Name: Ocena lokalizacji jądra soczewki danio pręgowanego i integralności szwów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Poznaj metody oceny morfologii soczewki i lokalizacji jądra u danio pręgowanego. Techniki mikrochirurgiczne i obrazowania in vitro oraz in vivo umożliwiają badanie fizjologii soczewki i mechanizmów rozwoju katarakty.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować naszemu źródłu finansowania: NIH R01 EY05661 J.E.H, Ines Gehring za pomoc w tworzeniu podwójnych mutantów aqp0a/b i hodowli danio pręgowanego, Dr Danielowi Dranowowi za dyskusje prowadzące do powstania transgeników, Dr Bruce'owi Blumbergowi i laboratoriom dr Kena Cho za użycie ich mikroskopów preparacyjnych, oraz dr Megan Smith za pomoc w analizie statystycznej.

Protokoły dotyczące zwierząt wykorzystane w niniejszym badaniu są zgodne z Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i nad widzeniem i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Kalifornijskiego w Irvine.

1. Hodowla i eutanazja danio pręgowanego
<ol>
	<li>Hodować i utrzymywać danio pręgowane (szczep AB) w standardowych warunkach laboratoryjnych12. Zarodki hodować w pożywce dla zarodków (EM)12. Do EM dodać 0,003% PTU od 20-24 h po zapłodnieniu (przed stadium prim-5), aby zapobiec powstawaniu pigmentu w zarodkach12 wykorzystywanych do obrazowania w stadiach embrionalnych9. Larwy od 6-30 dni po zapłodnieniu (dpf) hodować na diecie z żywych wrotków do 14 dpf, a po 14 dpf na żywej artemii12. 
	OSTROŻNIE: PTU jest bardzo toksyczne</li>
	<li>Zanurzyć ryby w roztworze trikainy do momentu utraty reakcji na dotyk.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór treściwy trikainy, łącząc 400 mg esteru etylowego kwasu 3-aminobenzoenowego z 2,1 mL 1 M Tris (pH 9) w 100 mL ddH2O. Dostosować pH do 7,0 i przechowywać w temperaturze -20 °C. 
		OSTROŻNIE: Trikaina jest toksyczna.</li>
		<li>Rozcieńczyć 4,2 mL roztworu treściwego trikainy w 100 mL wody z akwarium w celu znieczulenia larw/osobników dorosłych lub w EM w celu znieczulenia zarodków (końcowe stężenie trikainy 0,0165% w/v).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Fiksacja embrionów i larw
UWAGA: Protokoły immunohistochemiczne zostały dostosowane na podstawie wcześniej opublikowanych materiałów7.
<ol>
	<li>Zafiksuj zdechorionowane embriony lub larwy (do 2 tygodni po zapłodnieniu) w 4% (v/v) paraformaldehydzie (PFA) w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce. 
	UWAGA: PFA jest łatwopalny i rakotwórczy.</li>
	<li>Przemyj embriony trzy razy przez 10 min w PBS, a następnie poddaj permeabilizacji w PBS z dodatkiem 10% Tritonu i 1% DMSO (PBS-T) przez noc w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: DMSO jest toksyczny, szkodliwy w przypadku połknięcia lub wchłaniania przez skórę, przenosi substancje niebezpieczne przez skórę i jest łatwopalny. Triton jest toksyczny, żrący i stwarza zagrożenie dla środowisk wodnych.</li>
</ol>
3. Disekcja soczewek larw i osobników dorosłych danio pręgowanego
<ol>
	<li>Znieczulić ryby (od larw w 6 dpf do osobników dorosłych) za pomocą trikainy, aż przestaną reagować na dotyk, przy zachowaniu silnego bicia serca. Zmierzyć długość standardową ryb zgodnie z metodą Schillinga (2002) w celu określenia stadium rozwoju13.</li>
	<li>Niezwłocznie wyciąć oczy za pomocą nożyczek do mikrodysekcji i umieścić je w naczyniu do dysekcji z PBS (Rycina 2 przedstawia oczy dorosłych osobników).
	<ol>
		<li>Przygotować specjalne naczynie o średnicy 35 mm wypełnione silikonem do dysekcji soczewek. Po zastygnięciu silikonu wyciąć wgłębienie o średnicy około 2-3 mm i głębokości 0,5 mm, służące do unieruchamiania oczu/soczewek dorosłych osobników podczas dysekcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dysekcja soczewek dorosłych danio pręgowanych
	<ol>
		<li>Umieścić oko dorosłego osobnika w wgłębieniu naczynia z PBS stroną tylną do góry. Unieruchomić oko, wkładając pęsetę pod kątem &lt;45° przez tarczę nerwu wzrokowego. Należy uważać, aby nie uszkodzić ani nie ucisnąć soczewki. Za pomocą nożyczek do dysekcji wykonać dwa lub trzy nacięcia radialne przez siatkówkę i twardówkę, od tarczy nerwu wzrokowego do strefy rzęskowej.</li>
		<li>Odchylić siatkówkę i twardówkę niczym płatki kwiatu i odwrócić oko stroną rogówki do góry. Unieruchomić soczewkę pośrednio, manipulując twardówką i rogówką płaską stroną nożyczek, jednocześnie odsuwając pęsetą siatkówkę i tkanki przyległe. Ostrożnie odciąć nadmiar tkanek z soczewki. 
		UWAGA: Kluczowe jest przeprowadzenie dysekcji z najwyższą starannością, aby uzyskać powtarzalnie zdrowe soczewki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dysekcja soczewek larw danio pręgowanych
	<ol>
		<li>Umieścić oko larwy stroną tylną do góry na płaskiej części silikonowego naczynia z PBS i za pomocą zaostrzonej igły wolframowej wykonać nacięcia radialne przez siatkówkę i twardówkę, unieruchamiając oko drugą igłą wolframową lub pęsetą. 
		UWAGA: Należy uważać, aby nie uszkodzić soczewki.
		<ol>
			<li>Zaostrzyć elektrolitycznie końcówkę 2 cm odcinka drutu wolframowego o średnicy 0,1 mm, zanurzając końcówkę w 10% (w/v) NaOH i przykładając prąd przemienny o niskim napięciu14. Zamocować igłę w pipecie Pasteura, topiąc szklany koniec za pomocą palnika Bunsena. 
			UWAGA: Można również stosować alternatywne precyzyjne narzędzia do dysekcji. 
			OSTROŻNIE: NaOH ma właściwości żrące.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ostrożnie wybrać soczewkę z rozdzielonego oka tępą stroną igły i delikatnie odsunąć przylegające tkanki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Fixacja wypreparowanych soczewek
<ol>
	<li>Wypreparowane soczewki natychmiast utrwalić w 1,5% (v/v) PFA w PBS przez 24 h w temperaturze pokojowej (RT). Przemyć soczewki trzy razy w PBS po 10 min każdorazowo.</li>
	<li>Przeprowadzić permeabilizację soczewek do analizy całych preparatów (whole mount) lub krioprotekcję do kriotomii (patrz sekcja 8).
	<ol>
		<li>Permeabilizować soczewki w PBS-T przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Immunohistochemia soczewki
<ol>
	<li>Oznacz błony utrwalonych soczewek embrionalnych/larwalnych lub dorosłych poprzez inkubację w Phalloidin- Alexa Fluor 546 (1:200) oraz jądra komórkowe w DAPI (1:1 000 z roztworu stokowego 5 mg/mL) w PBS-T przez noc w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: DAPI jest substancją drażniącą skórę i oczy.</li>
	<li>Przemyj trzy razy w PBS-T po 10 min każde płukanie. Przejrzyść tkankę poprzez inkubację w 30%, 50% i 70% glicerolu w PBS-T (v/v) przez co najmniej 1 h w RT dla każdego stężenia lub przez noc w 4 °C.</li>
	<li>Zamontuj ryby w 70% glicerolu w PBS-T (v/v) na szklanych szalkach z mikrowypustkami 35 mm, tak aby oczy przylegały do szkiełka nakrywki jak najbardziej płasko i prosto. W przypadku młodszych ryb lekkie nachylenie przednio-boczne może pomóc w ustawieniu szwu soczewki równolegle do szkiełka nakrywki.</li>
</ol>
6. Analiza przednich szwów soczewki u danio pręgowanego z wykorzystaniem linii transgenicznej in vivo
<ol>
	<li>Wygenerować linie Tg(βB1cry:mAppleCAAX) przy użyciu zestawu Tol215. System transpozonu Tol215 umożliwia stabilną integrację konstruktu, w którym mApple jest sterowane przez 300 bp promotora ludzkiej βB1-krystaliny16, zakotwiczonego w błonie za pomocą sekwencji CAAX, co skutkuje ekspresją specyficzną dla błon komórek włókien soczewki. 
	UWAGA: Ten konstrukt (ID:122451) jest dostępny do zakupu.
	<ol>
		<li>W dniu iniekcji, rano, przygotować mieszaninę do iniekcji i przechowywać ją w lodzie. Aby uzyskać objętość końcową 10 µL w wodzie H2O wolnej od RNazy i DNazy, dodać: 1,5 µL konstruktu DNA huβB1cry:mAppleCAAX o stężeniu 50 ng/µL - [0,375-0,75 pg/final injection], 1,5 µL mRNA transpozazy Tol2 o stężeniu 300 ng/µL (zestaw Tol2)15 [15-30 pg/final injection] oraz 1 µL wskaźnika czerwieni fenolowej o stężeniu 1% w/v [1 x10-5% (w/v)/final injection].</li>
		<li>Wstrzyknąć 50-100 pL mieszaniny do iniekcji do embrionów w stadium jednej komórki12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierzyć wydajność transgenezy w wstrzykniętych embrionach F0 poprzez pomiar częstotliwości występowania embrionów z soczewkami mApple-dodatnimi w 3 dpf. 
	UWAGA: Przy zastosowaniu tej metody należy spodziewać się wydajności transgenezy &gt;80%. Mozaiki F0 umożliwiają szczegółową analizę morfologii błon poszczególnych komórek. Zróżnicowany stopień mozaikowości pozwala na obrazowanie morfologii pojedynczych komórek lub ich niewielkich grup, natomiast bardziej globalna ekspresja w soczewce umożliwia analizę struktur wielokomórkowych, takich jak szwy soczewki in vivo.</li>
	<li>Skrzyżować ryby mozaikowe F0 w celu wygenerowania stabilnych linii, które znakują wszystkie błony komórek włókien. Założyciele F0 z transgenem zintegrowanym z linią zarodkową wyprodukują potomstwo ze stabilnymi integracjami, które mogą być utrzymywane jako linie transgeniczne.</li>
</ol>
7. Analiza przednich szwów soczewki u danio pręgowanego z wykorzystaniem linii transgenicznej in vivo
<ol>
	<li>Zanurzyć w znieczuleniu ryby mozaikowe lub stabilne transgeniczne w wieku 3 dpf lub dorosłe, a następnie zamocować w 1% agarozie niskotopliwej (LMA) z trikainą w naczyniach z mikrootworami o szklanym dnie, tak aby oko przylegało płasko do szkiełka nakrywkowego.
	<ol>
		<li>Rozpuścić 1 g LMA w 100 mL EM (bez błękitu metylenowego), aby przygotować 1% LMA. Przechowywać długoterminowo w aliquotach 15 mL w temperaturze 4 °C. Rozpuścić zapas w mikrofalówce i przechowywać w temperaturze 42 °C do momentu użycia każdej probówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zastygnięciu LMA przykryć ryby do wieku 6 dpf EM z trikainą, a ryby dorosłe wodą z akwarium z trikainą.
	<ol>
		<li>Zmieszać 5 mL EM bez błękitu metylenowego lub wody z akwarium z 250 µL roztwoku trikainy oraz 7 µL PTU, jeśli obrazowane są ryby traktowane PTU.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Kriosiekanie i immunohistochemia soczewki
<ol>
	<li>Krioprotekcję utrwalonych embrionów lub soczewek dorosłych przeprowadza się poprzez umieszczenie ich w 10% sacharozie w PBS (w/v), następnie w 20% sacharozie przez 1 h w temperaturze pokojowej (lub przez noc w 4 °C), a na koniec przez noc w 30% sacharozie w 4 °C.</li>
	<li>Tkankę zatapia się w OCT w formach podstawowych, a następnie mrozi na uchwytach z użyciem OCT. Wykonuje się kriosekcje o grubości 12-14 µm, zbierając je na szkiełka przedmiotowe Superfrost/Plus. Przecięcia ogrzewa się na szkiełkach przez 10 min na podgrzewaczu do szkiełek rozgrzanym do ~35 °C.</li>
	<li>Przecięcia płucze się trzykrotnie w PBS po 10 min każde. Następnie przeprowadza się znakowanie sekcji za pomocą Phalloidin-Alexa Flour 546 (1:200) z DAPI (1:1,000) lub WGA-Alexa Flour 594 (1:200), po czym wykonuje się trzy płukania w PBS. Preparaty zamyka się w medium montażowym anti-fade, a szkiełko zakrywie uszczelnia lakierem do paznokci.</li>
</ol>
9. Obrazowanie
<ol>
	<li>Należy wykonać obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego. Należy pozyskać serie obrazów w osi z (z-stacks) lub przekroje optyczne, używając obiektywu z imersją wodną 60x N/A 1.2 lub podobnego, w wybranych obszarach od przedniego do tylnego bieguna soczewki. Należy zastosować następujące ustawienia akwizycji: dysk Airy 1.2 z laserem 561 nm, filtr Texas red dla faloidyny-Alexa Flour 546 lub mApple, bądź laser 405 z filtrem UV dla DAPI.</li>
	<li>Należy skorygować moc lasera w zależności od głębokości z, aby zniwelować utratę sygnału wraz z penetracją soczewki. Pozwala to na uzyskanie silnego sygnału w tylnym biegunie utrwalonych i żywych embrionów w 3 dpf oraz silnego sygnału w równikowych przekrojach optycznych soczewek dorosłych ryb.</li>
	<li>Obrazy należy zestawić i przeanalizować przy użyciu oprogramowania do przetwarzania obrazów.</li>
</ol>
10. Pomiar lokalizacji jądra soczewki w osi przednio-tylnej
<ol>
	<li>Świeżo wycięte soczewki ułożone osiowo w PBS w szalce 35 mm z dnem z listka przykrywkowego, tak aby bieguny i szwy były zorientowane równolegle do płaszczyzny ogniskowania. Aby zidentyfikować jądro soczewki, należy szukać różnicy w współczynniku załamania światła, która zazwyczaj występuje na granicy kory i jądra soczewki. 
	UWAGA: Zdrowe soczewki dorosłych osobników typu dzikiego są niezwykle przezroczyste, co utrudnia dostrzeżenie szwów i jądra soczewki lub określenie jej orientacji. W takim przypadku wykonanie pęsetą niewielkiego nacięcia torebki soczewki powoduje drobne uszkodzenia, dzięki którym szwy i jądro soczewki stają się widoczne po około 10 min, co pomaga w orientacji soczewki do tego pomiaru. Jednakże soczewki stają się nieprzydatne do dalszych zastosowań, ponieważ są teraz uszkodzone.</li>
	<li>Wykonaj zdjęcia soczewek z jądrem w ogniskowej przy oświetleniu w polu jasnym, z optyką DIC lub bez niej, używając mikroskopu sekcyjnego z podłączoną kamerą. W celu kalibracji wykonaj zdjęcie mikrometru przy tym samym powiększeniu.
	<ol>
		<li>Kliknij przycisk podglądu na żywo, dostosuj ustawienia ekspozycji, aby zwizualizować jądro i peryferie soczewki, a następnie wykonaj zdjęcie, klikając przycisk migawki. Zapisz plik w formacie tif.</li>
		<li>Użyj oprogramowania do przetwarzania obrazów, aby skalibrować uzyskane obrazy soczewek. Wybierz narzędzie linii prostej i narysuj linię o znanej długości na obrazie mikrometru, następnie kliknij analyze | set scale. Wpisz znaną odległość, jednostki i wybierz kalibrację „global”, a następnie kliknij ok.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz odległość od środka jądra soczewki do bieguna przedniego (a - r).
	<ol>
		<li>Użyj narzędzia linii prostej w oprogramowaniu do przetwarzania obrazów, aby narysować linię przechodzącą przez obrazowany środek jądra soczewki w orientacji osiowej. Przyjmij środek tej linii za środek jądra soczewki.</li>
		<li>Narysuj kolejną linię z tego punktu do bieguna przedniego soczewki i wybierz „measure” w menu „analyze”, aby zmierzyć odległość (a - r), gdzie a jest promieniem soczewki, a r jest odległością od środka soczewki do środka jądra.</li>
		<li>Narysuj kolejną linię od bieguna przedniego do tylnego i zmierz tę odległość jako średnicę soczewki (2a). Skopiuj te wartości z okna „results” i przenieś je do arkusza kalkulacyjnego lub programu statystycznego. 
		UWAGA: Łatwiej jest precyzyjnie zmierzyć odległość od środka jądra do bieguna przedniego niż od środka jądra soczewki do środka soczewki. Pomiar ten jest przeliczany zgodnie z formułą w kroku 10.3.5, aby określić odległość środka jądra soczewki od środka soczewki. Do pomiarów zawsze używaj jądra dorosłego, nawet jeśli widoczne jest jądro embrionalne.</li>
		<li>Podziel średnicę przez 2, aby obliczyć promień soczewki, a.</li>
		<li>Oblicz r/a jako <img alt="Wyrażenie matematyczne: człon ciągu geometrycznego; równanie do analizy różnic w ciągu." src="/files/ftp_upload/59528/59528eq1.jpg" style="opacity: 0.9;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1">, co stanowi znormalizowaną lokalizację jądra soczewki względem promienia soczewki. 
		UWAGA: W przypadku jądra położonego bliżej bieguna przedniego wartość r/a będzie &gt;0,0, natomiast jądro zlokalizowane centralnie będzie miało wartość r/a równą 0,0.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przedstaw logarytm znormalizowanego osiowego pomiaru jądra jako funkcję długości standardowej, aby określić zmiany w lokalizacji jądra soczewki podczas rozwoju danio pręgowanego.</li>
</ol>

<ol><li>Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqp0a+Regulates+Suture+Stability+in+the+Zebrafish+Lens%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).</li>
<li>Hall, J. E., Mathias, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Aquaporin+Zero+Puzzle%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The Aquaporin Zero Puzzle.</a> Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).</li>
<li>Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Extracellular+C-loop+Domain+Plays+an+Important+Role+in+the+Cell+Adhesion+Function+of+Aquaporin+0%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0.</a> Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).</li>
<li>Kumari, S. S., Varadaraj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+AQP0+performs+cell-to-cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).</li>
<li>Lindsey Rose, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C+Terminus+of+Lens+Aquaporin+0+Interacts+with+the+Cytoskeletal+Proteins+Filensin+and+CP49%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).</li>
<li>Kumari, S. S., Varadaraj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin+0+plays+a+pivotal+role+in+refractive+index+gradient+development+in+mammalian+eye+lens+to+prevent+spherical+aberration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).</li>
<li>Uribe, R. A., Gross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+on+Cryosections+from+Embryonic+and+Adult+Zebrafish+Eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).</li>
<li>Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+adult+morphology+of+the+eye+lens+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish.</a> Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Greiling, T. M. S., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+lens+development+in+the+zebrafish%3A+A+three-dimensional+time-lapse+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis.</a> Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).</li>
<li>Godinho, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+amacrine+cell+neurites+to+appropriate+synaptic+laminae+in+the+developing+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina.</a> Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio)</a>. , University of Oregon Press. (2002).</li>
<li>Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchilling%2C+TF+%22Zebrafish%22">Zebrafish</a>. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. 261, Oxford University Press. 59-94 (2002).</li>
<li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+making+very+fine%2C+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li>
<li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+A+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li>
<li>Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulation+of+human+%CE%B2B1-crystallin+promoter+activity+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Recapitulation of human βB1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).</li>
<li>Soules, K., Link, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+anterior+segment+in+the+zebrafish+eye%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye.</a> BMC Developmental Biology. 5 (1), 12(2005).</li>
<li>Greiling, T. M. S., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transparent+lens+and+cornea+in+the+mouse+and+zebra+fish+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).</li>
<li>Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Fate+and+Differentiation+of+the+Developing+Ocular+Lens%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).</li>
<li>Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+eye-a+paradigm+for+investigating+human+ocular+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics.</a> Eye. 31, 68(2016).</li>
<li>Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Visual+System+of+Zebrafish+and+its+Use+to+Model+Human+Ocular+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases.</a> Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).</li>
<li>Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+on+the+move+towards+ophthalmological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Zebrafish on the move towards ophthalmological research.</a> Eye. 28 (4), 367-380 (2014).</li>
<li>Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+Microscopy+Reveals+Zones+of+Membrane+Remodeling+in+the+Outer+Cortex+of+the+Human+Lens%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).</li>
<li>Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Effects+of+Hyperbaric+Oxygen+on+the+Biochemical+and+Optical+Properties+of+the+Bovine+LensEffects+of+HBO+on+the+Bovine+Lens%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).</li>
<li>Gold, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AKAP2+anchors+PKA+with+aquaporin-0+to+support+ocular+lens+transparency%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency.</a> EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).</li>
<li>Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+distributions+of+AQP5+and+AQP0+in+embryonic+and+postnatal+mouse+lens+development%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development.</a> Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).</li>
<li>Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+sodium+potassium+chloride+cotransporter+%28NKCC1%29+and+sodium+chloride+cotransporter+%28NCC%29+and+their+effects+on+rat+lens+transparency%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency.</a> Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).</li>
<li>Hayes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+%CE%B15%2Ffibronectin1+and+focal+adhesion+kinase+are+required+for+lens+fiber+morphogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrin α5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).</li>
<li>Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+proteasome+system+is+required+for+cell+proliferation+of+the+lens+epithelium+and+for+differentiation+of+lens+fiber+cells+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish.</a> Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).</li>
<li>Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+are+selectively+associated+with+interlocking+ball-and-sockets+but+not+protrusions+in+the+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens.</a> Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).</li>
</ol>

Nie mamy żadnych ujawnień.

Analiza morfologii soczewki danio pręgowanego jest pierwszym krokiem w zrozumieniu fenotypów mutantów, czyli efektów interwencji farmakologicznych mających na celu badanie biologii soczewki gałki ocznej. Przedstawiamy metody analizy szwów soczewkowych, morfologii komórek włókien korowych i aspektów jądra soczewki. Podejścia te stanowią połączenie metod in vitro i in vivo (porównanych w tabeli 1). Metody in vitro pozwalają na dokładniejsze poznanie morfologii komórek zewnętrznej...

Danio pręgowany jest doskonałym modelem do badania rozwoju soczewki i fizjologii ze względu na anatomiczne podobieństwa do soczewek ssaków, względną łatwość manipulacji genetycznej i farmakologicznej, szybkość rozwoju embrionalnego oka, mały rozmiar i przezroczystość we wczesnych stadiach pozwalających na obrazowanie in vivo. Opisane tutaj metody zostały opracowane w celu analizy morfologii soczewki danio pręgowanego w stadium embrionalnym i dorosłym, ze szczególnym uwzględnieniem integralności szwów, morfologii błony korowej in vitro i in vivo oraz lokalizacji położenia jądra soczewki wzdłuż osi przednio-tylnej ex vivo. Metody te służą jako punkt wyjścia do badań funkcjonalnych nad rozwojem i fizjologią soczewki, a także do odwróconych badań genetycznych fenotypów soczewek u danio pręgowanego.
Obrazowanie morfologii soczewki danio pręgowanego
Akwaporyna 0 (AQP0) jest najobficiej występującym białkiem błony soczewki i ma kluczowe znaczenie zarówno dla rozwoju soczewki, jak i jej przejrzystości, ze względu na wiele podstawowych funkcji u ssaków. Danio pręgowany ma dwa Aqp0 (Aqp0a i Aqp0b), a my opracowaliśmy metody analizy utraty ich funkcji zarówno w soczewkach embrionalnych, jak i dorosłych. Nasze badania pokazują, że mutanty aqp0a-/- rozwijają zmętnienie bieguna przedniego z powodu niestabilności szwu przedniego, a podwójne mutanty aqp0a/b rozwijają nieprzezroczystość jądrową1. Wykazano, że AQP0 odgrywa rolę w transporcie wody2, adhesion3,4, cytoszkielet anchoring5 i generowanie gradientu indeksu załamania światła6, ale badania te zostały w dużej mierze przeprowadzone in vitro. Danio pręgowany daje wyjątkową okazję do zbadania, w jaki sposób utrata funkcji lub zaburzona funkcja Aqp0a lub Aqp0b wpłynęłaby na morfologię i funkcję żywej soczewki. Aby ocenić morfologię komórek soczewki i integralność szwów podczas rozwoju, zmodyfikowaliśmy istniejące metody immunohistochemiczne in vitro7 do stosowania w soczewkach embrionalnych i dorosłych, a także wygenerowaliśmy transgeniczne w celu monitorowania tego procesu in vivo.
Analiza immunohistochemiczna struktury błony plazmatycznej i integralności szwów została przeprowadzona w całych zarodkach i soczewkach dorosłych. Soczewki danio pręgowanego są niezwykle małe (średnica soczewki wynosi ~100 μm u zarodków i do 1 mm u dorosłych) w porównaniu z ich odpowiednikami ssaków i mają szwy punktowe8, które są rzadko wychwytywane w kriosekcjach. W związku z tym całe soczewki są niezbędne do analizy integralności szwów. Do analizy in vivo tworzenia szwów przednich i obrazowania precyzyjnej architektury komórek soczewki, wygenerowaliśmy transgeniczne ekspresje mApple specyficznie znakujące błony soczewek.
Zalety obrazowania na żywo transgenicznych błon soczewek obejmują: 1) unikanie artefaktów fiksacji, 2) badanie dynamicznych zmian morfologicznych w filmach poklatkowych, oraz 3) umożliwienie badań podłużnych, w których wcześniejsze zdarzenia mogą być skorelowane z późniejszymi fenotypami. Pigmentacja tęczówki zwykle uniemożliwia wyraźne obrazowanie obrzeży soczewki. Dodatek 1-fenylo 2-tiomocznika (PTU) przed etapem primordia-5 (prim-5) 9 zapobiega melanogenezie i pigmentacji oczu do około 4 dni po zapłodnieniu (dpf). Jednak po 4 dpf obrzeża soczewki są zasłonięte in vivo, szczególnie w starszych stadiach. Co więcej, gęstość samej soczewki zasłania obrazowanie jej tylnego bieguna. Dlatego, aby zbadać morfologię obwodu soczewki lub szwu tylnego, po 4 dpf soczewki należy wyciąć i utrwalić.
Transgeniczne linie danio pręgowanego zostały wykorzystane do analizy struktury błony soczewki embrionalnej in vivo10. Transgeniczny Q01 ulega ekspresji cyjanowego białka fluorescencyjnego połączonego z sekwencją ukierunkowaną na błonę, Gap43, napędzaną przez promotor EF1α i heksamer elementu wzmacniającego DF4 pax6 wszechobecny w komórkach światłowodowych soczewki<klasa sup = "xref">11. Q01 ma ekspresję pozasoczewkową, w tym komórki amakrynowe w siatkówce, które dodają sygnał tła, jeśli głównym zainteresowaniem jest soczewka. Opracowaliśmy nowatorską linię transgeniczną, która wyraża mApple na uwięzi błonowej w soczewce, w celu uniknięcia jakiegokolwiek sygnału pozasoczewkowego.
Lokalizacja jądra soczewki
Odkryliśmy, że jądro soczewki przesuwa się z początkowej przedniej lokalizacji u larw danio pręgowanego do centralnego miejsca na osi przednio-tylnej u dorosłych soczewek. Uważa się, że to przesunięcie położenia jądra soczewki o wysokim współczynniku załamania światła jest wymogiem normalnego rozwoju optyki soczewki danio pręgowanego1. Nasze metody pozwalają na ilościowe określenie centralizacji jądrowej soczewki w stosunku do promienia soczewki. Korzystając z tej metody, wykazaliśmy, że Aqp0a jest wymagane do centralizacji jądra soczewki1, a ta prosta metoda może być zastosowana do innych badań nad rozwojem i fizjologią soczewki oraz jej właściwościami optycznymi w modelu danio pręgowanego.

<table><tbody><tr><td>1-fenylo-2-tiomocznik (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td>UWAGA &ndash; bardzo toksyczny</td></tr><tr><td>4% wodny roztwór paraformaldehydu</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>RT 157-4</td><td>UWAGA &ndash; zagrożenie dla zdrowia, palny</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td>Temperatura obiektywu i komory ustawiona na -21 i Stopniach; C</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>UWAGA &ndash; działa drażniąco na oczy i skórę</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128</td><td>UWAGA &ndash; palny, przenika przez skórę&nbsp;</td></tr><tr><td>Jednorazowa forma bazowa</td><td>VWR Scientific</td><td>15154-631</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe szklane pipety Pasteura</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5</td><td>Dumont & Fils</td><td></td><td>Utrzymuj kleszcze zaostrzone</td></tr><tr><td>Sól metanosulfonianu etylu 3-aminobenzoesanu (Trikaina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>UWAGA - toksyczna</td></tr><tr><td>Szklana miska mikrostudzienkowa (szalka Petriego 35 mm, mikrostudzienka 14 mm, szkło nakrywkowe #1,5)</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>hu&beta; B1cry:mAppleCAAX DNA construct</td><td>Addgene</td><td>ID:122451</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Wayne Rasband, NIH</td><td>v1.51n</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza niskotopliwa (LMA)</td><td>Apex</td><td>902-36-6</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements</td><td>Nikon</td><td>V 4.5</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie NIS-Elements AR</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus&nbsp; z kontrolerem modelu 2.1.1.183</td><td>Olympus Corp</td><td>Mikroskop DP70</td><td></td></tr><tr><td>Olympus&nbsp;</td><td>Olympus Corp</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>Mąka Phalloidin-Alexa 546</td><td>Thermo Fisher</td><td>A22283</td><td></td></tr><tr><td>Wskaźnik czerwieni fenolowej (1% w/v)</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>5725-16</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>CS5 v12.0</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Photoshop</td><td>Adobe</td><td>CS5 v12.0</td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo 60x/1.2 WD</td><td>obiektyw Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Źródło zasilania</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>MTr 22</td><td>Lub równoważne źródło zasilania&nbsp;</td></tr><tr><td>Podgrzewacz do slajdów nr 26020FS</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-594</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki wodorotlenku sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S612-3</td><td>UWAGA - działa żrąco/drażniąco na oczy i skórę, narząd docelowy - układ oddechowy, działa żrąco na metale</td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe Superfrost/Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 silikon Dow Corning</td><td>World Prevision Instruments</td><td></td><td></td>SYLG184</tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 BioXtra</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>UWAGA &ndash; Toksyczne, niebezpieczne dla środowiska wodnego,</td></tr><tr><td>Nożyczki do mikropreparacji Vannas</td><td>Ted Pella Inc</td><td>1346</td><td>Ostre/ostre proste końcówki</td></tr><tr><td>Vectashield antiblading mouting medium</td><td>Laboratoria wektorowe</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Aglutynina z kiełków pszenicy (WGA)-Alexa Mąka-594</td><td>Life Technologies</td><td>W11262</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena lokalizacji jądra soczewki danio pręgowanego i integralności szwów

Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity

Danio pręgowany jest wyjątkowo przystosowany do manipulacji genetycznych i obrazowania in vivo, co czyni go coraz bardziej popularnym modelem do odwrotnych badań genetycznych i do generowania transgeników do obrazowania in vivo. Te unikalne możliwości sprawiają, że danio pręgowany jest idealną platformą do badania rozwoju i fizjologii soczewek ocznych. Nasze ostatnie odkrycia, że akwaporyna-0, Aqp0a, jest wymagana do stabilności szwu przedniej soczewki, a także do przesunięcia jądra soczewki do środka soczewki wraz z wiekiem, skłoniły nas do opracowania narzędzi specjalnie nadających się do analizy właściwości soczewek danio pręgowanego. Poniżej przedstawiamy szczegółowe metody preparacji soczewek, które można zastosować zarówno do soczewek larwalnych, jak i dorosłych, aby przygotować je do analizy histologicznej, immunohistochemii i obrazowania. Koncentrujemy się na analizie integralności szwów soczewki i morfologii komórek korowych oraz porównujemy dane wygenerowane z wypreparowanych soczewek z danymi uzyskanymi z obrazowania in vivo morfologii soczewki, które było możliwe dzięki nowej transgenicznej linii danio pręgowanego z genetycznie kodowanym markerem fluorescencyjnym. Analiza wypreparowanych soczewek prostopadłych do ich osi optycznej pozwala na ilościowe określenie względnego położenia jądra soczewki wzdłuż osi przednio-tylnej. Ruch jądra soczewki od początkowej pozycji przedniej do środka jest wymagany dla normalnej optyki soczewki u dorosłego danio pręgowanego. Tak więc ilościowa miara położenia jądra soczewki bezpośrednio koreluje z jej właściwościami optycznymi.

Anatomia oka dorosłego danio pręgowanego ściśle przypomina anatomię oka ssaków (Rysunek 1A). Pomimo pewnych różnic między oczami danio pręgowanego a ssaków, takich jak obecność strefy rzęskowej zamiast ciała rzęskowego17, różnice we właściwościach optycznych18 oraz różnice w morfogenezie podczas rozwoju embrionalnego19, oko danio pręgowanego stanowi doskonały model do badania rozwoju oka ...

Te protokoły zostały opracowane w celu analizy morfologii soczewki korowej, integralności strukturalnej szwów soczewki danio pręgowanego w soczewkach stałych i żywych oraz do pomiaru położenia jądra soczewki danio pręgowanego wzdłuż osi przednio-tylnej.

Ocena lokalizacji jądra soczewki danio pręgowanego i integralności szwów

The zebrafish is uniquely suited to genetic manipulation and in vivo imaging, making it an increasingly popular model for reverse genetic studies and for ...

Nasze protokoły stanowią punkt wyjścia do badań funkcjonalnych nad rozwojem i fizjologią soczewek oraz do odwrotnych genetycznych badań przesiewowych fenotypów soczewek u danio pręgowanego. Nasze protokoły łączą analizy in vitro i in vivo morfologii błony soczewki danio pręgowanego i zapewniają nową i prostą metodę ilościowego określania rozwoju optyki soczewek danio pręgowanego. Analiza morfologii i optyki soczewki danio pręgowanego prowadzi do wglądu w mechanizmy kontrolujące rozwój soczewki, normalną fizjologię i patofizjologię.Te spostrzeżenia mogą z kolei prowadzić do zdolności do opóźniania lub zapobiegania zaćmie. Nie stwierdzono żadnych doniesień o asymetrycznie zlokalizowanych jądrach soczewek u gatunków innych niż danio pręgowany. Identyfikacja szwów soczewki ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej orientacji soczewki w celu pomiaru lokalizacji jądra.Po potwierdzeniu wystarczającego uspokojenia Trikainą, użyj nożyczek do mikrodysekcji, aby natychmiast wyciąć oba oczy dorosłego lub larwalnego danio pręgowanego i umieść oba oczy na 35-milimetrowej, wykonanej na zamówienie szalce Petriego z silikonową formą do preparacji wypełnioną PBS. Aby pobrać soczewkę od dorosłego danio pręgowanego, umieść oko tylną stroną do góry i włóż kleszcze pod kątem mniejszym niż 45 stopni przez tarczę nerwu wzrokowego. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby wykonać dwa lub trzy promieniste nacięcia przez siatkówkę i twardówkę od tarczy nerwu wzrokowego do strefy rzęskowej w unieruchomionym oku i odkleić siatkówkę i twardówkę jak płatki kwiatów.Odwróć oko rogówką do góry i użyj płaskiej strony nożyczek, aby pośrednio unieruchomić soczewkę poprzez manipulację twardówką i rogówką za pomocą kleszczy, aby odciągnąć siatkówkę i przyczepione tkanki, a następnie ostrożnie odciąć nadmiar tkanki z soczewki. W celu pobrania soczewek larw danio pręgowanego umieść tylną stronę oka larwy na płaskiej części silikonowego naczynia PBS i użyj zaostrzonej igły wolframowej, aby wykonać promieniste nacięcia przez siatkówkę i twardówkę, jednocześnie unieruchamiając oko inną igłą lub kleszczami, a następnie delikatnie zgarnij soczewkę z dysocjacyjnego oka stroną wykonanej na zamówienie igły z drutu wolframowego i ostrożnie odciągnij przyczepioną tkankę. Aby zmierzyć lokalizację jądra soczewki osi przednio-tylnej, należy ustawić świeżo wycięte soczewki osiowo w PBS w 35-milimetrowej czaszy ze szklanym dnem ze szklanym dnem z biegunami i szwami zorientowanymi równolegle do płaszczyzny ostrości.Aby zidentyfikować jądro soczewki, poszukaj różnicy we współczynniku załamania światła, który zwykle występuje na styku kory soczewki i jądra soczewki. Jeśli szwy soczewki nie są widoczne, lekkie lizanie kleszczami do torebki soczewki odsłania szwy i jądro soczewki, pomagając zorientować soczewkę do pomiaru. Umieść czaszę na stoliku mikroskopu preparacyjnego wyposażonego w kamerę i zobrazuj soczewki z jądrem soczewki w ostrości w świetle jasnego pola lub z interferencyjną optyką kontrastową z różnicowymi zakłóceniami.Zobrazuj mikrometr w tym samym powiększeniu w celu kalibracji i kliknij przycisk Live View (Podgląd na żywo). Kliknij przycisk Migawka, aby uzyskać obraz i zapisać go jako plik TIFF. Aby skalibrować uzyskane obrazy soczewek, w odpowiednim oprogramowaniu do przetwarzania obrazu wybierz narzędzie do linii prostej i narysuj linię o znanej długości na obrazie mikrometrycznym.Kliknij przycisk Analizuj i ustaw skalę i wprowadź znaną odległość i jednostki, a następnie wybierz opcję Kalibracja globalna i kliknij OK.To zmierz odległość od środka jądra soczewki do bieguna przedniego, określ położenie szwu soczewki i użyj narzędzia Linia prosta, aby narysować linię w poprzek obrazowanego środka jądra soczewki w orientacji osiowej. Środek tej linii jest środkiem jądra soczewki. Narysuj kolejną linię od tego punktu do przedniego bieguna soczewki i wybierz opcję Zmierz w menu Analizuj, aby zmierzyć odległość.Narysuj kolejną linię od bieguna przedniego do bieguna tylnego i zmierz tę odległość jako średnicę soczewki, a następnie skopiuj te długości z okna Wyniki do arkusza kalkulacyjnego i oblicz znormalizowaną lokalizację jądra soczewki w stosunku do promienia soczewki. Po trzech dniach od zapłodnienia na przednim biegunie tworzą się szwy przednie, a uderzająca zbieżność komórek jest wyraźnie uwidoczniona przez barwienie falloidyną błon komórkowych o wąskich włóknach w utrwalonych zarodkach. Silniejsze znakowanie komórek szerokowłóknistych w transgenicznym mApple zlokalizowanym w błonie soczewki umożliwia wizualizację na żywo subdomen błony, ale brakuje konwergencji szwów.Szwy tylne można uwidocznić zarówno in vitro, jak i in vivo po trzech dniach od zapłodnienia. W płaszczyźnie równikowej falloidyna silnie znakuje zewnętrzne komórki włókien korowych, odsłaniając spłaszczony sześciokątny kształt. Faloidyna jest wykluczona ze zbitego jądra soczewki, a soczewka typu dzikiego i zmutowana wygląda nie do odróżnienia.Silne znakowanie komórek szerokowłóknistych w transgenicznych mozaikach mApple zlokalizowanych w błonie soczewkowej ujawnia zakłócenia w objętości komórek w zmutowanej soczewce. Ponieważ ekspresja transgenu nie jest ograniczona przepuszczalnością, niektóre mozaiki ujawniają znakowanie jądra soczewki. U zwierząt typu dzikiego jądro soczewki zaczyna się bliżej przedniego bieguna soczewki we wczesnych stadiach rozwoju, zanim scentralizuje się w wieku dorosłym.Ekspresja białek oznaczonych na zielono w transgenicznym gospodarzu, w którym błony komórkowe fluoryzują na czerwono, umożliwia jednoczesną lokalizację białek, a także ocenę morfologii komórek włóknistych in vivo. Danio pręgowany szczególnie dobrze nadaje się do badań in vivo. Korzystając z opisanych tu narzędzi, możemy badać mechanizmy działania soczewek, w dużej mierze badane in vitro, w systemie in vivo.

assessment-zebrafish-lens-nucleus-localization-sutural

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Rozwój soczewki wiąże się z interakcjami z innymi tkankami. Kilka mutantów oka u danio pręgowanego charakteryzuje się nienaturalnie małym rozmiarem soczewki. W niniejszym opracowaniu prezentujemy eksperyment z transplantacji soczewki, mający na celu ustalenie, czy fenotyp ten wynika z przyczyn wewnętrznych, czy z wadliwych interakcji z tkankami otaczającymi soczewkę.

Transplantacja soczewki u rybek zebrafish i jej zastosowanie w analizie mutantów oka

Kluczem do zrozumienia procesów morfogenetycznych kształtujących wczesny embrion jest możliwość obrazowania komórek w wysokiej rozdzielczości. Opisujemy tutaj technikę znakowania pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek w całych embrionach ryby danio pręgowanej za pomocą białka GFP skierowanego do błony komórkowej.

Znakowanie i obrazowanie komórek w rdzeniu przedłużonym rybki danio

Ten film opisuje protokół, który został opracowany do analizy soczewek dorosłych i larw danio pręgowanego w celu analizy morfologii soczewki korowej i integralności strukturalnej szwów soczewki.

Rozwarstwienie soczewki oka: technika obserwacji morfologii soczewki danio pręgowanego

Procesy rozwojowe, takie jak proliferacja, wzorzec, różnicowanie i prowadzenie aksonów, mogą być łatwo modelowane w rdzeniu kręgowym drobnicy danio pręgowanego.  W tym artykule opisujemy procedurę montowania zarodków danio pręgowanego, która optymalizuje wizualizację tych zdarzeń.

Rozwarstwienie i boczne dopasowanie zarodków danio pręgowanego: analiza rozwoju rdzenia kręgowego

Danio pręgowany jest teraz sprawdzonym i potężnym narzędziem do modelowania dystrofii mięśniowych, wrodzonych miopatii i pokrewnych chorób nerwowo-mięśniowych. Dwójłomność i zachowanie ucieczki wywołane dotykiem to dwa powszechne nieinwazyjne testy stosowane do określenia stopnia dezorganizacji mięśni i upośledzenia lokomocji zarodków danio pręgowanego we wczesnym okresie rozwoju.

Analiza wad mięśni szkieletowych u larw danio pręgowanego za pomocą testów dwójłomności i reakcji ucieczki wywołanej dotykiem

Zarodek danio pręgowanego jest doskonałym modelem do badań nad biologią rozwojową. Podczas embriogenezy danio pręgowany rozwija się z masą żółtka, co stanowi trójwymiarowe wyzwanie dla obserwacji i analizy próbek. Protokół ten opisuje, w jaki sposób tworzyć dwuwymiarowe preparaty do montażu płaskiego całych próbek zarodków danio pręgowanego barwionych metodą montażu in situ (WISH).

Przygotowanie do obserwacji i analizy próbek zarodków danio pręgowanego wybarwionych metodą hybrydyzacji in situ metodą całego wierzchowca

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Mikroskopia fluorescencyjna z lekkim arkuszem jest doskonałym narzędziem do obrazowania rozwoju embrionalnego. Pozwala na nagrywanie długich filmów poklatkowych żywych zarodków w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Demonstrujemy jego zastosowanie do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego w szerokich skalach czasoprzestrzennych i przedstawiamy potok do fuzji i dekonwolucji zestawów danych multiview.

Wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy ustandaryzowaną serię protokołów do obserwacji górnej bruzdy ocznej, niedawno zidentyfikowanej, ewolucyjnie zachowanej struktury w oku kręgowców. Wykorzystując larwy danio pręgowanego, demonstrujemy techniki niezbędne do identyfikacji czynników, które przyczyniają się do powstawania i zamykania górnej bruzdy ocznej.

Wizualizacja bruzdy ocznej górnej podczas embriogenezy Danio rerio

Ten protokół opisuje podejście do etykietowania in toto i wielowymiarowego obrazowania wczesnego rozwoju oczu danio pręgowanego. Opisujemy znakowanie, osadzanie i obrazowanie czterowymiarowe (4D) za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej oraz rozważania dotyczące optymalizacji pozyskiwania zestawów danych do analizy mechanizmów morfogenezy panewki wzrokowej.

4-wymiarowe obrazowanie morfogenezy kubka wzrokowego danio pręgowanego

Opisano strategię przygotowania próbki do obrazowania wczesnych zarodków danio pręgowanego w nienaruszonym kosmówce za pomocą mikroskopu z arkuszami świetlnymi. Analizuje różne orientacje, jakie zarodki nabywają w kosmówce na 70% etapie epibolii i pąków, a także szczegółowo opisuje strategie obrazowania w celu uzyskania rozdzielczości w skali komórkowej w całym zarodku przy użyciu systemu arkuszy świetlnych.

Obrazowanie w mikroskopii świetlnej i strategie montażu wczesnych zarodków danio pręgowanego

Poznaj metody oceny morfologii soczewki i lokalizacji jądra u danio pręgowanego. Techniki mikrochirurgiczne i obrazowania in vitro oraz in vivo umożliwiają badanie fizjologii soczewki i mechanizmów rozwoju katarakty.

Ocena lokalizacji jądra soczewki danio pręgowanego i integralności szwów

Przeglądaj więcej filmów