowanych probówek zawierających enzym zamykający. Inkubować w temperaturze 30 °C w bloku grzewczym.</li>
		<li>Po 1, 2 lub 4 minutach zatrzymaj reakcje, przenosząc 30 μl każdej mieszaniny reakcyjnej do probówek zawierających 94 μl buforu zatrzymującego. Oczyszczać i analizować produkty reakcji zgodnie z opisem w punkcie 3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Oczyszczanie i analiza RNA
<ol>
	<li>Oczyszczanie RNA
	<ol>
		<li>Produkty reakcji inkubować w buforze zatrzymującym przez 20 minut w temperaturze pokojowej. 
		nuta: Punkt zatrzymania. Próbki w tym buforze były utrzymywane przez okres do 4 godzin bez utraty lub degradacji RNA.</li>
		<li>Ekstrahować raz 124 μl fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego (25:24:1) i raz chloroformem:alkoholem izoamylowym (24:1). 
		ostrożność: Fenol jest niezwykle toksyczny i szybko wchłaniany przez skórę. Nosić odpowiedni sprzęt ochronny. 
		nuta: Aby zmaksymalizować odzysk RNA podczas ekstrakcji, należy używać dostępnych na rynku probówek zawierających żel o dużej gęstości, który tworzy stabilną barierę między fazą wodną a organiczną. Zobacz dyskusję i tabelę materiałów.</li>
		<li>Przenieść fazę wodną (górna warstwa) do nowych probówek zawierających 12,4 μl 3 M octanu sodu o pH 5,2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytrącanie etanolu
	<ol>
		<li>Dodać 350 μl 100% etanolu i dokładnie wymieszać przez odwrócenie.</li>
		<li>Inkubować przez co najmniej 10 minut na suchym lodzie. 
		nuta: Punkt zatrzymania. Dla wygody można się tu zatrzymać i dokończyć procedurę następnego dnia; Możliwe jest jednak przejście bezpośrednio do kroku 3.3 i uruchomienie żelu tego samego dnia. RNA można przechowywać w temperaturze -80 °C przez kilka dni przed dalszym przetwarzaniem, ale nie należy pozostawiać go na dłużej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbek RNA do elektroforezy żelowej
	<ol>
		<li>Pozostawić próbki do rozmrożenia, wymieszać przez odwrócenie 2-3 razy i odwirować przez 15 minut w temperaturze 21 000 x g, 4 °C, w wirówce stołowej. W międzyczasie należy przygotować denaturującą mieszankę żelową (sekcja 3.4.1).</li>
		<li>Ostrożnie usuń etanol z próbek, nie naruszając osadu.</li>
		<li>Dodać 500 μl 70% etanolu, kilkakrotnie odwrócić probówkę w celu umycia granulatu, a następnie ponownie odwirować przy 21 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej lub 4 °C.</li>
		<li>Usuń jak najwięcej etanolu i szybko odwiruj (5-10 s) probówki w wirówce stołowej. Następnie za pomocą końcówki ładującej żel usuń ostatnią pozostałą objętość etanolu.</li>
		<li>Suszyć na powietrzu przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Rozpuść RNA, dodając 4 μlH2Odo górnej części każdej osadki. Inkubować 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodaj 4 μl 2x barwnika RNA (patrz tabela materiałów) do mieszanki, a następnie wiruj każdą probówkę przez kilka sekund, aby całkowicie zawiesić RNA. 
		nuta: Zalecany jest barwnik RNA zawierający formamid zamiast mocznika, ponieważ ten ostatni wytrąca się w niskich temperaturach.</li>
		<li>Szybko odwirować probówki, a następnie inkubować je w temperaturze 70 °C przez 10 minut w bloku grzewczym.</li>
		<li>Przechowuj probówki na suchym lodzie, aż będą gotowe do załadowania na gel. 
		UWAGA: Utrzymywanie RNA na suchym lodzie pozwala na elastyczność pracy nad innymi eksperymentami, podczas gdy żel polimeryzuje. Próbki po rozmrożeniu nie muszą być ponownie podgrzewane. Jednak RNA może być bezpośrednio załadowane po podgrzaniu, jeśli żel jest gotowy do pracy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie żelu Urea-PAGE
	<ol>
		<li>Aby uzyskać 40 ml mieszanki żelowej, połącz w stożkowej probówce o pojemności 50 ml: 16,7 g mocznika, 15 ml 40% roztworu bis:akrylamidu (stosunek 19:1), 4 ml 10x TBE (1 M Tris-HCl, 1 M boran sodu, 20 mM EDTA) i 8 ml H2O. Objętość ta wystarcza na jeden żel o standardowym rozmiarze (18 cm wysokości x 16 cm szerokości) z przekładkami 1,0 mm. 
		ostrożność: Akrylamid jest niezwykle toksyczny. Chociaż nie ma ryzyka wdychania, gdy znajduje się w roztworze, zawsze noś fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary ochronne podczas obsługi. 
		nuta: Ta mieszanina służy do odlewania denaturującego 15% żelu poliakrylamidowego, który łatwo rozpuszcza RNA w zakresie 15-50 nt. W razie potrzeby zmień stężenie bis/akrylamidu, aby rozdzielić różne transkrypty RNA o różnej długości.</li>
		<li>Umieścić zamkniętą probówkę zawierającą mieszaninę żelu na nutatorze, aż mocznik całkowicie się rozpuści.</li>
		<li>Ustaw stację odlewania żelu ze szklanymi płytkami, przekładkami 1 mm i 15-dołkowym grzebieniem.</li>
		<li>Pracując szybko, dodaj 40 μl TEMED i 400 μl 10% roztworu nadsiarczanu amonu do roztworu żelu i dobrze wymieszaj. Za pomocą pipety o pojemności 25 ml wlej roztwór żelu między płytki, włóż grzebień i pozwól żelowi polimeryzować przez co najmniej 2 godziny 
		nuta: Jeśli żel zostanie wylany więcej niż 2 godziny przed użyciem, po spolimeryzowaniu przykryj go wilgotnym ręcznikiem papierowym (pozostawiając grzebień na miejscu) i owiń folią, aby zapobiec wysychaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elektroforeza RNA w żelu denaturującym
	<ol>
		<li>Po polimeryzacji przenieś żel do działającego zbiornika i uruchom go wstępnie pod ciśnieniem 20 mA w 1x TBE przez 15-30 min.</li>
		<li>W międzyczasie rozmrozić próbki (jeśli zostały zamrożone), wirować i wirować przez 4 minuty w temperaturze 2 000 x g, 4 °C.</li>
		<li>Gdy będziesz gotowy, wyłącz zasilanie i ostrożnie przepłucz każdą studzienkę 1x TBE za pomocą strzykawki.</li>
		<li>Użyj końcówek do ładowania żelu, aby załadować próbki do żelu.</li>
		<li>Uruchom żel ze stałą wartością 20-30 mA przez około 2 godziny lub do momentu, gdy dolny barwnik (ksylen-cyjanol FF) dotrze do dna żelu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń żel, umieść go na kawałku chłonnego papieru i owiń folią.</li>
	<li>Żel znakowany radioizotopem należy poddać badaniu przesiewowemu luminoforowemu.</li>
	<li>Zeskanuj ekran fosforowy za pomocą luminowizora i przeanalizuj obraz.</li>
</ol>

<ol><li>Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+II+transcription%3A+structure+and+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase II transcription: structure and mechanism.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).</li>
<li>Daube, S. S., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+transcription+elongation+complexes+from+synthetic+RNA-DNA+bubble+duplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes.</a> Science. 258, 1320-1324 (1992).</li>
<li>Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. S., Kashlev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+8-nucleotide-long+RNA%3ADNA+hybrid+is+a+primary+stability+determinant+of+the+RNA+polymerase+II+elongation+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (9), 6530-6536 (2000).</li>
<li>Kellinger, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine+reduce+the+rate+and+substrate+specificity+of+RNA+polymerase+II+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 19 (8), 831-833 (2012).</li>
<li>Noe Gonzalez, M., Sato, S., Tomomori-Sato, C., Conaway, J. W., Conaway, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTD-dependent+and+-independent+mechanisms+govern+co-transcriptional+capping+of+Pol+II+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">CTD-dependent and -independent mechanisms govern co-transcriptional capping of Pol II transcripts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3392(2018).</li>
<li>Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap+and+cap-binding+proteins+in+the+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+RNA%22%5BJournal%5D)">Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 2 (2), 277-298 (2011).</li>
<li>Ramanathan, A., Robb, G. B., Chan, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+capping%3A+biological+functions+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">mRNA capping: biological functions and applications.</a> Nucleic Acids Research. 44 (16), 7511-7526 (2016).</li>
<li>Ghosh, A., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymology+of+RNA+cap+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+RNA%22%5BJournal%5D)">Enzymology of RNA cap synthesis.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 1 (1), 152-172 (2010).</li>
<li>Moteki, S., Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+coupling+of+capping+and+transcription+of+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional coupling of capping and transcription of mRNA.</a> Molecular Cell. 10, 599-609 (2002).</li>
<li>Conaway, J. W., Conaway, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA+polymerase+II+transcription+factor+shares+functional+properties+with+Escherichia+coli+sigma+70%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An RNA polymerase II transcription factor shares functional properties with Escherichia coli sigma 70.</a> Science. 248, 1550-1553 (1990).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+transcription%3A+backtracked+RNA+polymerase+II+at+3.4+angstrom+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution.</a> Science. 324 (5931), 1203-1206 (2009).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+5-carboxycytosine+recognition+by+RNA+polymerase+II+elongation+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex.</a> Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).</li>
<li>Martinez-Rucobo, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Basis+of+Transcription-Coupled+Pre-mRNA+Capping%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping.</a> Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).</li>
<li>Mandal, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interactions+of+RNA-capping+enzyme+with+factors+that+positively+and+negatively+regulate+promoter+escape+by+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).</li>
<li>Chiu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tat+stimulates+cotranscriptional+capping+of+HIV+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA.</a> Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).</li>
<li>Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+paused+transcription+complex+Pol+II-DSIF-NELF%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF.</a> Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).</li>
<li>Vos, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+activated+transcription+complex+Pol+II-DSIF-PAF-SPT6%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6.</a> Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).</li>
<li>Kujirai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+the+nucleosome+transition+during+RNA+polymerase+II+passage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage.</a> Science. 362 (6414), 595-598 (2018).</li>
<li>Szychowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavable+biotin+probes+for+labeling+of+biomolecules+via+azide-alkyne+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Badania, które mają na celu przeanalizowanie zdarzeń związanych z kompleksem elongacyjnym Pol II, takich jak przetwarzanie RNA i regulacja samego wydłużania transkryptu, mogą być znacznie ułatwione dzięki zastosowaniu wysoce oczyszczonego systemu enzymatycznego. Konfiguracja takich systemów enzymatycznych może być wyzwaniem. Transkrypcja zależna od promotora przez Pol II wymaga co najmniej pięciu ogólnych czynników transkrypcyjnych. Przygotowanie i gromadzenie tych czynników może zająć miesiące; W związku z tym krokiem o...

Synteza eukariotycznego informacyjnego RNA (mRNA) to skomplikowany proces biochemiczny, który obejmuje syntezę nieprzetworzonego prekursorowego RNA przez polimerazę RNA II i przetwarzanie prekursorowego RNA w celu uzyskania dojrzałego mRNA. Etapy przetwarzania RNA polegające na cappingu, splicingu i poliadenylacji odbywają się w dużej mierze kotranskrypcyjnie. Kompleks elongacyjny Pol II służy jako rusztowanie, które rekrutuje i koordynuje działania wielu enzymów przetwarzających RNA. W związku z tym nasze ostateczne zrozumienie, w jaki sposób generowane są dojrzałe eukariotyczne mRNA, będzie w dużej mierze zależało od opracowania systemów eksperymentalnych, które umożliwią analizę mechanizmów biochemicznych leżących u podstaw rekrutacji do kompleksu elongacyjnego i regulacji enzymów odpowiedzialnych za kotranskrypcyjne capping, splicing i poliadenylację.
Nic dziwnego, że rozwój takich eksperymentalnych systemów był trudny. Główną przeszkodą była niezwykła złożoność samej transkrypcji Pol II, gdzie proste odtworzenie podstawowej transkrypcji przez Pol II in vitro wymaga minimalnego zestawu pięciu ogólnych czynników inicjujących transkrypcję: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF i TFIIH1. Co więcej, odtworzenie jakiegokolwiek rodzaju regulowanej transkrypcji Pol II in vitro wymaga jeszcze większego zestawu czynników transkrypcyjnych i koregulatorów. W związku z tym głównym celem było opracowanie prostszych systemów eksperymentalnych pozwalających na odtworzenie aktywnych kompleksów elongacyjnych Pol II odpowiednich do badań nad funkcjonalnym sprzężeniem transkrypcji Pol II i przetwarzania RNA.
Jedna z takich prostszych metod odtwarzania aktywnych kompleksów elongacyjnych Pol II okazała się przydatna do badań strukturalnych i biochemicznych wydłużania Pol II, a ostatnio do badania kotranskrypcyjnego przetwarzania RNA2,3,4,5. W tym artykule pokazujemy, w jaki sposób kompleksy elongacyjne Pol II przygotowane z oczyszczonych pęcherzyków Pol II i syntetycznych pęcherzyków transkrypcyjnych mogą być skutecznie wykorzystane do badania mechanizmów leżących u podstaw kotranskrypcyjnego cappingu powstających transkryptów Pol II.
Capping odnosi się do kowalencyjnego dodania "czapki" 5'-guanozyny do końca 5'-trifosforanu powstających transkryptów Pol II. Czapka jest ważna dla kolejnych etapów dojrzewania, transportu, translacji i innych procesów mRNA6,7. Kap jest dodawany kotranskrypcyjnie do transkryptów Pol II przez enzym określany jako enzym cappingowy. W komórkach ssaków miejsca aktywne odpowiedzialne za aktywność 5'-trifosfatazy RNA i transferazy guanylylowej enzymu zamykającego są zawarte w pojedynczym polipeptydzie8. Enzym zamykający jest rekrutowany do kompleksu elongacyjnego Pol II poprzez interakcje z jeszcze niezdefiniowanymi powierzchniami na ciele Pol II i domeną karboksylowo-końcową Rpb1 (CTD) fosforylowaną na Ser5 jego powtórzeń heptapeptydu5. W kompleksie elongacyjnym enzym zamykający katalizuje dodanie czapu 5'-guanozyny, gdy powstający transkrypt osiągnie długość co najmniej 18 nukleotydów i wyłoni się z kanału wyjściowego RNA polimerazy. W pierwszym etapie reakcji cappingu trifosfataza hydrolizuje 5'-trifosforan RNA, aby uzyskać 5'-difosforan. W drugim etapie GTP jest hydrolizowany do GMP przez transferazę guanylylu, tworząc półprodukt enzymu ograniczającego GMP. Wreszcie, transferaza guanylilowa przenosi GMP do końca 5'-difosforanu powstającego transkryptu w celu wytworzenia czapeczki.
Niezwykłą cechą reakcji cappingu jest to, że capping kotranskrypcyjny (tj. capping transkryptów związanych z funkcjonalnymi kompleksami elongacyjnymi Pol II) jest znacznie bardziej efektywny niż capping wolnego RNA5,9. W związku z tym głównym pytaniem w tej dziedzinie było to, w jaki sposób ta dramatyczna aktywacja cappingu jest osiągana poprzez interakcje enzymu cappingu z kompleksem elongacyjnym Pol II. W tym protokole opisujemy składanie aktywnych kompleksów elongacyjnych polimerazy II RNA przy użyciu wyłącznie oczyszczonej polimerazy RNA II i sztucznych pęcherzyków transkrypcyjnych. Metody te pozwalają na tworzenie kompleksów elongacyjnych polimerazy II RNA z transkryptami o określonej długości i sekwencji. W niedawnym badaniu użyliśmy tych zdefiniowanych kompleksów elongacyjnych polimerazy II RNA jako modelu do badania aspektów mechanizmów cappingu RNA5. W szczególności wykazaliśmy, że (i) capping RNA związany z tymi kompleksami elongacyjnymi był ponad 100-krotnie bardziej efektywny niż capping wolnego RNA i (ii) był stymulowany przez zależną od TFIIH fosforylację Pol II CTD. Opisane tutaj podejście można w zasadzie zaadaptować do generowania substratów do badania innych reakcji przetwarzania kotranskrypcyjnego RNA związanych z kompleksem elongacyjnym Pol II.
W sekcji 1 tego protokołu, sztuczne kompleksy elongacyjne są tworzone przez wyżarzanie syntetycznego oligonukleotydu matrycowego nici DNA do oligonukleotydu RNA, który jest komplementarny na końcu 3' do około 9 nukleotydów matrycowej nici DNA. Pol II jest następnie ładowany do dupleksu DNA:RNA. Kompleks elongacyjny jest następnie uzupełniany przez dodanie częściowo komplementarnego, nieszablonowego oligonukleotydu DNA, który jest znakowany biotyną na końcu 3' (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1 i <silna klasa = "xfig" >Figura 2A). Oligonukleotyd RNA jest wydłużany przez Pol II w tych kompleksach elongacyjnych w celu wytworzenia znakowanych radioaktywnie transkryptów o określonej długości i sekwencji po dodaniu odpowiednich kombinacji znakowanych radioaktywnie nukleotydów. Ponadto, stosując kombinację płukanek w celu usunięcia nieinkorporowanych nukleotydów i dalszego dodawania różnych kombinacji nukleotydów, można "przeprowadzić" Pol II do różnych pozycji wzdłuż matrycy DNA i zsyntetyzować RNA o określonych długościach. RNA jest następnie oczyszczane i poddawane elektroforezie w denaturujących żelach mocznikowych-PAGE. W sekcji 2 protokołu sztuczne kompleksy elongacyjne są używane do analizy kotranskrypcyjnego cappingu RNA. Przedstawiony przykład mierzy wpływ zależnej od TFIIH fosforylacji CTD Pol II na cappingowanie kotranskrypcyjnego RNA. W tym eksperymencie mierzymy zakres cappingu kotranskrypcyjnego w funkcji stężenia enzymu cappingu (5, 15 i 45 ng na reakcję) i czasu (1, 2 i 4 min).

<table><tbody><tr><td>[&alpha;-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG007H001MC</td><td>Do znakowania radioaktywnego RNA</td></tr><tr><td>2x barwnik ładujący RNA</td><td>New England Biolabs</td><td>B0363S</td><td>Wysoce zalecane. Do przygotowania RNA podczas ładowania żelem</td></tr><tr><td>40% Bis: Roztwór akrylamidu</td><td>Biorad</td><td>1610144</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (20 mg / ml)</td> <td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>Cdk7 / Cyklina H / MAT1 (kompleks CAK) Białko, aktywne, 10 i mikro; g</td><td>Millipore Sigma</td><td>14-476</td><td>Służy do fosforylacji</td></tr><tr><td>oligonukleotydów Pol</td> II CTD DNA <td>IDT</td><td></td><td>Patrz tabela 8, aby zapoznać się ze specyfikacjami czystości</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Life Technologies Invitrogen</td><td>65001</td><td>Bez problemu użyliśmy również streptawidyny Dynabeads M-280, ale preferujemy kulki MyOne Streptavidin, ponieważ wolniej się osadzają</td></tr><tr><td>GlycoBlue Coprecipitant (15&thinsp; mg / mL)</td><td>Life Technologies Invitrogen</td><td>AM9516</td><td>Gorąco polecam. Barwniki w postaci granulek kwasów nukleinowych na niebiesko, dzięki czemu reakcje są znacznie łatwiejsze w obsłudze</td></tr><tr><td>Standardowy pionowy system elektroforezy Hoefer SE600 z podwójnym chłodzeniem z przekładkami 1 mm i 15-dołkowym grzebieniem</td> Probówki o wysokiej gęstości <td>Hoefer</td><td>SE600-15-1,5</td><td></td></tr><tr><td>MaXtract (1,5 ml)</td><td>Qiagen</td><td>129046</td><td>Wysoce zalecane. Zawiera żel o dużej gęstości, który tworzy stabilną barierę między fazą wodną a organiczną; poprawia wydajność RNA podczas ekstrakcji</td></tr><tr><td>Roztwór proteinazy K (20&thinsp; mg / ml)</td><td>Life Technologies Invitrogen</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotydy RNA</td><td>Trilink</td><td></td><td>Więcej informacji można znaleźć w tabeli 8</td></tr><tr><td>Drożdżowa pirofosfataza nieorganiczna (100 jednostek/ml)</td><td>New England Biolabs</td><td>NEBM2403S</td><td>Wymagane tylko podczas reakcji cappingu</td></tr></tbody></table>

sztuczne kompleksy elongacyjne polimerazy ii rna do analizy zdarzeń przetwarzania kotranskrypcyjnego rna

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Eukariotyczne syntezy mRNA to złożony proces biochemiczny wymagający transkrypcji matrycy DNA na prekursorowy RNA przez wielopodjednostkowy enzym polimerazę II oraz kotranskrypcyjne capping i splicing prekursorowego RNA w celu utworzenia dojrzałego mRNA. Podczas syntezy mRNA kompleks elongacyjny polimerazy II RNA jest celem regulacji przez duży zbiór czynników transkrypcyjnych, które kontrolują jego aktywność katalityczną, a także enzymy cappingu, splicingu i przetwarzania 3', które tworzą dojrzałe mRNA. Ze względu na nieodłączną złożoność syntezy mRNA, prostsze systemy eksperymentalne umożliwiające izolację i badanie różnych etapów kotranskrypcji mają dużą użyteczność.
W tym artykule opisujemy jeden z takich prostych eksperymentalnych systemów odpowiednich do badania kotranskrypcyjnego cappingu RNA. System ten opiera się na zdefiniowanych kompleksach elongacyjnych polimerazy II RNA złożonych z oczyszczonej polimerazy i sztucznych pęcherzyków transkrypcyjnych. Po unieruchomieniu za pomocą biotynylowanego DNA, te kompleksy wydłużające polimerazę II RNA stanowią łatwe w manipulacji narzędzie do analizowania kotranskrypcyjnego cappingu RNA i mechanizmów, za pomocą których kompleks elongacyjny rekrutuje i reguluje enzym cappingujący podczas kotranskrypcyjnego cappingu RNA. Przewidujemy, że system ten może zostać zaadaptowany do badania rekrutacji i/lub składania białek lub kompleksów białkowych odgrywających rolę w innych etapach dojrzewania mRNA sprzężonego z kompleksem wydłużającym polimerazę II RNA.

Rysunki 2 i 3 przedstawiają reprezentatywne wyniki reakcji wykorzystanych do generowania sztucznych kompleksów elongacyjnych zawierających transkrypty o różnych długościach poprzez przedłużanie polimerazy Pol II pochodzącej z różnych źródeł. Rysunek 4 obrazuje, w jaki sposób kompleksy elongacyjne te mogą być wykorzystane do analizy współtranskrypcyjnego nakładania czapeczek RNA zależnego od fosforylacji CTD.
<p class="jov...

Tutaj opisujemy składanie kompleksów elongacyjnych polimerazy II (Pol II) wymagających jedynie krótkich syntetycznych oligonukleotydów DNA i RNA oraz oczyszczonego Pol II. Kompleksy te są przydatne do badania mechanizmów leżących u podstaw kotranskrypcyjnego przetwarzania transkryptów związanych z kompleksem elongacyjnym Pol II.

Sztuczne kompleksy elongacyjne polimerazy II RNA do analizy zdarzeń przetwarzania kotranskrypcyjnego RNA

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

W tym miejscu opracowaliśmy prosty system eksperymentalny, który umożliwia odtworzenie aktywnych kompleksów elongacyjnych Pol II odpowiednich do badania funkcjonalnego sprzężenia transkrypcji Pol II i czapeczki RNA. Dzięki tej metodzie funkcjonalne kompleksy wydłużeniowe można łatwo zmontować za pomocą zaledwie kilku elementów. Kompleksy elongacyjne są unieruchomione na kulkach magnetycznych, dzięki czemu łatwo jest zmienić warunki reakcji.Aby unieruchomić oligonuligację DNA zawierającą biotynę na kulkach magnetycznych, najpierw dodaj 200 mikrolitrów kulek magnetycznych do niskobiałkowej probówki wiążącej 1,5 mililitra, a następnie umieść probówkę na stojaku magnetycznym na dwie minuty. Gdy probówka znajduje się na stojaku magnetycznym, użyj pipety, aby usunąć płyn z probówki bez naruszania kulek. Aby umyć kulki, wyjmij rurkę ze stojaka i dodaj jeden mililitr buforu płuczącego zawierającego chlorowodorek tris, EDTA i chlorek sodu.Umieść rurkę z powrotem w stojaku. Po dwóch minutach usuń roztwór myjący i powtórz mycie jeszcze dwa razy, używając 200 mikrolitrów tego samego buforu. Ponownie zawieś kulki magnetyczne w 400 mikrolitrach bufora 2X.Następnie dodaj 380 mikrolitrów wody i 20 mikrolitrów 10-mikromolowego nieszablonowego oligo biotynylowanego DNA do wymieszania. Umieść probówkę na nutatorze i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj kulki unieruchomionym nieszablonowym oligonem DNA trzy razy przy użyciu 200 mikrolitrów buforu, a następnie trzy razy 200 mikrolitrami buforu do przechowywania i rozcieńczania.Przechowuj probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, aby zakończyć blokowanie koralików za pomocą BSA. Następnego dnia wyrzuć roztwór, ponownie zawieś kulki w 200 mikrolitrach buforu do przechowywania i rozcieńczania, aby osiągnąć przybliżone stężenie DNA wynoszące pięć mikromolów, a następnie przenieś roztwór z kulkami do nowej probówki. Aby uzyskać duplex DNA-RNA, należy przygotować 10-mikrolitrową mieszankę do wyżarzania w probówce PCR o stosunku molowym RNA-DNA dwa do jednego, zgodnie z opisem w pisemnym protokole.Umieść rurkę w termocyklerze. Ustaw program na 45 stopni Celsjusza na pięć minut, a następnie 12 cykli po dwie minuty każdy, zaczynając od 43 stopni Celsjusza i obniżając temperaturę o dwa stopnie Celsjusza na cykl. Na koniec trzymaj go w stanie bezczynności w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Aby załadować oczyszczoną polimerazę RNA II do hybrydy DNA-RNA, wymieszaj jeden mikrolitr dupleksu DNA-RNA z 13 mikrolitrami świeżo przygotowanego buforu polimerazy II w probówce. Dodać jeden mikrolitr oczyszczonej polimerazy RNA II i mieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół, mieszając końcówką pipety, nie wprowadzając pęcherzyków. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza.Aby uzupełnić kompleks elongacyjny, dodaj jeden mikrolitr unieruchomionych nieszablonowych kulek oligonuligosowych DNA do 14 mikrolitrów buforu DNA bez matrycy, dodaj mieszaninę 15 mikrolitrów do wcześniej inkubowanej probówki i inkubuj ją przez kolejne 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Umieść próbkę na stojaku magnetycznym na dwie minuty. Przemyć próbkę jednorazowo 30 mikrolitrami buforu do przemywania w celu usunięcia nieinkorporowanej polimerazy II i oligonukleotydów.Aby znakować radioizotopowo kompleksy elongacyjne 23merami RNA, dodaj jeden mikrolitr ATP i jeden mikrolitr znakowanego radioaktywnie UTP do 23 mikrolitrów buforu impulsowego i dodaj tę mieszaninę do przemytych kulek magnetycznych w celu ponownego zawieszenia. Inkubować reakcję przez 10 minut, aby umożliwić syntezę znakowanych radioizotopowo 23merów. Dodać 1,5 mikrolitra roztworu zawierającego 100-mikromolową mieszankę ATP i 100-mikromolową mieszankę UTP do 3,5 mikrolitra buforu pościgowego i dodać mieszaninę do probówki zawierającej wstępnie złożone kompleksy wydłużające na kulkach.Ponownie inkubuj probówkę przez pięć minut, aby gonić wszystkie powstające transkrypty do 23merów. Następnie umieść probówkę na stojaku magnetycznym i umyj tak, jak to zrobiono wcześniej, aby usunąć niewbudowane nukleotydy. Zawiesić próbkę w 30 mikrolitrach buforu do przemywania ścieków.Aby wygenerować kompleksy elongacyjne z dłuższymi transkryptami, postępuj zgodnie z poprzednimi procedurami i czterokrotnie zwiększaj, aby wygenerować 120 mikrolitrów przemytych kompleksów elongacyjnych dla czterech reakcji. Oznacz trzy nowe tuby 23mer, 25mer i 29mer. Przenieś 30 mikrolitrów przemytych kompleksów wydłużających do probówki 23mer i dodaj 94 mikrolitry mieszanki stop zawierającej proteinazę K i glikogen.Umieść probówkę zawierającą pozostałe 90 mikrolitrów przemytych kompleksów wydłużających na stojaku magnetycznym na dwie minuty, usuń supernatant i ponownie zawieś kulki w 90 mikrolitrach BTB uzupełnionych 1,2 mikrolitrami ATP i CTP. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Po umyciu 90 mikrolitrami buforu do przemywania przenieś 30 mikrolitrów kompleksów wydłużających do probówki 25mer i dodaj 94 mikrolitry mieszanki zatrzymującej zawierającej proteinazę K i glikogen.Ponownie umieść probówkę zawierającą pozostałe 60 mikrolitrów kompleksów elongacyjnych na stojaku magnetycznym na dwie minuty. Powtórzyć zabieg BTB z 60 mikrolitrami buforu uzupełnionymi 0,8 mikrolitrami ATP i CTP. Po inkubacji i umyciu, jak poprzednio, ponownie zawiesić próbkę w 60 mikrolitrach buforu do przemywania popłuczyny.Przenieś 30 mikrolitrów z próbki do probówki 29 merów i dodaj 94 mikrolitry mieszanki stop zawierającej proteinazę K i glikogen. Analizuj produkty reakcji na denaturującym żelu poliakrylamidowym. Po pierwsze, wygeneruj przemyte kompleksy elongacyjne zawierające 23mery, zwiększając 13-krotnie procedurę opisaną wcześniej, aby uzyskać 390 mikrolitrów na 12 reakcji i jeden dodatkowy.Aby przeprowadzić fosforylację polimerazy II CTD, należy usunąć supernatant po umieszczeniu próbki w stojaku magnetycznym i ponownie zawiesić kulki w 377 mikrolitrach BTB. Oznaczyć dwie nowe probówki plus H i minus H.To plus H, dodać trzy mikrolitry czynnika inicjującego transkrypcję TFIIH o stężeniu 300 nanogramów na mikrolitr, a do minus H dodać dziewięć mikrolitrów buforu do przechowywania i rozcieńczania. Dodać 87 mikrolitrów przemytych kompleksów wydłużających do probówki plus H i 261 mikrolitrów do rurki minus H.Inkubować probówki przez 10 minut i przemyć buforem do mycia. Aby wykonać capping RNA, dodaj 87 mikrolitrów mieszanki zamykającej do probówki plus H i 261 mikrolitrów do probówki minus H w celu ponownego zawieszenia. Oznacz cztery nowe probówki, pięć plus H, pięć minus H, 15 minus H i 45 minus H, a następnie dozuj trzy mikrolitry po pięć, 15 lub 45 nanogramów na mikrolitr enzymu zamykającego do odpowiednich probówek.Następnie przygotuj 12 nowych probówek z 94 mikrolitrami buforu zatrzymującego. Rozpocznij pierwszą reakcję zamykania, dodając 87 mikrolitrów kompleksu wydłużającego potraktowanego TFIIH do probówki oznaczonej pięć plus H. Inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza w bloku grzewczym. Reakcje cappingu muszą być precyzyjnie mierzone za pomocą stopera.Podczas pracy z wieloma reakcjami czasy rozpoczęcia każdej reakcji powinny być rozłożone w czasie. Po jednej, dwóch lub czterech minutach przenieś 30 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej plus pięć do probówek oznaczonych jeden, dwa i trzy zawierających 94 mikrolitry buforu zatrzymującego, aby zatrzymać reakcje. Postępować z reakcjami zamykania próbek w pozostałych probówkach z minus H dokładnie w ten sam sposób, stosując kompleksy wydłużające poddane działaniu TFIIH.Analizuj produkty reakcji na denaturującym żelu poliakrylamidowym. Diagram jest pokazany tutaj dla cząsteczek DNA i RNA w sztucznych kompleksach elongacyjnych. Używając syntetycznego oligo RNA składającego się z 20 nukleotydów jako startera RNA podczas składania sztucznych kompleksów elongacyjnych, nukleotydy dodawano podczas każdego sekwencyjnego kroku chodzenia protokołu, aby wygenerować 23mer, 25mer i 29mer.Porównano reakcje z wykorzystaniem polimerazy RNA II z różnych źródeł. Sztuczne kompleksy elongacyjne zostały połączone z endogenną polimerazą II typu dzikiego oczyszczoną z wątroby szczura lub drożdży rozszczepieniowych i przeszły w celu wytworzenia 23 merów lub 25 merów. Przeprowadzono test w celu zmierzenia zamknięcia znakowanych radioaktywnie transkryptów związanych ze sztucznymi kompleksami elongacyjnymi zawierającymi 23 transkrypty nukleotydowe z pięcioma pierwszymi końcami trifosforanowymi.Ostatnie dwa pasy pokazują produkty reakcji, w których kompleksy elongacyjne inkubowano z enzymem zamykającym lub bez enzymu zamykającego w obecności TFIIH. Wolniej i szybciej migrujące pasma zawierają odpowiednio transkrypty z ograniczeniem i bez niego. Pierwsze 12 pasów pokazuje ograniczenie transkryptów związanych z kompleksami elongacyjnymi z fosforylowanym lub niefosforylowanym CTD.Aktywność polimerazy II i innych enzymów może się różnić w zależności od przygotowania, dlatego konieczna jest optymalizacja warunków reakcji poprzez miareczkowanie stężeń enzymów w celu określenia optymalnych poziomów. Ważne jest, aby bezpiecznie używać materiałów radioaktywnych i unikać skażenia. Upewnij się, że postępujesz zgodnie z wytycznymi swojego laboratorium i instytutu podczas przeprowadzania eksperymentów z radioaktywnością.

artificial-rna-polymerase-ii-elongation-complexes-for-dissecting-co

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Opisujemy metodę oczyszczania białek rekombinowanych z użyciem znaczników powinowactwa przy wykorzystaniu robotyki do obsługi cieczy. Metoda ta znajduje ogólne zastosowanie w małoscale’owym oczyszczaniu rozpuszczalnych białek z znacznikiem His w formacie wysokoprzepustowym.

Wysokoprzepustowe oczyszczanie rekombinowanych białek z markerami powinowactwa

RNA polimeraza II syntetyzuje prekursorowy RNA, który wykracza poza koniec 3' dojrzałego mRNA. Koniec dojrzałego RNA jest generowany kotranskrypcyjnie, w miejscu dyktowanym przez sekwencje RNA, poprzez aktywność endonukleazy kompleksu rozszczepienia. Tutaj szczegółowo opisujemy metodę badania reakcji rozszczepienia in vitro.

Analiza reakcji przetwarzania RNA przy użyciu systemów bezkomórkowych: 3' końcowe rozszczepienie substratów pre-mRNA in vitro

Opisany tutaj protokół opiera się na kwantyfikacji całego genomu nowo zsyntetyzowanych mRNA oczyszczonych z komórek drożdży znakowanych 4-tiouracylem. Metoda ta pozwala na pomiar syntezy mRNA niesprzężonej z rozpadem mRNA, a tym samym zapewnia dokładny pomiar transkrypcji polimerazy II RNA.

Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) Znakowanie metaboliczne za pomocą 4-tiouracylu i kwantyfikacja nowo zsyntetyzowanego mRNA jako wskaźnika aktywności polimerazy II RNA

Opisujemy inżynierię nowatorskiej polimerazy T7 RNA na uwięzi DNA do regulacji reakcji transkrypcji in vitro. Omawiamy etapy syntezy i charakterystyki białek, walidujemy regulację transkrypcji typu proof-of-concept i omawiamy jej zastosowania w obliczeniach molekularnych, diagnostyce i przetwarzaniu informacji molekularnych.

Polimeraza RNA na uwięzi DNA do programowalnej transkrypcji in vitro i obliczeń molekularnych

Oligonukleotydowe 5′-trifosforany są wszechobecnymi składnikami w podstawowych szlakach biologicznych i są coraz częściej wykorzystywane w zastosowaniach biotechnologicznych. W tym miejscu opisano techniki rutynowej syntezy i oczyszczania oligonukleotydowych 5′-trifosforanów, zaczynając od oligonukleotydów przygotowanych standardowymi technikami syntezy automatycznej.

Chemiczna trifosforylacja oligonukleotydów

To badanie opisuje metody koekspresji wielu genów z pojedynczego plazmidu w Escherichia coli za pośrednictwem T7 przy użyciu systemu plazmidowego pMGX.

Indukowalny wielogenowy system ekspresji za pośrednictwem polimerazy RNA T7, pMGX

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę sekwencjonowania Susieciowanych, Ligowanych i Swybranych Hybridów (SPLASH), która umożliwia mapowanie całego genomu wewnątrzcząsteczkowych i międzycząsteczkowych interakcji RNA-RNA in vivo. SPLASH może być stosowany do badania interakcji RNA w organizmach, w tym drożdżach, bakteriach i ludziach.

Mapowanie interakcji RNA-RNA na całym świecie przy użyciu biotynylowanego psoralenu

Ludzka odwrotna transkryptaza telomerazy (TERT) syntetyzuje nie tylko telomeryczne DNA, ale także dwuniciowe RNA poprzez aktywność polimerazy RNA zależnej od RNA. W tym miejscu opisujemy nowo opracowany test do wykrywania zależnej od RNA aktywności polimerazy RNA endogennego TERT.

Półilościowe wykrywanie zależnej od RNA aktywności polimerazy RNA ludzkiego białka odwrotnej transkryptazy telomerazy

Ta metoda ściągania RNA pozwala na identyfikację celów RNA długiego niekodującego RNA (lncRNA). Opierając się na hybrydyzacji domowej roboty, zaprojektowanych antysensownych sond oligonukleotydowych DNA specyficznych dla tego lncRNA w odpowiednio utrwalonej tkance lub linii komórkowej, skutecznie umożliwia wychwycenie wszystkich celów RNA lncRNA.

Procedura ściągania RNA w celu identyfikacji celów RNA długiego niekodującego RNA

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) to potężne narzędzie do charakterystyki genomu, które jest ograniczone przez wysoki poziom błędów platformy (~0,5–2,0%). Opisujemy nasze metody sekwencjonowania z korekcją błędów, które pozwalają nam wyeliminować wskaźnik błędów NGS i wykryć mutacje przy frakcjach alleli wariantów tak rzadkich, jak 0,0001.

Wykrywanie rzadkich zdarzeń za pomocą sekwencjonowania DNA i RNA z korekcją błędów

Poznaj metodę składania sztucznych kompleksów elongacyjnych polimerazy II RNA przy użyciu syntetycznych oligonukleotydów DNA i RNA. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów kotranskrypcyjnego przetwarzania RNA.

Sztuczne kompleksy elongacyjne polimerazy II RNA do analizy zdarzeń przetwarzania kotranskrypcyjnego RNA

Przeglądaj więcej filmów