Name: Badanie toksyczności nanocząstek tlenku w hodowli komórkowej i u Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Poznaj metody oceny nanotoksyczności tlenku cynku w komórkach ludzkich i u Drosophila melanogaster. Protokół obejmuje analizę typów śmierci komórkowej oraz pomiar produkcji reaktywnych form tlenu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie było wspierane przez grant o numerze R706-000-043-490. Badanie nie reprezentuje poglądu sponsora grantu.

1. Analiza sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) na komórkach żywych/stałych
<ol>
	<li>Sonikować ZnO NPs w zawiesinie przez 15 min.</li>
	<li>Przygotować nanocząsteczki ZnO o różnych stężeniach (np. 0, 10, 25, 50,100 i 200 μg/ml) przy użyciu 1 mg/ml roztworu podstawowego ZnO NP do traktowania hodowanych komórek.</li>
	<li>Wysiewaj ludzkie fibroblasty płuc MRC5 (1 x 105 komórek/dołek) na 6-dołkową płytkę hodowlaną dzień wcześniej, a następnie traktuj komórki 2 ml NP ZnO (w trzech powtórzeniach) przez 8 godzin, 16 godzin i 24 godziny.</li>
	<li>W każdym punkcie czasowym zebrać komórki, odwirowując przy 300 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Przemyć osady komórkowe dwukrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki z 1x buforem wiążącym, który składa się z 0,1 M HEPES/wodorotlenku sodu (NaOH), 1,4 M chlorku sodu (NaCl) i 25 mM chlorku wapnia (CaCl2), w stężeniu 1 x 105 komórek na 100 μL.</li>
	<li>Dodać 5 μl izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) aneksyny V i 5 μl barwnika DNA jodkiem propidyny (PI) i inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT; 25 °C) w ciemności.</li>
	<li>Uzupełnij próbki dodatkowymi 400 μl 1x buforu wiążącego przed sortowaniem komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Dla każdej próbki analizowanych jest co najmniej 10 000 komórek.</li>
	<li>Wykres słupkowy należy sporządzić w tabeli, korzystając z uzyskanej mediany intensywności.</li>
</ol>
2. Narażenie NPs ZnO na Drosophila
<ol>
	<li>Dodać 1 ml nanocząstek o różnych stężeniach do fiolek, a następnie 9 ml pokarmu dla much, aby uzyskać końcowe stężenie 0,1 mg/mL, 0,25 mg/ml lub 0,5 mg/ml NPs ZnO.</li>
	<li>Dokładnie wymieszać nanocząstki z pokarmem w fiolkach za pomocą pipety.</li>
	<li>Przed użyciem pozostawić pokarm dla much zawierający nanocząsteczki ZnO do ostygnięcia przez co najmniej 2-3 godziny.</li>
	<li>Wprowadzić dorosłe samce i samice much do fiolek na 5 dni i pozwolić im łączyć się w pary i składać jaja (które pojawiają się jako białe plamki) na powierzchni pokarmu.</li>
	<li>Usuń muchy rodzicielskie i pozwól jajom przejść dalszy rozwój, który składa się z 4 różnych etapów rozwoju (stadium embrionalne, larwalne, poczwarkowe i dorosłe).</li>
</ol>
3. Sekcja muchy
<ol>
	<li>Pobrać późne larwy 3. stadium rozwojowe ze ścianki fiolek do analizy. Świeżo złożone jaja zwykle rozwijają się w larwy późnego 3. stadium rozwojowego po 72-120 h w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wyczyść naczynie preparacyjne i napełnij studzienkę pożywką do preparacji/PBS.</li>
	<li>Wypreparuj larwy (późne 3stadium rozwojowe) pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Użyj końcówki kleszczy, aby zrobić mały otwór i rozerwać warstwę naskórka larw. Ostrożnie wyciągnij jelito i umieść je w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej pożywkę Drosophila firmy Schneider, przed etapem utrwalania przy użyciu 1 ml 4% paraformaldehydu (PF).</li>
	<li>3.5Utrwalić jelito w PF przez 10 minut w RT, do kolejnych eksperymentów, takich jak barwienie immunologiczne.</li>
</ol>
4. Wykrywanie ROS za pomocą barwienia dihydroethidium (DHE)
<ol>
	<li>Traktować larwy różnymi stężeniami nanocząsteczek ZnO, jak opisano w kroku 2.1.</li>
	<li>Po wypreparowaniu jelita z larw w 3.stadium rozwojowym, jak opisano w sekcji 3, należy inkubować jelito w pożywce Drosophila Schneidera w temperaturze RT przed wykonaniem barwienia tkanek. Rozpuścić 1 μl barwnika DHE (o stężeniu podstawowym 30 mM) w 1 ml pożywki Schneidera, uzyskując końcowe stężenie robocze 10-30 μM barwnika DHE.</li>
	<li>Inkubować jelita przez 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności, a następnie myć trzy razy pożywką Schneidera co 5 minut.</li>
	<li>Namocuj jelito za pomocą 4% PF (krok opcjonalny) i zamontuj jelito na szkiełkach podstawowych z podłożem zapobiegającym blaknięciu zawierającym 4′,6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI). Rejestruj obrazy pod mikroskopem konfokalnym.</li>
</ol>
5. Pomiar fluorescencji za pomocą oprogramowania ImageJ
<ol>
	<li>Zaimportuj przechwycone obrazy fluorescencyjne uzyskane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej do oprogramowania ImageJ.</li>
	<li>Kliknij menu Analizuj i wybierz Ustaw pomiary.</li>
	<li>Wybierz miarę wyjściową, taką jak obszar zintegrowany z intensywnością i średnia wartość szarości.</li>
	<li>Kliknij przycisk Zmierz.</li>
	<li>Wybierz region bez fluorescencji, aby ustawić tło.</li>
	<li>Wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego Excel i określ skorygowaną całkowitą fluorescencję komórek (CTCF), korzystając z obliczeń, jak pokazano poniżej. 
	CTCF = Gęstość zintegrowana - (Obszar wybranej komórki X Średnia fluorescencja odczytów tła)</li>
	<li>Skonstruuj wykres słupkowy i przeprowadź analizę statystyczną.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+100+nm+zinc+oxide+nanoparticles%3A+a+report+of+90-day+repeated+oral+administration+in+Sprague+Dawley+rats%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats.</a> International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).</li>
<li>Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial+activity+and+mechanism+of+action+of+zinc+oxide+nanoparticles+against+Campylobacter+jejuni%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).</li>
<li>Colvin, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+environmental+impact+of+engineered+nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The potential environmental impact of engineered nanomaterials.</a> Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).</li>
<li>De Angelis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+ZnO+and+TiO%282%29+nanoparticles%3A+physicochemical+characterisation+and+toxicological+effects+on+human+colon+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells.</a> Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).</li>
<li>Johnson, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+exposure+to+ZnO+nanoparticles+induces+autophagic+immune+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death.</a> Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).</li>
<li>Singh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoGenotoxicology%3A+the+DNA+damaging+potential+of+engineered+nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials.</a> Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).</li>
<li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+dissolved+zinc+ion+and+reactive+oxygen+species+in+cytotoxicity+of+ZnO+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles.</a> Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).</li>
<li>Wahab, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZnO+nanoparticles+induced+oxidative+stress+and+apoptosis+in+HepG2+and+MCF-7+cancer+cells+and+their+antibacterial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).</li>
<li>Namvar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+effects+of+biosynthesized+zinc+oxide+nanoparticles+on+murine+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Evidence-Based+Complementary+and+Alternative%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).</li>
<li>Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicities+of+nano+zinc+oxide+to+five+marine+organisms%3A+influences+of+aggregate+size+and+ion+solubility%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).</li>
<li>Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-specific+toxic+effects+of+differently+shaped+zinc+oxide+nanoparticles+to+zebrafish+embryos+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio).</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).</li>
<li>Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+ZnO+nanoparticles+exposure+induces+developmental+toxicity%2C+oxidative+stress+and+DNA+damage+in+embryo-larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).</li>
<li>Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+study+of+the+harmful+effects+of+ZnO+nanoparticles+using+Drosophila+melanogaster+as+an+in+vivo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hazardous+Materials%22%5BJournal%5D)">A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model.</a> Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).</li>
<li>Rand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophotoxicology%3A+the+growing+potential+for+Drosophila+in+neurotoxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology+and+Teratology%22%5BJournal%5D)">Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology.</a> Neurotoxicology and Teratology. 32, 74-83 (2010).</li>
<li>Ong, C., Yung, L. Y., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+as+a+model+organism+to+study+nanotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity.</a> Nanotoxicology. 9, 396-403 (2015).</li>
<li>Hoffmann, J. A., Reichhart, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+innate+immunity%3A+an+evolutionary+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective.</a> Nature Immunology. 3, 121-126 (2002).</li>
<li>Hughes, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+genetic+model+for+studying+pathogenic+human+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses.</a> Virology. 423, 1-5 (2012).</li>
<li>Jennings, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+-+a+versatile+model+in+biology+%26+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today%22%5BJournal%5D)">Drosophila - a versatile model in biology & medicine.</a> Materials Today. 14, 190-195 (2011).</li>
<li>Adams, M. D., Sekelsky, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+sequence+to+phenotype%3A+reverse+genetics+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster.</a> Nature Reviews Genetics. 3, 189-198 (2002).</li>
<li>Adams, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of Drosophila melanogaster.</a> Science. 287, 2185-2195 (2000).</li>
<li>Ong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+nanoparticles+disrupt+germline+stem+cell+maintenance+in+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Silver nanoparticles disrupt germline stem cell maintenance in the Drosophila testis.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li>
<li>Alaraby, M., Demir, E., Hernandez, A., Marcos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+potential+harmful+effects+of+CdSe+quantum+dots+by+using+Drosophila+melanogaster+as+in+vivo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Assessing potential harmful effects of CdSe quantum dots by using Drosophila melanogaster as in vivo model.</a> Science of the Total Environment. 530-531, 66-75 (2015).</li>
<li>Barik, B. K., Mishra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+as+a+potential+teratogen%3A+a+lesson+learnt+from+fruit+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles as a potential teratogen: a lesson learnt from fruit fly.</a> Nanotoxicology. , 1-27 (2018).</li>
<li>Jovanovic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+a+human+food+additive%2C+titanium+dioxide+nanoparticles+E171%2C+on+Drosophila+melanogaster+-+a+20+generation+dietary+exposure+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The effects of a human food additive, titanium dioxide nanoparticles E171, on Drosophila melanogaster - a 20 generation dietary exposure experiment.</a> Scientific Reports. 8, (2018).</li>
<li>Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Toxicity+of+Nanoparticles+to+Human+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).</li>
<li>Akhtar, M. J., Ahamed, M., Alhadlaq, H. A., Alshamsan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+ROS+scavenging+and+antioxidant+signalling+by+redox+metallic+and+fullerene+nanomaterials%3A+Potential+implications+in+ROS+associated+degenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta-General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Mechanism of ROS scavenging and antioxidant signalling by redox metallic and fullerene nanomaterials: Potential implications in ROS associated degenerative disorders.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1861, 802-813 (2017).</li>
<li>Akter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+on+silver+nanoparticles-induced+cytotoxicity%3A+Physicochemical+properties+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Advanced+Research%22%5BJournal%5D)">A systematic review on silver nanoparticles-induced cytotoxicity: Physicochemical properties and perspectives.</a> Journal of Advanced Research. 9, 1-16 (2018).</li>
<li>Vecchio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fruit+fly+in+the+nanoworld%3A+once+again+Drosophila+contributes+to+environment+and+human+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">A fruit fly in the nanoworld: once again Drosophila contributes to environment and human health.</a> Nanotoxicology. 9, 135-137 (2015).</li>
<li>Marino, G., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+apoptotic+phosphatidylserine+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure.</a> Cell Research. 23, 1247-1248 (2013).</li>
<li>Stoddart, M. J. Cell Viability Assays: Introduction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStoddart%2C+MJ+%22Mammalian+Cell+Viability%3A+Methods+and+Protocols%22">Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols</a>. , Chapter 1 (2011).</li>
<li>Yazdani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concerns+in+the+application+of+fluorescent+probes+DCDHF-DA%2C+DHR+123+and+DHE+to+measure+reactive+oxygen+species+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro.</a> Toxicology in Vitro. 30, 578-582 (2015).</li>
<li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+kinetics+of+dihydroethidium+fluorescence+with+superoxide+using+xanthine+oxidase+and+hypoxanthine+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Analysis of kinetics of dihydroethidium fluorescence with superoxide using xanthine oxidase and hypoxanthine assay.</a> Annals of Biomedical Engineering. 41, 327-337 (2013).</li>
<li>Hartig, S. M. Basic image analysis and manipulation in ImageJ. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHartig%2C+SM+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , Chapter 14, Unit14.15 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Aby ocenić, czy ZnO NP może indukować apoptozę w fibroblastach MRC5, używamy cytometrii przepływowej do odróżnienia komórek od martwiczej lub apoptotycznej śmierci komórki. W normalnych żywych komórkach fosfatydyloseryna (PS) jest zlokalizowana na błonie komórkowej. Jeśli dojdzie do apoptozy, PS jest przemieszczany do zewnątrzkomórkowej płatka błony komórkowej, umożliwiając wiązanie aneksyny V znakowanej fluoresceiną (FITC Aneksyna V)29. Z drugiej strony, jodek propydyny (PI) o czerwonej fluoresce...

Nanotechnologia odnosi się do zastosowania materiałów o rozmiarach nano, które są używane we wszystkich dziedzinach nauki, w tym w medycynie, materiałoznawstwie i biochemii. Na przykład nanocząsteczki ZnO, które są znane ze swojego rozpraszania w ultrafiolecie, wykrywania chemicznego i właściwości przeciwdrobnoustrojowych, a także wysokiej przewodności elektrycznej, są wykorzystywane do produkcji różnych produktów konsumenckich, takich jak opakowania do żywności, kosmetyki, tekstylia, gumy, baterie, katalizator do oczyszczania spalin samochodowych i zastosowania związane z biomedycyną1,2,3.
Jednak rosnące zastosowania produktów na bazie ZnO NPs, prowadzące do zwiększonej ekspozycji ludzi na NPs, wzbudziły obawy co do ich potencjalnego negatywnego wpływu na zdrowie ludzi. Szereg badań komórkowych in vitro wykazało, że nanocząsteczki ZnO mogą indukować stres oksydacyjny, cytotoksyczność związaną z autofagią, stan zapalny i genotoksyczność4,5,6,7,8. W szczególności zakłada się, że toksyczność nanocząsteczek ZnO jest spowodowana rozpuszczaniem Zn w celu uwolnienia jonówZn 2+, a także reaktywnością powierzchniową ZnO, co powoduje zaburzenia równowagi jonowej i metabolicznej komórek, które są związane z upośledzoną homeostazą jonową i hamowaniem transportu jonów4,7,9,10. Co ważne, badania wykazały, że wytwarzanie reaktywnych form tlenu (ROS) jest jednym z podstawowych mechanizmów leżących u podstaw toksyczności związanej z ZnO NPs. Wykazano, że niewystarczająca aktywność antyoksydacyjna po znieważeniu ROS jest odpowiedzialna za wywołanie cytotoksyczności i uszkodzenia DNA9. Toksyczne działanie nanocząsteczek ZnO odnotowano również w modelach zwierzęcych, w tym gryzoni1, danio pręgowany11,12, a także bezkręgowca Drosophila13.
Drosophila służy jako sprawdzony alternatywny model zwierzęcy do badania toksyczności jednostek chemicznych i nanomateriałów (NMs)14,15. Co ważne, istnieje wysoki poziom genetycznego i fizjologicznego podobieństwa między człowiekiem a Drosophila, co uzasadnia użycie Drosophila jako modelu in vivo do oceny reakcji biologicznych na zanieczyszczenia środowiska, takie jak NMs16. Ponadto istnieje wiele zalet stosowania Drosophila ze względu na jego niewielkie rozmiary, krótką żywotność, podatność genetyczną oraz łatwą i opłacalną pielęgnację. Co więcej, Drosophila jest szeroko stosowana do badań genetycznych, biologii molekularnej i rozwojowej, odkąd jej pełny genom został w pełni zsekwencjonowany wiele lat temu w 2000 roku, dzięki czemu nadaje się do różnych wysokoprzepustowych badań przesiewowych i do rozwiązywania nierozwiązanych problemów biologicznych17,18,19,20,21. W ostatnich latach opisano szereg badań związanych z immunotoksycznością przy użyciu różnych typów NP u Drosophila15,22,23,24. Ta fundamentalna nowa wiedza uzyskana w badaniach z wykorzystaniem Drosophila pomogła nam lepiej zrozumieć nanotoksykologię.
ROS jest dobrze znanym winowajcą cytotoksyczności i genotoksyczności powodowanej przez NPs, w szczególności NPs25. ROS to związki chemiczne zawierające tlen o wyższych właściwościach reaktywnych niż tlen cząsteczkowy. Wolne rodniki, takie jak rodnik ponadtlenkowy (O2-), a nawet cząsteczki nierodnikowe, takie jak nadtlenek wodoru (H2O2) mogą działać jako ROS. W normalnych warunkach fizjologicznych są one niezbędne do utrzymania homeostazy komórkowej26, jednak nadmierne ROS spowodowane nadprodukcją lub rozregulowaniem systemu obrony antyoksydacyjnej może powodować stres oksydacyjny, prowadząc do uszkodzenia białek, lipidów i kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA)27. Na przykład, wraz ze wzrostem poziomu ROS i jednoczesnym spadkiem poziomu glutationu (GSH), dochodzi do zakłócenia syntezy trifosforanu adenozyny (ATP) i wzrostu poziomu dehydrogenazy mleczanowej (LDH) w pożywce, czego kulminacją jest śmierć komórki27.
Tutaj udostępniamy protokoły do przeprowadzania analiz komórkowych i genetycznych z wykorzystaniem hodowanych komórek ssaków i Drosophila w celu określenia potencjalnych negatywnych skutków NP ZnO. Przegląd metody zastosowanej do badania toksyczności nanocząsteczek ZnO przedstawiono na rysunku 1.

<table><tbody><tr><td>15% 4-hydroksybenzoesan metylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cncCK6/TM3, Sb</td><td></td><td></td><td>a prezent od Dr. Kerppola T</td></tr><tr><td>Mąka kukurydziana, glukoza, drożdże piwowar</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CyAn ADP z Oprogramowanie Summit</td><td>DAKO</td><td></td><td>https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf</td></tr><tr><td>Dihydroethidium (Hydroethidine)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D11347</td><td></td></tr><tr><td>FITC Annexin V Zestaw do wykrywania apoptozy I</td><td>BD biosciences</td><td>556547</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucolin</td><td>Supermarket</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MRC5 ludzki fibroblast płuc</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>Schneider ' s Drosophila medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże montażowe zapobiegające blaknięciu Vectashield z DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Wild-type Canton-S; Sod2N308/CyO</td><td>NIG-FLY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanocząstki tlenku cynku</td><td>Sigma Aldrich</td><td>721077</td><td>Patrz karta 2</td></tr></tbody></table>

badanie toksyczności nanocząstek tlenku w hodowli komórkowej i u drosophila melanogaster

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

Nanocząstki tlenku (ZnO NPs) mają szeroki zakres zastosowań, ale liczba doniesień o toksyczności związanej z ZnO NP gwałtownie wzrosła w ostatnich latach. Jednak badania, które wyjaśniają mechanizmy leżące u podstaw toksyczności indukowanej przez ZnO NP, są skąpe. Określiliśmy profile toksyczności nanocząsteczek ZnO za pomocą modeli eksperymentalnych zarówno in vitro, jak i in vivo. Zaobserwowano znaczny spadek żywotności komórek w fibroblastach płuc MRC5 narażonych na ZnO NP, co pokazuje, że NP ZnO wywierają działanie cytotoksyczne. Podobnie, co ciekawe, jelita wystawione na działanie nanocząsteczek ZnO wykazywały dramatyczny wzrost poziomu reaktywnych form tlenu (ROS) u muszki owocowej Drosophila. Konieczne są bardziej dogłębne badania w celu ustalenia oceny ryzyka związanego ze zwiększonym stosowaniem nanocząsteczek ZnO przez konsumentów.

Komórki eksponowane na NP poddano obróbce z użyciem zestawu odczynników do barwienia komórek, a następnie wykonano sortowanie komórek metodą cytometrii przepływowej. Komórki traktowane NP ZnO (panel prawy, dół) wykazują wyższy odsetek komórek we wczesnej (R3) i późnej (R6) fazie apoptozy niż komórki kontrolne (R5, panel lewy, dół). Śmierć komórek w wyniku nekrozy jest oznaczona jako R4 (panel prawy, góra) (Rycina 2). Wyniki testu FITC/Annexin V przeprowadzone...

Opisujemy szczegółowy protokół oceny profili toksykologicznych nanocząstek tlenku (NPs ZnO), w szczególności rodzaju śmierci komórki w ludzkich fibroblastach płuc MRC5 i tworzenia ROS u muszki owocowej Drosophila.

Badanie toksyczności nanocząstek tlenku w hodowli komórkowej i u Drosophila melanogaster

Zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) have a wide range of applications, but the number of reports on ZnO NP-associated toxicity has grown rapidly in recent ...

Nasze metody przedstawiają prosty i powtarzalny sposób badania nanotoksyczności, taki jak badanie rodzajów śmierci komórek i badanie produkcji reaktywnych form tlenu. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją jest ścisłym formatem, który pozwala nam badać subpopulację komórek i rosnące różne typy śmierci komórek. Metoda badania sondą DHE pozwala nam na wykrycie i ilościowe określenie reaktywnych form tlenu, a następnie cytometrię przepływową, mikroskopowe obrazowanie o wysokiej zawartości oraz analizę fluorescencyjną opartą na dwuwierszach.Aby rozpocząć, umieść probówkę Eppendorfa zawierającą nanocząstki tlenku w roztworze podstawowym nanocząstek tlenku w sonikatorze na 15 minut. Przygotuj nanocząstki tlenku w różnych stężeniach, używając materiału o proporcji nanocząstek tlenku o wartości jednego miligrama na mililitr. Następnie, w komorze bezpieczeństwa biologicznego, wysiewaj ludzkie fibroblasty płuc MRC5 na trzy sześciodołkowe płytki hodowlane w stężeniu od jednego razy 10 do piątej komórki na studzienkę.Inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po jednym dniu potraktuj komórki dwoma mililitrami nanocząstek tlenku przez osiem godzin, 16 godzin lub 24 godziny. W każdym punkcie czasowym zbierz komórki do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i odwiruj przy 300 razy g przez pięć minut.Dwukrotnie przemyj granulki komórek solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, a następnie ponownie zawieś komórki za pomocą buforu wiążącego 1X. Następnie dodaj pięć mikrolitrów barwnika FITC Annexin V w pięciu mikrolitrach barwnika DNA z jodku propidyny. Inkubuj wybarwione komórki przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.Przed sortowaniem komórek za pomocą cytometrii przepływowej należy uzupełnić próbki dodatkowymi 400 mikrolitrami buforu wiążącego 1X. Wykres słupkowy należy sporządzić w tabeli, korzystając z uzyskanej mediany intensywności. Teraz użyj pipety, aby dodać jeden mililitr nanocząstek o różnych stężeniach do fiolek, a następnie dziewięć mililitrów pokarmu dla much, aby uzyskać końcowe stężenie 0,1 miligrama na mililitr, 0,25 miligrama na mililitr lub 0,5 miligrama na mililitr nanocząstek tlenku.Pipetuj w górę i w dół, aby dokładnie wymieszać. Przed użyciem pozostaw pokarm dla much zawierający nanocząsteczki tlenku do ostygnięcia przez co najmniej dwie do trzech godzin. Następnie znieczulij dorosłe samce i samice much w fiolce z dwutlenkiem węgla i wprowadź pięć samców much i pięć samic much do każdej fiolki na pięć dni.Pozwól im łączyć się w pary i składać jaja na powierzchni jedzenia. Po znieczuleniu należy usunąć muszki rodzicielskie i pozwolić jajom na dalszy rozwój w temperaturze pokojowej, która składa się z czterech różnych etapów rozwoju. Stadium embrionalne, larwalne, poczwarkowe i dorosłe.Po 72 do 120 godzinach świeżo złożone jaja przekształcają się w larwy w późnym trzecim stadium rozwojowym. Za pomocą kleszczy zebrać larwy ze ścianki fiolek do analizy. W studzience naczynia preparacyjnego z pożywką do preparacji lub PBS umieścić larwy w roztworze.Pod mikroskopem stereoskopowym użyj końcówki kleszczy, aby zrobić mały otwór i rozerwij warstwę naskórka larw. Ostrożnie wyciągnij jelita. Umieść jelito w 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki zawierającej pożywkę Drosophila firmy Schneider.Dodaj jeden mikrolitr sondy DHE i inkubuj w ciemności w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Umyj jelito trzy razy za pomocą pożywki Schneidera co pięć minut. Zamontuj jelito na szkiełkach podstawowych i zaopatrz w 10 mikrolitrów środka montażowego zapobiegającego blaknięciu zawierającego DAPI.Rejestruj obrazy pod mikroskopem konfokalnym. Aby zmierzyć fluorescencję, zaimportuj przechwycone obrazy fluorescencyjne uzyskane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej do oprogramowania ImageJ. Kliknij menu analizy i wybierz ustaw pomiary.Wybierz miarę wyjściową, taką jak intensywność zintegrowana z obszarem i średnia wartość szarości. Wybierz region bez fluorescencji, aby ustawić tło. Kliknij przycisk Zmierz miarę.Wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego i określ skorygowaną całkowitą fluorescencję komórek. Skonstruuj wykres słupkowy i przeprowadź analizę statystyczną. W tym badaniu komórki traktowane nanocząstkami tlenku wykazują wyższy odsetek wczesnych komórek R3 lub późnej apoptozy R6 niż komórek kontrolnych R5. Martwicza śmierć komórki była oznaczona przez R4. Jelito wyekstrahowane z larwy Drosophila zostało podzielone na trzy odrębne domeny o różnym pochodzeniu rozwojowym.Mianowicie jelito przednie, jelito środkowe i jelito tylne. Zapasy DHE mają tendencję do wygasania dość szybko, więc należy uważać na roztwór podstawowy, którego używasz. Alternatywnie możesz wypróbować inne sondy, na przykład komórkę Roche, która jest przeznaczona do wykrywania wewnątrzkomórkowych ROS w zielonych sygnałach i która jest bardziej fotostabilna niż DHE.Nasz protokół zawiera ogólny zarys badania wewnątrzkomórkowej produkcji ROS i kwantyfikacji poziomu ROS do badania nanotoksyczności. DMSO jest znany jako lepszy rozpuszczalnik dla DHE niż PBS. Jednak DMSO jest toksyczny.Dlatego chciałbym doradzić użytkownikowi, aby ograniczył cały proces nauki do maksymalnie 30 minut. Dzieje się tak, ponieważ możesz zaobserwować fałszywie dodatni wynik, ponieważ DMSO może spowodować śmierć komórki.

toxicity-study-zinc-oxide-nanoparticles-cell-culture-drosophila

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym artykule, zarodki danio pręgowanego są wykorzystywane do badań przesiewowych toksyczności chemicznej. Toksyczność chemiczna jest skorelowana z odczytami fenotypu. W protokole próbki przedstawiono metodologiczne podejście do przeprowadzania badań przesiewowych toksyczności chemicznej.

Badania przesiewowe toksyczności chemicznej na podstawie zarodków: ocena wpływu na rozwój zarodków danio pręgowanego

Protokół został opracowany w celu zbadania wpływu epigenetycznego leku DZNep na rozwój, płodność i przeżywalność komarów.  W tym miejscu opisujemy procedury wodnej ekspozycji DZNep na niedojrzałe komary oraz ekspozycji DZNep we krwi na dorosłe komary, a także pomiar hamowania hydrolazy SAH.

Testy toksykologiczne do badania wpływu leku epigenetycznego na rozwój, płodność i przeżywalność komarów malarii

W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół wystawiania gatunków z rodzaju Drosophila na zanieczyszczenia w celu zbadania wpływu ekspozycji na szereg wyników fenotypowych w różnych stadiach rozwoju i dla więcej niż jednego pokolenia.

Protokół doświadczalny wykorzystania Drosophila jako modelowego systemu bezkręgowców do badań toksyczności w laboratorium

Metoda ilościowa została opracowana do identyfikacji i przewidywania ostrej toksyczności chemikaliów poprzez automatyczną analizę profilowania fenotypowego Caenorhabditis elegans. Protokół ten opisuje, jak leczyć robaki chemikaliami w 384-dołkowej płytce, przechwytywać filmy i określać ilościowo fenotypy związane z toksykologią.

Wysokoprzepustowy test do przewidywania toksyczności chemicznej za pomocą zautomatyzowanego profilowania fenotypowego Caenorhabditis elegans

Chemikalia zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC) stanowią poważny problem dla organizmów i środowiska naturalnego. Drosophila melanogaster stanowi idealny model do badania efektów EDC in vivo. W tym miejscu przedstawiamy metody badania zaburzeń endokrynologicznych u Drosophila, odnosząc się do wpływu EDC na płodność, płodność, czas rozwoju i długość życia muchy.

Metody badania zaburzeń endokrynologicznych u Drosophila melanogaster

Ten protokół przedstawia powszechnie stosowane testy cytotoksyczności (testy Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red i MTT) dostosowane do oceny cytotoksyczności w liniach komórkowych zarodka danio pręgowanego (ZEM2S) i wątroby (ZFL) na 96-dołkowych płytkach.

Testy cytotoksyczności z liniami komórkowymi danio pręgowanego

Ten protokół opisuje efektywną i tanią metodę, która wykorzystuje płynne podłoża do oceny wpływu chemicznych substancji toksycznych na żywotność dorosłego Drosophila melanogaster.

Ocena toksyczności chemicznej u dorosłych osobników Drosophila melanogaster

Poniższe badanie ocenia profil toksykologiczny wybranego szkieletu metaloorganicznego za pomocą wykrywania impedancji ogniwa elektrycznego i substratu (ECIS), techniki badań przesiewowych w czasie rzeczywistym o wysokiej przepustowości.

Elektryczne wykrywanie podłoża komórkowego do oceny profili toksykologicznych struktury metaloorganicznej w czasie rzeczywistym

Protokół przedstawia wysokoprzepustową, opłacalną metodę oceny neurotoksyczności u muszki owocowej poprzez kwantyfikację dysfunkcji lokomotorycznej jako alternatywę dla tradycyjnych modeli ssaków. Ma na celu ocenę neurotoksycznego wpływu związków farmaceutycznych, czynników środowiskowych lub modyfikacji genetycznych przy użyciu czułego, powtarzalnego i etycznie korzystnego modelu.

Analiza behawioralna dysfunkcji narządu ruchu u Drosophila melanogaster jako odczyt neurotoksyczności

Przedstawiamy protokół otrzymywania swoistych dla antygenu limfocytów T myszy z wykorzystaniem transdukcji...

Retrowirusowa transdukcja receptorów limfocytów T w limfocytach T myszy

Poznaj metody oceny nanotoksyczności tlenku cynku w komórkach ludzkich i u Drosophila melanogaster. Protokół obejmuje analizę typów śmierci komórkowej oraz pomiar produkcji reaktywnych form tlenu.

Badanie toksyczności nanocząstek tlenku w hodowli komórkowej i u Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów