Mysi model niedoboru estrogenów in vivo do badań przesiewowych egzogennych metod leczenia estrogenów dysfunkcji układu krążenia po menopauzie
13 sierpnia 2019
Klinicznie, niedobór estrogenu u kobiet w okresie menopauzy może nasilać występowanie zaburzeń lipidowych i miażdżycy. Ustaliliśmy model niedoboru estrogenu in vivo za pomocą obustronnej owariektomii poprzez podwójne nacięcie grzbietowo-boczne u myszy apoE-/-. Model mysi ma zastosowanie do badań przesiewowych egzogennych metod leczenia estrogenów w dysfunkcji układu krążenia po menopauzie.
Brakuje modeli laboratoryjnych z udziałem myszy z niedoborem estrogenu prezentujących dane dotyczące miażdżycy. Procedura ta jest szczególnie pomocna w badaniach przesiewowych egzogennych metod leczenia estrogenów w kierunku dysfunkcji układu krążenia po menopauzie. Główną zaletą tej techniki jest to, że owariektomia bez podwójnego nacięcia grzbietowo-bocznego jest łatwiejszą, mniej czasochłonną metodą, która pozwala uniknąć poważnego zrostu i stanu zapalnego jamy brzusznej.
Procedurę zademonstruje Yue-Zhang Yin, doktorant z mojego laboratorium. Aby wykonać obustronną owariektomię u myszy z nokautem APOE, najpierw potwierdź brak reakcji na odruch pedałowania i umieść zwierzę w pozycji leżącej na poduszce grzewczej. Nałóż maść na oczy zwierzęcia i przykryj zwierzę obłożeniem chirurgicznym.
Wykonaj jednocentymetrowe nacięcie boczne do linii środkowej i jeden centymetr bocznie do żeber żebrowych i użyj kleszczy, aby tępo wyciąć tkankę podskórną. Za pomocą okularów preparacyjnych zidentyfikuj białą tkankę tłuszczową w jamie brzusznej. Za pomocą mikronożyczek i mikrokleszczyków wykonaj od 0,5 do jednego centymetra nacięcie przez powięź, aż do dotarcia do jamy brzusznej, a następnie użyj mikro kleszczyków, aby delikatnie cofnąć białą tkankę tłuszczową.
W obrębie jamy brzusznej należy zaobserwować różowy jajnik w kształcie morwy, owinięty tkanką tłuszczową. Użyj szwu monofilamentowego, aby podwiązać naczynie proksymalne o długości od 0,5 do jednego centymetra i róg macicy, a następnie użyj mikronożyczek do pobrania jajnika. Zwróć pozostałą tkankę do jamy brzusznej i użyj indywidualnych szwów monofilamentowych, aby oddzielnie zamknąć warstwy mięśni i skóry.
Następnie zbierz jajnik po przeciwnej stronie zwierzęcia, jak właśnie pokazano, i pozwól myszy dojść do siebie na poduszce grzewczej z monitorowaniem, aż do pełnego leżenia. Raz w tygodniu, od tygodnia poprzedzającego do 12 tygodni po operacji, mierz masę ciała każdego zwierzęcia pozorowanego i doświadczalnego na wadze. W celu pomiaru stężenia cholesterolu całkowitego i trójglicerydów w osoczu, w 12. tygodniu należy przygotować brzuszną część klatki piersiowej za pomocą 70% etanolu i wprowadzić igłę o rozmiarze 25 do prawej komory.
Odsysać powoli, aż jeden mililitr krwi wpłynie do strzykawki, a następnie dozować próbkę do 1,5 mililitrowej probówki zbiorczej zawierającej dziesięć mikrolitrów 0,5-molowego EDTA. Dokładnie odwróć probówkę kilka razy, aby wymieszać EDTA z krwią i natychmiast umieść probówkę na lodzie. W ciągu 30 minut od pobrania odwirować próbkę przez 20 minut w temperaturze 400 razy G i czterech stopniach Celsjusza.
Ostrożnie zebrać supernatant osocza do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby wyizolować aortę, w 12. tygodniu należy przymocować igłę o rozmiarze 25 do 50-mililitrowej strzykawki wypełnionej PBS i wprowadzić igłę do lewej komory zwierzęcia doświadczalnego. Przetnij prawy przedsionek, aby uniknąć wysokiego ciśnienia podczas perfuzji i wykonaj perfuzję tkanki serca z szybkością przepływu od 05 do 08 mililitrów PBS na minutę.
Wchłoń płyn perfuzyjny za pomocą tkanek laboratoryjnych i użyj nożyczek i kleszczy, aby usunąć żebra i płuca. Otwórz jamę brzuszną, aby usunąć narządy wewnętrzne, aby uzyskać lepszy widok aorty. Chwyć serce mikrokleszkami, aby umożliwić oddzielenie aorty grzbietowo, od kręgosłupa, aż do rozwidlenia biodrowego.
Następnie utrwal serce i aortę na 48 godzin w 4% paraformaldehydzie, a następnie przechowuj próbkę tkanki w soli fizjologicznej w temperaturze pokojowej lub w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza przez kilka godzin. Po dwunastu tygodniach diety wysokocholesterolowej myszy po owariektomii wykazują niezwykły wzrost stężenia cholesterolu całkowitego i trójglicerydów w osoczu. Myszy po owariektomii, podawane doustnie z 17-beta estradiolem lub PPD w postaci pasty z orzechów laskowych, wykazują znacznie niższe stężenie cholesterolu całkowitego w osoczu niż myszy operowane pozorami.
Poziom trójglicerydów w osoczu zmniejsza się u myszy po owariektomii, podawanym doustnie z 17-beta estradiolem, ale nie z PPD. Podczas gdy u myszy po owariektomii obserwuje się tendencję do zwiększania masy ciała, w porównaniu z myszami operowanymi pozorowano, nie obserwuje się znaczących zmian w masie ciała ogółem między czterema grupami zwierząt. Maksymalna blaszka miażdżycowa aorty wstępującej jest zwiększona u myszy poddanych owariektomii w porównaniu ze wszystkimi innymi grupami, w połączeniu z ogólnym spadkiem czynności serca obserwowanym u tych zwierząt.
Co więcej, średni procent obszaru uszkodzenia aorty w stosunku do całego obszaru aorty jest znacznie zwiększony u myszy po owariektomii. Zgodnie z oczekiwaniami, obecność tych zmian zmniejsza się po zastosowaniu leczenia 17-beta estradiolem lub PPD. Głównym ryzykiem operacji wycięcia jajników jest podwiązanie moczowodu, co skutkuje wysoką śmiertelnością.
Pamiętaj również, aby ciąć głęboko w pobliżu gałęzi tętnicy nerkowej, aby uniknąć uszkodzenia aorty.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie ustanawia model niedoboru estrogenów in vivo z wykorzystaniem obustronnej owariektomii u myszy apoE -/-, aby zbadać dysfunkcję sercowo-naczyniową po menopauzie. Model ten jest szczególnie użyteczny w przesiewowych badaniach nad egzogennymi terapiami estrogenowymi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Zdrowie układu sercowo-naczyniowego
- Endokrynologia
Wstęp
- Niedobór estrogenów może nasilać zaburzenia gospodarki lipidowej oraz miażdżycę u kobiet w okresie menopauzy.
- Istniejące modele laboratoryjne służące do badania niedoboru estrogenów i tętnicowstępności są ograniczone.
- Owariektomia jest powszechną metodą indukowania niedoboru estrogenów w modelach zwierzęcych.
- Celem niniejszego badania jest udoskonalenie techniki owariektomii w celu zminimalizowania powikłań.
Cel badania
- Stworzenie wiarygodnego modelu do badania dysfunkcji sercowo-naczyniowych wynikających z niedoboru estrogenów.
- Ocena skuteczności egzogennej terapii estrogenowej.
- Udoskonalenie technik chirurgicznych indukujących niedobór estrogenów u myszy.
Zastosowane metody
- Obustronna owariektomia wykonana u myszy apoE -/-.
- Zastosowanie techniki podwójnego nacięcia grzbietowo-bocznego w celu zminimalizowania powikłań.
- Ocena reakcji myszy na odruch stopy w celu potwierdzenia znieczulenia.
- Nałożenie maści ochronnej na oczy podczas operacji.
Główne wyniki
- Technika owariektomii została przeprowadzona pomyślnie przy minimalnych powikłaniach.
- Model wykazał potencjał w badaniach przesiewowych nad terapiami estrogenowymi.
- Udoskonalone metody chirurgiczne zmniejszyły ryzyko zrostów w jamie brzusznej i stanów zapalnych.
- Wyniki wspierają dalsze badania nad dysfunkcjami układu sercowo-naczyniowego po menopauzie.
Wnioski
- Ustanowiony model jest skuteczny w badaniu niedoboru estrogenów.
- Udoskonalone techniki chirurgiczne zwiększają wiarygodność wyników.
- Niniejsze badanie przyczynia się do zrozumienia zdrowia układu sercowo-naczyniowego u kobiet w okresie menopauzy.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niedobór estrogenów u kobiet w okresie pomenopauzalnym zwiększa ryzyko sercowo-naczyniowe poprzez dysregulację lipidową i progresję miażdżycy. Wiarygodne modele in vivo są niezbędne do oceny bezpieczeństwa egzogennych terapii estrogenowych przed ich wdrożeniem do praktyki klinicznej. Ten model myszy apoE-/- po owariektomii umożliwia badanie mechanizmów działania fitoestrogenów i analogów estradiolu w zakresie ochrony układu sercowo-naczyniowego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezę terapeutyczną dotyczącą ochronnego działania estrogenów na układ sercowo-naczyniowy w modelach predysponowanych do miażdżycy.
- Wartość operacyjna: Zapewnia funkcjonalną walidację celów egzogennych estrogenów poprzez podawanie doustne w systemie istotnym dla przebiegu choroby.
- Wartość predykcyjna: Wspiera identyfikację związków wiodących poprzez porównanie skuteczności fitoestrogenów z punktami odniesienia dla 17β-estradiolu.
Przesiewy i rozwój testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe odczyty lipidów w osoczu oraz zmian w aorcie do przesiewowego badania związków.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzowane, powtarzalne podawanie doustne za pomocą kremu orzechowego w celu zapewnienia kompatybilności z wysokoprzepustowością.
- Gotowość testu: Dostarcza mierzalne punkty końcowe, w tym całkowity poziom cholesterolu, triglicerydy oraz powierzchnię zmian w aorcie do późniejszej walidacji trafień.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modeluje ryzyko sercowo-naczyniowe w okresie pomenopauzalnym u myszy apoE-/-, wykazujących progresję miażdżycy podobną do ludzkiej.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną, wykazując przeciwmiażdżycowe działanie PPD porównywalne z estradiollem.
- Minimalizacja ryzyka: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach przesiewowych terapii estrogenowej dzięki podłużnemu monitorowaniu lipidów i funkcji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten wpisuje się w kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, wspierając testowanie hipotez we wczesnej fazie odkrywania, opracowywanie testów dla kampanii przesiewowych oraz walidację translacyjną punktów końcowych układu sercowo-naczyniowego przed optymalizacją związku wiodącego.
- Biologia odkrywcza: Testuje hipotezy mechanistyczne dotyczące wpływu niedoboru estrogenów na metabolizm lipidów i patologię naczyniową.
- Przesiew: Dostarcza zestandaryzowanych wyników ilościowych do oceny egzogennych związków estrogenowych.
- Analityka: Zapewnia profilowanie lipidów w osoczu oraz wskaźniki funkcjonalne pochodzące z echokardiografii do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez wykazanie efektów kardioprotekcyjnych w modelach podatnych na miażdżycę.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnie wykorzystywalną platformę chirurgiczną i dawkującą dla programów przesiewowych w endokrynologii układu sercowo-naczyniowego.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności prognostycznej w walidacji celu dzięki ograniczeniu niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach sygnalizacji estrogenowej.
- Wartość operacyjna: Standaryzowana technika chirurgiczna oraz nieinwazyjna podaż peroralna zwiększają powtarzalność i skalowalność.
- Wartość strategiczna: Wsparcie decyzji go/no-go poprzez redukcję ryzyka późnych niepowodzeń biologicznych w hormonoterapii układu sercowo-naczyniowego.
- Wpływ na portfolio: Umożliwienie priorytetyzacji kandydatów z grupy fitoestrogenów o profilach przeciwnowotworowych i kardioprotekcyjnych z uwzględnieniem korekty ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach mikrochirurgicznych oraz monitorowaniu znieczulenia w modelach mysich.
- Zależne od precyzyjnego instrumentarium, w tym mikronozyczek, pęset i gogli do sekcji.
- Konieczna jest międzyzespołowa standaryzacja podawania dawek doustnie za pomocą kremu orzechowego oraz protokołów analizy lipidów osocza.
- W kwestii adaptacji należy rozważyć przydatność modelu dla innych szlaków reagujących na estrogeny poza punktami końcowymi układu sercowo-naczyniowego.
- Ograniczenia praktyczne obejmują ryzyko śmiertelności pooperacyjnej w wyniku podwiązania moczowodu, jeśli nie zostanie zachowany odpowiedni odstęp od tętnicy nerkowej.
