Metody badania zaburzeń endokrynologicznych u Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster jest potężnym modelem do oceny in vivo potencjalnych toksycznych i endokrynologicznych skutków chemikaliów, takich jak substancje zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego, które stanowią poważny problem dla zdrowia ludzkiego i środowiska naturalnego. Zajęcie się wpływem EDC na hormonalne cechy życia muchy, takie jak płodność, płodność, czas rozwoju i długość życia. Jest to łatwy, tani i szybki sposób badania zaburzeń endokrynologicznych in vivo.

Na płodność, rozwój i długość życia Drosophila może mieć wpływ kilka czynników, które muszą być dokładnie kontrolowane, aby zapewnić pomyślny wynik tego protokołu. Dlatego wymagana jest maksymalna ostrożność podczas hodowli i obchodzenia się z muchami. Aby ocenić smak wybranego EDC, po znieczuleniu przenieś 15 młodych much z łoża muchy do czterech równoległych fiolek zawierających pożywkę z mąki kukurydzianej zmieszaną z barwnikiem spożywczym.

Fiolka kontrolna zawiera sam rozpuszczalnik, a trzy pozostałe fiolki są uzupełnione różnymi dawkami wybranych EDC. Przechowywać fiolki w wilgotnym inkubatorze przez jeden dzień przy naturalnym 12-godzinnym świetle. Po ponownym znieczuleniu muszek przenieś unieruchomione muchy na biały papier i umieść je pod mikroskopem stereoskopowym w celu obserwacji.

Porównaj zabarwienie brzucha w każdej grupie leczonej w odniesieniu do grupy kontrolnej. Aby ocenić wydajność reprodukcyjną much, przygotuj trzy fiolki much dla każdego EDC jako fiolki rodzicielskie, z ośmioma samicami i czterema samcami w 10 mililitrach pożywki z mąki kukurydzianej uzupełnionej EE2. Do kontroli przygotuj sześć fiolek much, każda z ośmioma samicami i czterema samcami w 10 mililitrach pożywki z mąki kukurydzianej uzupełnionej rozpuszczalnikiem EE2.

Tył leci w inkubatorze w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Podczas ich rozwoju unikaj przepełnienia larw. Po czterech dniach odwróć każdą fiolkę nad eteryzatorem, aby usunąć rodziców i zwróć fiolki do inkubatora na kolejne pięć dni.

Późnym popołudniem dziewiątego dnia odwróć każdą fiolkę nad eteryzatorem, aby usunąć wszystkie nowo pojawiające się muchy z fiolek i umieść fiolki w innym inkubatorze w temperaturze 18 stopni Celsjusza na noc. Rankiem 10 dnia, na stanowisku pracy z dwutlenkiem węgla Drosophila, ostrożnie odwrócić fiolkę z hodowlą, aby zapobiec wpadnięciu znieczulonych much na podłoże i włożyć gumową rurkę z igłą do fiolki między bawełnianym korkiem a ścianką fiolki. Otwórz zawór, aby dostarczyć dwutlenek węgla.

W ciągu kilku sekund przenieś muchy na łóżko muchowe pod mikroskopem. Zbierz dziewicze samice i młode samce osobno w dwie grupy na łóżku muchowym. Losowo podziel każdą grupę much na małe podgrupy, z 10 samicami lub 20 samcami na fiolkę wypełnioną świeżą odpowiednią pożywką z mąki kukurydzianej.

Kontynuować inkubację i zebrać 30 dziewiczych samic i 30 samców na każde EDC oraz 90 dziewiczych samic i 90 samców do kontroli. Trzymaj te grupy much w temperaturze 25 stopni Celsjusza, dopóki nie osiągną wieku czterech dni po ekluzji. Następnie co dwa dni przenosić je do nowych fiolek zawierających świeżą odpowiednią pożywkę.

Sprawdź, czy w fiolkach samic nie ma larw. Następnie oznaczyć fiolki inną serią kolejnych numerów dla następnego zabiegu. Po znieczuleniu przenieś jedną samicę potraktowaną rozpuszczalnikiem EE2 do małej fiolki zawierającej świeżą pożywkę pomidorową z mąki kukurydzianej bez EE2 i dodaj jednego samca potraktowanego rozpuszczalnikiem EE2 w celu kontroli w poprzek.

Sparuj samca poddanego działaniu EE2 z samicą poddaną działaniu rozpuszczalnika EE2 lub samicę poddaną działaniu EE2 z samcem poddanym działaniu rozpuszczalnika EE2 dla każdego zabiegu. Dom 20 pojedynczych krzyży w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Każdą parę kryjącą należy codziennie przez kolejne 10 dni przenosić do fiolek ze świeżymi pomidorami kukurydzianymi bez EDC.

Codziennie sprawdzaj wzrokowo każdą fiolkę pod kątem komórek jajowych i podaj ich liczbę w arkuszu kalkulacyjnym płodności. W każdej fiolce należy dokładnie sprawdzić, czy nie pojawiły się muchy i zapisać dzienną liczbę dorosłych osobników w okresie 10 dni. Po 10 dniach od pierwszego krycia usuń zwierzęta rodzicielskie z ostatniej serii fiolek.

W protokołach testów eklozji, najpierw, dla każdej grupy leczonej, ustaw 10 fiolek młodych, zdrowych much w wieku poniżej dwóch dni, każda z sześcioma samicami i trzema samcami w 10 mililitrach pokarmu z mąki kukurydzianej bez EDC. Hoduj muchy na pokarmie przez 24 godziny i pozwól im się kojarzyć. Następnie przygotuj kolejne 10 równoległych fiolek na grupę badaną po 10 mililitrów każdej świeżej mąki kukurydzianej uzupełnionej różnymi stężeniami EDC lub samym rozpuszczalnikiem EE2 do kontroli.

Przenieść sparowane muchy do tych nowych fiolek. Zrób rozwojowy arkusz kalkulacyjny, aby nagrać różne serie. Pozwól muchom złożyć jaja przez 16 godzin.

Następnie należy wyjąć elementy rodzicielskie z fiolek. Inkubuj fiolki w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez trzy do czterech dni lub do momentu, gdy pojawią się wędrujące larwy. Każdego dnia policz liczbę nowych poczwarek w każdej fiolce, zapisując liczbę po kolei przez każdą poczwarkę na zewnątrz fiolki, aby uniknąć dwukrotnego liczenia tej samej poczwarki.

Zgłaszaj liczbę nowo powstałych poczwarek przez trzy do czterech dni lub do momentu, gdy nie utworzy się więcej poczwarek. Począwszy od dziewiątego dnia, codziennie licz liczbę pojawiających się dorosłych osobników, aż nie pojawią się już żadne dorosłe. Zgłoś to w rozwojowym arkuszu kalkulacyjnym i wykonaj resztę testu eklozji zgodnie z manuskryptem.

W protokole długości życia najpierw ustaw 20 fiolek z ośmioma samicami i czterema samcami, z których każda jest wypełniona 10 mililitrami mąki kukurydzianej i umieść je w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Po czterech dniach należy wyrzucić muchy i umieścić fiolki z powrotem w inkubatorze. Późnym popołudniem dziewiątego dnia należy usunąć wszystkie nowo pojawiające się muchy z fiolek i umieścić je z powrotem w inkubatorze.

Po 16 do 24 godzinach podziel 250 jednodniowych dorosłych much obu płci na cztery grupy w lekkim znieczuleniu dwutlenkiem węgla i przenieś je do 250-mililitrowych butelek zawierających pokarm dla dorosłych, trzy uzupełnione różnymi stężeniami EDC i jedną z samym rozpuszczalnikiem EE2. Utrzymuj muchy w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez dwa do trzech dni, aby umożliwić im łączenie się w pary. Następnie posortuj każdą kohortę much według płci na dwie grupy.

W ramach każdego warunku leczenia, dla obu płci, losowo podzielić każdą grupę na pięć równoległych fiolek o gęstości 20 osobników na fiolkę. Przygotuj arkusz kalkulacyjny długości życia, w którym liczba martwych much jest odejmowana od liczby much, które przeżyły z poprzedniego transferu, tak aby automatycznie uzyskiwana była liczba ocalałych przy każdym transferze. Po trzech dniach przenieś muszki bez znieczulenia do nowych fiolek zawierających odpowiedni pokarm w tym samym czasie i sprawdź, czy nie padły.

Zapisz wiek much i liczbę martwych much. Powtarzaj transfer co trzy dni, aż wszystkie muchy umrą. W tym eksperymencie krzywe długości życia zostały wykreślone jako skumulowany czas przeżycia w funkcji dni, które upłynęły dla każdego stężenia EDC i kontroli.

W przypadku grupy kontrolnej, po długim okresie początkowym, w którym krzywa przeżycia pozostawała stosunkowo wysoka, zmniejszyła się wykładniczo po około 60 dniach. Po ekspozycji na EDC krzywa przeżywalności leczonych much uległa znacznemu pogorszeniu i wykazała dramatyczny spadek po 36 dniach. Zaleca się, aby analizowane równoległe fiolki były bardzo podobne, w przeciwnym razie trudno będzie zrozumieć, które należy wyrzucić.

Dlatego sugerujemy zachowanie dużej ostrożności, przyjęcie dobrej praktyki eksperymentalnej, przy użyciu dużej wielkości próby. Zgodnie z tymi protokołami możliwa jest również ocena międzypokoleniowego wpływu wybranego czynnika zaburzającego funkcjonowanie układu hormonalnego, a także przetestowanie potencjalnych skutków addytywnych połączenia różnych substancji zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego.