Name: Ocena komórkowej odpowiedzi immunologicznej muszki owocowej, Drosophila melanogaster, przy użyciu testu fagocytozy in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 50 s
Description: Poznaj test fagocytozy in vivo w Drosophila melanogaster do badania odpowiedzi immunologicznej na zakażenia mikrobowe. Ta metoda umożliwia ilościową analizę aktywności fagocytów i identyfikację genów regulujących fagocytozę.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr Beth Gonzalez i dr Aprajita Garg za wsparcie w przeprowadzaniu eksperymentów z fagocytozą in vivo. Prace te zostały sfinansowane ze środków NSF UMD ADVANCE Seed Grant oraz UMD NIH T32 Training Grants, Cell and Molecular Biology (CMB) oraz Host-Pathogen Interactions (HPI).

1. Przygotowanie cząsteczek fluoresceiny do wstrzyknięcia
<ol>
	<li>Zrekonstytuować 10 mg komercyjnie dostępnych, zabitych termicznie cząstek bakterii znakowanych fluoresceiną (patrz Tabela materiałów) do stężenia zapasu 10 mg/mL poprzez dodanie 990 µL sterylny 1x PBS oraz 10 µL 50 mM azotek sodu. Pomieszać za pomocą vortexa.
	<ol>
		<li>Podzielić na pojedyncze porcje do jednorazowego użycia 8 µL alikwoty w probówkach 0,2 ml i przechowywać w ciemnym pudełku w temperaturze 4 °C aby zminimalizować światłowrażliwość. 
		UWAGA: Konserwant w postaci azotku sodu jest opcjonalny i może zostać pominięty, jeśli roztwory stokowe o stężeniu 10 mg/mL zostaną przygotowane w 1 ml sterylnego 1x PBS, podzielone na alikwoty i przechowywane w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 10 ml 5% roztworu barwnika spożywczego w 1x PBS poprzez zmieszanie 500 µL przefiltrowany strzykawką zielony barwnik spożywczy oraz 9,5 ml sterylnego 1x PBS.</li>
	<li>Przemyć cząstki przed iniekcją w celu usunięcia azotku sodu. Wymieszać 42 µL sterylny 1x PBS oraz 8 µL o stężeniu 10 mg/mL w probówce o pojemności 1,7 ml. Wirować z maksymalną prędkością przez 2,5 min w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>Usunąć nadsącz, dodać 50 µL 1x PBS, a następnie wirować z maksymalną prędkością przez 2,5 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 1.3 i 1.3.1 dwukrotnie, aby w sumie przeprowadzić 3 przemycia.</li>
		<li>Po ostatnim przemyciu odlej nadsącz i zawieś ponownie cząstki do stężenia 1,6 mg/ml w 50 µL 5% barwnika spożywczego w 1x PBS.</li>
		<li>Owiń probówkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem. Przechowywać w temperaturze 4 °C, utylizować po 1 tygodniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie stanowiska do iniekcji i much
<ol>
	<li>Przygotuj podkładkę do iniekcji. Aby wstrzyknąć materiał do maksymalnie 4 genotypów much jednocześnie, użyj taśmy laboratoryjnej, aby podzielić prostokątną podkładkę do much CO2 na 4 sekcje. Na blacie obok mikroskopu wyznacz miejsca na fiolki, do których zostaną przeniesione muchy po ich ułożeniu w rzędzie na podkładce (po jednej dla każdego rogu podkładki).</li>
	<li>Przygotuj fiolki z muchami w tym samym wieku (od 4 do 7 dni) do iniekcji. Dla każdego testowanego szczepu przenieś 5 samców i 5 samic do nowej, oznakowanej fiolki z przygotowaną pożywką dla much i przechowuj w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Przygotuj pneumatyczny injektor (patrz Tabela materiałów), ustawiając instrument w trybie TIMED na 100 ms (krótkie impulsy ciśnienia gazu w celu wypchnięcia cieczy, co umożliwia podawanie objętości rzędu sub-nanolitrów).</li>
	<li>Przygotuj szkiełka mikroskopowe. Wytnij 1,5-calowe paski taśmy izolacyjnej, złóż je w pętlę stroną klejącą na zewnątrz i umieść na oznakowanym szkiełku mikroskopowym.</li>
</ol>
3. Przygotowanie szklanych igieł kapilarnych
<ol>
	<li>Wytwarzaj szklane igły (cienkościenne kapilary szklane) za pomocą wyciągacza do igieł.
	<ol>
		<li>Utrzymuj igłę pod mikroskopem za pomocą mikrometru i odłam końcówkę, używając stalowych pęset z cienkim czubkiem nr 5. Końcówki o średnicy 100 µm są wystarczające, aby przebić kutykulę muchy, minimalizując jednocześnie uszkodzenia.</li>
		<li>Zmierz objętość cieczy, która zostanie wstrzyknięta do każdej muchy. Napełnij igłę sterylnym 5% barwnikiem spożywczym w 1x PBS i wypuść ciecz na kroplę oleju mineralnego na mikrometr przedmiotowy 0,01 mm. 
		UWAGA: Jeśli kropla cieczy jest sferyczna, objętość w pikolitrach oblicza się jako (rozmiar)3/1910.30 Igła o średnicy 100 µm wypuści ~2 nL w ciągu 100 ms.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Iniekcja much
<ol>
	<li>Nanieś pipetą 10 µL cząsteczek o stężeniu 1,6 mg/mL na mały kwadrat parafilmu.
	<ol>
		<li>Wciągnij ciecz do igły i zamontuj ją w dyszy injektora (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Uśpij muchy za pomocą CO2 i ustaw je w wyznaczonym obszarze na podkładce do much (flypad), stroną brzuszną do góry, a głowami skierowanymi w stronę przodu podkładki. Umieść fiolki w odpowiednich miejscach na blacie.</li>
		<li>Wstrzyknij muchom w górnym rogu odwłoka ciecz za pomocą 5 pompek po 100 ms (~10 nL łącznie).</li>
		<li>Przenieś wstrzyknięte muchy do odpowiednich fiolek i zanotuj godzinę na fiolce. Przechowuj w temperaturze 25 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załaduj nową igłę 0,4% roztworem błękitu trypanowego.</li>
	<li>Ustaw injektor pneumatyczny w tryb GATED, co zapewnia stały przepływ powietrza wypychający ciecz z igły.</li>
	<li>Uśpij muchy po 30 min odpoczynku i wstrzykuj błękit trypanowy, aż odwłok będzie pełny i rozciągnięty. 
	UWAGA: Podczas badania dojrzewania fagosomów z użyciem cząsteczek znakowanych barwnikiem wrażliwym na pH, pozwól muchom odpoczywać przez 1 h i nie wstrzykuj błękitu trypanowego przed zamocowaniem much.</li>
	<li>Zamocuj muchy na szkiełkach przedmiotowych za pomocą taśmy izolacyjnej, stroną brzuszną do dołu. Odsuń skrzydła na bok i przymocuj je taśmą. Delikatnie dociśnij również głowę do taśmy, aby upewnić się, że mucha się nie przesunie.</li>
	<li>Przejdź niezwłocznie do kroku 5.</li>
</ol>
5. Obrazowanie much
<ol>
	<li>Wykonaj zdjęcia much, jedna po drugiej, przy powiększeniu 25x lub 32x, używając odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego podłączonego do kamery cyfrowej i komputera (patrz Tabela materiałów). Za pomocą oprogramowania kamery cyfrowej ustaw ostrość na naczynie grzbietowe muchy.</li>
	<li>Zapisz czas naświetlania oraz powiększenie pomiędzy poszczególnymi eksperymentami. 
	UWAGA: Pomylenie genotypów jest potencjalnym źródłem błędu podczas fotografowania wielu szczepów podczas jednej sesji. Aby uniknąć błędnego oznakowania much, zanotuj numery zdjęć pierwszej i ostatniej muchy dla każdego genotypu.</li>
</ol>
6. Ilościowe oznaczenie i normalizacja fluorescencji
<ol>
	<li>Uruchom oprogramowanie i otwieraj obrazy pojedynczo.
	<ol>
		<li>Zmierz intensywność fluorescencji naczynia grzbietowego. Obrysuj naczynie grzbietowe za pomocą wielokąta. Wybierz opcję Measure i zapisz wartość intensywności fluorescencji wewnątrz wielokąta.</li>
		<li>Wyznacz intensywność fluorescencji tła. Skopiuj pierwszy wielokąt i przesuń go na obszar sąsiadujący z naczyniem grzbietowym muchy. Wybierz opcję Measure i zapisz intensywność fluorescencji obszaru tła.</li>
		<li>Znormalizuj fluorescencję naczynia grzbietowego względem fluorescencji tła: 
		Naczynie grzbietowe ÷ tło.</li>
		<li>Oblicz średnią znormalizowaną intensywność fluorescencji naczynia grzbietowego dla wszystkich much w danej linii.</li>
		<li>Powtórz eksperyment jeszcze 2 razy.</li>
		<li>Użyj nieparzystego testu t Studenta, aby porównać średnie względne intensywności fluorescencji much kontrolnych i testowych z trzech eksperymentów. Oblicz wielkość efektu, korzystając ze wzoru: d Cohena = (M1-M2) ÷ SDpooled, gdzie M1 to średnia dla genotypu 1, a M2 to średnia dla genotypu 2 &amp; 
		SDpooled = <img alt="Wzór na odchylenie standardowe, równanie, obliczenia analizy statystycznej, pierwiastek z ((SD1^2 + SD2^2) / 2)." src="/files/ftp_upload/59543/59543eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie"> 
		gdzie SD1 to odchylenie standardowe dla genotypu 1, a SD2 to odchylenie standardowe dla genotypu 2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen+recognition+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pathogen recognition and innate immunity.</a> Cell. 124 (4), 783-801 (2006).</li>
<li>Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+host-pathogen+interactions+and+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Studying host-pathogen interactions and innate immunity in Caenorhabditis elegans.</a> Disease Models & Mechanisms. 1 (4-5), 205-208 (2008).</li>
<li>Lemaitre, B., Hoffmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+defense+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Immunology%22%5BJournal%5D)">The host defense of Drosophila melanogaster.</a> Annual Review Immunology. 25, 697-743 (2007).</li>
<li>Wu, L. P., Choe, K. M., Lu, Y., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Immunity%3A+Genes+on+the+Third+Chromosome+Required+for+the+Response+to+Bacterial+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection.</a> Genetics. 159 (1), 189-199 (2001).</li>
<li>De Gregorio, E., Spellman, P. T., Tzou, P., Rubin, G. M., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Toll+and+Imd+pathways+are+the+major+regulators+of+the+immune+response+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The Toll and Imd pathways are the major regulators of the immune response in Drosophila.</a> EMBO Journal. 21 (11), 2568-2579 (2002).</li>
<li>Michel, T., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A., Royet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Toll+is+activated+by+Gram-positive+bacteria+through+a+circulating+peptidoglycan+recognition+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila Toll is activated by Gram-positive bacteria through a circulating peptidoglycan recognition protein.</a> Nature. 414 (6865), 756-759 (2001).</li>
<li>Choe, K. M., Werner, T., Stoven, S., Hultmark, D., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+a+peptidoglycan+recognition+protein+%28PGRP%29+in+Relish+activation+and+antibacterial+immune+responses+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement for a peptidoglycan recognition protein (PGRP) in Relish activation and antibacterial immune responses in Drosophila.</a> Science. 296 (5566), 359-362 (2002).</li>
<li>Wu, J., Randle, K. E., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ird1+is+a+Vps15+homologue+important+for+antibacterial+immune+responses+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">ird1 is a Vps15 homologue important for antibacterial immune responses in Drosophila.</a> Cellular Microbiology. 9 (4), 1073-1085 (2007).</li>
<li>Lemaitre, B., Nicolas, E., Michaut, L., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dorsoventral+regulatory+gene+cassette+spatzle%2FToll%2Fcactus+controls+the+potent+antifungal+response+in+Drosophila+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults.</a> Cell. 86 (6), 973-983 (1996).</li>
<li>Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Toll+pathway+is+important+for+an+antiviral+response+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (20), 7257-7262 (2005).</li>
<li>Lemaitre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recessive+mutation%2C+immune+deficiency+%28imd%29%2C+defines+two+distinct+control+pathways+in+the+Drosophila+host+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A recessive mutation, immune deficiency (imd), defines two distinct control pathways in the Drosophila host defense.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 92 (21), 9465-9469 (1995).</li>
<li>Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+caspase+Dredd+is+required+to+resist+gram-negative+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection.</a> EMBO Reports. 1 (4), 353-358 (2000).</li>
<li>Meister, M., Lagueux, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophilablood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Drosophilablood cells.</a> Cellular Microbiology. 5 (9), 573-580 (2003).</li>
<li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Pathology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Annual Review Pathology. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Anderson, R. A., Sando, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+cDNA+encoding+human+lysosomal+acid+lipase%2Fcholesteryl+ester+hydrolase.+Similarities+to+gastric+and+lingual+lipases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of cDNA encoding human lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase. Similarities to gastric and lingual lipases.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (33), 22479-22484 (1991).</li>
<li>Ross, G. D., Reed, W., Dalzell, J. G., Becker, S. E., Hogg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+cytoskeleton+association+with+CR3+and+CR4+regulates+receptor+mobility+and+phagocytosis+of+iC3b-opsonized+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Macrophage cytoskeleton association with CR3 and CR4 regulates receptor mobility and phagocytosis of iC3b-opsonized erythrocytes.</a> Journal of Leukocyte Biology. 51 (2), 109-117 (1992).</li>
<li>Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+the+cellular+and+humoral+immune+responses+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila.</a> Current Biology. 10, 781-784 (2000).</li>
<li>Ramet, M., Pearson, A. M., Manfruelli, P., Li, X., Koziel, H., Gobel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Scavenger+Receptor+CI+Is+a+Pattern+Recognition+Receptor+for+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Drosophila Scavenger Receptor CI Is a Pattern Recognition Receptor for Bacteria.</a> Immunity. 15 (6), 1027-1038 (2001).</li>
<li>Ramet, M., Manfruelli, P., Pearson, A. M., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+phagocytosis+and+identification+of+a+Drosophila+receptor+for+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli.</a> Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).</li>
<li>Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+RNAi+screen+reveals+CD36+family+member+required+for+mycobacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection.</a> Science. 309, 1251-1253 (2005).</li>
<li>Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309 (5738), 1248-1251 (2005).</li>
<li>Stuart, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+to+Staphylococcus+aureus+requires+CD36-mediated+phagocytosis+triggered+by+the+COOH-terminal+cytoplasmic+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Response to Staphylococcus aureus requires CD36-mediated phagocytosis triggered by the COOH-terminal cytoplasmic domain.</a> Journal of Cell Biology. 170 (3), 477-485 (2005).</li>
<li>Stroschein-Stevenson, S. L., Foley, E., O’Farrell, P. H., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Drosophila+gene+products+required+for+phagocytosis+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of Drosophila gene products required for phagocytosis of Candida albicans.</a> PLoS Biology. 4 (1), e4(2006).</li>
<li>Kocks, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eater%2C+a+transmembrane+protein+mediating+phagocytosis+of+bacterial+pathogens+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Eater, a transmembrane protein mediating phagocytosis of bacterial pathogens in Drosophila.</a> Cell. 123 (2), 335-346 (2005).</li>
<li>Nehme, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+roles+of+the+cellular+and+humoral+responses+in+the+Drosophila+host+defense+against+three+gram-positive+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections.</a> PLoS One. 6 (3), e14743(2011).</li>
<li>Garver, L. S., Wu, J., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+peptidoglycan+recognition+protein+PGRP-SC1a+is+essential+for+Toll+signaling+and+phagocytosis+of+Staphylococcus+aureus+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The peptidoglycan recognition protein PGRP-SC1a is essential for Toll signaling and phagocytosis of Staphylococcus aureus in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (3), 660-665 (2006).</li>
<li>Garg, A., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Rab14+mediates+phagocytosis+in+the+immune+response+to+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus.</a> Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).</li>
<li>Gonzalez, E. A., Garg, A., Tang, J., Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glutamate-dependent+redox+system+in+blood+cells+is+integral+for+phagocytosis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A glutamate-dependent redox system in blood cells is integral for phagocytosis in Drosophila melanogaster.</a> Current Biology. 23 (22), 2319-2324 (2013).</li>
<li>Nazario-Toole, A. E., Robalino, J., Okrah, K., Corrada-Bravo, H., Mount, S. M., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Splicing+Factor+RNA-Binding+Fox+Protein+1+Mediates+the+Cellular+Immune+Response+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+%28Baltimore%2C+Md%3A+1950%29%22%5BJournal%5D)">The Splicing Factor RNA-Binding Fox Protein 1 Mediates the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Immunology (Baltimore, Md: 1950). 201 (4), 1154-1164 (2018).</li>
<li>Guille, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuille%2C+M+%22Molecular+Methods+in+Developmental+Biology%3A+Xenopus+and+Zebrafish%22">Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus and Zebrafish</a>. , Springer Science & Business Media. (1999).</li>
<li>Koundakjian, E. J., Cowan, D. M., Hardy, R. W., Becker, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zuker+collection%3A+a+resource+for+the+analysis+of+autosomal+gene+function+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Zuker collection: a resource for the analysis of autosomal gene function in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 167 (1), 203-206 (2004).</li>
<li>Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+ability+declines+with+age+in+adult+Drosophila+hemocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes.</a> Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).</li>
<li>Brennan, C. A., Delaney, J. R., Schneider, D. S., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psidin+is+required+in+Drosophila+blood+cells+for+both+phagocytic+degradation+and+immune+activation+of+the+fat+body%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Psidin is required in Drosophila blood cells for both phagocytic degradation and immune activation of the fat body.</a> Current Biology. 17 (1), 67-72 (2007).</li>
<li>Akbar, M. A., Tracy, C., Kahr, W. H., Kramer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+full-of-bacteria+gene+is+required+for+phagosome+maturation+during+immune+defense+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The full-of-bacteria gene is required for phagosome maturation during immune defense in Drosophila.</a> Journal of Cell Biology. 192 (3), 383-390 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dostępne na rynku, znakowane fluorescencyjnie cząstki są używane do ogólnej oceny fagocytozy (mikrosfery modyfikowane karboksylanem 0,2 μm) lub fagocytozy drobnoustrojów (znakowane fluorescencyjnie bakterie lub drożdże zabite termicznie lub chemicznie). Aby ocenić dojrzewanie fagosomu, naukowcy mogą wybrać cząstki znakowane barwnikiem wrażliwym na pH, który fluoryzuje, gdy pH spada z obojętnego do kwaśnego, jak w przypadku fagolizososomu. Alternatywnie, aby zbadać początkowe etapy fagocytozy, rozpoznawania i...

Wrodzona obrona immunologiczna stanowi pierwszą linię obrony przed drobnoustrojami chorobotwórczymi. Odpowiedzi te można funkcjonalnie podzielić na humoralną i komórkową odporność wrodzoną, w których pośredniczą receptory rozpoznawania wzorców kodowane przez linię zarodkową (PRR), które wyczuwają wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP)1. Wiele szlaków sygnałowych i mechanizmów efektorowych odporności wrodzonej jest zachowanych u ssaków i bezkręgowców, takich jak nicienie Caenorhabditis elegans i muszka owocowa Drosophila melanogaster2. Muszka owocowa stała się potężnym systemem do badania obrony gospodarza przed zakaźnymi mikroorganizmami3. Drosophila jest genetycznie podatna, łatwa i niedroga w hodowli w laboratoriach i ma krótki czas pokoleniowania. Co więcej, muszka owocowa wykazuje wysoce skuteczną obronę przed szeregiem drobnoustrojów, umożliwiając badanie odporności gospodarza na patogeny wirusowe, bakteryjne, grzybicze lub pasożytnicze.
Immunolodzy Drosophila historycznie wykorzystywali genetyczne badania przesiewowe, badania przesiewowe linii komórkowych owadów za pośrednictwem RNA w całym genomie oraz wcześniej istniejące zmutowane szczepy much do zbadania odporności wrodzonej - prowadząc do identyfikacji i scharakteryzowania kilku ewolucyjnie zachowanych humoralnych ścieżek immunologicznych4,5,6,7,8. Humalna wrodzona odpowiedź immunologiczna jest prawdopodobnie najlepiej scharakteryzowaną obroną immunologiczną u muszek owocowych. Po zakażeniu odpowiedź humoralna prowadzi do produkcji i ogólnoustrojowego uwalniania cząsteczek peptydu przeciwdrobnoustrojowego (AMP) do hemolimfy, odpowiednika krwi u owadów. AMP są wytwarzane przez wysoce konserwatywne szlaki sygnałowe Toll i Imd. Szlak Toll jest homologiczny do sygnalizacji receptora TLR / IL-1R u ssaków, a szlak Imd jest homologiczny do sygnalizacji czynnika martwicy nowotworu alfa u ssaków. U Drosophila sygnalizacja Toll jest indukowana przez bakterie Gram-dodatnie, grzyby i Drosophila X virus6,9,10, a sygnalizacja Imd jest indukowana przez bakterie Gram-ujemne11,12.
Odporność komórkowa, składająca się z enkapsulacji, melanizacji i fagocytozy inwazyjnych patogenów, przeprowadzana przez wyspecjalizowane komórki krwi zwane hemocytami13. W muszce owocowej występują trzy klasy hemocytów: komórki kryształowe, lamellocyty i plazmatocyty13. Komórki krystaliczne, które stanowią 5% krążących hemocytów w larwach, uwalniają enzymy profenolooksydazy (proPO), co prowadzi do melanizacji patogenów i tkanek gospodarza w miejscach ran. Blaszocyty, które zwykle nie występują w zdrowych zarodkach lub larwach, są przylegającymi komórkami, które otaczają ciała obce. Komórki te są indukowane podczas przepoczwarzania lub gdy pasożytujące jaja os są składane w larwach. Fagocytarne plazmatocyty, które stanowią 95% krążących hemocytów u larw i wszystkie pozostałe hemocyty u dorosłych, odgrywają rolę w przebudowie tkanek podczas rozwoju, a w szczególności służą jako główna komórka efektorowa odporności komórkowej Drosophila.
Fagocytoza natychmiastowa i kluczowa linia wrodzonej obrony immunologicznej; mikroby, które naruszają barierę nabłonkową gospodarza, są szybko pochłaniane i eliminowane przez fagocytarne komórki krwi (Aby uzyskać pełny przegląd biologii komórki fagocytozy, zobacz odniesienie 14). Proces ten jest inicjowany, gdy kodowane przez linię zarodkową receptory rozpoznawania wzorców (PRR) na hemocytach rozpoznają wzorce molekularne związane z patogenem (PAMP) drobnoustrojów. Po związaniu się ze swoimi celami, PRR inicjują kaskady sygnałowe, które prowadzą do tworzenia pseudopodów poprzez przebudowę cytoszkieletu aktynowego. Pseudopody otaczają drobnoustroj, który jest następnie pochłaniany i internalizowany w powstającą organellę, fagosom. Drobnoustroje są niszczone, gdy fagosom przechodzi proces dojrzewania fagosomu, gdy fagosom jest transportowany w kierunku wnętrza hemocytu i zakwasza się poprzez szereg interakcji z lizosomami. Badania in vitro i biologii komórki na pierwotnych komórkach ssaków odegrały zasadniczą rolę w identyfikacji i charakterystyce czynników regulujących fagocytozę, takich jak receptor Fc-gamma ssaków i receptory C3b15,16. Niemniej jednak możliwość wykonywania badań przesiewowych na dużą skalę lub badań in vivo jest ograniczona w systemach ssaków.
Tutaj prezentujemy test in vivo na fagocytozę u dorosłych muszek owocowych, który opiera się na procedurze po raz pierwszy wprowadzonej przez laboratorium Davida Schneidera w 2000 roku17. Laboratorium Schneidera wykazało, że siedzące hemocyty skupione wzdłuż naczynia grzbietowego brzucha łatwo fagocytozują kulki polistyrenowe i bakterie. Aby uwidocznić fagocytozę, muchom wstrzykuje się fluorescencyjnie znakowane cząstki (takie jak E. coli znakowane izotiocyjanianem fluoresceiny (E. coli-FITC)), inkubuje się przez 30 minut, aby dać hemocytom czas na pochłonięcie cząstek, a następnie wstrzykuje się im błękit trypanowy, który wygasza fluorescencję cząstek, które nie zostały fagocytozowane w okresie inkubacji. Naczynia grzbietowe much są następnie obrazowane za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Ten przełomowy artykuł, wykorzystując stosunkowo prosty eksperyment, wykazał, że hemocyty fagocytozy bakterie i kulki lateksowe, że fagocytoza bakteryjna może być hamowana przez wstępne wstrzyknięcie muchom kulek lateksowych i że muchy bez zarówno komórkowej, jak i humoralnej odpowiedzi immunologicznej są podatne nawet na E. coli. Test przedstawiony w tym raporcie opiera się na pracach laboratorium Schneidera mających na celu ilościowe określenie fagocytozy in vivo poprzez pomiar intensywności fluorescencji cząstek pochłoniętych przez hemocyty związane z naczyniem grzbietowym.
Podobnie jak w przypadku systemów ssaków, genetycy Drosophila początkowo używali badań przesiewowych RNAi in vitro w całym genomie do identyfikacji genów wymaganych do komórkowej odpowiedzi immunologicznej18,19,20,21,22,23. Jednak opracowanie testu fagocytozy u dorosłych osobników in vivo umożliwiło łatwe przeprowadzanie dalszych eksperymentów na całych zwierzętach, co umożliwiło naukowcom zweryfikowanie biologicznej roli czynników zidentyfikowanych w badaniach in vitro. Tak było w przypadku receptora transbłonowego Eater, który został po raz pierwszy zidentyfikowany jako receptor bakteryjny w badaniu przesiewowym RNAi przy użyciu komórek S224, a następnie wykazano, że pośredniczy w fagocytozie Escherichia coli (E. coli), Enterococcus faecalis i Staphylococcus aureus (S. aureus) u dorosłych25.
Nasze laboratorium wykorzystało test fagocytozy in vivo w badaniach genetycznych i badaniach asocjacyjnych całego genomu (przy użyciu Drosophila Genetic Reference Panel (DGRP)) do identyfikacji nowych genów regulujących fagocytozę u dorosłych hemocytów. Badania te doprowadziły do scharakteryzowania receptorów PGRP-SC1A i PGRP-SA26, białka transportu pęcherzyków wewnątrzkomórkowych Rab1427, transportera glutaminianu Polyphemus28 oraz białka wiążącego RNA Fox-129.
Przewidujemy, że przyszłe badania przesiewowe z wykorzystaniem fagocytozy in vivo mogą doprowadzić do identyfikacji dodatkowych genów, które są ważne dla komórkowej odpowiedzi immunologicznej u Drosophila. Badania przesiewowe wykorzystujące w pełni zsekwencjonowane linie wsobne, takie jak DGRP lub Drosophila Synthetic Population Resource (DSPR), mogą zidentyfikować naturalne warianty wpływające na fagocytozę lub rozwój hemocytów. Co więcej, technika ta może zostać zastosowana u innych gatunków Drosophila lub wykorzystana do badań przesiewowych nowych zasobów społecznościowych, takich jak kolekcja 250 gatunków Drosophila utrzymywana przez National Drosophila Species Stock Center (NDSSC) w Cornell. Eksperymenty te można przeprowadzić przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie biocząstek bakteryjnych lub grzybów, które są dostępne na rynku, lub można je przeprowadzić przy użyciu dowolnej liczby gatunków bakterii lub grzybów – pod warunkiem, że mikrob wykazuje ekspresję markerów fluorescencyjnych.

<table><tbody><tr><td>0,2 i mu; m Czerwone fluorescencyjne karboksylany modyfikowane FluoSpheres</td><td>Invitrogen</td><td>F8810</td><td>Znakowane fluorescencyjnie kulki lateksowe do badania ogólnej zdolności fagocytarnej fagocytów. (~580/~605 nm) Wstrzyknąć rozcieńczenie w stosunku 1:20 do PBS z 5% barwnikiem.</td></tr><tr><td>5430-10 Zestaw dysz PicoNozzle</td><td>World Precision Instruments</td><td>5430-10</td><td>Uchwyt do pipety 1,0 mm</td></tr><tr><td>E. coli (szczep K-12), koniugat Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>E13231</td><td>Zabity E. coli oznaczony Alexa Fluor 488. Służy do badania rozpoznawania fagocytów i wychwytu bakterii Gram-ujemnych. (~495/~519 nm)</td></tr><tr><td>E. coli (szczep K-12) BioParticles, koniugat Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>E23370</td><td>Zabity E. coli znakowany Alexa Fluor 594. Służy do badania rozpoznawania fagocytów i wychwytu bakterii Gram-ujemnych. (~590/~617 nm)</td></tr><tr><td>E. coli (szczep K-12) BioParticles, koniugat fluoresceiny</td><td>Invitrogen</td><td>E2861</td><td>Zabity E. coli znakowany FITC (fluoresceiną). Służy do badania rozpoznawania fagocytów i wychwytu bakterii Gram-ujemnych. (~494/~518 nm)</td></tr><tr><td>E. coli (szczep szczep K-12), koniugat Texas Red</td><td>Invitrogen</td><td>E2863</td><td>Zabity E. coli oznaczony Texas Red. Służy do badania rozpoznawania fagocytów i wychwytu bakterii Gram-ujemnych. (~595/~615 nm)</td></tr><tr><td>E. coli (szczep szczep K-12), koniugat Texas Red</td><td>Invitrogen</td><td>E2863</td><td>Zabity E. coli oznaczony Texas Red. Służy do badania rozpoznawania fagocytów i wychwytu bakterii Gram-ujemnych. (~595/~615 nm)</td></tr><tr><td>Ściągacz do pipet igłowych</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 725</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Red E. coli BioParticles koniugat do fagocytozy</td><td>Invitrogen</td><td>P35361</td><td>zabity E. coli oznaczony czerwienią pHrodo. Służy do badania rozpoznania, wychwytu i dojrzewania fagosomów bakterii Gram-ujemnych. (~560/~585 nm). Nie ma potrzeby gaszenia za pomocą Trypan Blue.</td></tr><tr><td>pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis</td><td>Invitrogen</td><td>A10010</td><td>Killed S. aureus znakowany pHrodo Red. Służy do testowania rozpoznania, wychwytu i dojrzewania fagosomu bakterii Gram-dodatnich. (~560/~585 nm). Nie ma potrzeby gaszenia za pomocą Trypan Blue.</td></tr><tr><td>Pneumatyczna pompa PicoPump PV820</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td>Pompa pneumatyczna PicoPump PV820 firmy World Precision Instruments wykorzystuje różnicę ciśnień do utrzymywania cieczy w szklanej igle między iniekcjami. Użytkownik ręcznie kontroluje krótkie impulsy ciśnienia gazu, aby usunąć ciecz &ndash; umożliwiając dostarczanie objętości sub-nanolitrowych. Ilość dostarczanej cieczy zależy od dwóch głównych zmiennych &ndash; wielkość szklanego otworu igły i czas stosowania ciśnienia wtrysku. Ustaw instrument na 100 ms " CZASOWY" tryb.</td></tr><tr><td>S. aureus (Szczep drewna bez białka A) BioParticles, koniugat Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>S23371</td><td>Zabity S. aureus oznaczony Alexa Fluor 488. Służy do badania rozpoznawania fagocytów i wychwytu bakterii Gram-dodatnich. (~495/~519 nm)</td></tr><tr><td>S. aureus (Szczep drewna bez białka A) BioParticles, koniugat Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>S23372</td><td>Zabity S. aureus oznaczony Alexa Fluor 594. Służy do badania rozpoznawania fagocytów i wychwytu bakterii Gram-dodatnich. (~590/~617 nm)</td></tr><tr><td>S. aureus (Szczep drewna bez białka A) Biocząstki, koniugat fluoresceiny</td><td>Invitrogen</td><td>E2851</td><td>Zabity S. aureus znakowany FITC (Fluoresceina). Służy do badania rozpoznawania fagocytów i wychwytu bakterii Gram-dodatnich. (~494/~518 nm)</td></tr><tr><td>Cienkościenne szklane kapilary</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100F-3</td><td>Igły do wstrzykiwań. OD = 1,0 mm</td></tr><tr><td>roztwór błękitu trypanowego (0,4%)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>Służy do gaszenia zewnątrzkomórkowej fluorescencji fluoresceiny, Alexa Fluor lub cząstek znakowanych czerwienią teksańską.</td></tr><tr><td>Mikroskop ZEISS SteREO (Discovery.V8)</td><td>Mikroskop Zeiss</td><td>SteREO Discovery.V8</td><td>Odwrócony mikroskop fluorescencyjny do obrazowania much. Do robienia zdjęć należy używać aparatu cyfrowego (np. aparatu AxioCam HC) i dołączonego oprogramowania (np. oprogramowania AxioVision 4.7).</td></tr><tr><td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, koniugat Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>Z23373</td><td>Zabity oznaczony Alexa Fluor 488. Służy do badania rozpoznania fagocytów i wychwytu drożdży. (~495/~519 nm)</td></tr><tr><td>Biocząstki Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae), koniugat Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>Z23374</td><td>Zabity oznaczony Alexa Fluor 594. Służy do badania rozpoznania fagocytów i wychwytu drożdży. (~590/~617 nm)</td></tr><tr><td>Biocząstki Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae), koniugat fluoresceiny</td><td>Invitrogen</td><td>Z2841</td><td>Zabity znakowany FITC (Fluoresceina). Służy do badania rozpoznania fagocytów i wychwytu drożdży. (~494/~518 nm)</td></tr><tr><td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red</td><td>Invitrogen</td><td>Z2843</td><td>Zabity oznaczony Texas Red. Służy do badania rozpoznania fagocytów i wychwytu drożdży. (~595/~615 nm)</td></tr></tbody></table>

ocena komórkowej odpowiedzi immunologicznej muszki owocowej, drosophila melanogaster, przy użyciu testu fagocytozy in vivo

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

U wszystkich zwierząt wrodzona odporność zapewnia natychmiastową i solidną obronę przed szerokim spektrum patogenów. Humoralne i komórkowe odpowiedzi immunologiczne są głównymi gałęziami odporności wrodzonej, a wiele czynników regulujących te reakcje jest ewolucyjnie konserwatywnych między bezkręgowcami a ssakami. Fagocytoza, centralny składnik wrodzonej odporności komórkowej, jest przeprowadzana przez wyspecjalizowane komórki krwi układu odpornościowego. Muszka owocowa, Drosophila melanogaster, stała się potężnym modelem genetycznym do badania mechanizmów molekularnych i fizjologicznych skutków fagocytozy u całych zwierząt. Tutaj demonstrujemy oparty na iniekcjach test fagocytozy in vivo w celu ilościowego określenia wychwytu i niszczenia cząstek przez komórki krwi Drosophila, hemocyty. Procedura pozwala naukowcom na precyzyjną kontrolę stężenia i dawki cząstek, co umożliwia uzyskanie wysoce powtarzalnych wyników w krótkim czasie. Eksperyment jest ilościowy, łatwy do przeprowadzenia i może być stosowany do badań przesiewowych pod kątem czynników gospodarza, które wpływają na rozpoznawanie, wychwyt i usuwanie patogenów.

Schemat testu fagocytozy in vivo z użyciem cząsteczek znakowanych fluoresceiną przedstawiono na Rysunku 1A. Muchy są montowane stroną brzuszną do dołu na kawałku taśmy izolacyjnej, dzięki czemu dwa pierwsze segmenty odwłoka, w których znajduje się naczynie grzbietowe, są wyraźnie widoczne (Rysunek 1B). Główne źródła błędów doświadczalnych występują na etapach wstrzykiwania i obrazowania procedury (Rysunek 1C<...

Ten protokół opisuje test fagocytozy in vivo u dorosłych Drosophila melanogaster w celu ilościowego określenia rozpoznawania fagocytów i usuwania infekcji mikrobiologicznych.

Ocena komórkowej odpowiedzi immunologicznej muszki owocowej, Drosophila melanogaster, przy użyciu testu fagocytozy in vivo

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

Ten test fagocytozy in vivo umożliwia naukowcom przeprowadzanie genetycznych badań przesiewowych i badań asocjacyjnych całego genomu w celu zidentyfikowania nowych genów regulujących fagocytozę w dorosłych komórkach krwi. Eksperyment ten jest ilościowy, łatwy do przeprowadzenia i może być stosowany do badań przesiewowych żywych zwierząt pod kątem czynników gospodarza, które wpływają na rozpoznawanie, wychwyt i usuwanie patogenów. Po naciągnięciu cienkościennych szklanych kapilar za pomocą ściągacza do igieł, użyj mikrometru, aby przytrzymać igłę pod mikroskopem i użyj pęsety ze stali nierdzewnej o drobnym czubku, aby rozbić końcówkę do średnicy końcówki 100 mikrometrów.Aby zmierzyć objętość płynu, który zostanie wstrzyknięty do każdej muchy, załaduj igłę kapilarną sterylnym 5% barwnikiem spożywczym w PBS i wylej płyn na kroplę oleju mineralnego na mikrometrze o średnicy 0,01 milimetra. Dozuj 10 mikrolitrów po 1,6 miligrama na mililitr cząstek na mały kwadrat Parafilm i wciągnij płyn do igły. Zamontuj igłę w dyszy wtryskiwacza i ustaw znieczulone muchy wzdłuż wyznaczonego obszaru na podkładce muchowej, brzuszną stroną do góry, z głowami skierowanymi do przodu podkładki.Umieść fiolki w odpowiednich miejscach na ławce i wstrzyknij muchy w górny róg brzucha za pomocą pięciu 100-milisekundowych pompek płynu, aby dostarczyć łącznie około 10 nanolitrów cząstek. Przenieść każdą muchę do odpowiedniej fiolki podczas jej wstrzykiwania, zwracając uwagę na czas na fiolce. Następnie załaduj nową igłę 0,4% roztworem błękitu trypanowego i ustaw wtryskiwacz pneumatyczny w pozycji bramkowej, aby umożliwić stały przepływ powietrza w celu wypchnięcia cieczy z igły.Po 30 minutach od pierwszego wstrzyknięcia należy wstrzyknąć do każdego brzucha muchy Trypan Blue, aż brzuch będzie pełny i rozdęty. Zamontuj muchy na szkiełkach mikroskopowych za pomocą taśmy izolacyjnej, brzuszną stroną do dołu, popychając skrzydła na bok muchy, aby przymocować je do taśmy. Następnie delikatnie wepchnij głowę w taśmę, aby upewnić się, że mucha się nie poruszy.Natychmiast po zabezpieczeniu wszystkich much, zobrazuj owady, pojedynczo, w 25 lub 32-krotnym powiększeniu na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym podłączonym do aparatu cyfrowego i komputera, skupiając się na naczyniu grzbietowym każdej muchy za pomocą oprogramowania komputerowego aparatu cyfrowego. Następnie zapisz czas ekspozycji i powiększenie między eksperymentami. Aby określić ilościowo fluorescencję, otwórz odpowiedni program do analizy obrazowania i otwórz jeden obraz.Aby zmierzyć intensywność fluorescencji naczynia grzbietowego, narysuj wielokąt wokół naczynia grzbietowego i wybierz opcję Zmierz, aby zarejestrować intensywność fluorescencji wewnątrz wielokąta. Aby określić intensywność fluorescencji tła, skopiuj pierwszy wielokąt i przenieś go do obszaru przylegającego do naczynia grzbietowego każdej muchy. Następnie wybierz opcję Zmierz i zapisz intensywność fluorescencji obszaru tła.Aby znormalizować fluorescencję naczyń grzbietowych przez fluorescencję tła, po zmierzeniu intensywności fluorescencji pozostałych much, podziel fluorescencję naczynia grzbietowego przez fluorescencję tła i oblicz średnią znormalizowaną intensywność fluorescencji naczyń grzbietowych wszystkich much w jednym szczepie. Po zamontowaniu brzusznie do dołu na kawałku taśmy izolacyjnej, pierwsze dwa segmenty brzucha, w których znajduje się naczynie grzbietowe, są wyraźnie widoczne. Główne źródła błędów eksperymentalnych pojawiają się na etapie iniekcji i obrazowania procedury.Używanie tej samej igły do wstrzykiwania wielu much może spowodować jej zatkanie tkanką lub cząstkami muchy. Muchy, które nie otrzymują wystarczającej ilości fluorescencji błękitu trypanowego jasno w całym odwłoku, co może zmniejszyć stosunek fluorescencji naczynia grzbietowego do fluorescencji tła, zmniejszając w ten sposób rzeczywisty współczynnik intensywności fluorescencji zwierzęcia. Muchy powinny być fotografowane, gdy są unieruchomione przez dwutlenek węgla, ponieważ aktywnie poruszające się muchy wytwarzają rozmyte obrazy, których nie można określić ilościowo.Zmutowana linia z kolekcji Zuker muszek traktowanych metanosulfonianem etylu nie jest w stanie fagocytozować bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich i prawie nie wykazuje fluorescencji naczyń grzbietowych w teście fagocytozy in vivo, w połączeniu z izogenicznym szczepem Zuker na tle izogenicznym i innym powszechnym laboratoryjnym szczepem kontrolnym. Śledź czas i kolejność, w jakiej muchy są wstrzykiwane, aby upewnić się, że muchy są na porównywalnych etapach rozpoznawania i wchłaniania patogenu po zobrazowaniu. Mechanizmy molekularne leżące u podstaw defektów fagocytarnych można określić, badając pojedyncze hemocyty za pomocą mikroskopii konfokalnej lub po sortowaniu komórek aktywowanym fluorescencją lub przez izolację kulek magnetycznych dorosłych hemocytów.

assessing-cellular-immune-response-fruit-fly-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Aby zrozumieć związek między odpowiedzią immunologiczną a zachowaniem, opisujemy metodę pomiaru aktywności lokomotorycznej Drosophila podczas infekcji bakteryjnej, a także zdolność much do wywołania odpowiedzi immunologicznej poprzez monitorowanie przeżywalności, obciążenia bakteryjnego oraz aktywności w czasie rzeczywistym kluczowego regulatora odporności wrodzonej, NFκB.

Ilościowy pomiar odpowiedzi immunologicznej i snu u Drosophila

Ten film opisuje, jak wykonać zastrzyk żywym dorosłym muchom i zawiera przykładowy protokół, w którym oznaczone cząstki i błękit trypanowy są wstrzykiwane do brzuchów muchy w celu zbadania fagocytozy.

Wstrzyknięcie dorosłych much Drosophila: metoda dostarczania związku lub etykiety

Ten film demonstruje technikę barwienia immunologicznego, aby uwidocznić pochłanianie komórek apoptotycznych w homogenizowanych komórkach embrionalnych Drosophila melanogaster. Metoda ta zapewnia wgląd w fizjologię komórkową poprzez określenie zakresu apoptotycznego pochłaniania komórek.

Test fagocytozy: technika barwienia immunologicznego do wizualizacji pochłaniania komórek apoptotycznych w komórkach embrionalnych Drosophila melanogaster

Ten film demonstruje test in vivo przeznaczony do pomiaru fagocytozy bakteryjnej u dorosłych muszek Drosophila. Po wstrzyknięciu fluorescencyjnie znakowanych bakterii do brzucha dorosłych muszek, hemocyty związane z naczyniem grzbietowym angażują się w fagocytozę. Wprowadzenie barwnika błękitu trypanowego służy wygaszeniu fluorescencji emitowanej przez zewnątrzkomórkowe, niefagocytozowane bakterie. Ten proces wygaszania poprawia identyfikację bakterii fagocytozowanych, gdy są obserwowane pod...

Test in vivo do ilościowego określenia fagocytozy bakteryjnej u dorosłych much Drosophila

Drosophila melanogaster to wybitny organizm modelowy do badania wrodzonego układu odpornościowego oraz fizjologicznych konsekwencji infekcji i chorób. Protokół ten opisuje, w jaki sposób dostarczyć D. melanogaster solidne i ilościowo powtarzalne infekcje bakteryjne, a następnie jak zmierzyć nasilenie infekcji i określić ilościowo odpowiedź immunologiczną gospodarza.

Ogólnoustrojowe infekcje bakteryjne i fenotypy obrony immunologicznej u Drosophila melanogaster

Krwinki Drosophila, czyli hemocyty, krążą między miejscami rezydentnymi a krążeniem.  U larwy hemocyty rezydentne (siedzące) lokalizują się w mikrośrodowiskach indukcyjnych, kieszeniach krwiotwórczych, podczas gdy krążące hemocyty poruszają się swobodnie w hemolimfie. Celem tego protokołu jest standaryzowana izolacja i kwantyfikacja tych dwóch, behawioralnie odrębnych, ale wymiennych populacji hemocytów.

Oznaczanie populacji krwinek larwy Drosophila melanogaster

Test CApillary FEeder (CAFE) jest prostą, niedrogą i wysoce niezawodną metodą badania mechanizmów leżących u podstaw przyjmowania pokarmu. Stosowany w połączeniu z wysoce wszechstronnym modelem genetycznym Drosophila melanogaster, stanowi potężny środek do uzyskania nowego wglądu w mechanizmy regulacyjne przyjmowania pokarmu.

Test CApillary FEeder mierzy spożycie pokarmu u Drosophila melanogaster

Opisujemy tutaj test fagocytozy z wykorzystaniem rozproszonych komórek embrionalnych Drosophila. Umożliwia nam łatwe i precyzyjne ilościowe określenie poziomów fagocytozy in vivo oraz identyfikację nowych cząsteczek wymaganych do fagocytozy komórek apoptotycznych.

Test fagocytozy na obecność komórek apoptotycznych w zarodkach Drosophila

Ta metoda pokazuje, jak wizualizować inwazję patogenów na komórki owadów za pomocą trójwymiarowych (3D) modeli. Hemocyty larw Drosophila były zakażone patogenami wirusowymi lub bakteryjnymi, zarówno ex vivo, jak i in vivo. Zainfekowane hemocyty zostały następnie utrwalone i wybarwione w celu obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego, a następnie rekonstrukcji komórkowej 3D.

Ekstrakcja hemocytów z larw Drosophila melanogaster do infekcji mikrobiologicznej i analizy

Ten protokół opisuje test in vivo fagocytozy używany do oceny i ilościowego określenia zdolności młodych i starszych hemocytów Drosophila melanogaster do fagocytozy bakterii.

Ocena specyficznej dla wieku zdolności fagocytarnej dorosłych hemocytów Drosophila melanogaster za pomocą testu fagocytozy in vivo

Ten protokół opisuje efektywną i tanią metodę, która wykorzystuje płynne podłoża do oceny wpływu chemicznych substancji toksycznych na żywotność dorosłego Drosophila melanogaster.

Ocena toksyczności chemicznej u dorosłych osobników Drosophila melanogaster

Poznaj test fagocytozy in vivo w Drosophila melanogaster do badania odpowiedzi immunologicznej na zakażenia mikrobowe. Ta metoda umożliwia ilościową analizę aktywności fagocytów i identyfikację genów regulujących fagocytozę.

Ocena komórkowej odpowiedzi immunologicznej muszki owocowej, Drosophila melanogaster, przy użyciu testu fagocytozy in vivo

Przeglądaj więcej filmów