Name: Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptacja protokołu amplifikacji powtórzeń telomerów do kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Poznaj metodę ddTRAP do pomiaru aktywności telomerazy w komórkach ludzkich z użyciem cyfrowej PCR w kroplach. Ta technika zapewnia wyższą czułość i lepszą analizę statystyczną w porównaniu do klasycznych metod.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować za źródła finansowania z National Institutes of Health (NIH) (NCI-R00-CA197672-01A1). Linie drobnokomórkowego raka płuca (SHP77 i H82) były hojnym darem od dr Johna Minny i Adi Gazdara z UT Southwestern Medical Center.

1. Przygotowanie i przechowywanie bufora
<ol>
	<li>Przygotuj 50 ml 1x podstawowego buforu do lizy NP-40 wolnego od RNaz/DNaz (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM MgCl2, 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 1% [obj./obj.] NP-40, 10% [obj./obj.] glicerolu, 150 mM NaCl, 5 mM β-merkaptoetanolu i 0,1 mM chlorowodorku fluorku 4-benzenesulfonylu (AEBSF)). Bufor ten może być porcjowany i przechowywany w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości. Unikaj cykli zamrażania/rozmrażania, aby uzyskać optymalną lizę komórek.</li>
	<li>Przygotuj 50 ml 10x podstawowego bufora rozszerzającego TRAP wolnego od RNaz/DNaz (200 mM Tris-HCl [pH 8,0], 15 mM MgCl2, 630 mM KCl, 0,5% [vol/vol] Tween 20 i 10 mM glikolu etylenowego-bis(β-aminoetylowego eter)-N,N,N′,N′-tetraoctowego kwasu (EGTA)). Bufor ten może być podzielony na podwielokrotności o pojemności 1 ml i przechowywany w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
</ol>
2. Liza komórek
<ol>
	<li>Przygotowanie komórek
	<ol>
		<li>Rozmrozić zamrożoną porcję buforu do lizy NP-40. Po rozmrożeniu umieść bufor do lizy na lodzie. Dodać fluorek fenylometylosulfonylu (inhibitor proteazy PMSF) do buforu do lizy NP-40, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,2 mM. 
		UWAGA: Należy to zrobić bezpośrednio przed lizą komórek.</li>
		<li>Usuń nadmiar płynu z zebranych granulek komórek, aby zapewnić suche osady komórkowe. Należy zauważyć, że granulki komórek, zarówno świeżo zebrane, jak i wcześniej zamrożone (w temperaturze -80 °C lub zamrożone w płynieN2), nie mogą zawierać żadnych pozostałości roztworów z poprzednich wirówek, ponieważ roztwory te mogą zakłócać dalsze procedury.</li>
		<li>Hoduj, zbieraj i zamrażaj zarówno linie komórkowe telomerazy dodatnie, jak i telomerazy ujemne (fibroblasty BJ, IMR-90 lub U2OS) w celu wykorzystania ich jako kontroli dodatniej i negatywnej. Używaj nowych lizatów kontrolnych za każdym razem, gdy wykonywana jest próba, aby zapewnić odtwarzalność testu. 
		UWAGA: Zaleca się, aby przed zamrożeniem wyhodować dużą kulturę komórek telomerazy ujemnych i podzielić je na porcje w celu usunięcia wszelkich artefaktów związanych z kulturą tkankową, które mogą zostać wprowadzone podczas długotrwałej hodowli linii komórkowych, aby zapewnić powtarzalne wyniki ujemnej próbki kontrolnej.</li>
		<li>Umieść granulki komórek na lodzie. Jeśli komórki zostały zamrożone, pozwól im na chwilę rozmrozić się na lodzie. 
		UWAGA: Typowe rozmiary granulek komórek dla ddTRAP wynoszą od 500 000 do 1 000 000 komórek. W razie potrzeby można również użyć granulek o mniejszych komórkach, ale liczba komórek musi/najlepiej powinna być znana. ddTRAP można również przeprowadzić w oparciu o wprowadzone białko za pomocą testu białka BCA (dane wejściowe zwykle wynoszą 1 μg).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lizacja komórek
	<ol>
		<li>Lizować komórki w buforze do lizy NP-40. Utrzymuj równoważność komórek na poziomie 25 000 komórek/μl buforu. Na przykład liza osadu (zawierającego 1 000 000 komórek) w 40 μl buforu do lizy NP-40. Delikatnie pipetować lizat w górę i w dół, aby rozbić komórki. Staraj się unikać robienia bąbelków.</li>
		<li>Pozwól komórkom lizować się na lodzie przez 30 minut. Upewnij się, że delikatnie wirujesz lizat, aby zapobiec tworzeniu się skupisk resztek komórkowych. Można to robić co 10 minut i ma na celu utrzymanie lizatu jako zhomogenizowanej mieszaniny.</li>
		<li>Rozcieńczyć lizat komórkowy (25 000 komórek/μl) w stosunku 1:20 w buforze do lizy NP-40, uzyskując nowy równoważnik komórek 1,250 komórek/μl. Na przykład rozcieńczyć 5 μl lizatu komórkowego w 95 μl buforu do lizy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Reakcja przedłużenia telomerazy
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę wzorcową (tabela 1) do reakcji wydłużania telomerazy (na reakcję). 
	UWAGA: Najlepiej jest przygotować główną mieszankę reakcji przedłużającej podczas lizy komórek i przechowywać ją na lodzie.
	<ol>
		<li>Odpipetować 48 μl przedłużającej mieszanki wzorcowej do każdej probówki PCR.</li>
		<li>Dodać 2 μl rozcieńczonego (1,250 komórek/μl) lizatu do reakcji przedłużania. Całkowita objętość powinna teraz wynosić 50 μl, a końcowy odpowiednik komórek to 50 komórek/μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź reakcję wydłużenia telomerazy (Tabela 2).</li>
	<li>Produkty przedłużające telomerazy należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3–5 dni, jednak optymalnie jest zużyć je w ciągu pierwszych 24 godzin.</li>
</ol>
4. Konfiguracja cyfrowego PCR kropelkowego
<ol>
	<li>Przygotować mieszankę wzorcową (tabela 3) dla ddTRAP (na reakcję). 
	UWAGA: Gdy odczynniki osiągną temperaturę pokojową, nie umieszczaj ich ani mieszanki głównej na lodzie. Umieszczenie mieszanki na lodzie może zwiększyć lepkość i prowadzić do słabego tworzenia się kropel. Polimeraza DNA w supermiksie ddPCR jest gorącym początkiem i powinna być stabilna w temperaturze pokojowej. Mieszanka ddPCR supermix może być przechowywana w temperaturze 4 °C po początkowym rozmrożeniu w temperaturze od -20 °C.
	<ol>
		<li>Odpipetować 19,8 μl głównej mieszanki ddPCR do każdej probówki PCR.</li>
		<li>Dodać 2,2 μl reakcji przedłużania do każdej probówki. Należy pamiętać, że całkowita objętość powinna teraz wynosić 22 μL. 
		UWAGA: Całkowita ilość próbki potrzebna do ddTRAP wynosi 20 μL (odpowiednik 100 komórek). Dodatkowa objętość jest środkiem ostrożności w przypadku błędu pipetowania lub utraty próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja kasety z generowaniem kropel. 
	UWAGA: Wkład zawiera trzy różne kolumny studzienek, które są oznaczone.
	<ol>
		<li>Załadować 20 μl reakcji przygotowanej zgodnie z krokiem 4.1.2 do dołka na próbkę (studzienki środkowej) we wkładzie. Podczas pipetowania próbki należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza. 
		UWAGA: Jeśli są bąbelki, delikatnie postukaj w bok wkładu, aby te bąbelki znalazły się na górze roztworu.</li>
		<li>Załadować 70 μl oleju wytwarzającego kropelki do szybu naftowego (lewa studzienka). 
		UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia, należy używać wyłącznie oddzielnego zestawu pipet i końcówek do etapów generowania kropelek ddPCR. Ważna jest kolejność ładowania wkładu. Próbka musi być załadowana przed załadowaniem oleju, ponieważ olej jest cięższy i wypełni komory mikroprzepływowe i doprowadzi do słabego tworzenia się kropel. Minimalna liczba próbek, które można przeprowadzić, to osiem. Wszystkie studzienki wkładu muszą być załadowane próbką, ponieważ każda pusta studzienka doprowadzi do zatrzymania wytwarzania kropel z generatora kropel. Jeśli nie są dostępne odpowiednie próbki do załadowania wszystkich ośmiu studzienek do wkładu, do pozostałych wkładów można załadować 20 μl mieszanki głównej ddTRAP (krok 4.1).</li>
		<li>Zabezpiecz uszczelkę na miejscu, przymocowując ją do końców wkładu. 
		UWAGA: Brak lub niewłaściwe umieszczenie uszczelki zapobiegnie wytwarzaniu kropel przez generator</li>.
		<li>Umieść załadowany i zmontowany wkład w generatorze kropel. 
		UWAGA: Wkład jest rozpoznawany przez magnes w generatorze, który poinformuje użytkownika o prawidłowym umieszczeniu wkładu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjmij wkład po wytworzeniu kropelek i zakończeniu cyklu (~60–90 s).
	<ol>
		<li>Delikatnie wyjmij uszczelkę z wkładu. Odpipetować nowo wygenerowane kropelki (prawy dołek) za pomocą pipety wielokanałowej na 96-dołkową płytkę PCR. 
		UWAGA: Przybliżona objętość nowo wytworzonej emulsji kropelkowej powinna wynosić 40–43 μL.</li>
		<li>Zgrzej płytkę folią aluminiową Uszczelki płytki PCR po załadowaniu wszystkich próbek do płytki 96-dołkowej, aby zapobiec parowaniu podczas etapów PCR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załaduj 96-dołkową płytkę do termocyklera i przeprowadź następującą reakcję PCR (Tabela 4). 
	UWAGA: Wszystkie szybkości narastania między stopniami temperatury muszą być ustawione na 2.5 °C/s, aby prawidłowo podgrzać reakcje.</li>
</ol>
5. Wykrywanie produktów przedłużających telomerazę
<ol>
	<li>Załaduj 96-dołkową płytkę do czytnika kropel. 
	UWAGA: Upewnij się, że płytka jest prawidłowo ustawiona, tak aby próbka A1 pasowała do próbki uchwytu.
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie powiązane z czytnikiem kropel. Kliknij dwukrotnie pierwszy dołek A1, aby otworzyć ekran edytora próbki/studzienki.</li>
		<li>Kliknij Eksperyment i wybierz ABS z menu rozwijanego. 
		UWAGA: Eksperyment określa rodzaj testu, który ma być użyty (tj. bezwzględna kwantyfikacja lub test liczby kopii genu). ABS oznacza bezwzględną kwantyfikację.</li>
		<li>Wybierz QX200 ddPCR Evagreen Supermix, aby upewnić się, że czytnik stosuje właściwą metodę wykrywania. Kliknij przycisk Zastosuj w prawym dolnym rogu ekranu edytora studni, aby zapisać ustawienia zdefiniowane przez użytkownika we wszystkich podświetlonych studniach. 
		UWAGA: SUPERMIX określa rodzaj mieszanki PCR i chemii detekcyjnej, która będzie odczytywana przez czytnik.</li>
		<li>Kliknij TARGET na ekranie edytora odwiertów w oprogramowaniu, aby zdefiniować próbkę.</li>
		<li>Zdefiniuj TYP próbki, klikając menu rozwijane CEL i wybierając opcję nieznany, referencyjny lub NTC (kontrola bez szablonu). 
		UWAGA: Nieznany odnosi się do próbki eksperymentalnej, odniesienie może być próbką kontrolną o znanej aktywności telomerazy, a NTC jest krytyczną kontrolą dla określenia ważności testu pod względem zanieczyszczenia i sygnału tła.</li>
		<li>Oznacz wszystkie próbki w sekcji Nazwa próbki i kliknij przycisk Zastosuj, aby upewnić się, że wyróżnione dołki są odpowiednio edytowane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kliknij przycisk Uruchom, aby uruchomić/odczytać płytę. Wybierz opcję Kolumny lub Wiersze na ekranie OPCJE URUCHAMIANIA, gdy pojawi się monit o poinformowanie maszyny o orientacji, w której należy wczytać tabliczkę.</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Określ liczbę przyjętych kropel dla każdej próbki, klikając poszczególne studzienki. Kliknij dwukrotnie poszczególne źródła lub nagłówki kolumn/wierszy, aby wyświetlić i przeanalizować przykładowe dane. 
	UWAGA: Najważniejszym kryterium decydującym o tym, czy przystąpić do analizy danej próbki, jest liczba "zaakceptowanych kropel". W przypadku ddTRAP próbki zawierające 10 000 lub więcej akceptowanych kropel są ważne do dalszej analizy. Dane mogą być przekazywane użytkownikowi w wielu formatach, w tym w formie tabeli .csv, obrazów .jpg, histogramów itp. Dostępnych jest wiele zasobów do dogłębnej analizy danych ddPCR, w tym ddTRAP11,13. Zasoby te zawierają przewodnik po analizie danych ddTRAP, od wyboru progów11,13 po wybór próbek do dalszej analizy11,13, identyfikowanie wyników fałszywie dodatnich i negatywnych13 i ogólne rozwiązywanie problemów13.</li>
	<li>Podświetl studzienki reprezentujące kontrpróby próbek i próbki NTC. Przeanalizować próbki w porównaniu z NTC lub liniami kontroli ujemnej, takimi jak komórki BJ (jak wymieniono powyżej w kroku 2.1.2).
	<ol>
		<li>Ręcznie ustaw próg dla próbek, klikając ikonę ustawiania progów w lewym dolnym rogu ekranu. Ustaw progi dla każdej pojedynczej studni lub dla wielu studzienek jednocześnie (zalecane). 
		UWAGA: Jeśli w NTC zostanie wykryte tło, można je odjąć od wszystkich innych próbek, aby "znormalizować" sygnał i zapewnić, że analizowany jest tylko prawdziwy sygnał dodatni. Wartości NTC mieszczą się zwykle w zakresie 0,2–1 cząsteczki/μl dla systemu bufora do lizy NP-40. Konieczne byłoby przetestowanie innych systemów i komponentów (na przykład CHIPS).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Frenck, R. W. Jr, Blackburn, E. H., Shannon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rate+of+telomere+sequence+loss+in+human+leukocytes+varies+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).</li>
<li>Morin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+telomere+terminal+transferase+enzyme+is+a+ribonucleoprotein+that+synthesizes+TTAGGG+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats.</a> Cell. 59 (3), 521-529 (1989).</li>
<li>de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+telomeres+solve+the+end-protection+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">How telomeres solve the end-protection problem.</a> Science. 326 (5955), 948-952 (2009).</li>
<li>Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+telomeres+and+telomerase+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of telomeres and telomerase in cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).</li>
<li>Kim, W., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+telomere+regulation+of+gene+expression%3A+Telomere+looping+and+telomere+position+effect+over+long+distances+%28TPE-OLD%29%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD).</a> Differentiation. 99, 1-9 (2018).</li>
<li>Robin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+position+effect%3A+regulation+of+gene+expression+with+progressive+telomere+shortening+over+long+distances%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Development%22%5BJournal%5D)">Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances.</a> Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).</li>
<li>Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence+and+immortalization%3A+role+of+telomeres+and+telomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase.</a> Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).</li>
<li>Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection+of+human+telomerase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection of human telomerase activity.</a> DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).</li>
<li>Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonradioactive+detection+of+telomerase+activity+using+the+telomeric+repeat+amplification+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).</li>
<li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li>
<li>Ludlow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+telomerase+enzyme+activity+determination+using+droplet+digital+PCR+with+single+cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution.</a> Nucleic Acids Research. 42 (13), e104(2014).</li>
<li>Huang, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Maintenance+of+Telomere+Length+in+CD28%2B+T+Cells+During+T+Lymphocyte+Stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6785(2017).</li>
<li>Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ddTRAP%3A+A+Method+for+Sensitive+and+Precise+Quantification+of+Telomerase+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity.</a> Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pomiar aktywności telomerazy ma kluczowe znaczenie dla wielu tematów badawczych, w tym między innymi raka, biologii telomerów, starzenia się, medycyny regeneracyjnej i projektowania leków opartych na strukturze. RNP telomerazy są mało obfite, nawet w komórkach rakowych, co sprawia, że wykrywanie i badanie tego enzymu jest trudne. W tym artykule opisaliśmy procedury krok po kroku dla nowo opracowanego testu ddTRAP w celu solidnego ilościowego określenia aktywności telomerazy w komórkach. Łącząc tradycyjną reakcję wydłużan...

Telomery to dynamiczne kompleksy DNA-białko na końcach liniowych chromosomów. Ludzkie telomery składają się z tablicy powtórzeń heksamserycznych 5'-TTAGGGn, które różnią się długością od 12 do 15 kilozasad (kb) przy urodzeniu1. Ludzka telomeraza, enzym rybonukleoproteinowy, który utrzymuje telomery, została po raz pierwszy zidentyfikowana w lizatach komórkowych HeLa (linia komórek rakowych)2. Telomery i telomeraza odgrywają razem ważną rolę w spektrum procesów biologicznych, takich jak ochrona genomu, regulacja genów i nieśmiertelność komórek rakowych3,4,5,6.
Telomeraza ludzka składa się głównie z dwóch kluczowych składników, a mianowicie odwrotnej transkryptazy telomerazy i RNA telomerazy (odpowiednio hTERT i hTERC). Podjednostka białkowa, hTERT, jest katalitycznie aktywnym składnikiem odwrotnej transkryptazy enzymu telomerazy. Matryca RNA, hTERC, dostarcza telomerazę z matrycą do przedłużania i/lub utrzymywania telomerów. Większość ludzkich tkanek somatycznych nie ma wykrywalnej aktywności telomerazy. Niezdolność polimerazy DNA do wydłużenia końca opóźnionej nici DNA wraz z brakiem telomerazy prowadzi do postępującego skracania telomerów po każdej rundzie podziału komórkowego. Zjawiska te prowadzą do skrócenia telomerów w większości komórek somatycznych, aż osiągną krytycznie skróconą długość, w wyniku czego komórki wchodzą w stan starzenia replikacyjnego. Maksymalna liczba podziałów, przez które komórka może się podzielić, zależy od długości telomerów i uważa się, że ta blokada do dalszego podziału komórki zapobiega postępowi do onkogenezy7. Komórki rakowe są w stanie przezwyciężyć starzenie replikacyjne wywołane telomerami i kontynuować proliferację, wykorzystując telomerazę do utrzymania telomerów. Około 90% nowotworów aktywuje telomerazę, co sprawia, że aktywność telomerazy jest niezwykle ważna zarówno w wykrywaniu, jak i leczeniu raka.
Rozwój testu TRAP w latach 90. był kluczowy w identyfikacji niezbędnych składników enzymu telomerazy, jak również w pomiarze telomerazy w szerokim zakresie komórek i tkanek, zarówno normalnych, jak i rakowych. W oryginalnym żelowym teście PCR wykorzystano radioaktywnie znakowane substraty DNA do wykrycia aktywności telomerazy. W 2006 roku test został zaadaptowany do postaci nieradioaktywnej przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie substratów8,9. Używając substratów znakowanych fluorescencyjnie, użytkownicy byli w stanie zwizualizować produkty przedłużające telomerazę jako pasma na żelu, wystawiając go na działanie odpowiedniej długości fali wzbudzenia. Czułość testu TRAP i jego zdolność do wykrywania aktywności telomerazy w surowych lizatach komórkowych sprawiły, że test ten stał się najczęściej stosowaną metodą wykrywania aktywności telomerazy. Test TRAP ma jednak ograniczenia. Test jest oparty na żelu, co utrudnia wykonanie niezbędnych powtórzeń w badaniach o umiarkowanej i wysokiej przepustowości, a zatem rzadko osiąga się właściwą analizę statystyczną. Co więcej, test na bazie żelu jest trudny do wiarygodnego określenia ilościowego ze względu na niemożność wykrycia mniej niż dwukrotnych różnic w aktywności telomerazy między próbkami. Pokonanie tych dwóch ograniczeń ma kluczowe znaczenie dla przeniesienia testów aktywności enzymatycznej, takich jak TRAP, do zastosowań klinicznych lub przemysłowych w celu wykrywania aktywności telomerazy w próbkach pobranych od pacjentów lub w badaniach nad projektowaniem leków.
Digital PCR został początkowo opracowany w 1999 roku jako sposób na przekształcenie wykładniczego i analogowego charakteru PCR w liniowy i cyfrowy test10. Cyfrowy PCR kropelkowy (ddPCR) jest najnowszą innowacją oryginalnej metodologii cyfrowego PCR. Cyfrowy PCR kropelkowy pojawił się wraz z pojawieniem się zaawansowanych mikrofluidyków i chemii emulsji typu olej w wodzie, aby niezawodnie generować stabilne i równomierne kropelki. W przeciwieństwie do żelowego, a nawet ilościowego PCR (qPCR), ddPCR generuje bezwzględną kwantyfikację materiału wejściowego. Kluczem do ddPCR jest wygenerowanie ~20 000 indywidualnych reakcji poprzez podzielenie próbek na kropelki. Po PCR w punkcie końcowym czytnik kropelek skanuje każdą kroplę w sposób podobny do cytometru przepływowego, zliczając, wymiarując i rejestrując obecność lub brak fluorescencji w każdej pojedynczej kropli (tj. brak lub obecność amplikonów PCR w każdej kropli). Następnie, korzystając z rozkładu Poissona, cząsteczki wejściowe są szacowane na podstawie stosunku dodatnich kropel do całkowitej liczby kropel. Liczba ta reprezentuje szacunkową liczbę cząsteczek wejściowych w każdym PCR. Ponadto ddPCR jest wykonywany i analizowany na 96-dołkowej płytce, która pozwala użytkownikowi na badanie wielu próbek, a także wykonywanie replik biologicznych i technicznych w celu prawidłowej analizy statystycznej. W rezultacie połączyliśmy potężną kwantyfikację i umiarkowaną przepustowość ddPCR z testem TRAP, aby opracować test ddTRAP 11. Ten test jest przeznaczony dla użytkowników do badania i solidnego określania ilościowego bezwzględnej aktywności telomerazy z próbek biologicznych11,12. Czułość ddTRAP pozwala na ilościowe określenie aktywności telomerazy na podstawie ograniczonych i cennych próbek, w tym pomiarów jednokomórkowych. Co więcej, użytkownicy mogą również badać skutki manipulacji telomerazą i/lub leków z bezwzględną kwantyfikacją mniej niż dwukrotnych zmian (~50% różnic). ddTRAP jest naturalną ewolucją testu TRAP w kierunku cyfrowego i bardziej przepustowego charakteru nowoczesnych eksperymentów laboratoryjnych i warunków klinicznych.

<table><tbody><tr><td>1 M Tris-HCl pH 8,0</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td>wolny od RNAzy/DNAzy</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td>wolny od Rnaz / DNAZ</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA pH 8,0</td><td>Ambion</td><td>AM9261</td> Bez <td>RNAzy/DNAzy</td></tr><tr><td>Surfakt - Amps NP-40</td><td>Thermo Scientific</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>100% Ultraczysty glicerol</td><td>Invitrogen</td><td>15514011</td><td>wolny od RNAzy/DNAzy</td></tr><tr><td>fluorek fenylometylosulfonylu</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td>Proszek</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>516732</td><td></td></tr><tr><td>Bez nukleaz H20</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td>Bez RNAzy/DNAz</td></tr><tr><td>2,5 mM mieszanka dNTP</td><td>Thermo Scientific</td><td>R72501</td><td>2,5 mM każdego dATP, dCTP, dGTP i dTTP</td></tr><tr><td>2 M KCl</td><td>Ambion</td><td>AM9640G</td><td>wolne od RNAzy/DNAzy</td></tr><tr><td>100% Tween-20</td><td>Fisher</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EGTA pH 8,0</td><td>Fisher</td><td>50-255-956</td> Wolny od <td>RNAz/DNAzy</td></tr><tr><td>substrat telomerazy (TS) Zintegrowany</td> podkład DNA <td>(IDT)</td><td>Niestandardowy podkład (oczyszczony HPLC)</td><td>5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'ACX</td></tr> <tr><td>(Revers) Zintegrowany podkład</td><td>DNA (IDT)</td><td>Niestandardowy podkład (oczyszczony HPLC)</td><td>5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -</td></tr><tr><td>3'Cienkościenne (250 ul) probówki klasy PCR</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2900</td><td>paski, płytki, rurki itp.</td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>Bio Rad</td><td>1864034</td><td></td></tr><tr><td>Twin-Tec 96 Płytka dołkowa</td><td>Fisher</td><td>Eppendorf 951020362</td><td></td></tr><tr><td>Zgrzewana folia przebijająca</td><td>Bio Rad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>Kartridgi generatora kropel (DG8)</td><td>Bio Rad</td><td>1863008</td><td></td></tr><tr><td>Olej do generatora kropel</td><td>Bio Rad</td><td>1863005</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelka generatora kropel</td><td>Bio Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowy termocykler T100</td><td>Bio Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>PX1 Zgrzewarka do płytek PCR</td><td>Bio Rad</td><td>1814000</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Czytnik kropel i oprogramowanie Quantasoft</td><td>Bio Rad</td><td>1864001 i 1864003</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Czytnik kropelek</td><td>Olej Bio Rad</td><td>1863004</td><td></td></tr><tr><td>Filtrowane końcówki do pipet bez nukleaz</td><td>Thermo Naukowy</td><td></td><td>10 ul, 20 ul, 200 ul i 1000 ul</td></tr></tbody></table>

droplet digital trap (ddtrap): adaptacja protokołu amplifikacji powtórzeń telomerów do kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Protokół wielokrotnej amplifikacji telomerów (TRAP) jest najczęściej używanym testem do wykrywania aktywności telomerazy w danej próbce. Metoda oparta na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) pozwala na rzetelne pomiary aktywności enzymatycznej z większości lizatów komórkowych. Żelowy TRAP z fluorescencyjnie znakowanymi starterami ogranicza przepustowość próbki, a zdolność do wykrywania różnic w próbkach jest ograniczona do dwukrotnych lub większych zmian aktywności enzymu. Cyfrowy kropelkowy TRAP, ddTRAP, jest bardzo czułym podejściem, które zostało zmodyfikowane w stosunku do tradycyjnego testu TRAP, umożliwiając użytkownikowi przeprowadzenie solidnej analizy na 96 próbkach na serię i uzyskanie bezwzględnej kwantyfikacji DNA (produktów przedłużenia telomerazy) wejściowych w każdym PCR. W związku z tym nowo opracowany test ddTRAP pokonuje ograniczenia tradycyjnego testu TRAP na bazie żelu i zapewnia bardziej wydajne, dokładne i ilościowe podejście do pomiaru aktywności telomerazy w warunkach laboratoryjnych i klinicznych.

Przy użyciu metody ddTRAP zmierzono aktywność telomerazy w panelu komórek składającym się z następujących linii komórkowych (Rycina 1): niedrobnokomórkowego raka płuca (H2882, H1299, Calu6, H920, A549 oraz H2887), drobnokomórkowego raka płuca (H82 i SHP77) oraz fibroblastów negatywnych pod kątem telomerazy (BJ). Osady miliona komórek poddano lizie w buforze NP-40, a reakcje wydłużania telomerazy przeprowadzono w trzech powtórzeniach biologicznych. Powszechnie...

Udało nam się przekształcić standardowy test protokołu wielokrotnej amplifikacji telomerów (TRAP) do zastosowania w kropelkowych reakcjach łańcuchowych polimerazy cyfrowej. Ten nowy test, nazwany ddTRAP, jest bardziej czuły i ilościowy, co pozwala na lepsze wykrywanie i analizę statystyczną aktywności telomerazy w różnych komórkach ludzkich.

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptacja protokołu amplifikacji powtórzeń telomerów do kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

Test ddTRAP umożliwia uzyskanie czułego, solidnego i wysoce ilościowego pomiaru aktywności enzymatycznej telomerazy w komórkach. Ogromną zaletą jest dla nas możliwość przeprowadzenia do 96 próbek na cykl w sposób średnioprzepustowy. Możemy uruchomić kontrole i replikacje w celu właściwej analizy statystycznej zebranych danych.Bezpośrednio przed lizą komórek rozmrozić zamrożoną porcję buforu do lizy NP-40. Po rozmrożeniu umieść bufor do lizy na lodzie. Dodaj inhibitor proteazy PMSF do buforu do lizy NP-40, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,2 milimola.Następnie dodaj 40 mikrolitrów buforu do lizy do probówki zawierającej osad komórkowy, aby osiągnąć równoważność komórek 25 000 komórek na mikrolitr. Delikatnie pipetować lizat w górę i w dół, aby rozbić komórki. Staraj się unikać robienia bąbelków.Pozwól komórkom lizować się na lodzie przez 30 minut. Delikatnie mieszaj lizat co 10 minut, aby zapobiec tworzeniu się skupisk resztek komórkowych. Podczas lizy komórek przygotuj mieszankę wzorcową w probówce mikrowirówkowej do reakcji wydłużania telomerazy i przechowuj na lodzie.Po lizie komórek odpipetować 48 mikrolitrów wzorca przedłużającego do każdej probówki PCR. Dodaj dwa mikrolitry rozcieńczonego lizatu do każdej probówki PCR, aby osiągnąć ostateczny odpowiednik komórek 50 komórek na mikrolitr i kontynuuj reakcję wydłużania telomerazy zgodnie z manuskryptem. Przygotuj mieszankę wzorcową w probówce mikrowirówkowej dla ddTRAP i utrzymuj ją w temperaturze pokojowej.Odpipetować 19,8 mikrolitrów wzorca ddPCR wymieszać z każdą probówką PCR. Dodaj 2,2 mikrolitra poprzedniego roztworu reakcyjnego przedłużającego do każdej probówki, pozostawiając całkowitą objętość 22 mikrolitrów. Aby skonfigurować wkład do wytwarzania kropel, najpierw załaduj 20 mikrolitrów przygotowanego roztworu do środkowej studzienki na próbkę we wkładzie .Delikatnie postukaj w bok wkładu, aby przesunąć wszelkie pęcherzyki na wierzch roztworu. Wszystkie studzienki wkładu muszą być załadowane próbką przed załadowaniem oleju. Następnie załaduj 70 mikrolitrów oleju wytwarzającego kropelki do lewej studzienki olejowej.Zabezpiecz uszczelkę na miejscu, przywiązując ją do końców wkładu, a następnie umieść załadowany i zmontowany wkład w generatorze kropel. Generator świeci ciągłym zielonym światłem, informując, że wkład jest prawidłowo umieszczony. Po 60 do 90 sekundach, gdy kontrolka generatora przestanie migać, cykl jest zakończony.Teraz wyjmij wkład. Delikatnie wyjmij uszczelkę z wkładu. Za pomocą pipety wielokanałowej odpipetuj około 40 mikrolitrów nowo wygenerowanych kropelek z prawej studzienki na 96-dołkową płytkę PCR.Zgrzej płytkę za pomocą folii aluminiowej Uszczelki płytkowe PCR po załadowaniu wszystkich próbek do płytki 96-dołkowej, aby zapobiec parowaniu. Następnie załaduj 96-dołkową płytkę do termocyklera, aby przeprowadzić reakcję PCR. Aby rozpocząć, załaduj 96-dołkową płytkę do czytnika kropelk.Ustawić płytkę w odpowiednim położeniu, tak aby próbka A1 była zgodna z próbką znajdującą się w uchwycie. Otwórz oprogramowanie powiązane z czytnikiem kropel. Kliknij dwukrotnie pierwszy dołek, A01, aby otworzyć ekran edytora studzienek próbki.Kliknij opcję Eksperyment i z menu rozwijanego wybierz typ testu, który ma zostać użyty. Wybierz QX200 ddPCR EvaGreen Supermix jako właściwą metodę wykrywania. Kliknij przycisk Zastosuj w prawym dolnym rogu ekranu edytora odwiertów, aby zapisać ustawienia zdefiniowane przez użytkownika we wszystkich podświetlonych studniach.Następnie kliknij Cel na ekranie edytora odwiertów i kliknij menu rozwijane Cel, aby wybrać kontrolkę nieznaną, referencyjną lub bez szablonu, aby zdefiniować typ próbki. W sekcji Nazwa próbki oznacz wszystkie próbki i kliknij przycisk Zastosuj. Kliknij przycisk Uruchom, aby odczytać tabliczkę.Wybierz opcję Kolumny lub Wiersze na ekranie Opcje uruchamiania, gdy pojawi się monit o informację o orientacji, w której powinna być wczytywana tabliczka. Określ liczbę akceptowanych kropel dla każdej próbki, klikając dwukrotnie poszczególne studzienki lub nagłówki kolumn i wierszy, aby wyświetlić tabelę informacji. W przypadku ddTRAP próbki zawierające 10 000 lub więcej akceptowanych kropel są ważne do dalszej analizy.Podświetl studzienki reprezentujące kontrpróby próbek i próbki NTC. Ręcznie ustaw próg dla próbek, klikając ikonę ustawiania progów w lewym dolnym rogu ekranu. W tym protokole aktywność telomerazy mierzono w panelu komórkowym składającym się z dziewięciu linii komórkowych raka płuc i fibroblastów telomerazy-ujemnych.Próg ustalono na poziomie około 2 000 amplitudy fluorescencji dla wszystkich trzech kontrprób biologicznych dla SHP77, H2887 i NTC. Dodatnie kropelki miały intensywność fluorescencji około 6 000 amplitudy fluorescencji, które tworzyły wyraźną populację na górze i oddzielały się od ujemnych kropel o amplitudzie około 1 100 fluorescencji. Całkowite produkty wydłużania telomerazy na komórkę równoważną między wszystkimi próbkami oszacowano na podstawie zmierzonego stężenia kwasów nukleinowych, które reprezentuje aktywność telomerazy w liniach raka płuc.Każde zanieczyszczenie RNazą podczas etapów reakcji lizy lub wydłużania zniszczy aktywność enzymatyczną telomerazy, ponieważ jest to kompleks rybonukleoproteinowy. ddTRAP można śledzić za pomocą ddPCR na poziomach ekspresji mRNA hTERT w komórce. Te dwa zestawy danych pozwalają nam skorelować ekspresję hTERT z aktywnością telomerazy i zagłębić się w potencjalne mechanizmy regulacyjne telomerazy, takie jak alternatywny splicing.Możemy badać manipulacje określonymi czynnikami splicingowymi i ich wpływ na aktywność telomerazy. Obecnie projektujemy modulatory splicingu oligonukleotydów jako potencjalne leki ukierunkowane na aktywność telomerazy.

droplet-digital-trap-ddtrap-adaptation-telomere-repeat-amplification

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W tym filmie prezentujemy krok po kroku procedurę generowania emulgowanych nanokropelek do wykrywania docelowych kwasów nukleinowych za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy lub dPCR.

Kropelkowa cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy: metoda generowania reakcji PCR nanokropelkowych w celu wykrywania rzadkich mutacji nowotworowych

Ten film pokazuje rolę cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej w identyfikacji mutacji indel w próbce DNA. Wysoka precyzja i czułość ddPCR umożliwiają dokładne i spójne wykrywanie rzadkich mutacji obecnych w próbce, nawet przy niskich poziomach. Może identyfikować i określać ilościowo mutacje indel w różnych regionach genomu, dostarczając cennych informacji na temat mechanizmów mutacji i funkcjonalnych konsekwencji tych mutacji.

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy kropelkowej do wykrywania mutacji indel w genach docelowych

W tym filmie demonstrujemy technikę duplex digital PCR (ddPCR) — modyfikację tradycyjnej techniki PCR, która jest przydatna do jednoczesnego wykrywania dwóch różnych markerów genetycznych. Pojedyncza reakcja PCR jest dzielona na zemulgowane kropelki o wielkości nanolitrów, które są niezależnie amplifikowane, a wykrywanie różnokolorowych sygnałów amplifikacji fluorescencji z frakcji kropel służy do obliczenia początkowego stężenia sekwencji docelowych.

Duplex Digital PCR do jednoczesnej kwantyfikacji podwójnych markerów genetycznych

Ta praca dostarcza metody wytwarzania platform mikroprzepływowych opartych na kropelkach oraz zastosowania mikrosfer poliakrylamidowych do amplifikacji mikrosferycznej PCR. Metoda microsphere-PCR umożliwia otrzymanie jednoniciowych amplikonów DNA bez rozdzielania dwuniciowego DNA.

Podejście mikroprzepływowe oparte na kropelkach i amplifikacja mikrosferyczno-PCR dla jednoniciowych amplikonów DNA

Tutaj prezentujemy protokół do dokładnego ilościowego oznaczania wielu zmian genetycznych regionu docelowego w jednej reakcji za pomocą drop-off ddPCR i unikalnej pary sond hydrolizy.

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy z pojedynczą kroplą do kompleksowego i jednoczesnego wykrywania mutacji w obszarach hotspotów

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania mutacji somatycznych nowotworu w krążącym DNA obecnym w płynach biologicznych pacjenta (biofluidach). Nasza metoda oparta na kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (dPCR) umożliwia ilościowe określenie częstości alleli mutacji nowotworowych (MAF), ułatwiając minimalnie inwazyjne uzupełnienie diagnozy i czasowego monitorowania odpowiedzi guza.

Wykrywanie i monitorowanie krążącego DNA związanego z nowotworem w płynach biologicznych pacjenta

Markery epigenetyczne są używane do podtypowania białych krwinek (WBC) poprzez kwantyfikację wzorców metylacji DNA. Protokół ten przedstawia metodę reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej (mdPCR) przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego na bazie elastomeru termoplastycznego (TPE) do generowania kropel, co pozwala na precyzyjną i specyficzną dla metylacji multipleksową docelową kwantyfikację różnic WBC.

Specyficzny dla metylacji multipleksowy PCR kropelkowy przy użyciu generatora kropel polimerowych do diagnostyki hematologicznej

Testy kropelek wody w oleju są przydatne do chemii analitycznej, ewolucji enzymów i analizy pojedynczych komórek, ale zazwyczaj wymagają mikrofluidyki do formowania kropel. W tym miejscu opisujemy emulgację z szablonami cząstek, bezprzepływowe podejście do wykonywania testów kropelkowych.

Emulgacja szablonowa cząstek umożliwia oznaczanie kropel bez mikroprzepływowości

Ta praca podsumowuje kroki nad opracowaniem różnych testów do wykrywania SARS-CoV-2 przy użyciu dwukolorowego systemu ddPCR. Kroki są skomplikowane i dołączono uwagi dotyczące tego, jak poprawić wyniki testów i eksperymentów. Testy te mogą być stosowane w wielu zastosowaniach SARS-CoV-2 RT-ddPCR.

Dwuetapowe cyfrowe protokoły PCR z kroplami odwrotnej transkrypcji do wykrywania i kwantyfikacji SARS-CoV-2

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i walidacji dobrych praktyk laboratoryjnych w zakresie zgodnego wykrywania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w ludzkich łzach za pomocą kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy w celu wsparcia klinicznego rozwoju wektorów terapii genowej.

Walidowalny cyfrowy test reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej do wykrywania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w badaniach bioliowania łez

Badanie to przedstawia solidną metodę izolacji mRNA aksonalnych za pomocą wkładek z błony porowatej, umożliwiając całkowite rozdzielenie neuronów od neurytów oraz oczyszczanie RNA. W połączeniu z RTddPCR podejście pozwala na absolutną ilościową ilościową ilościową transkrypcję o niskiej liczbie kopii, ułatwiając badania transportu mRNA i lokalnej translacji o wysokiej czułości, powtarzalności i szerokim zastosowaniu eksperymentalnym.

Izolacja i ilościowa ilościowość mRNA aksonalnych z użyciem wkładek z błony porowatej oraz RTddPCR

Poznaj metodę ddTRAP do pomiaru aktywności telomerazy w komórkach ludzkich z użyciem cyfrowej PCR w kroplach. Ta technika zapewnia wyższą czułość i lepszą analizę statystyczną w porównaniu do klasycznych metod.

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptacja protokołu amplifikacji powtórzeń telomerów do kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (Wideo) | JoVE Journal

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptacja protokołu amplifikacji powtórzeń telomerów do kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy

Przeglądaj więcej filmów