Sztuczne kompleksy elongacyjne polimerazy II RNA do analizy zdarzeń przetwarzania kotranskrypcyjnego RNA

W tym miejscu opracowaliśmy prosty system eksperymentalny, który umożliwia odtworzenie aktywnych kompleksów elongacyjnych Pol II odpowiednich do badania funkcjonalnego sprzężenia transkrypcji Pol II i czapeczki RNA. Dzięki tej metodzie funkcjonalne kompleksy wydłużeniowe można łatwo zmontować za pomocą zaledwie kilku elementów. Kompleksy elongacyjne są unieruchomione na kulkach magnetycznych, dzięki czemu łatwo jest zmienić warunki reakcji.

Aby unieruchomić oligonuligację DNA zawierającą biotynę na kulkach magnetycznych, najpierw dodaj 200 mikrolitrów kulek magnetycznych do niskobiałkowej probówki wiążącej 1,5 mililitra, a następnie umieść probówkę na stojaku magnetycznym na dwie minuty. Gdy probówka znajduje się na stojaku magnetycznym, użyj pipety, aby usunąć płyn z probówki bez naruszania kulek. Aby umyć kulki, wyjmij rurkę ze stojaka i dodaj jeden mililitr buforu płuczącego zawierającego chlorowodorek tris, EDTA i chlorek sodu.

Umieść rurkę z powrotem w stojaku. Po dwóch minutach usuń roztwór myjący i powtórz mycie jeszcze dwa razy, używając 200 mikrolitrów tego samego buforu. Ponownie zawieś kulki magnetyczne w 400 mikrolitrach bufora 2X.

Następnie dodaj 380 mikrolitrów wody i 20 mikrolitrów 10-mikromolowego nieszablonowego oligo biotynylowanego DNA do wymieszania. Umieść probówkę na nutatorze i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj kulki unieruchomionym nieszablonowym oligonem DNA trzy razy przy użyciu 200 mikrolitrów buforu, a następnie trzy razy 200 mikrolitrami buforu do przechowywania i rozcieńczania.

Przechowuj probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, aby zakończyć blokowanie koralików za pomocą BSA. Następnego dnia wyrzuć roztwór, ponownie zawieś kulki w 200 mikrolitrach buforu do przechowywania i rozcieńczania, aby osiągnąć przybliżone stężenie DNA wynoszące pięć mikromolów, a następnie przenieś roztwór z kulkami do nowej probówki. Aby uzyskać duplex DNA-RNA, należy przygotować 10-mikrolitrową mieszankę do wyżarzania w probówce PCR o stosunku molowym RNA-DNA dwa do jednego, zgodnie z opisem w pisemnym protokole.

Umieść rurkę w termocyklerze. Ustaw program na 45 stopni Celsjusza na pięć minut, a następnie 12 cykli po dwie minuty każdy, zaczynając od 43 stopni Celsjusza i obniżając temperaturę o dwa stopnie Celsjusza na cykl. Na koniec trzymaj go w stanie bezczynności w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Aby załadować oczyszczoną polimerazę RNA II do hybrydy DNA-RNA, wymieszaj jeden mikrolitr dupleksu DNA-RNA z 13 mikrolitrami świeżo przygotowanego buforu polimerazy II w probówce. Dodać jeden mikrolitr oczyszczonej polimerazy RNA II i mieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół, mieszając końcówką pipety, nie wprowadzając pęcherzyków. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Aby uzupełnić kompleks elongacyjny, dodaj jeden mikrolitr unieruchomionych nieszablonowych kulek oligonuligosowych DNA do 14 mikrolitrów buforu DNA bez matrycy, dodaj mieszaninę 15 mikrolitrów do wcześniej inkubowanej probówki i inkubuj ją przez kolejne 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Umieść próbkę na stojaku magnetycznym na dwie minuty. Przemyć próbkę jednorazowo 30 mikrolitrami buforu do przemywania w celu usunięcia nieinkorporowanej polimerazy II i oligonukleotydów.

Aby znakować radioizotopowo kompleksy elongacyjne 23merami RNA, dodaj jeden mikrolitr ATP i jeden mikrolitr znakowanego radioaktywnie UTP do 23 mikrolitrów buforu impulsowego i dodaj tę mieszaninę do przemytych kulek magnetycznych w celu ponownego zawieszenia. Inkubować reakcję przez 10 minut, aby umożliwić syntezę znakowanych radioizotopowo 23merów. Dodać 1,5 mikrolitra roztworu zawierającego 100-mikromolową mieszankę ATP i 100-mikromolową mieszankę UTP do 3,5 mikrolitra buforu pościgowego i dodać mieszaninę do probówki zawierającej wstępnie złożone kompleksy wydłużające na kulkach.

Ponownie inkubuj probówkę przez pięć minut, aby gonić wszystkie powstające transkrypty do 23merów. Następnie umieść probówkę na stojaku magnetycznym i umyj tak, jak to zrobiono wcześniej, aby usunąć niewbudowane nukleotydy. Zawiesić próbkę w 30 mikrolitrach buforu do przemywania ścieków.

Aby wygenerować kompleksy elongacyjne z dłuższymi transkryptami, postępuj zgodnie z poprzednimi procedurami i czterokrotnie zwiększaj, aby wygenerować 120 mikrolitrów przemytych kompleksów elongacyjnych dla czterech reakcji. Oznacz trzy nowe tuby 23mer, 25mer i 29mer. Przenieś 30 mikrolitrów przemytych kompleksów wydłużających do probówki 23mer i dodaj 94 mikrolitry mieszanki stop zawierającej proteinazę K i glikogen.

Umieść probówkę zawierającą pozostałe 90 mikrolitrów przemytych kompleksów wydłużających na stojaku magnetycznym na dwie minuty, usuń supernatant i ponownie zawieś kulki w 90 mikrolitrach BTB uzupełnionych 1,2 mikrolitrami ATP i CTP. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Po umyciu 90 mikrolitrami buforu do przemywania przenieś 30 mikrolitrów kompleksów wydłużających do probówki 25mer i dodaj 94 mikrolitry mieszanki zatrzymującej zawierającej proteinazę K i glikogen.

Ponownie umieść probówkę zawierającą pozostałe 60 mikrolitrów kompleksów elongacyjnych na stojaku magnetycznym na dwie minuty. Powtórzyć zabieg BTB z 60 mikrolitrami buforu uzupełnionymi 0,8 mikrolitrami ATP i CTP. Po inkubacji i umyciu, jak poprzednio, ponownie zawiesić próbkę w 60 mikrolitrach buforu do przemywania popłuczyny.

Przenieś 30 mikrolitrów z próbki do probówki 29 merów i dodaj 94 mikrolitry mieszanki stop zawierającej proteinazę K i glikogen. Analizuj produkty reakcji na denaturującym żelu poliakrylamidowym. Po pierwsze, wygeneruj przemyte kompleksy elongacyjne zawierające 23mery, zwiększając 13-krotnie procedurę opisaną wcześniej, aby uzyskać 390 mikrolitrów na 12 reakcji i jeden dodatkowy.

Aby przeprowadzić fosforylację polimerazy II CTD, należy usunąć supernatant po umieszczeniu próbki w stojaku magnetycznym i ponownie zawiesić kulki w 377 mikrolitrach BTB. Oznaczyć dwie nowe probówki plus H i minus H.To plus H, dodać trzy mikrolitry czynnika inicjującego transkrypcję TFIIH o stężeniu 300 nanogramów na mikrolitr, a do minus H dodać dziewięć mikrolitrów buforu do przechowywania i rozcieńczania. Dodać 87 mikrolitrów przemytych kompleksów wydłużających do probówki plus H i 261 mikrolitrów do rurki minus H.

Inkubować probówki przez 10 minut i przemyć buforem do mycia. Aby wykonać capping RNA, dodaj 87 mikrolitrów mieszanki zamykającej do probówki plus H i 261 mikrolitrów do probówki minus H w celu ponownego zawieszenia. Oznacz cztery nowe probówki, pięć plus H, pięć minus H, 15 minus H i 45 minus H, a następnie dozuj trzy mikrolitry po pięć, 15 lub 45 nanogramów na mikrolitr enzymu zamykającego do odpowiednich probówek.

Następnie przygotuj 12 nowych probówek z 94 mikrolitrami buforu zatrzymującego. Rozpocznij pierwszą reakcję zamykania, dodając 87 mikrolitrów kompleksu wydłużającego potraktowanego TFIIH do probówki oznaczonej pięć plus H. Inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza w bloku grzewczym. Reakcje cappingu muszą być precyzyjnie mierzone za pomocą stopera.

Podczas pracy z wieloma reakcjami czasy rozpoczęcia każdej reakcji powinny być rozłożone w czasie. Po jednej, dwóch lub czterech minutach przenieś 30 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej plus pięć do probówek oznaczonych jeden, dwa i trzy zawierających 94 mikrolitry buforu zatrzymującego, aby zatrzymać reakcje. Postępować z reakcjami zamykania próbek w pozostałych probówkach z minus H dokładnie w ten sam sposób, stosując kompleksy wydłużające poddane działaniu TFIIH.

Analizuj produkty reakcji na denaturującym żelu poliakrylamidowym. Diagram jest pokazany tutaj dla cząsteczek DNA i RNA w sztucznych kompleksach elongacyjnych. Używając syntetycznego oligo RNA składającego się z 20 nukleotydów jako startera RNA podczas składania sztucznych kompleksów elongacyjnych, nukleotydy dodawano podczas każdego sekwencyjnego kroku chodzenia protokołu, aby wygenerować 23mer, 25mer i 29mer.

Porównano reakcje z wykorzystaniem polimerazy RNA II z różnych źródeł. Sztuczne kompleksy elongacyjne zostały połączone z endogenną polimerazą II typu dzikiego oczyszczoną z wątroby szczura lub drożdży rozszczepieniowych i przeszły w celu wytworzenia 23 merów lub 25 merów. Przeprowadzono test w celu zmierzenia zamknięcia znakowanych radioaktywnie transkryptów związanych ze sztucznymi kompleksami elongacyjnymi zawierającymi 23 transkrypty nukleotydowe z pięcioma pierwszymi końcami trifosforanowymi.

Ostatnie dwa pasy pokazują produkty reakcji, w których kompleksy elongacyjne inkubowano z enzymem zamykającym lub bez enzymu zamykającego w obecności TFIIH. Wolniej i szybciej migrujące pasma zawierają odpowiednio transkrypty z ograniczeniem i bez niego. Pierwsze 12 pasów pokazuje ograniczenie transkryptów związanych z kompleksami elongacyjnymi z fosforylowanym lub niefosforylowanym CTD.

Aktywność polimerazy II i innych enzymów może się różnić w zależności od przygotowania, dlatego konieczna jest optymalizacja warunków reakcji poprzez miareczkowanie stężeń enzymów w celu określenia optymalnych poziomów. Ważne jest, aby bezpiecznie używać materiałów radioaktywnych i unikać skażenia. Upewnij się, że postępujesz zgodnie z wytycznymi swojego laboratorium i instytutu podczas przeprowadzania eksperymentów z radioaktywnością.