Name: Przygotowanie neutralnie naładowanych, reagujących na pH nanocząstek polimerowych do dostarczania cytozolowego siRNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Poznaj metodę przygotowania neutralnie naładowanych nanocząstek siRNA reagujących na pH w nanomedycynie. Technika ta zwiększa biodostępność siRNA i umożliwia systemowe podawanie w terapii genowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni doktorom Craigowi Duvallowi i Rebecce Cook za dostęp do danych i zasobów laboratoryjnych do przeprowadzenia tych badań. Autorzy są wdzięczni Vanderbilt Institute for Nanoscale Science and Engineering (VINSE) za dostęp do instrumentów DLS i TEM (NSF EPS 1004083). Autorzy są wdzięczni Narodowej Fundacji Nauki za wsparcie programu stypendialnego Graduate Research Fellowship Program (NSF#1445197). Autorzy są wdzięczni National Institutes of Health za wsparcie finansowe (NIH R01 EB019409). Autorzy są wdzięczni Programowi Badań Medycznych Kierowanych przez Kongres Departamentu Obrony za wsparcie finansowe (DOD CDMRP OR130302).

1. Przygotowanie i charakterystyka si-NP
<ol>
	<li>przygotowanie si-NP
	<ol>
		<li>Rozpuścić polimer w 10 mM buforze cytryzianowym (pH 4,0) do stężenia 3,3 mg/ml. W celu zapewnienia pełnego rozpuszczenia polimer można najpierw rozpuścić w etanolu w stężeniu 10-krotnie większym. 
		UWAGA: Polimer można rozpuścić przy niższych stężeniach, jednak stosowanie stężeń powyżej 3,3 mg/ml może zapobiegać powstawaniu homogenicznych NP.</li>
		<li>Dodaj siRNA (50 μM w diH2O) w celu uzyskania N+:P- stosunku 10. Dokładnie wymieszać roztwory polimeru i siRNA poprzez pipetowanie, a następnie inkubować przez 30 min. N+:P- stosunek ten reprezentuje liczbę dodatnio naładowanych grup aminowych w polimerze w stosunku do liczby ujemnie naładowanych grup fosforanowych w siRNA i jest obliczany według poniższego wzoru: 
		<img alt="równanie kompleksowania siRNA, równowaga statyczna, obliczanie stosunku molowego, schemat edukacyjny" src="/files/ftp_upload/59549/59549eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie"> 
		gdzie mol Pol to molowa ilość polimeru, RU amine to liczba jednostek powtarzalnych dodatnio naładowanych amin w polimerze, mol siRNA to molowa ilość siRNA, a bp siRNA to liczba par zasad w cząsteczce siRNA.</li>
		<li>Dodać 5-krotny nadmiar buforu fosforanowego 10 mM (pH 8,0) i delikatnie wymieszać, pipetując lub odwracając probówkę. Aby potwierdzić, że końcowe pH jest obojętne (~7,2–7,5), należy pobrać pipetą 10 μL roztworu si-NP na paski testowe do pomiaru pH. 
		UWAGA: Bufor cytrynowy i fosforanowy przygotowano zgodnie z tabelami Buffer Reference Center firmy Millipore Sigma.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Charakterystyka fizykochemiczna nanocząsteczek krzemionki (si-NP)</li>
	<li>Zmierz rozmiar i ładunek powierzchniowy otrzymanych si-NP za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS). Przygotuj próbkę do DLS, filtrując 1 ml si-NP (0,1–1,0 mg/ml) przez 0.45 μm filtry strzykawkowe o odpowiedniej wielkości porów do kwarcowej lub polistyrenowej kuwety o przekroju kwadratowym. Pomiary wielkości i ładunku powierzchniowego należy przeprowadzić za pomocą instrumentu DLS zgodnie ze specyfikacją producenta.
	<ol>
		<li>Potwierdź rozmiar i morfologię si-NP za pomocą analizy obrazowej z wykorzystaniem transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM).
		<ol>
			<li>Dodać 5 μL roztwór si-NP o stężeniu 1 mg/mL na siateczki TEM i inkubować przez 60 s. Osuszyć przez blotowanie przez 3 s.</li>
			<li>Dodaj 5 μL do 3% roztworu octanu uranylu i inkubować przez 20 s. Osuszyć przez 3 s. Suszyć siatki przez noc w warunkach desykacji.</li>
			<li>Siatki do obrazowania zgodnie z protokołem ustalonym dla konkretnego mikroskopu, który będzie wykorzystywany.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Charakterystyka stopnia załadunku siRNA w si-NP przy różnych wartościach N+:P- stosunki z wykorzystaniem opóźnienia w żelu agarozowym.
		<ol>
			<li>Aby przygotować 2% żel agarozowy, należy dodać 2 g agarozy w proszku klasy elektroforetycznej do 10 ml buforu 1x TAE (Tris-octan-EDTA) o pH 8,0. Zamieszać, aby zawiesić agarozę. Podgrzewać w mikrofalówce bez przykrycia do czasu całkowitego rozpuszczenia agarozy (1–3 min).</li>
			<li>Po schłodzeniu dodać 5 μL bromku etydyny (10 mg/ml w H2O), a następnie wymieszać dokładnie. Wlać agarozę do kasetki do żelowania i umieścić grzebień w celu utworzenia dołków, pozostawiając do wyschnięcia na 30 min. Ostrożnie wyjąć grzebień, aby pozostawić dołki do nakładania próbek, a następnie wypełnić kasetkę do linii maksymalnego napełnienia buforem 1x TAE.</li>
			<li>Przygotować si-NP (zgodnie z powytą procedurą) przy 0, 1, 2, 5, 7, 10, 20 i 40 N+:P- stosunki. Umieścić 2 μL alikwoty barwnika do nakładania próbek (bez SDS i czynników redukujących) na folii parafinowej dla każdej formulacji si-NP. Wymieszać 10 μL roztworu si-NP z barwnikiem do ładowania na folię parafinową za pomocą pipety.</li>
			<li>Dodaj roztwory si-NP/barwnika do wgłębień w żelu agarozowym. Uruchom źródło napięcia przy 10 V na 35 min (lub do momentu, gdy próbki przejdą 80% długości żelu).</li>
			<li>Wizualizuj prążki siRNA na transiluminatorze UV zgodnie ze specyfikacją producenta.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Określanie bioaktywności si-NP in vitro
<ol>
	<li>Wyciszenie ekspresji genu modelowego lucyferazy
	<ol>
		<li>Przygotować si-NP z lucyferazą (zgodnie z powyższą procedurą), używając siRNA przeciwko lucyferazie, oraz kontrolne si-NP z sekwencją scrambled siRNA. Oba rodzaje si-NP sformułować przy tym samym końcowym stosunku N+:P- oraz przy optymalnym stosunku wyznaczonym w badaniach retardacji na żelu agarozowym. Przykładowe sekwencje siRNA znajdują się w Tabeli materiałów.</li>
		<li>Zasiać komórki wykazujące ekspresję lucyferazy [stabilna linia komórkowa MDA-MB-231/Luciferase (Bsd)] w czarnych płytkach 96-dołkowych z gęstością 20 komórek na dołek. Pozostawić do przytwierdzenia przez noc w pełnej pożywce (DMEM, 10% FBS) w inkubatorze (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności).</li>
		<li>Rozcieńczyć si-NP w pełnej pożywce z surowicą do końcowej objętości 10 μL na dołek i stężenia siRNA 10 nM. Traktować komórki si-NP przez 24 h.</li>
		<li>Po 24 h usunąć preparaty i zastąpić pożywkę pełną pożywką z surowicą zawierającą 150 μg/mL D-lucyferyny. Inkubować komórki przez 5 min przed pomiarem luminescencji za pomocą czytnika płytek lub systemu obrazowania optycznego in vivo zgodnie ze specyfikacją producenta.</li>
		<li>Zastąpić pożywkę z lucyferyną świeżą, pełną pożywką z surowicą i inkubować przez kolejne 24 h. Powtórzyć powyższy krok, usuwając pożywkę i zastępując ją pełną pożywką z surowicą zawierającą 150 μg/mL D-lucyferyny, a następnie inkubować przez 5 min przed pomiarem luminescencji w punkcie czasowym 48 h.</li>
		<li>W badaniach podłużnych utrzymywać komórki w warunkach sterylnych podczas pomiaru luminescencji. Kontynuować hodowlę w świeżej, pełnej pożywce pomiędzy pomiarami, po usunięciu pożywki z lucyferyną. 
		UWAGA: Odpowiednie stężenie siRNA będzie różnić się w zależności od rodzaju si-NP i cząsteczek siRNA. W przypadku stosowania polipleksów o ładunku obojętnym z rdzeniem endozomolitycznym (np. PEG-DB), stężenie 10 nM jest zazwyczaj dobrze tolerowane przez komórki i pozwala uzyskać >75% wyciszenia lucyferazy. Stosunek masowy PEG-DB do siRNA przy stosunku 10 N+:P- i traktowaniu 10 nM siRNA (przy założeniu 26 bp siRNA) wynosi 23,3, co oznacza dodanie 23,3 ng PEG-DB na każde 1,0 ng siRNA. Na przykład, aby potraktować jeden dołek w płytce 96-dołkowej w stężeniu 10 nM (objętość pożywki 10 mL na dołek), dodać 1,16 μL polimeru o stężeniu 3,3 mg/mL na 16,5 ng siRNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Elbashir, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411 (6836), 494-498 (2001).</li>
<li>Soutschek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+silencing+of+an+endogenous+gene+by+systemic+administration+of+modified+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs.</a> Nature. 432 (7014), 173-178 (2004).</li>
<li>Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA interference.</a> Nature. 418, 244(2002).</li>
<li>Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+silent+treatment%3A+siRNAs+as+small+molecule+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs.</a> Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).</li>
<li>Wittrup, A., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knocking+down+disease%3A+a+progress+report+on+siRNA+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Knocking down disease: a progress report on siRNA therapeutics.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (9), 543(2015).</li>
<li>Li, H. E., Nelson, C. C., Evans, B., Duvall, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+Intracellular-Acting+Biologics+in+Pro-Apoptotic+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Delivery of Intracellular-Acting Biologics in Pro-Apoptotic Therapies.</a> Current Pharmaceutical Design. 17 (3), 293-319 (2011).</li>
<li>Bartlett, D. W., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+siRNA+nuclease+stability+on+the+in+vitro+and+in+vivo+kinetics+of+siRNA-mediated+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Effect of siRNA nuclease stability on the in vitro and in vivo kinetics of siRNA-mediated gene silencing.</a> Biotechnology and Bioengineering. 97 (4), 909-921 (2007).</li>
<li>Zuckerman, J. E., Choi, C. H., Han, H., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycation-siRNA+nanoparticles+can+disassemble+at+the+kidney+glomerular+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Polycation-siRNA nanoparticles can disassemble at the kidney glomerular basement membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (8), 3137-3142 (2012).</li>
<li>Dominska, M., Dykxhoorn, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+down+the+barriers%3A+siRNA+delivery+and+endosome+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Breaking down the barriers: siRNA delivery and endosome escape.</a> Journal of Cell Science. 123 (Pt 8), 1183-1189 (2010).</li>
<li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle%E2%80%93mediated+siRNA+delivery%2C+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Image-based analysis of lipid nanoparticle–mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 638(2013).</li>
<li>Sahay, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+siRNA+delivery+by+lipid+nanoparticles+is+limited+by+endocytic+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).</li>
<li>Wittrup, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+lipid-formulated+siRNA+release+from+endosomes+and+target+gene+knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown.</a> Nature Biotechnology. 33 (8), 870-876 (2015).</li>
<li>Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+materials+for+siRNA+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Delivery materials for siRNA therapeutics.</a> Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).</li>
<li>Adams, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patisiran%2C+an+RNAi+Therapeutic%2C+for+Hereditary+Transthyretin+Amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patisiran, an RNAi Therapeutic, for Hereditary Transthyretin Amyloidosis.</a> New England Journal of Medicine. 379 (1), 11-21 (2018).</li>
<li>Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugging+the+%27undruggable%27+cancer+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drugging the 'undruggable' cancer targets.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (8), 502(2017).</li>
<li>Alexis, F., Pridgen, E., Molnar, L. K., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+clearance+and+biodistribution+of+polymeric+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles.</a> Molecular Pharmaceutics. 5 (4), 505-515 (2008).</li>
<li>Verbaan, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fate+of+poly%282-dimethyl+amino+ethyl%29methacrylate-based+polyplexes+after+intravenous+administration%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">The fate of poly(2-dimethyl amino ethyl)methacrylate-based polyplexes after intravenous administration.</a> International Journal of Pharmaceutics. 214 (1-2), 99-101 (2001).</li>
<li>Lv, H., Zhang, S., Wang, B., Cui, S., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+cationic+lipids+and+cationic+polymers+in+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery.</a> Journal of Controlled Release. 114 (1), 100-109 (2006).</li>
<li>Shi, J., Kantoff, P. W., Wooster, R., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+nanomedicine%3A+progress%2C+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer nanomedicine: progress, challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (1), 20(2016).</li>
<li>Torchilin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+delivery+of+macromolecular+drugs+based+on+the+EPR+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Tumor delivery of macromolecular drugs based on the EPR effect.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (3), 131-135 (2011).</li>
<li>Duncan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dawning+era+of+polymer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The dawning era of polymer therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 2 (5), 347(2003).</li>
<li>Tang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+optimal+size+of+anticancer+nanomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Investigating the optimal size of anticancer nanomedicine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (43), 15344-15349 (2014).</li>
<li>Nelson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+Cationic+and+Hydrophobic+Content+of+PEGylated+siRNA+Polyplexes+Enhances+Endosome+Escape%2C+Stability%2C+Blood+Circulation+Time%2C+and+Bioactivity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Balancing Cationic and Hydrophobic Content of PEGylated siRNA Polyplexes Enhances Endosome Escape, Stability, Blood Circulation Time, and Bioactivity in vivo.</a> ACS Nano. 7 (10), 8870-8880 (2013).</li>
<li>Jackson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zwitterionic+Nanocarrier+Surface+Chemistry+Improves+siRNA+Tumor+Delivery+and+Silencing+Activity+Relative+to+Polyethylene+Glycol%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Zwitterionic Nanocarrier Surface Chemistry Improves siRNA Tumor Delivery and Silencing Activity Relative to Polyethylene Glycol.</a> ACS Nano. , (2017).</li>
<li>Akinc, A., Thomas, M., Klibanov, A. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+polyethylenimine-mediated+DNA+transfection+and+the+proton+sponge+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis.</a> The Journal of Gene Medicine. 7 (5), 657-663 (2005).</li>
<li>de Wet, J. R., Wood, K. V., DeLuca, M., Helinski, D. R., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+luciferase+gene%3A+structure+and+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 7 (2), 725-737 (1987).</li>
<li>Aggarwal, P., Hall, J. B., McLeland, C. B., Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+interaction+with+plasma+proteins+as+it+relates+to+particle+biodistribution%2C+biocompatibility+and+therapeutic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle interaction with plasma proteins as it relates to particle biodistribution, biocompatibility and therapeutic efficacy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 428-437 (2009).</li>
<li>Geng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+effects+of+filaments+versus+spherical+particles+in+flow+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Shape effects of filaments versus spherical particles in flow and drug delivery.</a> Nature Nanotechnology. 2 (4), 249(2007).</li>
<li>Chauhan, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+nanorods+and+nanospheres+for+real-time+in+vivo+probing+of+nanoparticle+shape-dependent+tumor+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Fluorescent nanorods and nanospheres for real-time in vivo probing of nanoparticle shape-dependent tumor penetration.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (48), 11417-11420 (2011).</li>
<li>Chu, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma%2C+tumor+and+tissue+pharmacokinetics+of+Docetaxel+delivered+via+nanoparticles+of+different+sizes+and+shapes+in+mice+bearing+SKOV-3+human+ovarian+carcinoma+xenograft%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Plasma, tumor and tissue pharmacokinetics of Docetaxel delivered via nanoparticles of different sizes and shapes in mice bearing SKOV-3 human ovarian carcinoma xenograft.</a> Nanomedicine. 9 (5), 686-693 (2013).</li>
<li>Werfel, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+mTORC2+Inhibitor+Therapeutically+Blocks+Breast+Cancer+Cell+Growth+and+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Selective mTORC2 Inhibitor Therapeutically Blocks Breast Cancer Cell Growth and Survival.</a> Cancer Research. 78 (7), 1845-1858 (2018).</li>
<li>Sarett, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipophilic+siRNA+targets+albumin+in+situ+and+promotes+bioavailability%2C+tumor+penetration%2C+and+carrier-free+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Lipophilic siRNA targets albumin in situ and promotes bioavailability, tumor penetration, and carrier-free gene silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (32), E6490-E6497 (2017).</li>
<li>Williams, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+apoptotic+pathway+activation+increases+response+to+anti-estrogens+in+luminal+breast+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Intrinsic apoptotic pathway activation increases response to anti-estrogens in luminal breast cancers.</a> Cell Death and Disease. 9 (2), 21(2018).</li>
<li>Evans, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+Vivo+Red+Blood+Cell+Hemolysis+Assay+for+the+Evaluation+of+pH-responsive+Endosomolytic+Agents+for+Cytosolic+Delivery+of+Biomacromolecular+Drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50166(2013).</li>
<li>Werfel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+Optimization+of+PEG+Architecture+and+Hydrophobic+Content+Improves+siRNA+Polyplex+Stability%2C+Pharmacokinetics%2C+and+Potency+In+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Combinatorial Optimization of PEG Architecture and Hydrophobic Content Improves siRNA Polyplex Stability, Pharmacokinetics, and Potency In vivo.</a> Journal of Controlled Release. , (2017).</li>
<li>Kilchrist, K. V., Evans, B. C., Brophy, C. M., Duvall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Enhanced+Cellular+Uptake+and+Cytosolic+Retention+of+MK2+Inhibitory+Peptide+Nano-polyplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Enhanced Cellular Uptake and Cytosolic Retention of MK2 Inhibitory Peptide Nano-polyplexes.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (3), 368-381 (2016).</li>
<li>Kilchrist, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gal8+Visualization+of+Endosome+Disruption+Predicts+Carrier-Mediated+Biologic+Drug+Intracellular+Bioavailability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Gal8 Visualization of Endosome Disruption Predicts Carrier-Mediated Biologic Drug Intracellular Bioavailability.</a> ACS Nano. , (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawniają potencjalnych konfliktów interesów.

Opisane tutaj si-NP powstają w wyniku elektrostatycznego asocjacji anionowego siRNA i polimerów kationowych w kompleksy polijonowe (polipleksy). Kompleksowanie elektrostatyczne siRNA i kationowego bloku DB polimerów PEG-DB jest ułatwione przez mieszanie przy niskim pH (4,0). Przy pH 4,0 DMAEMA jest silnie protonowana, w wyniku czego blok DB jest silnie naładowany. Gwarantuje to, że polimery rozpuszczają się jako unimery w roztworze, a nie tworzą miceli, a DB skutecznie kompleksuje się z siRNA. Następnie pH roztworu dosto...

Ponieważ siRNA hamują translację białek z sekwencji mRNA, teoretycznie mogą być używane do leczenia wszystkich znanych patologii1,2,3,4,5. Zastosowanie siRNA w medycynie jest jednak ograniczone przez całkowicie słaby profil farmakokinetyczny cząsteczek siRNA6,7. Po wstrzyknięciu dożylnym siRNA są szybko usuwane przez nerki i/lub degradowane przez nukleazy8,9. Ze względu na duży rozmiar i ładunek ujemny, siRNA nie może dostać się do komórek ani uciec ze szlaku endolizosomalnego, aby uzyskać dostęp do kompleksu wyciszającego indukowanego RNA (RISC), który znajduje się w cytozolu10,11,12,13. W związku z tym szeroko zakrojone wysiłki skupiły się na projektowaniu i wdrażaniu strategii dostarczania siRNA14. Wysiłki te w dużej mierze skupiły się na opracowaniu nanocząstek na bazie lipidów i polimerów, które pakują siRNA, chronią je przed klirensem i degradacją in vivo oraz inicjują wychwyt komórkowy i ucieczkę endosomalną przez jonizowalne kationowe grupy aminowe. Odnotowano wiele sukcesów przedklinicznych, a ostatnio odnotowano pierwszy sukces kliniczny dotyczący dostarczania wątrobowego siRNA na bazie nanocząsteczek w leczeniu dziedzicznej amyloidozy za pośrednictwem transtyretyny (hATTR)15.
Istnieje wiele genów powodujących raka, które są obecnie "nieuleczalne" przez konwencjonalną farmakologię (np. leki małocząsteczkowe), co motywuje do projektowania polimerowych nanocząsteczek siRNA (si-NPs) do leczenia raka16. Istnieje jednak osobny zestaw parametrów projektowych, które należy wziąć pod uwagę w przypadku dostarczania siRNA bez wątroby. System dostarczania musi osłaniać ładunek kationowy polipleksu, który powoduje aglutynację w krążeniu ogólnoustrojowym17,18,19. W szczególności w przypadku dostarczania guza, stabilność si-NP jest niezbędna do zapewnienia długiego krążenia, a tym samym zwiększonej akumulacji w guzach dzięki efektowi zwiększonej przepuszczalności i retencji (EPR)20,21. Co więcej, kontrola nad rozmiarem si-NP jest niezbędna, ponieważ tylko nanocząstki o średnicy około 20 – 200 nm wykorzystują EPR22, a mniejsze si-NP (~20 – 50 nm średnicy) wykazują lepszą penetrację guza w porównaniu z większymi nanocząstkami i mikrocząstkami23.
Aby rozwiązać te dodatkowe ograniczenia projektowe dotyczące systemowego dostarczania siRNA do guza po podaniu dożylnym, opracowano neutralnie naładowane, reagujące na pH si-NP (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)24. Te si-NP są PEGylowane, lub ostatnio Zwitterionated25, dla neutralnego ładunku powierzchniowego i odporności na adsorpcję i opsonizację białek w obiegu. Ponieważ nie mogą polegać wyłącznie na charakterze kationowym w celu napędzania dostarczania wewnątrzkomórkowego, niezwykle skuteczna ucieczka endosomalna jest niezbędna do osiągnięcia silnego wyciszenia genów. W związku z tym rdzeń tych si-NP składa się z wysoce endosomolitycznego rdzenia, który jest obojętny przy pH zewnątrzkomórkowym (7,4), ale jest wyzwalany w sposób podobny do przełącznika w zakwaszonych warunkach szlaku endolizosomalnego [pH 6,8 (wczesne endosomy) – 5,0 (lizosomy)]. Wreszcie, mieszanina kationów i hydrofobowości w rdzeniu si-NP zapewnia zarówno siły elektrostatyczne, jak i stabilizacyjne van der Waalsa, poprawiając stabilność si-NP we krwi w porównaniu z układami czysto kationowymi.
Integracja wielu funkcji w stosunkowo prostym projekcie jest możliwa dzięki kontrolowanej polimeryzacji z odwracalnym transferem łańcucha dodawania i fragmentacji (RAFT) do produkcji polimerów o złożonej architekturze i precyzyjnym składzie. Aby wytworzyć si-NP o neutralnym ładunku powierzchniowym, reakcji pH i stabilności NP, RAFT stosuje się do syntezy poli(metakrylanu glikolu etylenowego-b-[2-(dimetyloamino)etylometakrylanu-ko-butylu]) (PEG-DB; <silna klasa="xfig">Rysunek 1A). PEG-DB jest elektrostatycznie skompleksowany z siRNA, tworząc si-NP z koroną PEG i rdzeniem DB/siRNA (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). PEG tworzy obojętną, neutralnie naładowaną warstwę hydrofilową na koronie si-NP. Blok DB składa się ze stosunku molowego 2-(dimetyloamino)etylu metakrylanu (DMAEMA) i metakrylanu butylu (BMA) w stosunku 50:50. Kationowe DMAEMA elektrostatycznie kompleksuje ujemnie naładowane siRNA. BMA samoasocjuje się w rdzeniu NP poprzez oddziaływania van der Waalsa, zwiększając stabilność NP. Razem, DMAEMA i BMA nadają zależnemu od pH dwuwarstwowe zachowanie lityczne lipidów blokowi polimerowemu DB. Przy zewnątrzkomórkowym pH blok DB jest sekwestrowany do rdzenia si-NP i jest obojętny na dwuwarstwy lipidowe. W warunkach kwaśnych, takich jak te w obrębie szlaku endolizosomalnego, jonizowalny DMAEMA w bloku DB ułatwia efekt gąbki protonowej, gdzie buforowanie endosomalne prowadzi do obrzęku osmotycznego i pęknięcia26. Dodatkowo, hydrofobowe ugrupowania BMA w bloku DB aktywnie integrują się z dwuwarstwami lipidowymi i lizują je, co powoduje silną endosomolizę. W ten sposób siRNA jest skompleksowane z PEG-DB w celu wytworzenia si-NP, które są neutralnie naładowane i wysoce stabilne przy pH zewnątrzkomórkowym, ale które rozbijają dwuwarstwy lipidowe przy kwaśnym pH, zapewniając cytozolowe dostarczanie ładunku siRNA.
Tutaj opisane są eksperymentalne procedury produkcji si-NPs z PEG-DB. Przedstawiono i omówiono metody charakterystyki parametrów fizykochemicznych i bioaktywności si-NP. W celu szybkiej oceny bioaktywności si-NP lucyferazy stosuje się jako gen modelowy do badań knockdown. Lucyferazy świetlików to białko odpowiedzialne za "poświatę" świetlików27. W związku z tym komórki ssaków transfekowane genem lucyferazy świetlików wytwarzają bioluminescencyjną "poświatę", którą można uchwycić za pomocą luminometru w celu ilościowego określenia poziomów ekspresji lucyferazy. Tutaj używamy lucyferazy do oceny bioaktywności si-NP poprzez dostarczanie siRNA przeciwko lucyferazy i ilościowe określenie odpowiedniego zmniejszenia bioluminescencji w komórkach eksprymujących lucyferazy w porównaniu z komórkami, które otrzymują zaszyfrowane siRNA.

<table><tbody><tr><td>0,45 &#956; m Filtry strzykawkowe o wielkości porów</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F25133</td><td>Średnica 17 mm, membrana PTFE</td></tr><tr><td>0-14 Paski testowe pH</td><td>Millipore Sigma</td><td>P4786</td><td></td></tr><tr><td>10x bufor TAE</td> Paski testowe pH <td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td><td>AM9869</td><td></td></tr><tr><td>6-7,7</td><td>Millipore Sigma</td><td>P3536</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki o czarnych ściankach</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>Agaroza w proszku poddana hodowli tkankowej</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td><td>16500</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy jednowodny</td><td>Millipore Sigma</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>dwuzasadowy fosforan sodu dwuwodny</td><td>Millipore Sigma</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>D-lucyferyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88294</td><td>Sól monopotasowa</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995065</td><td>Wysoka zawartość glukozy i pirogronianu</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>bromek etydyny</td><td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>barwnik ładujący</td><td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Lucyferazy siRNA</td><td>IDT</td><td>Nie dotyczy</td><td>Sekwencja nici antysensownej: GAGGAGUUCAUUUUUCAGUGC AAUUGUU Sekwencja nici Sense: CAAUUGCACU GAUAAUGAACUCCT*C* *Zasady DNA</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 / Stabilne komórki lucyferazy (Bsd)</td><td>GenTarget Inc</td><td>SC059-Bsd</td><td>Komórki eksprymujące lucyferazy pozwane do oceny bioaktywności si-NP</td></tr><tr><td>monozasadowy monohydrat fosforanu sodu</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Scarmbled siRNA</td><td>IDT</td><td>N/ Sekwencja</td><td>nici antysensownej: AUACGCGUAUU AUACGCGAUUAACGAC Sense Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUAC GCGUA*T* *DNA podstawy</td></tr><tr><td>kwadratowe kuwety z polistyrenu</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-129</td> Siatka TEM <td>o pojemności 4,5 ml</td></tr><tr><td></td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>1GC50 PELCO</td><td>Siatki oznaczone centralnie, 50 oczek, 3,0 mm OD, dwuwodny</td></tr><tr><td>cytrynian trisodowy</td> miedzi <td>Millipore Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>octan uranylu</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>21447-25</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie neutralnie naładowanych, reagujących na ph nanocząstek polimerowych do dostarczania cytozolowego sirna

Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery

Sukces siRNA jako celowanego leku molekularnego zależy od jego efektywnego cytozolowego dostarczania do komórek w tkance patologicznej. Osiągnięto sukces kliniczny w leczeniu siRNA wcześniej "nieuleczalnych" celów choroby wątroby. Jednak skuteczne dostarczanie siRNA do guza wymaga dodatkowych rozważań farmakokinetycznych dotyczących projektowania, w tym długiego czasu krążenia, unikania klirensu narządów (np. wątroby i nerek) oraz penetracji i zatrzymywania guza. W tym miejscu opisujemy przygotowanie i fizykochemiczną/biologiczną charakterystykę in vitro nanocząstek polimerowych przeznaczonych do efektywnego dostarczania siRNA, szczególnie do tkanek niewątrobowych, takich jak nowotwory. Nanocząstki siRNA są otrzymywane przez elektrostatyczne kompleksowanie siRNA i kopolimeru diblokowego poli(glikol etylenowy-b-[2-(dimetyloamino)metakrylan etylu-ko-butyl metakrylan]) (PEG-DB) w celu utworzenia kompleksów polijonowych (polipleksów), w których siRNA jest sekwestrowane w rdzeniu polipleksu, a PEG tworzy hydrofilową, neutralnie naładowaną koronę. Co więcej, blok DB staje się błonowo-lityczny, gdy pęcherzyki szlaku endolizosomalnego zakwaszają się (< pH 6,8), wywołując ucieczkę endosomalną i cytozolowe dostarczanie siRNA. Opisano metody charakterystyki fizykochemicznej nanocząstek siRNA, takie jak wielkość, ładunek powierzchniowy, morfologia cząstek i obciążenie siRNA. Bioaktywność nanocząstek siRNA mierzy się przy użyciu lucyferazy jako genu modelowego w szybkim i wysokoprzepustowym teście wyciszania genów. Projekty, które przejdą te wstępne testy (takie jak polipleksy na bazie PEG-DB) są uważane za odpowiednie do przełożenia do przedklinicznych badań na zwierzętach oceniających dostarczanie siRNA do guzów lub innych miejsc patologii.

Kluczowymi charakterystykami skutecznych si-NP do dostarczania siRNA in vivo są odpowiedni rozmiar (średnica ~20 – 20 nm), pakowanie siRNA oraz bioaktywność w zakresie wyciszania genów. Choć nie jest to lista wyczerpująca (co omówiono w sekcji Dyskusja), podstawowe parametry te powinny zostać potwierdzone przed rozważeniem dalszych testów danej formulacji.
Rycina 2 przedstawia charakterystykę rozmia...

Przedstawiono metody przygotowania i scharakteryzowania właściwości fizykochemicznych i bioaktywności neutralnie naładowanych, reagujących na pH nanocząstek siRNA. Omówiono kryteria skutecznego stosowania nanoleków siRNA, takie jak rozmiar, morfologia, ładunek powierzchniowy, obciążenie siRNA i wyciszanie genów.

Przygotowanie neutralnie naładowanych, reagujących na pH nanocząstek polimerowych do dostarczania cytozolowego siRNA

The success of siRNA as a targeted molecular medicine is dependent upon its efficient cytosolic delivery to cells within the tissue of pathology. Clinical ...

Obecny protokół jest istotny, ponieważ pozwala naukowcom na wytwarzanie nanocząstek naładowanych siRNA i odpowiednie scharakteryzowanie tych nanocząstek, aby zapewnić ich przydatność do podawania zwierzętom przed kolejnymi badaniami. Zaletą tego podejścia jest wytwarzanie nanocząstek, które zwiększają biodostępność siRNA oraz wytwarzanie nanocząstek, które są naładowane neutralnie, a zatem nadają się do podawania ogólnoustrojowego. Technika ta ma znaczenie, ponieważ nanocząstki siRNA mogą być stosowane w leczeniu niezliczonych chorób wymagających podawania ogólnoustrojowego, w tym między innymi raka, chorób układu krążenia i zaburzeń autoimmunologicznych.Na początek rozpuść polimer w etanolu w stężeniu 33,3 miligrama na mililitr i wymieszaj, aby zapewnić rozpuszczenie. Następnie za pomocą pipety przenieś roztwór polimeru w 10-milimolowym buforze kwasu cytrynowego, aby osiągnąć stężenie 3,33 miligrama na mililitr. Dodaj wodę destylowaną do probówki zawierającej małe interferujące RNA, aby osiągnąć stężenie 50 mikromolowych.Dokładnie wymieszaj polimer i małe interferujące roztwory RNA w probówce, pipetując w górę i w dół, aby uzyskać stosunek azotu do fosforanu równy 10. Umieść probówkę w temperaturze otoczenia na 30 minut. Następnie dodaj jeden mililitr 10-milimolowego buforu fosforanowego o pH ósmym do probówki, aby osiągnąć stężenie 0,28 miligrama na mililitr i delikatnie wymieszaj, pipetując lub odwracając probówkę.Aby potwierdzić, że końcowe pH jest neutralne, około 7,2 do 7,5 należy odpipetować 10 mikrolitrów małego interferującego roztworu nanocząstek RNA na paski testowe pH. Najpierw przygotuj próbkę dynamicznego rozpraszania światła, filtrując jeden mililitr małych interferujących nanocząstek RNA o stężeniu 0,28 miligrama na mililitr przez filtry strzykawkowe o wielkości porów 0,45 mikrometra do kwadratowej kuwety kwarcowej lub polistyrenowej. Następnie zapisz pomiary wielkości i ładunku powierzchniowego za pomocą przyrządu do dynamicznego rozpraszania światła zgodnie ze specyfikacją producenta.Aby potwierdzić rozmiar i morfologię małych interferujących nanocząstek RNA za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej, najpierw dodaj pięć mikrolitrów przefiltrowanego roztworu małych interferujących nanocząstek RNA w ilości 0,28 miligrama na mililitr do każdej siatki TEM. Umieść kratki w temperaturze otoczenia na 60 sekund. Osusz bibułą filtracyjną przez trzy sekundy.Następnie dodaj pięć mikrolitrów 3% roztworu octanu uranylu do każdej siatki i inkubuj przez 20 sekund. Osusz do sucha przez trzy sekundy. Następnie umieść siatki w eksykatorze do wyschnięcia przez noc przed obrazowaniem pod transmisyjną mikroskopią elektronową.Aby wykonać opóźnienie żelu agarozowego, najpierw dodaj dwa gramy proszku agarozowego klasy elektroforetycznej do 100 mililitrów buforu 1X Tris-acetate-EDTA o pH ósmym w zlewce, aby wytworzyć 2% żel agarozowy. Wymieszaj, aby zawiesić agarozę. Umieść zlewkę bez przykrycia w kuchence mikrofalowej, aby podgrzewała się przez jedną do trzech minut, aż cała agaroza się rozpuści.Po schłodzeniu dodać do zlewki pięć mikrolitrów bromku etydyny o stężeniu 10 miligramów na mililitr i dobrze wymieszać. Następnie wlej agarozę do tacki na żel i umieść grzebień, aby uzyskać dołki. Pozostaw żel do wyschnięcia na 30 minut.Ostrożnie wyjmij grzebień, aby pozostawić studzienki załadowcze i wlej 1X bufor Tris-acetate-EDTA do tacki na żel, aby napełnić do linii maksymalnego napełnienia. Następnie umieść dwie mikrolitrowe porcje barwnika ładującego bez SDS lub środków redukujących na folii parafinowej dla każdego małego interferującego preparatu nanocząstek RNA przy różnych proporcjach azotu do fosforanu. Pipeta do wymieszania 10 mikrolitrów małego interferującego roztworu nanocząstek RNA z obciążeniem barwnikiem na folię parafinową.Dodaj mieszaninę do studzienek z żelem agarozowym. Podłącz system elektroforezy do źródła zasilania i uruchom źródło napięcia o napięciu 100 V przez 35 minut lub do momentu, gdy próbki przejdą 80% długości żelu. Przenieś żel z tacki do transiluminatora UV i zwizualizuj małe interferujące pasma RNA na transiluminatorze UV zgodnie ze specyfikacją producenta.Określ optymalny stosunek azotu do fosforanów na podstawie zaniku małych interferujących prążków RNA na dnie żelu. Aby obalić modelowy gen lucyferazy, najpierw zasiej komórki wyrażające lucyferazy w 96-dołkowej płytce o czarnych ściankach z DMEM w 10% FBS o gęstości 2000 komórek na dołek. Umieść płytkę w inkubatorze na noc, aby komórki mogły się przykleić.Rano usuń pożywkę i dodaj 10 mikrolitrów na studzienkę małych interferujących nanocząstek RNA rozcieńczonych w pełnej pożywce surowicy, aby uzyskać końcowe małe interferujące stężenie RNA wynoszące 100 nanomolów. Umieść studzienki z powrotem w inkubatorze na 24 godziny, aby potraktować komórki małymi zakłócającymi nanocząstkami RNA. Następnego dnia zastąp pożywkę pełną pożywką surowicy zawierającą 150 mikrogramów na mililitr D-lucyferyny.Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez pięć minut przed pomiarem luminescencji na czytniku płytkowym. Następnie powtórzyć odświeżanie pożywki dwukrotnie ze świeżymi, pełnymi pożywkami surowicy wolnymi od D-lucyferyny, a następnie inkubować przez 24 godziny. Zastąp pożywkę pełną pożywką surowicy zawierającą 150 miligramów na mililitr D-lucyferyny i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Zmierz luminescencję w 48-godzinnym punkcie czasowym. W przypadku badań podłużnych należy pozostawić pokrywkę na górze płytki studzienki, gdy znajduje się ona poza komorą bezpieczeństwa biologicznego, aby utrzymać komórki w sterylnych warunkach i kontynuować inkubację po zastąpieniu pożywki zawierającej lucyferynę świeżą, pełną pożywką. Pomiary dynamicznego rozpraszania światła pokazują, że mała interferująca nanocząstka RNA 1 ma średnią średnicę 35 nanometrów.Obecność pojedynczego piku o wąskiej szerokości piku wskazuje na rozkład jednomodalny i niską polidyspersyjność. Pomiary TEM potwierdzają, że pomiar wielkości z dynamicznego rozpraszania światła sugeruje obecność jednolitej populacji małych interferujących nanocząstek RNA i ujawnił sferyczną morfologię małych interferujących nanocząstek RNA. Zbyt wysokie stężenie polimeru na etapie przygotowania spowodowało powstanie małych interferujących nanocząstek RNA o niepożądanej średnicy większej niż 200 nanometrów, multimodalnej i polirozproszonej populacji oraz agregatów w roztworze tworzących brak wyraźnej morfologii cząstek.Zarówno małe interferujące nanocząstki RNA, jeden, jak i dwa, wykazują neutralny ładunek powierzchniowy, na który wskazują bliskie zeru średnie wartości potencjału zeta. Test opóźnienia żelu agarozowego wykazuje zanik małych interferujących prążków RNA na dnie żelu, co wskazuje na kompleksowanie małego interferującego RNA z polimerem. Skompleksowany polimerem mały interferujący RNA nie jest w stanie migrować przez żel i dlatego jest wizualizowany w górnej części żelu w pobliżu studzienek załadowczych.Wraz ze wzrostem stosunku azotu do fosforanu zwiększa się małe interferujące kompleksowanie RNA, na co wskazuje zmniejszona intensywność małego interferującego pasma RNA na dnie żelu. Bioaktywna lucyferazy, mała interferująca nanocząstka RNA, wykazuje znacznie zmniejszoną aktywność lucyferazy w porównaniu z kontrolą zaszyfrowaną. W przeciwieństwie do tego, lucyferazy mała interferująca nanocząstka RNA druga nie jest uważana za bioaktywną.Aby wytworzyć spójne nanocząstki siRNA o pożądanych właściwościach fizykochemicznych, należy stosować roztwory polimerowe o odpowiednich stężeniach i walidować pH roztworów buforowych na każdym etapie protokołu. Korzystając z tych metod w naszych badaniach, byliśmy w stanie wyprodukować terapie oparte na nanocząstkach siRNA dla wcześniej nieuleczalnych genów powodujących raka i przetestować skuteczność tych terapii w przedklinicznych modelach raka piersi.

preparation-neutrally-charged-ph-responsive-polymeric-nanoparticles

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano protokół analizy śledzenia nanocząstek (NTA) i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej do oceny nanocząstek dostarczających geny polimerowe. NTA wykorzystuje się do scharakteryzowania rozkładu wielkości cząstek nanocząstek i rozkładu plazmidu na cząstkę. Wysokoprzepustowa cytometria przepływowa umożliwia ilościową ocenę skuteczności transfekcji dla biblioteki biomateriałów dostarczających geny.

Ocena nanocząstek dostarczających geny polimerowe za pomocą analizy śledzenia nanocząstek i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej

Powtarzające się retro-orbitalne iniekcje kompleksów liposomów kationowych/siRNA/ITSN-1s u myszy, co 72 godziny przez 24 dni, skutecznie dostarczają duplex siRNA do mikrokrążenia płuc myszy, zmniejszając ekspresję mRNA i białka ITSN-1s o 75%. Technika ta jest wysoce powtarzalna w modelu zwierzęcym, nie ma żadnych skutków ubocznych i pozwala uniknąć ofiar śmiertelnych.

Długotrwałe wyciszanie intersectin-1 w płucach myszy poprzez wielokrotne dostarczanie specyficznego siRNA przez kationowe liposomy. Ocena efektów knockdown za pomocą mikroskopii elektronowej

Dostarczanie pozostaje głównym wyzwaniem dla terapeutycznej implementacji małego interferującego RNA (siRNA). Protokół ten polega na wykorzystaniu wielofunkcyjnej i biokompatybilnej platformy dostarczania siRNA, składającej się z porowatych mikrocząstek krzemu szczepionych argininą i polietyleniną.

Porowate mikrocząsteczki krzemu do dostarczania terapii siRNA

Celem tego protokołu jest użycie kationowych/anionowych liposomów z peptydem neurotargetującym jako systemu dostarczania OUN, aby umożliwić siRNA przejście przez BBB.  Optymalizacja systemu dostarczania leków, takich jak siRNA, pozwoliłaby na więcej opcji leczenia prionów i innych chorób neurodegeneracyjnych.

Dostarczanie terapeutycznego siRNA do OUN za pomocą liposomów kationowych i anionowych

Prezentujemy nowatorską metodę, która wykorzystuje fotoczułe kopolimery blokowe do bardziej efektywnej czasoprzestrzennej kontroli wyciszania genów bez wykrywalnych efektów poza celem. Ponadto zmiany w ekspresji genów można przewidzieć za pomocą prostych testów uwalniania siRNA i prostego modelowania kinetycznego.

Przewidywanie wyciszania genów poprzez czasoprzestrzenną kontrolę uwalniania siRNA z reagujących na światło nanonośników polimerowych

Tutaj opisujemy protokół generowania kationowych nanoliposomów, który opiera się na metodzie suchego filmu i może być wykorzystany do bezpiecznego i efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA.

Wytwarzanie kationowych nanoliposomów w celu efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA

Opisujemy metodę użycia superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza pokrytych polietylenoiminą (PEI) do transfekcji makrofagów za pomocą siRNA. Te nanocząstki mogą skutecznie dostarczać siRNA do makrofagów in vitro i in vivo oraz wyciszać ekspresję docelowych genów.

Nanocząstki tlenku żelaza pokryte polietylenopiną jako nośnik do dostarczania małych interferujących RNA do makrofagów in vitro i in vivo

Demonstrujemy syntezę fuzogennych porowatych nanocząsteczek krzemu do skutecznego dostarczania oligonukleotydów in vitro i in vivo. Porowate nanocząstki krzemu są ładowane siRNA w celu utworzenia rdzenia, który jest pokryty fuzogenicznymi lipidami poprzez wytłaczanie w celu utworzenia powłoki. Uwzględniono ugrupowanie celowe, funkcjonalizację i charakterystykę cząstek.

Synteza, funkcjonalizacja i charakterystyka fuzogennych porowatych nanocząstek krzemu do dostarczania oligonukleotydów

Dostarczamy protokoły i reprezentatywne dane do projektowania, montażu i charakteryzowania miceli kompleksu polielektrolitowego, nanocząstek typu rdzeń-powłoka tworzonych przez polielektrolity i hydrofilowe naładowane-nienaładowane kopolimery blokowe.

Montaż i charakterystyka miceli kompleksu polielektrolitu

Nanocząsteczki lipidowe są opracowywane przy użyciu mikroprzepływowej platformy mieszania do enkapsulacji mRNA i DNA.

Formułowanie i charakteryzowanie nanocząstek lipidowych do dostarczania genów przy użyciu platformy mieszania mikroprzepływowego

Tutaj przedstawiono prosty protokół produkcji nanocząsteczek mRNA opartych na polimerach poli(beta aminoestrowych), który można łatwo dostosować poprzez zmianę kapsułkowanego mRNA. Opisano również przebieg syntezy polimerów, nanocząstek oraz ich niezbędną charakterystykę in vitro. Dodano również dowód słuszności koncepcji dotyczący szczepień.

Synteza i charakterystyka nanocząstek poli(beta-aminoestrów) obciążonych mRNA do celów szczepień

Poznaj metodę przygotowania neutralnie naładowanych nanocząstek siRNA reagujących na pH w nanomedycynie. Technika ta zwiększa biodostępność siRNA i umożliwia systemowe podawanie w terapii genowej.

Przygotowanie neutralnie naładowanych, reagujących na pH nanocząstek polimerowych do dostarczania cytozolowego siRNA

Przeglądaj więcej filmów