Przygotowanie neutralnie naładowanych, reagujących na pH nanocząstek polimerowych do dostarczania cytozolowego siRNA

Obecny protokół jest istotny, ponieważ pozwala naukowcom na wytwarzanie nanocząstek naładowanych siRNA i odpowiednie scharakteryzowanie tych nanocząstek, aby zapewnić ich przydatność do podawania zwierzętom przed kolejnymi badaniami. Zaletą tego podejścia jest wytwarzanie nanocząstek, które zwiększają biodostępność siRNA oraz wytwarzanie nanocząstek, które są naładowane neutralnie, a zatem nadają się do podawania ogólnoustrojowego. Technika ta ma znaczenie, ponieważ nanocząstki siRNA mogą być stosowane w leczeniu niezliczonych chorób wymagających podawania ogólnoustrojowego, w tym między innymi raka, chorób układu krążenia i zaburzeń autoimmunologicznych.

Na początek rozpuść polimer w etanolu w stężeniu 33,3 miligrama na mililitr i wymieszaj, aby zapewnić rozpuszczenie. Następnie za pomocą pipety przenieś roztwór polimeru w 10-milimolowym buforze kwasu cytrynowego, aby osiągnąć stężenie 3,33 miligrama na mililitr. Dodaj wodę destylowaną do probówki zawierającej małe interferujące RNA, aby osiągnąć stężenie 50 mikromolowych.

Dokładnie wymieszaj polimer i małe interferujące roztwory RNA w probówce, pipetując w górę i w dół, aby uzyskać stosunek azotu do fosforanu równy 10. Umieść probówkę w temperaturze otoczenia na 30 minut. Następnie dodaj jeden mililitr 10-milimolowego buforu fosforanowego o pH ósmym do probówki, aby osiągnąć stężenie 0,28 miligrama na mililitr i delikatnie wymieszaj, pipetując lub odwracając probówkę.

Aby potwierdzić, że końcowe pH jest neutralne, około 7,2 do 7,5 należy odpipetować 10 mikrolitrów małego interferującego roztworu nanocząstek RNA na paski testowe pH. Najpierw przygotuj próbkę dynamicznego rozpraszania światła, filtrując jeden mililitr małych interferujących nanocząstek RNA o stężeniu 0,28 miligrama na mililitr przez filtry strzykawkowe o wielkości porów 0,45 mikrometra do kwadratowej kuwety kwarcowej lub polistyrenowej. Następnie zapisz pomiary wielkości i ładunku powierzchniowego za pomocą przyrządu do dynamicznego rozpraszania światła zgodnie ze specyfikacją producenta.

Aby potwierdzić rozmiar i morfologię małych interferujących nanocząstek RNA za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej, najpierw dodaj pięć mikrolitrów przefiltrowanego roztworu małych interferujących nanocząstek RNA w ilości 0,28 miligrama na mililitr do każdej siatki TEM. Umieść kratki w temperaturze otoczenia na 60 sekund. Osusz bibułą filtracyjną przez trzy sekundy.

Następnie dodaj pięć mikrolitrów 3% roztworu octanu uranylu do każdej siatki i inkubuj przez 20 sekund. Osusz do sucha przez trzy sekundy. Następnie umieść siatki w eksykatorze do wyschnięcia przez noc przed obrazowaniem pod transmisyjną mikroskopią elektronową.

Aby wykonać opóźnienie żelu agarozowego, najpierw dodaj dwa gramy proszku agarozowego klasy elektroforetycznej do 100 mililitrów buforu 1X Tris-acetate-EDTA o pH ósmym w zlewce, aby wytworzyć 2% żel agarozowy. Wymieszaj, aby zawiesić agarozę. Umieść zlewkę bez przykrycia w kuchence mikrofalowej, aby podgrzewała się przez jedną do trzech minut, aż cała agaroza się rozpuści.

Po schłodzeniu dodać do zlewki pięć mikrolitrów bromku etydyny o stężeniu 10 miligramów na mililitr i dobrze wymieszać. Następnie wlej agarozę do tacki na żel i umieść grzebień, aby uzyskać dołki. Pozostaw żel do wyschnięcia na 30 minut.

Ostrożnie wyjmij grzebień, aby pozostawić studzienki załadowcze i wlej 1X bufor Tris-acetate-EDTA do tacki na żel, aby napełnić do linii maksymalnego napełnienia. Następnie umieść dwie mikrolitrowe porcje barwnika ładującego bez SDS lub środków redukujących na folii parafinowej dla każdego małego interferującego preparatu nanocząstek RNA przy różnych proporcjach azotu do fosforanu. Pipeta do wymieszania 10 mikrolitrów małego interferującego roztworu nanocząstek RNA z obciążeniem barwnikiem na folię parafinową.

Dodaj mieszaninę do studzienek z żelem agarozowym. Podłącz system elektroforezy do źródła zasilania i uruchom źródło napięcia o napięciu 100 V przez 35 minut lub do momentu, gdy próbki przejdą 80% długości żelu. Przenieś żel z tacki do transiluminatora UV i zwizualizuj małe interferujące pasma RNA na transiluminatorze UV zgodnie ze specyfikacją producenta.

Określ optymalny stosunek azotu do fosforanów na podstawie zaniku małych interferujących prążków RNA na dnie żelu. Aby obalić modelowy gen lucyferazy, najpierw zasiej komórki wyrażające lucyferazy w 96-dołkowej płytce o czarnych ściankach z DMEM w 10% FBS o gęstości 2000 komórek na dołek. Umieść płytkę w inkubatorze na noc, aby komórki mogły się przykleić.

Rano usuń pożywkę i dodaj 10 mikrolitrów na studzienkę małych interferujących nanocząstek RNA rozcieńczonych w pełnej pożywce surowicy, aby uzyskać końcowe małe interferujące stężenie RNA wynoszące 100 nanomolów. Umieść studzienki z powrotem w inkubatorze na 24 godziny, aby potraktować komórki małymi zakłócającymi nanocząstkami RNA. Następnego dnia zastąp pożywkę pełną pożywką surowicy zawierającą 150 mikrogramów na mililitr D-lucyferyny.

Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez pięć minut przed pomiarem luminescencji na czytniku płytkowym. Następnie powtórzyć odświeżanie pożywki dwukrotnie ze świeżymi, pełnymi pożywkami surowicy wolnymi od D-lucyferyny, a następnie inkubować przez 24 godziny. Zastąp pożywkę pełną pożywką surowicy zawierającą 150 miligramów na mililitr D-lucyferyny i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Zmierz luminescencję w 48-godzinnym punkcie czasowym. W przypadku badań podłużnych należy pozostawić pokrywkę na górze płytki studzienki, gdy znajduje się ona poza komorą bezpieczeństwa biologicznego, aby utrzymać komórki w sterylnych warunkach i kontynuować inkubację po zastąpieniu pożywki zawierającej lucyferynę świeżą, pełną pożywką. Pomiary dynamicznego rozpraszania światła pokazują, że mała interferująca nanocząstka RNA 1 ma średnią średnicę 35 nanometrów.

Obecność pojedynczego piku o wąskiej szerokości piku wskazuje na rozkład jednomodalny i niską polidyspersyjność. Pomiary TEM potwierdzają, że pomiar wielkości z dynamicznego rozpraszania światła sugeruje obecność jednolitej populacji małych interferujących nanocząstek RNA i ujawnił sferyczną morfologię małych interferujących nanocząstek RNA. Zbyt wysokie stężenie polimeru na etapie przygotowania spowodowało powstanie małych interferujących nanocząstek RNA o niepożądanej średnicy większej niż 200 nanometrów, multimodalnej i polirozproszonej populacji oraz agregatów w roztworze tworzących brak wyraźnej morfologii cząstek.

Zarówno małe interferujące nanocząstki RNA, jeden, jak i dwa, wykazują neutralny ładunek powierzchniowy, na który wskazują bliskie zeru średnie wartości potencjału zeta. Test opóźnienia żelu agarozowego wykazuje zanik małych interferujących prążków RNA na dnie żelu, co wskazuje na kompleksowanie małego interferującego RNA z polimerem. Skompleksowany polimerem mały interferujący RNA nie jest w stanie migrować przez żel i dlatego jest wizualizowany w górnej części żelu w pobliżu studzienek załadowczych.

Wraz ze wzrostem stosunku azotu do fosforanu zwiększa się małe interferujące kompleksowanie RNA, na co wskazuje zmniejszona intensywność małego interferującego pasma RNA na dnie żelu. Bioaktywna lucyferazy, mała interferująca nanocząstka RNA, wykazuje znacznie zmniejszoną aktywność lucyferazy w porównaniu z kontrolą zaszyfrowaną. W przeciwieństwie do tego, lucyferazy mała interferująca nanocząstka RNA druga nie jest uważana za bioaktywną.

Aby wytworzyć spójne nanocząstki siRNA o pożądanych właściwościach fizykochemicznych, należy stosować roztwory polimerowe o odpowiednich stężeniach i walidować pH roztworów buforowych na każdym etapie protokołu. Korzystając z tych metod w naszych badaniach, byliśmy w stanie wyprodukować terapie oparte na nanocząstkach siRNA dla wcześniej nieuleczalnych genów powodujących raka i przetestować skuteczność tych terapii w przedklinicznych modelach raka piersi.