Ocena lokalizacji jądra soczewki danio pręgowanego i integralności szwów

Nasze protokoły stanowią punkt wyjścia do badań funkcjonalnych nad rozwojem i fizjologią soczewek oraz do odwrotnych genetycznych badań przesiewowych fenotypów soczewek u danio pręgowanego. Nasze protokoły łączą analizy in vitro i in vivo morfologii błony soczewki danio pręgowanego i zapewniają nową i prostą metodę ilościowego określania rozwoju optyki soczewek danio pręgowanego. Analiza morfologii i optyki soczewki danio pręgowanego prowadzi do wglądu w mechanizmy kontrolujące rozwój soczewki, normalną fizjologię i patofizjologię.

Te spostrzeżenia mogą z kolei prowadzić do zdolności do opóźniania lub zapobiegania zaćmie. Nie stwierdzono żadnych doniesień o asymetrycznie zlokalizowanych jądrach soczewek u gatunków innych niż danio pręgowany. Identyfikacja szwów soczewki ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej orientacji soczewki w celu pomiaru lokalizacji jądra.

Po potwierdzeniu wystarczającego uspokojenia Trikainą, użyj nożyczek do mikrodysekcji, aby natychmiast wyciąć oba oczy dorosłego lub larwalnego danio pręgowanego i umieść oba oczy na 35-milimetrowej, wykonanej na zamówienie szalce Petriego z silikonową formą do preparacji wypełnioną PBS. Aby pobrać soczewkę od dorosłego danio pręgowanego, umieść oko tylną stroną do góry i włóż kleszcze pod kątem mniejszym niż 45 stopni przez tarczę nerwu wzrokowego. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby wykonać dwa lub trzy promieniste nacięcia przez siatkówkę i twardówkę od tarczy nerwu wzrokowego do strefy rzęskowej w unieruchomionym oku i odkleić siatkówkę i twardówkę jak płatki kwiatów.

Odwróć oko rogówką do góry i użyj płaskiej strony nożyczek, aby pośrednio unieruchomić soczewkę poprzez manipulację twardówką i rogówką za pomocą kleszczy, aby odciągnąć siatkówkę i przyczepione tkanki, a następnie ostrożnie odciąć nadmiar tkanki z soczewki. W celu pobrania soczewek larw danio pręgowanego umieść tylną stronę oka larwy na płaskiej części silikonowego naczynia PBS i użyj zaostrzonej igły wolframowej, aby wykonać promieniste nacięcia przez siatkówkę i twardówkę, jednocześnie unieruchamiając oko inną igłą lub kleszczami, a następnie delikatnie zgarnij soczewkę z dysocjacyjnego oka stroną wykonanej na zamówienie igły z drutu wolframowego i ostrożnie odciągnij przyczepioną tkankę. Aby zmierzyć lokalizację jądra soczewki osi przednio-tylnej, należy ustawić świeżo wycięte soczewki osiowo w PBS w 35-milimetrowej czaszy ze szklanym dnem ze szklanym dnem z biegunami i szwami zorientowanymi równolegle do płaszczyzny ostrości.

Aby zidentyfikować jądro soczewki, poszukaj różnicy we współczynniku załamania światła, który zwykle występuje na styku kory soczewki i jądra soczewki. Jeśli szwy soczewki nie są widoczne, lekkie lizanie kleszczami do torebki soczewki odsłania szwy i jądro soczewki, pomagając zorientować soczewkę do pomiaru. Umieść czaszę na stoliku mikroskopu preparacyjnego wyposażonego w kamerę i zobrazuj soczewki z jądrem soczewki w ostrości w świetle jasnego pola lub z interferencyjną optyką kontrastową z różnicowymi zakłóceniami.

Zobrazuj mikrometr w tym samym powiększeniu w celu kalibracji i kliknij przycisk Live View (Podgląd na żywo). Kliknij przycisk Migawka, aby uzyskać obraz i zapisać go jako plik TIFF. Aby skalibrować uzyskane obrazy soczewek, w odpowiednim oprogramowaniu do przetwarzania obrazu wybierz narzędzie do linii prostej i narysuj linię o znanej długości na obrazie mikrometrycznym.

Kliknij przycisk Analizuj i ustaw skalę i wprowadź znaną odległość i jednostki, a następnie wybierz opcję Kalibracja globalna i kliknij OK.To zmierz odległość od środka jądra soczewki do bieguna przedniego, określ położenie szwu soczewki i użyj narzędzia Linia prosta, aby narysować linię w poprzek obrazowanego środka jądra soczewki w orientacji osiowej. Środek tej linii jest środkiem jądra soczewki. Narysuj kolejną linię od tego punktu do przedniego bieguna soczewki i wybierz opcję Zmierz w menu Analizuj, aby zmierzyć odległość.

Narysuj kolejną linię od bieguna przedniego do bieguna tylnego i zmierz tę odległość jako średnicę soczewki, a następnie skopiuj te długości z okna Wyniki do arkusza kalkulacyjnego i oblicz znormalizowaną lokalizację jądra soczewki w stosunku do promienia soczewki. Po trzech dniach od zapłodnienia na przednim biegunie tworzą się szwy przednie, a uderzająca zbieżność komórek jest wyraźnie uwidoczniona przez barwienie falloidyną błon komórkowych o wąskich włóknach w utrwalonych zarodkach. Silniejsze znakowanie komórek szerokowłóknistych w transgenicznym mApple zlokalizowanym w błonie soczewki umożliwia wizualizację na żywo subdomen błony, ale brakuje konwergencji szwów.

Szwy tylne można uwidocznić zarówno in vitro, jak i in vivo po trzech dniach od zapłodnienia. W płaszczyźnie równikowej falloidyna silnie znakuje zewnętrzne komórki włókien korowych, odsłaniając spłaszczony sześciokątny kształt. Faloidyna jest wykluczona ze zbitego jądra soczewki, a soczewka typu dzikiego i zmutowana wygląda nie do odróżnienia.

Silne znakowanie komórek szerokowłóknistych w transgenicznych mozaikach mApple zlokalizowanych w błonie soczewkowej ujawnia zakłócenia w objętości komórek w zmutowanej soczewce. Ponieważ ekspresja transgenu nie jest ograniczona przepuszczalnością, niektóre mozaiki ujawniają znakowanie jądra soczewki. U zwierząt typu dzikiego jądro soczewki zaczyna się bliżej przedniego bieguna soczewki we wczesnych stadiach rozwoju, zanim scentralizuje się w wieku dorosłym.

Ekspresja białek oznaczonych na zielono w transgenicznym gospodarzu, w którym błony komórkowe fluoryzują na czerwono, umożliwia jednoczesną lokalizację białek, a także ocenę morfologii komórek włóknistych in vivo. Danio pręgowany szczególnie dobrze nadaje się do badań in vivo. Korzystając z opisanych tu narzędzi, możemy badać mechanizmy działania soczewek, w dużej mierze badane in vitro, w systemie in vivo.