Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptacja protokołu amplifikacji powtórzeń telomerów do kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy

Test ddTRAP umożliwia uzyskanie czułego, solidnego i wysoce ilościowego pomiaru aktywności enzymatycznej telomerazy w komórkach. Ogromną zaletą jest dla nas możliwość przeprowadzenia do 96 próbek na cykl w sposób średnioprzepustowy. Możemy uruchomić kontrole i replikacje w celu właściwej analizy statystycznej zebranych danych.

Bezpośrednio przed lizą komórek rozmrozić zamrożoną porcję buforu do lizy NP-40. Po rozmrożeniu umieść bufor do lizy na lodzie. Dodaj inhibitor proteazy PMSF do buforu do lizy NP-40, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,2 milimola.

Następnie dodaj 40 mikrolitrów buforu do lizy do probówki zawierającej osad komórkowy, aby osiągnąć równoważność komórek 25 000 komórek na mikrolitr. Delikatnie pipetować lizat w górę i w dół, aby rozbić komórki. Staraj się unikać robienia bąbelków.

Pozwól komórkom lizować się na lodzie przez 30 minut. Delikatnie mieszaj lizat co 10 minut, aby zapobiec tworzeniu się skupisk resztek komórkowych. Podczas lizy komórek przygotuj mieszankę wzorcową w probówce mikrowirówkowej do reakcji wydłużania telomerazy i przechowuj na lodzie.

Po lizie komórek odpipetować 48 mikrolitrów wzorca przedłużającego do każdej probówki PCR. Dodaj dwa mikrolitry rozcieńczonego lizatu do każdej probówki PCR, aby osiągnąć ostateczny odpowiednik komórek 50 komórek na mikrolitr i kontynuuj reakcję wydłużania telomerazy zgodnie z manuskryptem. Przygotuj mieszankę wzorcową w probówce mikrowirówkowej dla ddTRAP i utrzymuj ją w temperaturze pokojowej.

Odpipetować 19,8 mikrolitrów wzorca ddPCR wymieszać z każdą probówką PCR. Dodaj 2,2 mikrolitra poprzedniego roztworu reakcyjnego przedłużającego do każdej probówki, pozostawiając całkowitą objętość 22 mikrolitrów. Aby skonfigurować wkład do wytwarzania kropel, najpierw załaduj 20 mikrolitrów przygotowanego roztworu do środkowej studzienki na próbkę we wkładzie .

Delikatnie postukaj w bok wkładu, aby przesunąć wszelkie pęcherzyki na wierzch roztworu. Wszystkie studzienki wkładu muszą być załadowane próbką przed załadowaniem oleju. Następnie załaduj 70 mikrolitrów oleju wytwarzającego kropelki do lewej studzienki olejowej.

Zabezpiecz uszczelkę na miejscu, przywiązując ją do końców wkładu, a następnie umieść załadowany i zmontowany wkład w generatorze kropel. Generator świeci ciągłym zielonym światłem, informując, że wkład jest prawidłowo umieszczony. Po 60 do 90 sekundach, gdy kontrolka generatora przestanie migać, cykl jest zakończony.

Teraz wyjmij wkład. Delikatnie wyjmij uszczelkę z wkładu. Za pomocą pipety wielokanałowej odpipetuj około 40 mikrolitrów nowo wygenerowanych kropelek z prawej studzienki na 96-dołkową płytkę PCR.

Zgrzej płytkę za pomocą folii aluminiowej Uszczelki płytkowe PCR po załadowaniu wszystkich próbek do płytki 96-dołkowej, aby zapobiec parowaniu. Następnie załaduj 96-dołkową płytkę do termocyklera, aby przeprowadzić reakcję PCR. Aby rozpocząć, załaduj 96-dołkową płytkę do czytnika kropelk.

Ustawić płytkę w odpowiednim położeniu, tak aby próbka A1 była zgodna z próbką znajdującą się w uchwycie. Otwórz oprogramowanie powiązane z czytnikiem kropel. Kliknij dwukrotnie pierwszy dołek, A01, aby otworzyć ekran edytora studzienek próbki.

Kliknij opcję Eksperyment i z menu rozwijanego wybierz typ testu, który ma zostać użyty. Wybierz QX200 ddPCR EvaGreen Supermix jako właściwą metodę wykrywania. Kliknij przycisk Zastosuj w prawym dolnym rogu ekranu edytora odwiertów, aby zapisać ustawienia zdefiniowane przez użytkownika we wszystkich podświetlonych studniach.

Następnie kliknij Cel na ekranie edytora odwiertów i kliknij menu rozwijane Cel, aby wybrać kontrolkę nieznaną, referencyjną lub bez szablonu, aby zdefiniować typ próbki. W sekcji Nazwa próbki oznacz wszystkie próbki i kliknij przycisk Zastosuj. Kliknij przycisk Uruchom, aby odczytać tabliczkę.

Wybierz opcję Kolumny lub Wiersze na ekranie Opcje uruchamiania, gdy pojawi się monit o informację o orientacji, w której powinna być wczytywana tabliczka. Określ liczbę akceptowanych kropel dla każdej próbki, klikając dwukrotnie poszczególne studzienki lub nagłówki kolumn i wierszy, aby wyświetlić tabelę informacji. W przypadku ddTRAP próbki zawierające 10 000 lub więcej akceptowanych kropel są ważne do dalszej analizy.

Podświetl studzienki reprezentujące kontrpróby próbek i próbki NTC. Ręcznie ustaw próg dla próbek, klikając ikonę ustawiania progów w lewym dolnym rogu ekranu. W tym protokole aktywność telomerazy mierzono w panelu komórkowym składającym się z dziewięciu linii komórkowych raka płuc i fibroblastów telomerazy-ujemnych.

Próg ustalono na poziomie około 2 000 amplitudy fluorescencji dla wszystkich trzech kontrprób biologicznych dla SHP77, H2887 i NTC. Dodatnie kropelki miały intensywność fluorescencji około 6 000 amplitudy fluorescencji, które tworzyły wyraźną populację na górze i oddzielały się od ujemnych kropel o amplitudzie około 1 100 fluorescencji. Całkowite produkty wydłużania telomerazy na komórkę równoważną między wszystkimi próbkami oszacowano na podstawie zmierzonego stężenia kwasów nukleinowych, które reprezentuje aktywność telomerazy w liniach raka płuc.

Każde zanieczyszczenie RNazą podczas etapów reakcji lizy lub wydłużania zniszczy aktywność enzymatyczną telomerazy, ponieważ jest to kompleks rybonukleoproteinowy. ddTRAP można śledzić za pomocą ddPCR na poziomach ekspresji mRNA hTERT w komórce. Te dwa zestawy danych pozwalają nam skorelować ekspresję hTERT z aktywnością telomerazy i zagłębić się w potencjalne mechanizmy regulacyjne telomerazy, takie jak alternatywny splicing.

Możemy badać manipulacje określonymi czynnikami splicingowymi i ich wpływ na aktywność telomerazy. Obecnie projektujemy modulatory splicingu oligonukleotydów jako potencjalne leki ukierunkowane na aktywność telomerazy.