Name: Monitorowanie kolonizacji i utrzymania kolonizacji bakteryjnej korzeni Arabidopsis thaliana w pływającym systemie hydroponicznym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-28T09:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Poznaj metodę hydroponiczną do monitorowania kolonizacji i utrzymania bakterii na korzeniach Arabidopsis thaliana. Protokół umożliwia ilościową analizę i wizualizację przestrzenną mikroorganizmów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusze badawcze dostarczone przez Departament Badań Biologicznych i Środowiskowych Energii (DOE-BER 0000217519 do E.A.S.), National Science Foundation (INSPIRE IOS-1343020 do E.A.S.). SLH był również wspierany przez National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program. Dziękujemy dr Jeffery'emu Danglowi za dostarczenie szczepów bakteryjnych i bezcennych informacji. Dziękujemy dr Andrew Kleinowi i Matthew J. Powersowi za sugestie dotyczące eksperymentów. Na koniec SLH pragnie podziękować swoim znajomym w mediach społecznościowych za przypomnienie nam, że rozpowszechnianie nauki jest przywilejem i odpowiedzialnością, zwłaszcza za pomocą kreatywnych i dostępnych środków.

UWAGA: Konfiguracja eksperymentalna jest opisana dla jasności i używana do generowania reprezentatywnych wyników zawartych w tym raporcie, ale warunki mogą być modyfikowane zgodnie z życzeniem. Wszystkie kroki należy wykonywać przy użyciu środków ochrony indywidualnej i zgodnie z zaleceniami instytucjonalnymi i federalnymi dotyczącymi bezpieczeństwa, zgodnie ze statusem BSL zastosowanych bakterii.
1. Charakterystyka bakterii
<ol>
	<li>Określ morfologię bakterii na płytce agarowej pożywki wzrostowej. Ponownie zawiesić komórki przy przybliżonej średnicy zewnętrznej600 = 0,5 i umieścić objętość 1 μl na wybranym podłożu agarowym. Dodać X-gal do płytek agarowych do końcowego stężenia 20 mg/ml, aby lepiej rozróżnić poszczególnych członków określonej społeczności bakteryjnej. Hoduj w temperaturze 24 °C lub 30 °C, aż utworzą się kolonie, a następnie zrób zdjęcia i notatki na temat morfologii kolonii.</li>
	<li>Zdefiniuj korelację między gęstością optyczną każdego szczepu bakteryjnego a liczbą CFU (jednostek tworzących kolonie) na mL16. Zawiesić bakterie w 1 ml wody na 24-dołkowej płytce do przybliżonej średnicy zewnętrznej600 = 5, wykonać dwukrotne seryjne rozcieńczenia, monitorować OD600 wszystkich rozcieńczeń i płytkować w celu określenia żywotnej CFU/ml w każdej próbce przy wielu gęstościach optycznych.</li>
	<li>Określ maksymalną tolerancję sonikacji dla każdego szczepu bakteryjnego. W tym celu należy podzielić komórki na 24-dołkową płytkę zawierającą płynne podłoże, zachowując niektóre komórki jako niesoniczną próbkę kontrolną. Używając ultrasonografu z 24-końcówkową nasadką klaksonową, zastosuj trzy rundy po 12 s sonikacji przy 40 amp z impulsami 2 s. 
	UWAGA: Zaleca się stosowanie 24-dołkowego ultrasonografu w celu ułatwienia dalszego multipleksowania próbek z zakładu przetwórczego, ale jeśli nie jest on dostępny, należy użyć ultrasonografu wyposażonego w mikrokońcówkę i wykonać sonizację każdej próbki niezależnie. Zawsze noś nauszniki o stopniu ochrony co najmniej 25 NRR.</li>
	<li>Wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenia próbek poddanych sonikacji i niesonicznych i umieścić punktowo na płytkach agarowych. Określ, czy po sonikacji następuje zmniejszenie liczby żywotnych komórek. Jeśli tak, należy użyć świeżej próbki i powtórzyć etap sonikacji, stosując skrócony całkowity czas lub amplitudę sonikacji, aż zabieg nie będzie miał wpływu na końcowy CFU/mL17.</li>
</ol>
2. Przygotowanie sadzonek Arabidopsis thaliana na plastikowej siatce
<ol>
	<li>Utwórz krążki z plastikowej siatki za pomocą standardowego dziurkacza.
	<ol>
		<li>Zbierz krążki w szklanym pojemniku z luźną pokrywą z folii aluminiowej i sterylizuj za pomocą autoklawu ustawionego na 20-minutowy cykl suchy13.</li>
		<li>Za pomocą pęsety sterylizowanej płomieniem rozprowadź około 40 wysterylizowanych krążków siatkowych w jednej warstwie na powierzchni płytki agarowej z podłożem do wzrostu roślin. Użyj 0,5 soli Murashige i Skoog (MS), zawierających 500 mg/l buforu MES [kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy] i 1,5% agaru Bacto, jako pożywkę dla wzrostu roślin, z dodatkiem 50 μg/ml benomylu w celu ograniczenia zanieczyszczenia sadzonek grzybami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj nasiona akseniczne A. thaliana zgodnie z wcześniejszym opisem17.
	<ol>
		<li>Umieść około 100–300 nasion w osobnych probówkach wirówkowych na stojaku i umieść w zamykanym szklanym lub ciężkim plastikowym pojemniku ("słoiku") w dygestorium.</li>
		<li>Zachowując ostrożność, umieść zlewkę ze 100 ml wybielacza w słoiku, dodaj 3 ml skoncentrowanego HCl do wybielacza i natychmiast zamknij słoik i pozwól, aby opary wysterylizowały nasiona przez co najmniej 4 godziny.</li>
		<li>Ostrożnie wyjmij probówki ze wysterylizowanymi nasionami spod słoika i zamknij.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść dwa nasiona na środku każdej siatki. Uszczelnić płytki taśmą chirurgiczną i inkubować przez 2–6 dni w temperaturze 4 °C w ciemności, aby zwernalizować nasiona.</li>
	<li>Aby wykiełkować i wyhodować siewki, umieść płytkę agarową do dołu w komorze wzrostu roślin na 8–10 dni w krótkich warunkach dziennych: 9 godzin światła w temperaturze 21 °C i 15 godzin ciemności w temperaturze 18 °C (Rysunek 1, krok 2).</li>
</ol>
3. Kolonizacja roślin w płynnym pożywce bakteryjnej
<ol>
	<li>Dodać 1 ml pożywki do wzrostu bakterii do każdego dołka sterylnej płytki 24-dołkowej, z wyjątkiem studzienek kontrolnych zawierających tylko pożywkę. Jako pożywkę do hodowli bakterii należy użyć bulionu Lennox Luria (10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego, 5 g NaCl).</li>
	<li>Przenieś kiełkujące sadzonki osadzone w siatce z płytek agarowych do płynu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1, krok 3a).
	<ol>
		<li>Delikatnie oderwij siatkę zawierającą dwie kiełkujące sadzonki do góry i z płytki agarowej za pomocą sterylizowanych płomieniowo kleszczy. Wybierz siatkę z sadzonkami o jednakowej wielkości i nieuszkodzonymi.</li>
		<li>Jeśli usunięcie z agaru nie jest gładkie, wyrzuć tę siatkę i posadź. Przenieś jeden pływak do każdej studzienki płynu do rozwoju bakterii, korzeniem do dołu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zaszczepij bakterie w studzienkach zawierających pływające sadzonki.
	<ol>
		<li>Zawiesić bakterie wyhodowane przez noc na płytkach agarowych do OD600 odpowiadającego 108 jtk/ml w płynie pożywki do wzrostu bakterii. Dodać 10 μl zawiesiny bakteryjnej do każdej studzienki, aby uzyskać końcowe stężenie 10-6 bakterii CFU na studzienkę.</li>
		<li>W przypadku przygotowywania mieszaniny bakterii, należy ponownie zawiesić każdą z nich do OD600 odpowiadającej 108 jtk/ml, wymieszać w równych proporcjach i dodać 10 μl końcowej mieszanki na studzienkę cieczy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapieczętuj płytkę, aby zapewnić sterylny wzrost. Nie dotykając lepkiej strony, ostrożnie dociśnij folię przepuszczającą gaz w poprzek płytki. Upewnij się, że każda studzienka została indywidualnie uszczelniona, wywierając nacisk wokół każdego z pierścieni utworzonych przez studzienki. Załóż plastikową pokrywę płyty dokładnie na płytę i folię przepuszczającą gaz (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1, krok 3b).</li>
	<li>Inkubować płytki przez 18 godzin w komorze wzrostu roślin, w takich samych warunkach, w jakich kiełkowały pierwotnie sadzonki, z wyjątkiem wytrząsarki orbitalnej ustawionej na 220 obr./min.</li>
</ol>
4. Utrzymanie kolonizacji bakteryjnej
<ol>
	<li>Aby wypłukać wszystkie pływaki (rośliny na siatce), dodaj 1 ml sterylnej wody do studzienek nowej 24-dołkowej płytki. Usuń folię przepuszczającą gaz. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś pływaki do studni z wodą (Rysunek 1, krok 4a). Płukać odpoczywając przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT) bez mieszania. 
	UWAGA: Aby określić skuteczność kolonizacji bakteryjnej korzeni, a nie ich zdolność do utrzymania kolonizacji w czasie, rośliny można poświęcić na tym etapie, przenosząc je bezpośrednio do kroku 5.1.</li>
	<li>Napełnij dołki nowej 24-dołkowej płytki 1 ml pożywki do wzrostu roślin. Przenieś jedną siatkę do każdej studzienki. Przykryć uszczelką przepuszczającą gaz i inkubować przez 72 godziny na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 220 obr./min w komorze wzrostu roślin (rysunek 1, krok 4b).</li>
	<li>Powtórzyć płukanie, jak w kroku 4.1 z pływakami po 72-godzinnym okresie inkubacji.</li>
</ol>
5. Zbieranie bakterii do liczenia żywotnych komórek
UWAGA: Liczba bakterii na korzeń siewki może być określona w dowolnym momencie inkubacji. Kolonizacja może być monitorowana od 0 h do 18 h, podczas gdy konserwacja może być monitorowana od 18 h. Rośliny przeznaczone do obrazowania mogą przejść bezpośrednio do sekcji 6.
<ol>
	<li>Usuń sadzonki z siatki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1, krok 5). Delikatnie umieść wysterylizowane płomieniem kleszcze pod liśćmi (ale po stronie liści siatki) i lekko uszczypnij łodygę. Przesuń sadzonki w górę i odsuń je od siatki, aby usunąć korzeń bez jego łamania. Jeśli korzeń pęknie, delikatnie zeskrob spód siatki, aby zebrać całą długość.</li>
	<li>Usuń bakterie z korzeni roślin. Przenieść bakterie do studzienek na 24-dołkowej płytce zawierającej 1 ml ddH20. Sonizacja próbek zgodnie z opisem w kroku 1.3. 
	UWAGA: Za pomocą mikroskopu poszukaj wszelkich pozostałych bakterii na powierzchni korzenia na sonifikowanej próbce. Jeśli bakterie pozostają, należy zwiększyć całkowity czas lub intensywność sonikacji, aż do momentu, gdy żadne bakterie nie pozostaną związane, aż do najwyższego poziomu sonikacji, który nie wpływa na liczbę żywotnych komórek, jak określono w sekcji 1.</li>
	<li>Określ ilościowo bakterie na korzeniach.
	<ol>
		<li>Wykonać seryjne 10-krotne rozcieńczenia sonikowanych próbek do rozcieńczenia 10-6 w pożywce do wzrostu bakterii. Dodać 50 μl każdego rozcieńczenia do poszczególnych płytek agarowych i rozprowadzić sterylnymi szklanymi kulkami (lub rozsiewaczem bakteryjnym). Inkubuj płytki w temperaturze optymalnej dla bakterii, aż poszczególne kolonie będą policzalne.</li>
		<li>Po odróżnieniu policz liczbę morfologii każdej kolonii (jak określono w sekcji 1) i oblicz CFU każdego gatunku bakterii na sadzonkę. Wyrzuć wszystkie próbki wykazujące zanieczyszczenie, ponieważ zanieczyszczenie podczas kolonizacji lub konserwacji może wpływać na obecność bakterii.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Zbiór nienaruszonych korzeni roślin do mikroskopii
<ol>
	<li>Za pomocą kleszczy usuń sadzonki z siatki, jak w rozdziale 5.</li>
	<li>Przenieś każdą roślinę na szkiełka mikroskopowe.
	<ol>
		<li>Umieść końcówkę korzenia na szkiełku i odciągnij od końcówki, aby ustawić pęd równo ze szkiełkiem, zapewniając wyprostowany korzeń dla najlepszego obrazowania. Dodaj kroplę wody lub sterylnego podłoża do wzrostu roślin do próbek, aby uwodnić powierzchnie między szkiełkami nakrywkowymi a szkiełkami.</li>
		<li>Umieść szklane szkiełko nakrywkowe tuż nad koroną korzenia (najwyższy obszar w ramce Rysunek 1) i poniżej liści pędów, aby uniknąć pochylenia szkiełka nakrywkowego (aby umożliwić obrazowanie korony korzenia) i delikatnie dociśnij17.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku stosowania bakterii fluorescencyjnych, należy wykonać obraz za pomocą odpowiednich filtrów wzbudzenia/emisji, aby odróżnić bakterie od siebie i od korzenia rośliny18.</li>
</ol>

<ol><li>Strange, R. N., Scott, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+disease%3A+a+threat+to+global+food+security%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Plant disease: a threat to global food security.</a> Annual Review of Phytopathology. 43, 83-116 (2005).</li>
<li>Cook, A. M., Grossenbacher, H., Hütter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cultivation+of+microbes+with+biodegradative+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Isolation and cultivation of microbes with biodegradative potential.</a> Experientia. 39 (11), 1191-1198 (1983).</li>
<li>Vacheron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+growth-promoting+rhizobacteria+and+root+system+functioning%5BTitle%5D)+AND+%22Fronteirs+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Plant growth-promoting rhizobacteria and root system functioning.</a> Fronteirs in Plant Science. 4, 356(2013).</li>
<li>Backer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+Growth-Promoting+Rhizobacteria%3A+Context%2C+Mechanisms+of+Action%2C+and+Roadmap+to+Commercialization+of+Biostimulants+for+Sustainable+Agriculture%5BTitle%5D)+AND+%22Fronteirs+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Plant Growth-Promoting Rhizobacteria: Context, Mechanisms of Action, and Roadmap to Commercialization of Biostimulants for Sustainable Agriculture.</a> Fronteirs in Plant Science. 9, 1473(2018).</li>
<li>Zamioudis, C., Pieterse, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+host+immunity+by+beneficial+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Modulation of host immunity by beneficial microbes.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (2), 139-150 (2012).</li>
<li>Kröber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+strain+Bacillus+amyloliquefaciens+FZB42+on+the+microbial+community+in+the+rhizosphere+of+lettuce+under+field+conditions+analyzed+by+whole+metagenome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Effect of the strain Bacillus amyloliquefaciens FZB42 on the microbial community in the rhizosphere of lettuce under field conditions analyzed by whole metagenome sequencing.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 252(2014).</li>
<li>Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functions+of+the+bacterial+microbiota+of+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure and functions of the bacterial microbiota of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).</li>
<li>Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+and+representative+bacterial+community+of+maize+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Simplified and representative bacterial community of maize roots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (12), E2450-E2459 (2017).</li>
<li>Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Strategies+to+Separate+Root-Associated+Microbial+Communities%3A+A+Crucial+Choice+in+Rhizobiome+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 773(2016).</li>
<li>Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+coculture+to+detect+chemically+mediated+interspecies+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions.</a> Journal of Visual Experiments. (80), e50863(2013).</li>
<li>Woodward, A. W., Bartel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+in+Bloom%3A+A+Primer+on+the+Arabidopsis+thaliana+Model+System%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Biology in Bloom: A Primer on the Arabidopsis thaliana Model System.</a> Genetics. 208 (4), 1337-1349 (2018).</li>
<li>Alatorre-Cobos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved%2C+low-cost%2C+hydroponic+system+for+growing+Arabidopsis+and+other+plant+species+under+aseptic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions.</a> BMC Plant Biology. 14, 69(2014).</li>
<li>Haney, C. H., Samuel, B. S., Bush, J., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+with+rhizosphere+bacteria+can+confer+an+adaptive+advantage+to+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Associations with rhizosphere bacteria can confer an adaptive advantage to plants.</a> Nature Plants. 1 (6), (2015).</li>
<li>Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+root-bacteria+interactions+in+a+microfluidics+setup%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).</li>
<li>Townsley, L., Yannarell, S. M., Huynh, T. N., Woodward, J. J., Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+di-AMP+Acts+as+an+Extracellular+Signal+That+Impacts%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Cyclic di-AMP Acts as an Extracellular Signal That Impacts.</a> MBio. 9 (2), (2018).</li>
<li>Beauregard, P. B., Chai, Y., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+subtilis+biofilm+induction+by+plant+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bacillus subtilis biofilm induction by plant polysaccharides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (17), E1621-E1630 (2013).</li>
<li>Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adherence+of+Bacteria+to+Plant+Surfaces+Measured+in+the+Laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory.</a> Journal of Visual Experiments. 136 (136), (2018).</li>
<li>Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+Bacillus+subtilis+biofilms+using+fluorescence+microscopy+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.</a> Journal of Visual Experiments. (60), (2012).</li>
<li>Cole, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+bacterial+plant+colonization+genes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of bacterial plant colonization genes.</a> PLoS Biology. 15 (9), e2002860(2017).</li>
<li>Lundberg, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+core+Arabidopsis+thaliana+root+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome.</a> Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).</li>
<li>Grandchamp, G. M., Caro, L., Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pirated+Siderophores+Promote+Sporulation+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pirated Siderophores Promote Sporulation in Bacillus subtilis.</a> Applied Environmental Microbiology. 83 (10), (2017).</li>
<li>Gange, A. C., Gadhave, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+growth-promoting+rhizobacteria+promote+plant+size+inequality%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Plant growth-promoting rhizobacteria promote plant size inequality.</a> Science Reports. 8 (1), 13828(2018).</li>
<li>Levy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+features+of+bacterial+adaptation+to+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genomic features of bacterial adaptation to plants.</a> Nature Genetics. 50 (1), 138-150 (2018).</li>
<li>Martínez-Hidalgo, P., Maymon, M., Pule-Meulenberg, F., Hirsch, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+root+microbiomes+for+healthier+crops+and+soils+using+beneficial%2C+environmentally+safe+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Canada+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Engineering root microbiomes for healthier crops and soils using beneficial, environmentally safe bacteria.</a> Canada Journal of Microbiology. , 1-14 (2018).</li>
<li>Niu, B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+the+Composition+Dynamics+of+a+Maize+Root-associated+Simplified+Bacterial+Community+and+Evaluation+of+Its+Biological+Control+Effect%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protocol%22%5BJournal%5D)">Quantification of the Composition Dynamics of a Maize Root-associated Simplified Bacterial Community and Evaluation of Its Biological Control Effect.</a> Bio Protocol. 8 (12), (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Rośliny we wszystkich środowiskach wchodzą w interakcje z tysiącami, a nawet milionami różnych bakterii i grzybów 5,7. Interakcje te mogą zarówno negatywnie, jak i pozytywnie wpływać na zdrowie roślin, potencjalnie wpływając na plony i produkcję żywności. Ostatnie prace sugerują również, że zmienna kolonizacja upraw przez PGPB może odpowiadać za nieprzewidywalną wielkość roślin i plony w próbach polowych22. Zrozumienie mechanizmów stojącyc...

Niszczenie upraw przez choroby bakteryjne i grzybicze powoduje obniżenie produkcji żywności i może poważnie zakłócić globalną stabilność1. Opierając się na odkryciu, że mikroorganizmy w glebach tłumiących są odpowiedzialne za poprawę zdrowia roślin2, naukowcy zapytali, czy mikrobiom roślinny może być wykorzystany do wspierania wzrostu roślin poprzez modyfikację obecności i liczebności określonych gatunków bakterii3. Bakterie, które pomagają we wzroście lub rozwoju roślin, są zbiorczo określane jako bakterie wspomagające wzrost roślin (PGPB). Ostatnio badania przesunęły się z prostej identyfikacji potencjalnego PGPB na zrozumienie, w jaki sposób interakcje międzykrólestwowe w glebie, wokół korzeni lub w ryzosferze (obszar bezpośrednio otaczający i obejmujący powierzchnię korzenia) mogą wpływać na aktywność PGPB4.
Kolonizacja ryzosfery przez PGPB może poprawić zdrowie lub rozwój roślin żywicielskich w odpowiedzi na różne czynniki stresogenne w stosunku do roślin nieskolonizowanych5. Jednak wyniki są często bardziej zmienne w rodzimych warunkach glebowych w porównaniu z tymi obserwowanymi w ściśle kontrolowanych warunkach szklarniowych i laboratoryjnych6. Jedną z hipotez dotyczących tej różnicy jest to, że wzrost lub zachowanie PGPB może być hamowane przez rodzime bakterie glebowe lub grzyby na polach7,8. Korzystne działanie bakterii ryzosferowych na ogół zależy od zdolności bakterii do 1) lokalizowania i przemieszczania się w kierunku korzenia, 2) kolonizacji korzenia poprzez tworzenie biofilmu oraz 3) interakcji z rośliną żywicielską lub patogenami poprzez produkcję metabolitów drobnocząsteczkowych7,9. Na każde z tych zachowań kolonizacyjnych może mieć wpływ obecność i aktywność sąsiednich drobnoustrojów10.
Zaprojektowaliśmy system do ilościowego określania i wizualizacji tych różnych etapów kolonizacji bakteryjnej ryzosfery (Rysunek 1). Takie podejście ułatwi badania mające na celu zbadanie, dlaczego czasami nie obserwuje się długotrwałego utrzymania PGPB po przeniesieniu roślin do nowego środowiska, na przykład podczas sadzenia wstępnie zaszczepionych sadzonek. Arabidopsis thaliana zostały wybrane jako model roślinny ze względu na jego szerokie zastosowanie w badaniach laboratoryjnych, a także obszerne dostępne dane na temat jego interakcji mikrobiologicznych11. W systemie występują trzy etapy: 1) wzrost A. thaliana, 2) kolonizacja bakteryjna i 3) utrzymanie bakteryjne (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1). Ponieważ A. thaliana jest rośliną lądową, ważne było, aby upewnić się, że nie cierpi ona na nadmierny stres wodny w systemie hydroponicznym12. Zainspirowane metodami stosowanymi przez Haney et al.13, sadzonki są hodowane na plastikowej siatce, aby oddzielić pęd od płynnego podłoża wzrostowego. Wydaje się, że ten system nie zagraża zdrowiu i rozwojowi gospodarza rośliny, a także poprawia wzrost A. thaliana w liquid11. Gdy pęd rośliny unosi się nad powierzchnią, korzenie są w pełni narażone na kolonizację przez bakterie zaszczepione w płynnym pożywce bakteryjnej. Pozwala to na zbadanie interesujących bakterii pod kątem kolonizacji składników odżywczych, które najbardziej sprzyjają wzrostowi, a następnie zmianę warunków, aby umożliwić roślinie dalszy wzrost w pożywce zaprojektowanej do wspierania jej wzrostu. Oba etapy obejmują równomierne potrząsanie, aby zapobiec niedotlenieniu root13. Bakterie można wizualizować lub określać ilościowo na podstawie korzeni roślin po przeniesieniu z pożywki kolonizacyjnej lub pożywki pielęgnacyjnej. Ten system hydroponiczny jest bardzo elastyczny, co pozwala na łatwą zmianę warunków eksperymentalnych i zastosowanych naprężeń w zależności od zainteresowań badaczy.
Ta opisana metoda jest ważna w kontekście większej ilości literatury na temat interakcji roślina-mikroorganizm, ponieważ dostarcza solidny system do badania tych interakcji na powierzchni korzenia, a jednocześnie można go dostosować do preferencji wzrostu różnych bakterii. Laboratoria biologii roślin często przeprowadzają eksperymenty kolonizacji mikroorganizmów roślinnych na stałym agarze pozwalającym jedynie na płaski ruch (jeśli w ogóle) bakterii, a jednocześnie wymagając potencjalnie destrukcyjnej manipulacji roślinami podczas późniejszego przenoszenia. W przeciwieństwie do tego, laboratoria mikrobiologiczne często priorytetowo traktowały zdrowie bakterii w swoich eksperymentach, ze szkodą dla roślin14,15. Te różne priorytety laboratoriów zajmujących się roślinami i mikrobiologią historycznie utrudniały porównywanie wyników między tymi grupami, ponieważ każda z nich zazwyczaj optymalizuje warunki eksperymentalne, aby zoptymalizować swój organizm będący przedmiotem zainteresowania15. Opisany tutaj system wzrostu roślin z pływającą siatką zapobiega całkowitemu zanurzeniu roślin, co jest zauważalną zaletą w porównaniu z poprzednimi badaniami zorientowanymi na mikrobiologię, jednocześnie tymczasowo optymalizując wzrost i przeżywalność bakterii do ułatwić kolonizację. Tak więc test, który tutaj prezentujemy, może rozwiać obawy zarówno biologów roślin (dotyczące nadmiernego nawodnienia i dotykowej manipulacji rośliną), spełniając jednocześnie kryteria mikrobiologów (dopuszczając różne warunki rozwoju bakterii i interakcje wielu gatunków)7. Protokół ten został zaprojektowany tak, aby można go było dostosować do użytku z różnymi bakteriami, roślinami i warunkami środowiskowymi.

<table><tbody><tr><td>Wymagane materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówek eppendorf</td><td>dowolne</td> płytki <td>24-dołkowe</td><td></td></tr><tr><td></td><td>bez razu BD Falcon</td><td>1801343</td><td></td></tr><tr><td>Aeraseal</td><td>Excel Scientific</td><td>BE255A2</td><td></td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td>wszelkie</td> bakterie <td>N/A</td><td></td></tr> będące przedmiotem <tr><td>zainteresowania</td><td>Dowolna</td><td>N/A</td><td>Przechowywana w - 80? C w 40% glicerolu preferowany</td></tr><tr><td>BactoAgar</td><td>BD</td><td>2306428; REF 214010</td><td></td></tr><tr><td>wybielacz</td><td>dowolny</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Conviron</td><td>dowolny</td><td>N/A</td><td>Krótki dzień Cykle jasne-ciemne: 460-600 i mikro; Krety/M&SUP2;/s ustawione na 9/15 godzin jasne/ciemne na 18/21? C, z wewnętrznym gniazdkiem zasilania</td></tr><tr><td>Eksykator Słoik: szklany lub ciężki plastik</td><td>dowolny</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>dowolny</td> Nie <td>dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Płomień</td><td>dowolny</td> Nie <td>dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>dowolna</td><td>Nie</td><td></td></tr> dotyczy <tr><td>Inkubator</td><td>dowolny</td><td>Nie dotyczy</td><td>W temperaturze optymalnej dla rozwoju określonych bakterii</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>dowolny</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Lennox LB Bulion</td><td>RPI</td><td>L24066-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>dowolna</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetery</td><td>dowolne</td><td>N/D</td><td>Objętości 5 i mikro; L do 1000 i mikro; L</td></tr><tr><td>Mikroskop (najlepiej fluorescencyjny)</td> <td>dowolny</td><td>Nie dotyczy</td><td>Może być lekki, jeśli najlepsza definicja nie jest ważna</td></tr><tr><td>Sole MS + MES</td><td>RPI</td><td>M70300-50.0</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>dowolna</td><td>Nie</td> dotyczy <td>Może pracować z prędkością 220 obr./min przez co najmniej 96 godzin</td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>dowolna</td><td>Nie dotyczy</td><td>Całkowita objętość 50 ml</td></tr><tr><td>Zbiorniki</td><td>dowolne</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>dowolny</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Standardowy dziurkacz</td><td>dowolny</td><td>Nie dotyczy</td><td>Średnica stempla około 7 mm</td></tr><tr><td>Sterylna woda</td><td>dowolna</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Taśma chirurgiczna</td><td>3M</td><td>MMM1538-1</td><td></td></tr><tr><td>Siatka teflonowa</td><td>McMaster-Carr</td><td>1100t41</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonograf</td><td>dowolny</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>dowolny</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>GoldBio</td><td>x4281c</td><td>inni dostępni dostawcy</td></tr> <tr><td>< mocny> Sugerowane materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 Prong Ultradźwiękowy przystawka</td><td>dowolna</td><td>Nie dotyczy</td><td>Do sonizacji wielu próbek jednocześnie. Można to zrobić indywidualnie</td></tr>: <tr><td>Alumaseal II</td><td>Excel Scientific</td><td>FE124F</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki szklane</td><td>dowolne:</td><td>N/A</td><td></td></tr>, <tr><td>Multipetter/Repetter</td><td>, dowolna</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne płytki 96-dołkowe,</td><td>dowolna</td><td>N/A</td><td>Do rozcieńczeń seryjnych. Może być zastąpiony przez probówki eppendorfa</td></tr><tr><td>Biological Materials Used</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>emArabidopsis thaliana</td><td>nasiona dowolne</td><td>Nie dotyczy</td><td>Polecamy Centrum Zasobów Biologicznych Arabidopsis dla zapasów nasion<</td></tr><tr><td>em>Arthrobacter nicotinovorans</td><td></td><td></td><td>Levy, et al. 2018</td></tr><tr><td>Curtobacterium oceanosedimentum</td><td></td><td></td><td>Levy, et al. 2018</td></tr><tr><td>Microbacterium oleivorans</td><td></td><td></td><td>Levy, et al. 2018</td></tr><tr><td>Pseudomonas simiae WCS417r</td><td></td><td></td><td>Opublikowano w podobnym systemie w: Haney, et al. 2015. Zastosowany szczep opracowany w Cole, et al. 2017</td></tr></tbody></table>

monitorowanie kolonizacji i utrzymania kolonizacji bakteryjnej korzeni arabidopsis thaliana w pływającym systemie hydroponicznym

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Bakterie tworzą złożone mikrobiomy ryzosferyczne kształtowane przez oddziałujące ze sobą mikroby, większe organizmy i środowisko abiotyczne. W warunkach laboratoryjnych kolonizacja ryzosfery przez bakterie wspomagające wzrost roślin (PGPB) może poprawić zdrowie lub rozwój roślin żywicielskich w stosunku do roślin nieskolonizowanych. Jednak w warunkach polowych zabiegi bakteryjne za pomocą PGPB często nie przynoszą znaczących korzyści dla upraw. Jednym z wyjaśnień jest to, że może to być spowodowane utratą PGPB podczas interakcji z endogennymi mikroorganizmami glebowymi przez cały okres życia rośliny. Możliwość ta była trudna do potwierdzenia, ponieważ większość badań koncentruje się na początkowej kolonizacji, a nie utrzymaniu PGPB w społecznościach ryzosfery. Postawiono tutaj hipotezę, że składanie, współistnienie i utrzymywanie społeczności bakteryjnych jest kształtowane przez deterministyczne cechy mikrośrodowiska ryzosfery i że te interakcje mogą wpływać na przeżywalność PGPB w warunkach rodzimych. Aby zbadać te zachowania, zoptymalizowano hydroponiczny test wzrostu roślin przy użyciu Arabidopsis thaliana w celu ilościowego określenia i wizualizacji przestrzennego rozmieszczenia bakterii podczas początkowej kolonizacji korzeni roślin i po przeniesieniu do różnych środowisk wzrostu. Odtwarzalność i użyteczność tego systemu są następnie weryfikowane za pomocą dobrze przebadanego PGPB Pseudomonas simiae. Aby zbadać, w jaki sposób obecność wielu gatunków bakterii może wpływać na dynamikę kolonizacji i utrzymania korzenia rośliny, skonstruowano modelową społeczność z trzech szczepów bakteryjnych (Arthrobacter, Curtobacterium i Microbacterium) pierwotnie wyizolowanych z ryzosfery A. thaliana. Wykazano, że obecność tych różnorodnych gatunków bakterii można zmierzyć za pomocą tego hydroponicznego testu konserwacji roślin, który stanowi alternatywę dla badań społeczności bakteryjnych opartych na sekwencjonowaniu. Przyszłe badania z wykorzystaniem tego systemu mogą poprawić zrozumienie zachowania bakterii w wielogatunkowych mikrobiomach roślinnych w czasie i w zmieniających się warunkach środowiskowych.

Dobrze scharakteryzowana PGPB P. simiae WCS417r jest znana z kolonizacji korzeni A. thaliana w uprawie hydroponicznej. Tę naturalnie fluorescencyjną bakterię można łatwo zwizualizować za pomocą mikroskopii na korzeniach siewek po kolonizacji (Rysunek 2). Chociaż możliwe jest obrazowanie pełnej długości korzeni tych siewek A. thaliana (długość 4–6 mm), wykonanie tego dla wielu roślin zajęłoby zbyt dużo czasu. Ponieważ większość różni...

Tutaj opisujemy hydroponiczny test wzrostu roślin, aby określić ilościowo obecność gatunków i zobrazować przestrzenne rozmieszczenie bakterii podczas początkowej kolonizacji korzeni roślin i po ich przeniesieniu do różnych środowisk wzrostu.

Monitorowanie kolonizacji i utrzymania kolonizacji bakteryjnej korzeni Arabidopsis thaliana w pływającym systemie hydroponicznym

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

Większość eksperymentów bada interakcje między roślinami a mikroorganizmami, koncentrując się na kolonizacji, ale nasz protokół ma na celu przyjrzenie się zarówno kolonizacji, jak i utrzymaniu bakterii na korzeniu. Możemy zmienić eksperyment, aby dopasować go do różnych bakterii i roślin, a nawet możemy przetestować wiele bakterii w każdej 24-dołkowej płytce. Aby rozpocząć, użyj standardowego dziurkacza, aby utworzyć krążki z plastikowej siatki.Zbierz krążki do szklanego pojemnika i luźno przykryj. Sterylizuj w autoklawie ustawionym na 20-minutowy cykl suchy. Użyj pęsety sterylizowanej płomieniem, aby rozprowadzić około 40 wysterylizowanych krążków siatkowych w jednej warstwie na powierzchni wcześniej przygotowanej płytki agarowej pożywki do wzrostu roślin.Umieść dwa wcześniej wysterylizowane nasiona na środku każdej siatki. Uszczelnij płytkę taśmą chirurgiczną i inkubuj przez dwa do sześciu dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności, aby zwernalizować nasiona. Następnie umieść płytkę agarową do dołu w komorze wzrostu roślin na osiem do 10 dni w krótkich warunkach dnia, czyli dziewięć godzin światła w temperaturze 21 stopni Celsjusza i 15 godzin ciemności w temperaturze 18 stopni Celsjusza, aby wykiełkować i wyhodować sadzonki.Dodaj jeden mililitr pożywki bakteryjnej do każdego dołka sterylnej 24-dołkowej płytki. Aby przenieść kiełkujące sadzonki osadzone w siatce, użyj sterylizowanych płomieniowo kleszczy, aby delikatnie oderwać siatkę zawierającą dwie kiełkujące, jednakowej wielkości i nieuszkodzone sadzonki w górę i z płytki agarowej. Przenieś jeden pływak z sadzonkami do każdej studzienki płynu do wzrostu bakterii, korzeniem do dołu.Następnie ponownie zawieś bakterie wyhodowane przez noc na płytkach agarowych w płynnym podłożu do wzrostu bakterii. Dodaj 10 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej do każdej studzienki, z wyjątkiem studzienek kontrolnych zawierających tylko pożywkę, aby uzyskać końcowe stężenie miliona jednostek tworzących kolonie bakterii na studzienkę. Aby uszczelnić płytkę w celu sterylnego wzrostu, ostrożnie dociśnij folię przepuszczającą gaz w poprzek płytki, nie dotykając lepkiej strony.Zastosuj nacisk wokół każdego z pierścieni wykonanych przez studzienki, aby upewnić się, że każda studzienka została indywidualnie uszczelniona. Następnie zamknij płytkę plastikową pokrywką ciasno na folii przepuszczającej gaz. Umieść płytkę w komorze wzrostu roślin na orbitalnej wytrząsarce płytkowej ustawionej na 220 obr./min i inkubuj przez 18 godzin w tych samych warunkach, w jakich kiełkowały sadzonki.Aby przepłukać wszystkie pływaki roślinami, dodaj jeden mililitr sterylnej wody do każdej studzienki nowej 24-dołkowej płytki. Usuń przepuszczającą gaz folię z płytki z roślinami i za pomocą sterylnych kleszczy przenieś pływaki do studni z wodą i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej bez mieszania. Następnie napełnij każdą studzienkę nowej 24-dołkowej płytki jednym mililitrem pożywki do wzrostu roślin.Przenieś jedną siatkę do każdej studzienki i przykryj uszczelką przepuszczającą gaz. Inkubować przez 72 godziny na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 220 obr./min w komorze wzrostu roślin. Po inkubacji opłucz rośliny jak poprzednio.Po spłukaniu wyjmij sadzonki z siatki, delikatnie umieszczając sterylizowane płomieniowo kleszcze poniżej liści po stronie liści siatki. Lekko uszczypnij łodygę i porusz sadzonkami w górę i z dala od siatki, aby usunąć korzeń bez jego łamania. Aby usunąć bakterie z korzeni roślin, przenieś sadzonki z każdej siatki do indywidualnych dołków 24-dołkowej płytki sonizacyjnej zawierającej jeden mililitr podwójnie destylowanej wody.Poddać sonifikacji wszystkich próbek znajdujących się na płytce jednocześnie za pomocą wielopłaszczyznowego sonikatora, jak opisano w manuskrypcie. Aby określić ilościowo bakterie, należy wykonać seryjne 10-krotne rozcieńczenia sonikowanych próbek w pożywce dla bakterii. Rozprowadzić za pomocą sterylnych szklanych kulek i inkubować w temperaturze optymalnej dla bakterii, aż poszczególne kolonie będą policzalne.Aby zebrać nienaruszony korzeń rośliny, użyj kleszczy, aby usunąć sadzonki z siatki. Następnie przenieś każdą roślinę na szkiełko mikroskopowe, umieszczając końcówkę korzenia na szkiełku i odciągając ją od końcówki, aby ustawić pęd równo ze szkiełkiem, zapewniając wyprostowany korzeń dla najlepszego obrazowania. Do każdej próbki dodać kroplę wody lub sterylnego podłoża do wzrostu roślin, aby uwodnić powierzchnie między szkiełkami nakrywkowymi a szkiełkami.Umieść szklane szkiełko nakrywkowe tuż nad koroną korzenia i poniżej liści pędów, aby uniknąć pochylenia szkiełka nakrywkowego, i delikatnie dociśnij. Następnie zobrazuj bakterie za pomocą odpowiednich filtrów wzbudzenia/emisji, aby odróżnić bakterie od siebie i od korzenia rośliny. Pseudomonas simiae, naturalnie fluorescencyjna bakteria, skolonizowała korzenie Arabidopsis thaliana i utrzymywała się na korzeniu po przeniesieniu na podłoże roślinne.Korona, środek długości i wierzchołek korzenia wykazują fluorescencję spowodowaną kolonizacją Pseudomonas simiae. Negatywna kontrola bez bakterii nie wykazała kolonizacji. Gdy Pseudomonas simiae na korzeniach Arabidopsis thaliana oznaczono ilościowo po 18 godzinach kolonizacji lub 72 godzinach utrzymania, całkowita liczba jednostek tworzących kolonie na sadzonkę w dowolnym punkcie czasowym wykazała dobrą odtwarzalność w replikach biologicznych wykonanych w różnych dniach.Nastąpił wzrost liczby jednostek tworzących kolonie na sadzonkę po 72 godzinach w pożywce pielęgnacyjnej, w porównaniu z liczbami obserwowanymi w 18-godzinnym punkcie czasowym po kolonizacji, co wskazuje, że aktywny wzrost skolonizowanych bakterii na korzeniu rośliny nastąpił w fazie konserwacji. Trzy gatunki bakterii wyizolowanych z Arabidopsis thaliana wyhodowanych w naturalnej glebie w warunkach laboratoryjnych wykorzystano do monitorowania asocjacji wielu gatunków na korzeniach roślin. Były one wyraźnie zróżnicowane na pożywkach zawierających X-gal ze względu na różnice w morfologii i kolorze kolonii, co pozwoliło na policzenie jednostek tworzących kolonie na sadzonkę każdego gatunku bez selekcji antybiotyków, nawet w kokulturze wielogatunkowej.Wszystkie te trzy gatunki bakterii zostały skolonizowane i utrzymywane na korzeniu, czy to pojedynczo, czy w kokulturze bakteryjnej. Każdy gatunek wykazywał trendy, które były podobne w różnych biologicznych i technicznych powtórzeniach, co pokazuje, że protokół ten może być używany do pomiaru zarówno względnych, jak i całkowitych jednostek tworzących kolonie na korzeń każdego gatunku. W przypadku uprawy pojedynczo żaden pojedynczy gatunek nie wykazał znacznego wzrostu liczebności w fazie utrzymania, ale ogólna liczba jednostek tworzących kolonie na korzeń połączonej społeczności wzrosła w kokulturach, co wskazuje, że bakterie te nie zabraniają kolonizacji innych szczepów.Najtrudniejsze kroki to te, które wymagają usunięcia nienaruszonych roślin z krążków siatki. Bycie cierpliwym i delikatnym sprawi, że będzie to możliwe. Jeśli komórki bakteryjne są fluorescencyjne, próbki można sortować za pomocą cytometrii przepływowej w celu określenia względnej liczby komórek.

monitoring-bacterial-colonization-maintenance-on-arabidopsis-thaliana

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Nathoo, N., et al. Hydroponiczny system kouprawy do jednoczesnej i systematycznej analizy interakcji molekularnych roślina/mikroorganizm oraz sygnalizacji. J. Vis. Exp. (2017).Ten film przedstawia hydroponiczny system wspólnej uprawy do badania interakcji między roślinami a bakteriami w sterylnych warunkach. Sadzonki roślin przenosi się do sterylnego, kwaśnego podłoża wzrostowego, inkubuje i sprawdza pod kątem zanieczyszczenia przed zaszczepieniem Agrobacterium. Aktywowane bakterie...

System wspólnej uprawy do badania reakcji molekularnych gospodarzy roślinnych i bakterii oddziałujących na siebie

Źródło: Harris, S. L. i in. Monitorowanie kolonizacji bakteryjnej i utrzymania korzeni Arabidopsis thaliana w pływającym systemie hydroponicznym. J. Vis. Exp. (2019)Ten film prezentuje protokół monitorowania kolonizacji bakterii związanych z korzeniami na sadzonkach Arabidopsis thaliana uprawianych w systemie bezglebowym. Po kolonizacji bakterie są usuwane przez sonikację, następnie rozcieńczane, pokładane i inkubowane, tworząc kolonie odzwierciedlające przywiązanie i żywotność bakterii.

Monitorowanie kolonizacji bakteryjnej korzeni Arabidopsis thaliana w bezglebowym systemie

Kwantyfikacja wzrostu patogenów jest potężnym narzędziem do charakteryzowania różnych odpowiedzi immunologicznych Arabidopsis thaliana (dalej: Arabidopsis). Opisana tutaj metoda przedstawia zoptymalizowany test infiltracji strzykawki w celu ilościowego określenia Pseudomonas syringae pv. Maculicola powiedział: Wzrost ES4326 w dorosłych liściach Arabidopsis.

Test infiltracji bakteryjnych liści w celu dokładnej charakterystyki reakcji obronnych roślin przy użyciu patosystemu Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae

Opisany system kouprawy hydroponicznej wspiera nienaruszone rośliny za pomocą metalowych siatek i współhoduje je z bakteriami. Tkanki roślinne, bakterie i wydzielane cząsteczki mogą być następnie oddzielnie zbierane do dalszych analiz, co jednocześnie pozwala na zbadanie odpowiedzi molekularnych zarówno gospodarzy roślinnych, jak i oddziałujących na siebie mikroorganizmów lub mikrobiomów.

Hydroponiczny system wspólnej uprawy do jednoczesnej i systematycznej analizy interakcji molekularnych między roślinami a mikroorganizmami oraz sygnalizacji

Ten artykuł pokazuje, jak hodować siewki Arabidopsis thaliana w dwuwarstwowej platformie mikroprzepływowej, która ogranicza główny korzeń i włośniki do jednej płaszczyzny optycznej. Platforma ta może być wykorzystywana do obrazowania optycznego w czasie rzeczywistym drobnej morfologii korzeni, a także do obrazowania w wysokiej rozdzielczości za pomocą innych środków.

Obrazowanie morfologii włośnika siewek rzodkiewnika w dwuwarstwowej platformie mikroprzepływowej

Prosty, wszechstronny i tani system hydroponiczny in vitro został pomyślnie zoptymalizowany, umożliwiając eksperymenty na dużą skalę w sterylnych warunkach. System ten ułatwia stosowanie substancji chemicznych w roztworze i ich efektywne wchłanianie przez korzenie do badań molekularnych, biochemicznych i fizjologicznych.

Elastyczny, niedrogi system hydroponiczny do oceny reakcji roślin na małe cząsteczki w sterylnych warunkach

Używamy prostych narzędzi laboratoryjnych do badania architektury systemu korzeniowego (RSA) Arabidopsis i Medicago. Sadzonki są uprawiane hydroponicznie na siatce i rozprowadzane za pomocą pędzla artystycznego, aby odsłonić RSA. Obrazy są wykonywane za pomocą skanowania lub kamery o wysokiej rozdzielczości, a następnie analizowane za pomocą ImageJ w celu zmapowania cech.

Prosty protokół mapowania cech architektury systemu korzeniowego roślin

Przedstawiamy protokół dla opartego na szkle, półhydroponicznego systemu eksperymentalnego, wspierającego wzrost różnych filogenetycznie odrębnych roślin z mikrobami lub bez. System jest kompatybilny z różnymi podłożami wzrostowymi i umożliwia nieniszczące pobieranie próbek wysięku korzeniowego do dalszej analizy.

Wszechstronny system szklanych słoików do półhydroponicznego profilowania wysięku korzeniowego

Kolonizacja ryzobakterii wspomagających wzrost roślin (PGPR) w ryzosferze jest niezbędna dla jej efektu stymulującego wzrost. Konieczne jest ujednolicenie metody wykrywania kolonizacji ryzosfery bakteryjnej. W tym miejscu opisujemy powtarzalną metodę ilościowego określania kolonizacji bakteryjnej na powierzchni korzenia.

Pomiar kolonizacji bakteryjnej korzeni Arabidopsis thaliana w warunkach hydroponicznych

Aby zbadać wzrost guza oraz mikrośrodowisko nowotworowe in vivo, zastosowaliśmy syngeniczny i ortotopowy model raka jajnika u immunokompetentnych myszy. Przetransdukowaliśmy linię komórkową nowotworu mysiego (MOV1) białkiem fluorescencyjnym Katushka (MOV1KAT), a w niniejszej pracy przedstawiamy sposób jej ortotopowej implantacji do jajnika oraz obrazowanie in vivo.

Ortotopowy model surowiczego raka jajnika u immunokompetentnych myszy do obrazowania guzów in vivo i monitorowania odpowiedzi immunologicznych guza

Poznaj metodę hydroponiczną do monitorowania kolonizacji i utrzymania bakterii na korzeniach Arabidopsis thaliana. Protokół umożliwia ilościową analizę i wizualizację przestrzenną mikroorganizmów.

Monitorowanie kolonizacji i utrzymania kolonizacji bakteryjnej korzeni Arabidopsis thaliana w pływającym systemie hydroponicznym (Wideo) | JoVE Journal

Monitorowanie kolonizacji i utrzymania kolonizacji bakteryjnej korzeni Arabidopsis thaliana w pływającym systemie hydroponicznym

Przeglądaj więcej filmów