Ocena komórkowej odpowiedzi immunologicznej muszki owocowej, Drosophila melanogaster, przy użyciu testu fagocytozy in vivo

Ten test fagocytozy in vivo umożliwia naukowcom przeprowadzanie genetycznych badań przesiewowych i badań asocjacyjnych całego genomu w celu zidentyfikowania nowych genów regulujących fagocytozę w dorosłych komórkach krwi. Eksperyment ten jest ilościowy, łatwy do przeprowadzenia i może być stosowany do badań przesiewowych żywych zwierząt pod kątem czynników gospodarza, które wpływają na rozpoznawanie, wychwyt i usuwanie patogenów. Po naciągnięciu cienkościennych szklanych kapilar za pomocą ściągacza do igieł, użyj mikrometru, aby przytrzymać igłę pod mikroskopem i użyj pęsety ze stali nierdzewnej o drobnym czubku, aby rozbić końcówkę do średnicy końcówki 100 mikrometrów.

Aby zmierzyć objętość płynu, który zostanie wstrzyknięty do każdej muchy, załaduj igłę kapilarną sterylnym 5% barwnikiem spożywczym w PBS i wylej płyn na kroplę oleju mineralnego na mikrometrze o średnicy 0,01 milimetra. Dozuj 10 mikrolitrów po 1,6 miligrama na mililitr cząstek na mały kwadrat Parafilm i wciągnij płyn do igły. Zamontuj igłę w dyszy wtryskiwacza i ustaw znieczulone muchy wzdłuż wyznaczonego obszaru na podkładce muchowej, brzuszną stroną do góry, z głowami skierowanymi do przodu podkładki.

Umieść fiolki w odpowiednich miejscach na ławce i wstrzyknij muchy w górny róg brzucha za pomocą pięciu 100-milisekundowych pompek płynu, aby dostarczyć łącznie około 10 nanolitrów cząstek. Przenieść każdą muchę do odpowiedniej fiolki podczas jej wstrzykiwania, zwracając uwagę na czas na fiolce. Następnie załaduj nową igłę 0,4% roztworem błękitu trypanowego i ustaw wtryskiwacz pneumatyczny w pozycji bramkowej, aby umożliwić stały przepływ powietrza w celu wypchnięcia cieczy z igły.

Po 30 minutach od pierwszego wstrzyknięcia należy wstrzyknąć do każdego brzucha muchy Trypan Blue, aż brzuch będzie pełny i rozdęty. Zamontuj muchy na szkiełkach mikroskopowych za pomocą taśmy izolacyjnej, brzuszną stroną do dołu, popychając skrzydła na bok muchy, aby przymocować je do taśmy. Następnie delikatnie wepchnij głowę w taśmę, aby upewnić się, że mucha się nie poruszy.

Natychmiast po zabezpieczeniu wszystkich much, zobrazuj owady, pojedynczo, w 25 lub 32-krotnym powiększeniu na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym podłączonym do aparatu cyfrowego i komputera, skupiając się na naczyniu grzbietowym każdej muchy za pomocą oprogramowania komputerowego aparatu cyfrowego. Następnie zapisz czas ekspozycji i powiększenie między eksperymentami. Aby określić ilościowo fluorescencję, otwórz odpowiedni program do analizy obrazowania i otwórz jeden obraz.

Aby zmierzyć intensywność fluorescencji naczynia grzbietowego, narysuj wielokąt wokół naczynia grzbietowego i wybierz opcję Zmierz, aby zarejestrować intensywność fluorescencji wewnątrz wielokąta. Aby określić intensywność fluorescencji tła, skopiuj pierwszy wielokąt i przenieś go do obszaru przylegającego do naczynia grzbietowego każdej muchy. Następnie wybierz opcję Zmierz i zapisz intensywność fluorescencji obszaru tła.

Aby znormalizować fluorescencję naczyń grzbietowych przez fluorescencję tła, po zmierzeniu intensywności fluorescencji pozostałych much, podziel fluorescencję naczynia grzbietowego przez fluorescencję tła i oblicz średnią znormalizowaną intensywność fluorescencji naczyń grzbietowych wszystkich much w jednym szczepie. Po zamontowaniu brzusznie do dołu na kawałku taśmy izolacyjnej, pierwsze dwa segmenty brzucha, w których znajduje się naczynie grzbietowe, są wyraźnie widoczne. Główne źródła błędów eksperymentalnych pojawiają się na etapie iniekcji i obrazowania procedury.

Używanie tej samej igły do wstrzykiwania wielu much może spowodować jej zatkanie tkanką lub cząstkami muchy. Muchy, które nie otrzymują wystarczającej ilości fluorescencji błękitu trypanowego jasno w całym odwłoku, co może zmniejszyć stosunek fluorescencji naczynia grzbietowego do fluorescencji tła, zmniejszając w ten sposób rzeczywisty współczynnik intensywności fluorescencji zwierzęcia. Muchy powinny być fotografowane, gdy są unieruchomione przez dwutlenek węgla, ponieważ aktywnie poruszające się muchy wytwarzają rozmyte obrazy, których nie można określić ilościowo.

Zmutowana linia z kolekcji Zuker muszek traktowanych metanosulfonianem etylu nie jest w stanie fagocytozować bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich i prawie nie wykazuje fluorescencji naczyń grzbietowych w teście fagocytozy in vivo, w połączeniu z izogenicznym szczepem Zuker na tle izogenicznym i innym powszechnym laboratoryjnym szczepem kontrolnym. Śledź czas i kolejność, w jakiej muchy są wstrzykiwane, aby upewnić się, że muchy są na porównywalnych etapach rozpoznawania i wchłaniania patogenu po zobrazowaniu. Mechanizmy molekularne leżące u podstaw defektów fagocytarnych można określić, badając pojedyncze hemocyty za pomocą mikroskopii konfokalnej lub po sortowaniu komórek aktywowanym fluorescencją lub przez izolację kulek magnetycznych dorosłych hemocytów.