Name: Metody badania zaburzeń endokrynologicznych u Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Poznaj metody badania wpływu chemicznych zaburzaczy endokrynnych na płodność, rozwój i długość życia u Drosophila melanogaster. Protokół ten pozwala ocenić toksyczność in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Orsolinie Petillo za wsparcie techniczne. Autorzy dziękują dr Mariarosarii Alettie (CNR) za wsparcie bibliograficzne. Autorzy dziękują dr. Gustavo Damiano Mita za wprowadzenie ich w świat EDC. Autorzy dziękują Leica Microsystems i Pasquale Romano za ich pomoc. Badania te były wspierane przez Projekt PON03PE_00110_1. "Sviluppo di nanotecnologie Orientate alla Rigenerazione e Ricostruzione Tissutale, Implantologia e Sensoristica in Odontoiatria/oculistica" acronimo "SORRISO"; Committente: PO FESR 2014-2020 KAMPANIA; Projekt PO FESR Kampania 2007-2013 "NANOTECNOLOGIE PER IL RILASCIO CONTROLLATO DI MOLECOLE BIO-ATTIVE NANOTECNOLOGIE".

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Muszka owocowa D. melanogaster została szeroko wykorzystana jako system modelowy in vivo do zbadania potencjalnego wpływu środowiskowych EDC, takich jak DBP28, BPA, 4-NP, 4-tert-OP29, MP30, EP31,32, DEHP33 i EE234. Kilka powodów skłoniło go do wykorzystania go jako modelu w tej dziedzinie badań. Oprócz niekwestionowanych zalet jako syst...

Działalność człowieka uwalnia do środowiska ogromne ilości substancji chemicznych, które stanowią poważny problem dla organizmów i naturalnych ekosystemów1. Szacuje się, że spośród tych zanieczyszczeń około 1000 różnych substancji chemicznych może zmienić normalną równowagę układów hormonalnych; zgodnie z tą właściwością są klasyfikowane jako substancje chemiczne zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC). W szczególności, w oparciu o niedawną definicję Towarzystwa Endokrynologicznego, EDC są "egzogenną substancją chemiczną lub mieszaniną substancji chemicznych, która może zakłócać dowolny aspekt działania hormonów"2. W ciągu ostatnich trzech dekad pojawiło się coraz więcej dowodów naukowych na to, że EDC mogą wpływać na reprodukcję i rozwój zwierząt i roślin3,4,5,6,7,8. Co więcej, narażenie na EDC jest związane z rosnącym występowaniem niektórych chorób u ludzi, w tym raka, otyłości, cukrzycy, chorób tarczycy i zaburzeń zachowania9,10,11.
Ogólne mechanizmy EDC
Ze względu na swoje właściwości molekularne, EDC zachowują się jak hormony lub prekursory hormonów3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. W tym sensie mogą wiązać się z receptorem hormonu i zakłócać układy hormonalne, naśladując aktywność hormonów lub blokując wiązanie hormonów endogennych. W pierwszym przypadku, po związaniu się z receptorem, mogą go aktywować tak, jak zrobiłby to jego naturalny hormon. W drugim przypadku wiązanie EDC z receptorem zapobiega wiązaniu się jego naturalnego hormonu, więc receptor jest zablokowany i nie może być już aktywowany, nawet w obecności jego naturalnego hormonu3. W konsekwencji EDC mogą wpływać na kilka procesów, takich jak synteza, wydzielanie, transport, metabolizm lub obwodowe działanie endogennych hormonów, które są odpowiedzialne za utrzymanie homeostazy, reprodukcję, rozwój i/lub zachowanie organizmu. Wiązanie z receptorem nie jest jedynym opisanym do tej pory sposobem działania EDC. Teraz jest jasne, że mogą one również działać poprzez rekrutację koaktywatorów lub korepresorów w szlakach enzymatycznych lub poprzez modyfikację markerów epigenetycznych deregulujących ekspresję genów10,11,12,13,14, z konsekwencjami nie tylko dla obecnego pokolenia, ale także dla zdrowia przyszłych pokoleń8.
Hormony Drosophila
Potencjalne efekty wybranych EDC były szeroko badane, zarówno u dzikich gatunków, jak i w kilku systemach modelowych, w których mechanizmy endokrynologiczne są dość dobrze znane. W przypadku bezkręgowców układy hormonalne, które wpływają na wzrost, rozwój i rozmnażanie, zostały szeroko scharakteryzowane u owadów z kilku powodów, w tym ich szerokiego zastosowania w dziedzinie badań biologicznych, ich znaczenia ekonomicznego, a wreszcie rozwoju insektycydów, które mogą specyficznie ingerować w układ hormonalny szkodników.
Szczególnie wśród owadów, muszka owocowa D. melanogaster okazała się bardzo potężnym systemem modelowym do oceny potencjalnych skutków endokrynologicznych EDC. U D. melanogaster, podobnie jak u kręgowców, hormony odgrywają ważną rolę w całym cyklu życiowym. W tym organizmie istnieją trzy główne układy hormonalne, które obejmują hormon steroidowy 20-hydroksyekdyzon (20E)15,16, seskwiterpenoidowy hormon juchwenilowy (JH)17 oraz neuropeptydy i hormony peptydowe/białkowe18. Ta trzecia grupa składa się z kilku peptydów odkrytych niedawno, ale wyraźnie zaangażowanych w ogromną różnorodność procesów fizjologicznych i behawioralnych, takich jak długowieczność, homeostaza, metabolizm, reprodukcja, pamięć i kontrola lokomotoryczna. 20E jest homologiczny do hormonów steroidowych pochodzących z cholesterolu, takich jak estradiol, podczas gdy JH ma pewne podobieństwa z kwasem retinowym; oba są bardziej znanymi hormonami w Drosophila19,20. Ich równowaga jest niezbędna w koordynowaniu linienia i metamorfozy, a także w kontrolowaniu kilku procesów porozwojowych, takich jak reprodukcja, długość życia i zachowanie21, oferując w ten sposób różne możliwości testowania zaburzeń endokrynologicznych u Drosophila. Co więcej, hormony ekdysteroidowe i JH są głównymi celami tak zwanych insektycydów trzeciej generacji, opracowanych w celu zakłócania rozwojowych i reprodukcyjnych procesów endokrynologicznych u owadów. Agonistyczny lub antagonistyczny sposób działania tych substancji chemicznych jest dobrze znany, a zatem mogą one służyć jako wzorce referencyjne do oceny wpływu potencjalnych EDC na wzrost, rozmnażanie i rozwój owadów22. Na przykład metopren, który jest szeroko stosowany w zwalczaniu komarów i innych owadów wodnych23,24, działa jako agonista JH i hamuje indukowaną przez 20E transkrypcję i metamorfozę genu.
Oprócz hormonów, nadrodzina receptorów jądrowych (NR) u Drosophila jest również dobrze znana; składa się z 18 ewolucyjnie zachowanych czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w kontrolowanie zależnych od hormonów ścieżek rozwojowych, a także reprodukcji i fizjologii25. Te hormony NR należą do wszystkich sześciu podtypów nadrodziny NR, w tym tych zaangażowanych w neurotransmisję26, dwa dla NR kwasu retinowego i te dla steroidowych NR, które u kręgowców stanowią jeden z głównych celów EDCs27.
Drosophila jako modelowy system do badania EDC
Obecnie, na podstawie właściwości molekularnych, kilka agencji środowiskowych na całym świecie przypisuje potencjał ingerencji w układy hormonalne różnym substancjom chemicznym wytworzonym przez człowieka. Biorąc pod uwagę, że EDC są globalnym i wszechobecnym problemem dla środowiska i organizmów, ogólnym celem badań w tej dziedzinie jest zmniejszenie obciążenia nimi chorobowymi, a także ochrona organizmów żywych przed ich niekorzystnym skutkiem. Aby pogłębić wiedzę na temat potencjalnych skutków endokrynologicznych substancji chemicznej, konieczne jest jej przetestowanie in vivo. W tym celu D. melanogaster reprezentuje prawidłowy system modelowy. Do tej pory muszka owocowa była szeroko stosowana jako model in vivo do oceny skutków kilku środowiskowych EDC; doniesiono, że narażenie na kilka EDC, takich jak ftalan dibutylu (DBP)28, bisfenol A (BPA), 4-nonylofenol (4-NP), 4-tert-oktylofenol (4-tert-OP)29, methylparaben (MP)30, ethylparaben (EP)31,32, ftalan bis-(2-etyloheksylu) (DEHP)33 i 17-α-etynyloestradiol (EE2)34, wpływa na metabolizm i funkcje hormonalne, jak w modelach kręgowców. Do wykorzystania go jako modelu w tej dziedzinie badań skłoniło kilka powodów. Poza doskonałą znajomością układów hormonalnych, dalsze zalety to krótki cykl życia, niski koszt, łatwy do manipulowania genom, długa historia badań i kilka możliwości technicznych (zobacz stronę internetową FlyBase, http://flybase.org/). D. melanogaster dostarcza również potężnego modelu do łatwego badania efektów międzypokoleniowych i reakcji populacji na czynniki środowiskowe8 i unika kwestii etycznych istotnych dla badań in vivo na zwierzętach wyższych. Ponadto muszka owocowa ma wysoki stopień zachowania genów z ludźmi, co może umożliwić testom Drosophila EDC pomoc w przewidywaniu lub sugerowaniu potencjalnych skutków tych chemikaliów dla zdrowia ludzkiego. Oprócz poszerzania wiedzy na temat wpływu na zdrowie ludzkie, Drosophila może pomóc w ocenie ryzyka narażenia środowiska na EDC, takiego jak utrata różnorodności biologicznej i degradacja środowiska. Wreszcie, muszka owocowa ma tę dodatkową zaletę, że jest wykorzystywana w laboratoriach, gdzie czynniki potencjalnie wpływające na jej rozwój, rozmnażanie i długość życia mogą być kontrolowane w celu przypisania wszelkich zmian badanej substancji.
Mając to na uwadze, zoptymalizowaliśmy proste i solidne testy sprawnościowe do określenia wpływu EDC na niektóre cechy hormonalne Drosophila, takie jak płodność/płodność, czas rozwoju i długość dorosłego życia. Testy te są szeroko stosowane w niektórych EDC23,24,25,26,27. W szczególności zastosowaliśmy następujące protokoły do oceny skutków ekspozycji na syntetyczny estrogen EE234 oraz na BPA i bisfenol AF (BPA F) (dane niepublikowane). Protokoły te mogą być łatwo modyfikowane w celu zbadania skutków danego EDC na raz, a także łącznych efektów wielu EDC u D. melanogaster.

<table><tbody><tr><td>17&alfa;-etynyloestradiol</td><td>Sigma</td><td>E4876-1G</td><td></td></tr><tr><td>Agar do Drosophila pożywka</td><td>BIOSIGMA</td><td>789148</td><td></td></tr><tr><td>Bisfenol A</td><td>Sigma</td><td>239658-50G</td><td></td></tr><tr><td>Bisfenol AF</td><td>Sigma</td><td>90477-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Mąka kukurydziana</td><td>CA' BIANCA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eter dietylowy</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiolki Drosophila</td><td>BIOSIGMA</td><td>789008</td><td>25 mm x 95 mm</td></tr><tr><td>Fiolki Drosophila</td><td>BIOSIGMA</td><td>789009</td><td>29 mm x 95 mm</td></tr><tr><td>Fiolki Drosophila</td><td>Kaltek</td><td>187</td><td>22 mm x 63 mm</td></tr><tr><td>Klatka do pobierania zarodków</td><td>Rzemiosło</td><td></td><td>Cylinder z pleksiglasu (12,5 mm x 7 cm) z otwartym końcem i drugim końcem zamkniętym prostokątną podstawą, w której znajduje się szczelina umożliwiająca włożenie specjalne tace do układania</td></tr><tr><td>etanolu</td><td>FLUKA</td><td>2860</td><td></td></tr><tr><td>Etherizer</td><td>Crafts</td><td></td><td>cylindryczny szklany pojemnik z bawełnianą zatyczką</td></tr><tr><td>Szklana butelka</td><td></td><td></td><td>250 ml Butelki</td></tr><tr><td>Fiolki szklane</td><td>Microtech</td><td>ST 10024</td><td>Rura z płaskim dnem 100 x 24</td></tr><tr><td>Blender ręczny Robot kuchenny Pimmy</td><td>Ariete</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natychmiastowy Sukces</td><td>drożdży ESKA</td><td></td><td>Drożdże w proszku</td></tr><tr><td>Taca do układania</td><td>Rzemiosło</td><td></td><td>tace z pleksi (11 cm x 2,6 cm), do których wlewa się podłoże do układania</td></tr><tr><td>Metylo4-hydroksybenzoesan</td><td>SIGMA</td><td>H5501</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>Sokół</td><td>351016</td><td>60x5</td></tr><tr><td>Czerwony barwnik nr 40</td><td>SIGMA</td><td>16035</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy ze światłami LED</td><td>Leica</td><td></td><td>S4E</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>HIMEDIA</td><td>MB025</td><td></td></tr><tr><td>Sos pomidorowy</td><td>Cirio</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metody badania zaburzeń endokrynologicznych u drosophila melanogaster

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

W ostatnich latach pojawiło się coraz więcej dowodów na to, że wszystkie organizmy i środowisko są narażone na działanie hormonopodobnych substancji chemicznych, znanych jako substancje zaburzające gospodarkę hormonalną (EDC). Te chemikalia mogą zmieniać normalną równowagę układów hormonalnych i prowadzić do niekorzystnych skutków, a także do rosnącej liczby zaburzeń hormonalnych w populacji ludzkiej lub zaburzonego wzrostu i zmniejszonej reprodukcji gatunków dzikich zwierząt. W przypadku niektórych EDC istnieją udokumentowane skutki zdrowotne i ograniczenia dotyczące ich stosowania. Jednak w przypadku większości z nich nadal nie ma dowodów naukowych w tym sensie. Aby zweryfikować potencjalne skutki endokrynologiczne substancji chemicznej w całym organizmie, musimy przetestować ją w odpowiednich systemach modelowych, a także u muszki owocowej Drosophila melanogaster. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe protokoły in vivo do badania zaburzeń endokrynologicznych u Drosophila, odnosząc się do wpływu EDC na płodność/płodność, czas rozwoju i długość życia muchy. W ciągu ostatnich kilku lat wykorzystaliśmy te cechy życiowe Drosophila do zbadania skutków ekspozycji na 17-α-etynyloestradiol (EE2), bisfenol A (BPA) i bisfenol AF (BPA F). W sumie testy te objęły wszystkie etapy życia Drosophila i umożliwiły ocenę zaburzeń endokrynologicznych we wszystkich procesach za pośrednictwem hormonów. Testy płodności/płodności i czasu rozwoju były przydatne do pomiaru wpływu EDC odpowiednio na wydajność reprodukcyjną muszki i na etapy rozwojowe. Wreszcie, test długości życia obejmował przewlekłe narażenie na EDC u dorosłych i mierzył ich przeżywalność. Jednak na te cechy życiowe może mieć również wpływ kilka czynników eksperymentalnych, które musiały być dokładnie kontrolowane. Dlatego w tej pracy sugerujemy szereg procedur, które zoptymalizowaliśmy pod kątem prawidłowego wyniku tych testów. Metody te pozwalają naukowcom ustalić zaburzenia endokrynologiczne dla dowolnego EDC lub dla mieszaniny różnych EDC u Drosophila, chociaż aby zidentyfikować mechanizm endokrynologiczny odpowiedzialny za ten efekt, potrzebne mogą być dalsze eseje.

W tej sekcji kluczowe kroki powyższych protokołów przedstawiono w formie uproszczonych schematów. Ze względu na to, że muchówki mają tendencję do unikania związków o nieprzyjemnym smaku, w pierwszej kolejności należy zbadać smak wybranego EDC. Można to zrobić, mieszając barwnik spożywczy (na przykład czerwony barwnik spożywczy nr 40)35 z pożywką uzupełnionej o wybrany EDC w różnych dawkach lub z samym rozpuszczalnikiem. Muchówki karmione na tych podłożach bada się pod stereomikroskopem, a pobór po...

Chemikalia zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC) stanowią poważny problem dla organizmów i środowiska naturalnego. Drosophila melanogaster stanowi idealny model do badania efektów EDC in vivo. W tym miejscu przedstawiamy metody badania zaburzeń endokrynologicznych u Drosophila, odnosząc się do wpływu EDC na płodność, płodność, czas rozwoju i długość życia muchy.

Metody badania zaburzeń endokrynologicznych u Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Drosophila melanogaster jest potężnym modelem do oceny in vivo potencjalnych toksycznych i endokrynologicznych skutków chemikaliów, takich jak substancje zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego, które stanowią poważny problem dla zdrowia ludzkiego i środowiska naturalnego. Zajęcie się wpływem EDC na hormonalne cechy życia muchy, takie jak płodność, płodność, czas rozwoju i długość życia. Jest to łatwy, tani i szybki sposób badania zaburzeń endokrynologicznych in vivo.Na płodność, rozwój i długość życia Drosophila może mieć wpływ kilka czynników, które muszą być dokładnie kontrolowane, aby zapewnić pomyślny wynik tego protokołu. Dlatego wymagana jest maksymalna ostrożność podczas hodowli i obchodzenia się z muchami. Aby ocenić smak wybranego EDC, po znieczuleniu przenieś 15 młodych much z łoża muchy do czterech równoległych fiolek zawierających pożywkę z mąki kukurydzianej zmieszaną z barwnikiem spożywczym.Fiolka kontrolna zawiera sam rozpuszczalnik, a trzy pozostałe fiolki są uzupełnione różnymi dawkami wybranych EDC. Przechowywać fiolki w wilgotnym inkubatorze przez jeden dzień przy naturalnym 12-godzinnym świetle. Po ponownym znieczuleniu muszek przenieś unieruchomione muchy na biały papier i umieść je pod mikroskopem stereoskopowym w celu obserwacji.Porównaj zabarwienie brzucha w każdej grupie leczonej w odniesieniu do grupy kontrolnej. Aby ocenić wydajność reprodukcyjną much, przygotuj trzy fiolki much dla każdego EDC jako fiolki rodzicielskie, z ośmioma samicami i czterema samcami w 10 mililitrach pożywki z mąki kukurydzianej uzupełnionej EE2. Do kontroli przygotuj sześć fiolek much, każda z ośmioma samicami i czterema samcami w 10 mililitrach pożywki z mąki kukurydzianej uzupełnionej rozpuszczalnikiem EE2.Tył leci w inkubatorze w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Podczas ich rozwoju unikaj przepełnienia larw. Po czterech dniach odwróć każdą fiolkę nad eteryzatorem, aby usunąć rodziców i zwróć fiolki do inkubatora na kolejne pięć dni.Późnym popołudniem dziewiątego dnia odwróć każdą fiolkę nad eteryzatorem, aby usunąć wszystkie nowo pojawiające się muchy z fiolek i umieść fiolki w innym inkubatorze w temperaturze 18 stopni Celsjusza na noc. Rankiem 10 dnia, na stanowisku pracy z dwutlenkiem węgla Drosophila, ostrożnie odwrócić fiolkę z hodowlą, aby zapobiec wpadnięciu znieczulonych much na podłoże i włożyć gumową rurkę z igłą do fiolki między bawełnianym korkiem a ścianką fiolki. Otwórz zawór, aby dostarczyć dwutlenek węgla.W ciągu kilku sekund przenieś muchy na łóżko muchowe pod mikroskopem. Zbierz dziewicze samice i młode samce osobno w dwie grupy na łóżku muchowym. Losowo podziel każdą grupę much na małe podgrupy, z 10 samicami lub 20 samcami na fiolkę wypełnioną świeżą odpowiednią pożywką z mąki kukurydzianej.Kontynuować inkubację i zebrać 30 dziewiczych samic i 30 samców na każde EDC oraz 90 dziewiczych samic i 90 samców do kontroli. Trzymaj te grupy much w temperaturze 25 stopni Celsjusza, dopóki nie osiągną wieku czterech dni po ekluzji. Następnie co dwa dni przenosić je do nowych fiolek zawierających świeżą odpowiednią pożywkę.Sprawdź, czy w fiolkach samic nie ma larw. Następnie oznaczyć fiolki inną serią kolejnych numerów dla następnego zabiegu. Po znieczuleniu przenieś jedną samicę potraktowaną rozpuszczalnikiem EE2 do małej fiolki zawierającej świeżą pożywkę pomidorową z mąki kukurydzianej bez EE2 i dodaj jednego samca potraktowanego rozpuszczalnikiem EE2 w celu kontroli w poprzek.Sparuj samca poddanego działaniu EE2 z samicą poddaną działaniu rozpuszczalnika EE2 lub samicę poddaną działaniu EE2 z samcem poddanym działaniu rozpuszczalnika EE2 dla każdego zabiegu. Dom 20 pojedynczych krzyży w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Każdą parę kryjącą należy codziennie przez kolejne 10 dni przenosić do fiolek ze świeżymi pomidorami kukurydzianymi bez EDC.Codziennie sprawdzaj wzrokowo każdą fiolkę pod kątem komórek jajowych i podaj ich liczbę w arkuszu kalkulacyjnym płodności. W każdej fiolce należy dokładnie sprawdzić, czy nie pojawiły się muchy i zapisać dzienną liczbę dorosłych osobników w okresie 10 dni. Po 10 dniach od pierwszego krycia usuń zwierzęta rodzicielskie z ostatniej serii fiolek.W protokołach testów eklozji, najpierw, dla każdej grupy leczonej, ustaw 10 fiolek młodych, zdrowych much w wieku poniżej dwóch dni, każda z sześcioma samicami i trzema samcami w 10 mililitrach pokarmu z mąki kukurydzianej bez EDC. Hoduj muchy na pokarmie przez 24 godziny i pozwól im się kojarzyć. Następnie przygotuj kolejne 10 równoległych fiolek na grupę badaną po 10 mililitrów każdej świeżej mąki kukurydzianej uzupełnionej różnymi stężeniami EDC lub samym rozpuszczalnikiem EE2 do kontroli.Przenieść sparowane muchy do tych nowych fiolek. Zrób rozwojowy arkusz kalkulacyjny, aby nagrać różne serie. Pozwól muchom złożyć jaja przez 16 godzin.Następnie należy wyjąć elementy rodzicielskie z fiolek. Inkubuj fiolki w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez trzy do czterech dni lub do momentu, gdy pojawią się wędrujące larwy. Każdego dnia policz liczbę nowych poczwarek w każdej fiolce, zapisując liczbę po kolei przez każdą poczwarkę na zewnątrz fiolki, aby uniknąć dwukrotnego liczenia tej samej poczwarki.Zgłaszaj liczbę nowo powstałych poczwarek przez trzy do czterech dni lub do momentu, gdy nie utworzy się więcej poczwarek. Począwszy od dziewiątego dnia, codziennie licz liczbę pojawiających się dorosłych osobników, aż nie pojawią się już żadne dorosłe. Zgłoś to w rozwojowym arkuszu kalkulacyjnym i wykonaj resztę testu eklozji zgodnie z manuskryptem.W protokole długości życia najpierw ustaw 20 fiolek z ośmioma samicami i czterema samcami, z których każda jest wypełniona 10 mililitrami mąki kukurydzianej i umieść je w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Po czterech dniach należy wyrzucić muchy i umieścić fiolki z powrotem w inkubatorze. Późnym popołudniem dziewiątego dnia należy usunąć wszystkie nowo pojawiające się muchy z fiolek i umieścić je z powrotem w inkubatorze.Po 16 do 24 godzinach podziel 250 jednodniowych dorosłych much obu płci na cztery grupy w lekkim znieczuleniu dwutlenkiem węgla i przenieś je do 250-mililitrowych butelek zawierających pokarm dla dorosłych, trzy uzupełnione różnymi stężeniami EDC i jedną z samym rozpuszczalnikiem EE2. Utrzymuj muchy w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez dwa do trzech dni, aby umożliwić im łączenie się w pary. Następnie posortuj każdą kohortę much według płci na dwie grupy.W ramach każdego warunku leczenia, dla obu płci, losowo podzielić każdą grupę na pięć równoległych fiolek o gęstości 20 osobników na fiolkę. Przygotuj arkusz kalkulacyjny długości życia, w którym liczba martwych much jest odejmowana od liczby much, które przeżyły z poprzedniego transferu, tak aby automatycznie uzyskiwana była liczba ocalałych przy każdym transferze. Po trzech dniach przenieś muszki bez znieczulenia do nowych fiolek zawierających odpowiedni pokarm w tym samym czasie i sprawdź, czy nie padły.Zapisz wiek much i liczbę martwych much. Powtarzaj transfer co trzy dni, aż wszystkie muchy umrą. W tym eksperymencie krzywe długości życia zostały wykreślone jako skumulowany czas przeżycia w funkcji dni, które upłynęły dla każdego stężenia EDC i kontroli.W przypadku grupy kontrolnej, po długim okresie początkowym, w którym krzywa przeżycia pozostawała stosunkowo wysoka, zmniejszyła się wykładniczo po około 60 dniach. Po ekspozycji na EDC krzywa przeżywalności leczonych much uległa znacznemu pogorszeniu i wykazała dramatyczny spadek po 36 dniach. Zaleca się, aby analizowane równoległe fiolki były bardzo podobne, w przeciwnym razie trudno będzie zrozumieć, które należy wyrzucić.Dlatego sugerujemy zachowanie dużej ostrożności, przyjęcie dobrej praktyki eksperymentalnej, przy użyciu dużej wielkości próby. Zgodnie z tymi protokołami możliwa jest również ocena międzypokoleniowego wpływu wybranego czynnika zaburzającego funkcjonowanie układu hormonalnego, a także przetestowanie potencjalnych skutków addytywnych połączenia różnych substancji zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego.

methods-to-test-endocrine-disruption-in-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Zasobniki konserwowanych szlaków sygnalizacji insulinowej występujące u muszki owocówki Drosophila melanogaster sprawiają, że organizm ten jest potencjalnym narzędziem do modelowania zaburzeń metabolicznych, w tym cukrzycy typu II. W związku z tym kluczowe jest opracowanie testów fizjologicznych pozwalających na skuteczne pomiary ogólnoustrojowego działania insuliny w zakresie obwodowej utylizacji glukozy u dorosłych much.

Wstrzykiwanie insuliny i pobieranie hemolimfy w celu pomiaru wrażliwości na insulinę u dorosłych Drosophila melanogaster

Naukowcy używają protokołu długości życia Drosophila do mierzenia, jak różne warunki eksperymentalne wpływają na długowieczność muszek i generowania krzywych przeżycia w tym procesie, aby określić ilościowo wyniki eksperymentu. Protokół próbki obejmuje test stosowany do badania wpływu narażenia na długowieczność substancji chemicznych zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego lub EDC, takich jak 17-α-etynyloestradiol (EE2).

Protokół długości życia dla Drosophila melanogaster: generowanie krzywych przeżycia w celu identyfikacji różnic w długości życia much

Ten film opisuje test karmienia muszek owocowych, w którym kolorowy pokarm jest używany do monitorowania karmienia oraz wpływ, jaki dodane związki mogą mieć na aktywność żywieniową. Przykładowy protokół testuje działanie kilku substancji chemicznych zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC).

Test żywieniowy: ocena preferencji żywieniowych u Drosophila melanogaster

Wprowadzenie małych cząsteczek do rozwijającego się zarodka Drosophila daje ogromne możliwości do charakteryzowania aktywności biologicznej nowych związków, leków i toksyn, a także do badania podstawowych ścieżek rozwojowych. Opisane tu metody nakreślają kroki, które pokonują naturalne bariery dla tego podejścia, rozszerzając użyteczność modelu zarodka Drosophila.

Metoda przenikania zarodków Drosophila do oznaczania aktywności drobnocząsteczkowej

W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół wystawiania gatunków z rodzaju Drosophila na zanieczyszczenia w celu zbadania wpływu ekspozycji na szereg wyników fenotypowych w różnych stadiach rozwoju i dla więcej niż jednego pokolenia.

Protokół doświadczalny wykorzystania Drosophila jako modelowego systemu bezkręgowców do badań toksyczności w laboratorium

Ten protokół opisuje metodę rejestrowania malejącej aktywności elektrycznej ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster, aby umożliwić ekonomiczne i wygodne testowanie środków farmakologicznych, mutacji genetycznych białek nerwowych i/lub roli niezbadanych ścieżek fizjologicznych.

Elektrofizjologiczny zapis aktywności ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym

Ten protokół ma na celu ocenę żywotności Drosophila na każdym etapie rozwoju, od zarodka do dorosłego osobnika. Metoda ta może być stosowana do określania i porównywania żywotności różnych genotypów lub warunków wzrostu.

Bezpośrednia i prosta metoda oceny żywotności Drosophila melanogaster od zarodka do dorosłego osobnika

Integralność bariery krew-mózg jest kluczowa dla funkcjonowania układu nerwowego. U Drosophila melanogaster bariera krew-mózg jest tworzona przez komórki glejowe podczas późnej embriogenezy. Protokół ten opisuje metody oznaczania tworzenia i utrzymywania bariery krew-mózg w zarodkach D. melanogaster i larwach trzeciego stadium rozwojowego.

Test integralności bariery krew-mózg u Drosophila melanogaster

Ten protokół opisuje efektywną i tanią metodę, która wykorzystuje płynne podłoża do oceny wpływu chemicznych substancji toksycznych na żywotność dorosłego Drosophila melanogaster.

Ocena toksyczności chemicznej u dorosłych osobników Drosophila melanogaster

Tutaj opisana jest metoda karmienia Drosophila melanogaster lekami i ekstraktami roślinnymi oraz oceny ich wpływu na przewód pokarmowy poprzez analizę złogów kałowych muszek. Muchy leczone lekami mogą być wykorzystane jako model do dalszych badań.

Ocena wpływu leków przeciwbiegunkowych i ekstraktów roślinnych na Drosophila melanogaster

Protokół przedstawia wysokoprzepustową, opłacalną metodę oceny neurotoksyczności u muszki owocowej poprzez kwantyfikację dysfunkcji lokomotorycznej jako alternatywę dla tradycyjnych modeli ssaków. Ma na celu ocenę neurotoksycznego wpływu związków farmaceutycznych, czynników środowiskowych lub modyfikacji genetycznych przy użyciu czułego, powtarzalnego i etycznie korzystnego modelu.

Analiza behawioralna dysfunkcji narządu ruchu u Drosophila melanogaster jako odczyt neurotoksyczności

Poznaj metody badania wpływu chemicznych zaburzaczy endokrynnych na płodność, rozwój i długość życia u Drosophila melanogaster. Protokół ten pozwala ocenić toksyczność in vivo.

Metody badania zaburzeń endokrynologicznych u Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów