Dyfrakcja rentgenowska nienaruszonych mięśni szkieletowych myszy jako narzędzie do badania strukturalnych podstaw choroby mięśni
18 lipca 2019
Przedstawiamy szczegółowe protokoły przeprowadzania eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej pod małym kątem przy użyciu nienaruszonych mięśni szkieletowych myszy. Dzięki szerokiej dostępności transgenicznych modeli myszy w chorobach ludzkich, ta eksperymentalna platforma może stanowić użyteczne stanowisko testowe do wyjaśnienia strukturalnych podstaw genetycznych chorób mięśni
Fizjologicznie nienaruszone mięśnie szkieletowe myszy mogą wytwarzać wysokiej jakości wzory dyfrakcji rentgenowskiej zawierające wiele informacji strukturalnych, które mogą zapewnić wgląd w procesy fizjologiczne. Dyfrakcja promieniowania rentgenowskiego jest jedyną techniką, która pozwala na pozyskiwanie informacji strukturalnych o wysokiej rozdzielczości z żywej tkanki mięśniowej w rzeczywistych warunkach fizjologicznych w rzeczywistym czasie fizjologicznym. Wiele chorób mięśni jest dziedzicznych.
Dzięki zwiększonej dostępności do genetycznej modyfikacji większości modeli miopatii, dyfrakcja promieniowania rentgenowskiego może dostarczyć informacji strukturalnych na temat mechanizmów chorobowych i wskazać strategie terapeutyczne. Większość mięśni prostowników palców długich i płaszczkowatych jest szczególnie wygodna do tego celu. Ale wiele innych mięśni u małych zwierząt można rozciąć w stanie nienaruszonym i obchodzić się z nimi w podobny sposób.
Przed rozpoczęciem procedury należy włączyć połączony przetwornik siły silnika, sterownik przetwornika siły silnika z dwufazowym stymulatorem prądu o dużej mocy oraz komputerowy system sterowania akwizycją danych sterujących. Następnie spryskaj skórę tylnej kończyny myszy zimnym roztworem Ringera i użyj cienkich nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć skórę wokół uda. Za pomocą kleszczy numer pięć szybko pociągnij skórę w dół, aby odsłonić mięśnie i amputować tylną kończynę.
Umieść kończynę w pokrytym elastomerem naczyniu preparacyjnym zawierającym natleniony roztwór Ringera i umieść naczynie pod lornetkowym mikroskopem preparacyjnym. Aby zebrać mięsień płaszczkowaty, przypnij tylną kończynę tak, aby mięsień brzuchaty łydki był skierowany do góry. Użyj cienkich nożyczek, aby przeciąć dystalne ścięgno grupy mięśni brzuchatego łydki/płaszczkowatego.
Odetnij powięź po obu stronach mięśnia brzuchatego łydki, aby umożliwić delikatne i powolne unoszenie mięśni od kości. Następnie uwolnij ścięgno bliższe mięśnia płaszczkowatego. Przypnij grupę mięśni zawierającą mięsień brzuchaty łydki i dystalne ścięgno w naczyniu.
Delikatnie unieś mięsień płaszczkowaty przez ścięgno proksymalne, aby oddzielić go od mięśnia brzuchatego łydki, pozostawiając jak największą część dystalnego ścięgna płaszczkowatego nienaruszoną. Aby zebrać mięsień prostownik długi palca lub EDL, przypnij tylną kończynę do naczynia z mięśniem piszczelowym przednim skierowanym do góry i przetnij powięź wzdłuż mięśnia piszczelowego przedniego. Użyj kleszczy, aby wyciągnąć powięź i przeciąć dystalne ścięgno mięśnia piszczelowego przedniego.
Podnieś mięsień piszczelowy przedni i wytnij go ostrożnie, nie ciągnąc za mięsień EDL, a następnie rozetnij boczną stronę kolana, aby odsłonić dwa ścięgna. Przetnij ścięgno proksymalne, pozostawiając nam jak największą część ścięgna nadal przyczepionego do mięśnia i delikatnie pociągnij za ścięgno, aby unieść mięsień EDL. Następnie przetnij dystalne ścięgno, gdy zostanie odsłonięte.
Aby zamontować pobrany mięsień, przypnij mięsień za pomocą ścięgien i przytnij jak najwięcej dodatkowego tłuszczu, powięzi i ścięgien. Włóż jedno ścięgno do wstępnie zawiązanego węzła i użyj kleszczy do wiązania szwów, aby mocno zawiązać szew. Zawiąż drugi węzeł wokół metalowego haczyka i powtórz procedurę na drugim końcu ścięgna.
Następnie przymocuj krótki hak do dna komory doświadczalnej, a długi hak do silnika przetwornika siły w dwóch trybach. Pęcherzyk roztworu w komorze doświadczalnej ze 100% tlenem. Aby zoptymalizować protokół stymulacji i długość mięśni, wyreguluj mikromanipulatory przymocowane do silnika przetwornika, aby wygenerować napięcie wyjściowe w zakresie od 15 do 20 miliniutonów, aby znaleźć najlepsze parametry bodźca do rozciągnięcia mięśnia.
Ustaw napięcie stymulacji na 40 woltów. Prąd stymulacji będzie systematycznie zwiększany, aż do momentu, gdy nie nastąpi dodatkowy wzrost siły drgania. Aby znaleźć optymalną długość, zwiększ długość mięśnia i aktywuj mięsień jednym skurczem, aż aktywna siła przestanie rosnąć.
Wykonaj jednosekundowy skurcz tężcowy, aby przetestować mocowanie i w razie potrzeby rozciągnąć mięsień z powrotem do optymalnej siły wyjściowej. Następnie zapisz długość mięśni w milimetrach za pomocą suwmiarki cyfrowej. Aby określić położenie wiązki, użyj kawałka papieru wrażliwego na promieniowanie rentgenowskie, który wytwarza ciemną plamę w odpowiedzi na promieniowanie rentgenowskie, oraz generatora krzyża nitkowego, aby utworzyć krzyż nitkowy wyrównany ze śladem przypalenia na papierze.
Korzystając z graficznego interfejsu użytkownika dostarczonego przez BioCAT do pozycjonera próbki, wyśrodkuj mięsień na pozycji wiązki i przesuń stolik próbki, aby oscylować w komorze próbki z prędkością od 10 do 20 milimetrów na sekundę, aby rozprowadzić dawkę promieniowania rentgenowskiego po całym mięśniu podczas ekspozycji. Obserwuj próbkę podczas jej ruchu, aby uniknąć dużych obszarów powięzi, które zawierają kolagen i upewnić się, że pozostaje oświetlona podczas całej drogi podróży. Uzbrój detektor i poczekaj na wyzwolenie z systemu akwizycji danych.
Następnie uruchom jednocześnie dane mechaniczne i rentgenowskie, aby je zsynchronizować. Wzorce promieniowania rentgenowskiego będą zbierane w sposób ciągły przez cały czas trwania protokołu z 10-milisekundowym czasem ekspozycji i 50-milisekundowym okresem ekspozycji. W tym reprezentatywnym izometrycznym skurczu tężcowym mięsień EDL był utrzymywany w spoczynku przez 0,5 sekundy, zanim został aktywowany na jedną sekundę, po czym nastąpiło 1,5-sekundowe rozluźnienie.
Wzór dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego mięśni może dostarczyć informacji strukturalnych o rozdzielczości nanometrowej ze struktur wewnątrz sarkomeru. Linie warstwowe na bazie miozyny zawierające grube włókna są mocne i ostre we wzorach z mięśni spoczynkowych, podczas gdy linie warstw na bazie aktyny zawierające cienkie włókna są bardziej widoczne we wzorcach z kurczących się mięśni. Wzorce różnicowe uzyskane przez odjęcie wzorca spoczynkowego od wzorca kurczenia się mogą rzucić światło na zmiany strukturalne podczas rozwoju siły w zdrowych i chorych mięśniach.
Śledząc te zmiany strukturalne w milisekundowej skali czasowej zdarzeń molekularnych podczas skurczu i rozluźnienia mięśni, wzory dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego mogą ujawnić istotne informacje strukturalne. W tej reprezentatywnej analizie odbić równikowych przy użyciu procedury Equator w pakiecie MuscleX o otwartym kodzie źródłowym, stosunek intensywności równikowej wskazuje na bliskość miozyny do aktyny w mięśniach spoczynkowych i jest ściśle skorelowany z liczbą przyczepionych mostków krzyżowych w kurczących się mysich mięśniach szkieletowych. Odległość między dwoma odbiciami 1,0 jest odwrotnie proporcjonalna do odstępów między włóknami.
Czysta sekcja jest kluczem do udanego eksperymentu rentgenowskiego z nienaruszonymi mięśniami, więc staraj się unikać jakichkolwiek uszkodzeń mechanicznych podczas przygotowania mięśni. Każdy standardowy protokół fizjologiczny z całymi mięśniami może być zaimplementowany w tych eksperymentach i może być wykorzystany do badania aktywacji mięśni, rozluźnienia i zachowania mostka krzyżowego podczas szybkiego mechanicznego przemijania. Manipulacje genetyczne myszy stają się coraz bardziej wyrafinowane.
Nowe transgeniczne modele myszy pozwolą na zaprojektowanie bardziej szczegółowych i wnikliwych eksperymentów, które wskażą nowe kierunki terapeutyczne dla ludzkich miopatii.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokoły przeprowadzania eksperymentów małokątowego rozproszenia promieniowania rentgenowskiego (SAXS) na nienaruszonych mięśniach szkieletowych myszy. Metoda ta pozwala na poznanie strukturalnych podstaw genetycznych chorób mięśni, wykorzystując dostępność transgenicznych modeli mysich.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biofizyka
- Fizjologia mięśni
Wstęp
- Dyfrakcja rentgenowska dostarcza wysokorozdzielczych informacji strukturalnych z żywej tkanki mięśniowej.
- Zrozumienie chorób mięśni może zostać usprawnione dzięki wiedzy uzyskanej w drodze analizy strukturalnej.
- Modele myszy transgenicznych są coraz bardziej dostępne do badania miopatii.
- Konkretne mięśnie, takie jak mięsień prostownik długi palców oraz mięsień płaszczkowaty, są odpowiednie do tych eksperymentów.
Cel badania
- Wyjaśnienie zmian strukturalnych w mięśniach podczas skurczu i rozkurczu.
- Zapewnienie platformy do badania mechanizmów dziedzicznych chorób mięśni.
- Wskazanie potencjalnych strategii terapeutycznych w oparciu o analizę strukturalną.
Zastosowane metody
- Pobieranie nienaruszonych mięśni szkieletowych od myszy.
- Przygotowanie eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej w warunkach fizjologicznych.
- Wykorzystanie dwtrybowego przetwornika siły do stymulacji mięśni.
- Zbieranie obrazów dyfrakcyjnych w celu analizy zmian strukturalnych w skali nanometrów.
Główne wyniki
- Dyfrakcjogramy rentgenowskie ujawniają informacje strukturalne o sarkomerach.
- Różnice w dyfrakcjogramach między mięśniami w spoczynku a mięśniami kurczącymi się dostarczają wiedzy na temat generowania siły.
- Zmiany strukturalne mogą być śledzone w skali milisekund podczas aktywności mięśniowej.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia funkcji mięśni oraz mechanizmów chorobowych.
Wnioski
- Badanie wykazuje użyteczność dyfrakcji rentgenowskiej w badaniach nad mięśniami.
- Uzyskane informacje mogą pomóc w opracowaniu podejść terapeutycznych w chorobach mięśni.
- Metoda ta pogłębia nasze zrozumienie fizjologii i patologii mięśni.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dyfrakcja rentgenowska nienaruszonego mięśnia szkieletowego myszy umożliwia analizę strukturalną w skali nanometrów w warunkach fizjologicznych, zapewniając bezpośredni związek między genotypem a fenotypem funkcjonalnym w modelach chorób mięśni. Podejście to wspiera walidację celów poprzez ujawnianie zmian strukturalnych sarkomerów podczas generowania siły, co pozwala na mechanistyczną redukcję ryzyka w strategiach terapeutycznych w miopatiach dziedzicznych. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych poprzez kwantyfikację odstępów międzyfilamentowych oraz dynamiki mostków poprzecznych w skalach czasowych rzędu milisekund.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez powiązanie modyfikacji genetycznych ze zmianami strukturalnymi sarkomerów w nienaruszonym mięśniu.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez analizę w czasie rzeczywistym odczytów strukturalnych oddziaływań miozyna-aktyna podczas skurczu.
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną poprzez kwantyfikację korelacji strukturalnych wiązania mostków poprzecznych i odstępów międzyfilamentowych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analizy poprzez zachowanie natywnej architektury i fizjologii mięśni.
- Wartość operacyjna: Rozwiązuje kwestie standaryzacji i powtarzalności testów dzięki kontrolowanym protokołom stymulacji oraz zsynchronizowanej kolekcji danych rentgenowskich.
- Wartość naukowa: Podkreśla gotowość do badań przesiewowych poprzez ilościowe wyniki strukturalne, takie jak stosunki intensywności równikowej oraz analizy linii warstwowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Omawia istotność choroby, łącząc zmiany strukturalne w modelach transgenicznych z mechanizmami ludzkiej miopatii.
- Wartość operacyjna: Opisuje ciągłość procesu od odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez umożliwienie podłużnego monitorowania strukturalnego.
- Wartość naukowa: Odnosi się do decyzji o postępie skorygowanych o ryzyko poprzez identyfikację strukturalnych biomarkerów progresji choroby.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje kontinuum odkryć – od walidacji celu po walidację przedkliniczną – zapewniając strukturalne fenotypowanie funkcji mięśni w warunkach fizjologicznych.
- Biologia odkrywcza: Wyjaśnia, w jaki sposób metoda ta wspomaga testowanie hipotez, wyjaśnianie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez analizę strukturalną dynamiki sarkomerów.
- Przesiewanie: Opisuje gotowość testu, powtarzalność i wyniki ilościowe uzyskiwane dzięki zsynchronizowanej akwizycji danych mechanicznych i rentgenowskich.
- Analityka: Wskazuje pomiary, odczyty lub wyniki statystyczne pomagające zespołom w porównywaniu warunków, w tym stosunki intensywności równikowej oraz odstępy refleksów.
- Badania translacyjne: Łączy metodę z ciągłością przedkliniczną lub dopasowaniem biomarkerów poprzez śledzenie zmian strukturalnych w modelach chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia metodę jako wielokrotnie wykorzystywalną kompetencję, a nie technikę jednorazową, dzięki standaryzowanym protokołom montowania i stymulacji.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna, walidacja celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje go/no-go, efektywność kapitałowa i zredukowane ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja i decyzje o rozwoju skorygowane o ryzyko.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana wiedza specjalistyczna z zakresu fizjologii mięśni, dyfrakcji rentgenowskiej oraz obsługi modeli transgenicznych.
- Potrzeby w zakresie instrumentacji i infrastruktury analitycznej, w tym linii wiązek synchrotronowych, dwukierunkowych przetworników siły oraz zsynchronizowanych systemów akwizycji danych.
- Wymagania dotyczące standaryzacji międzyzespołowej w zakresie protokołów sekcji, montażu i stymulacji mięśni w różnych laboratoriach.
- Kwestie adaptacji w różnych systemach modelowych, w szczególności dla różnych mięśni mysich i modeli chorobowych.
- Praktyczne ograniczenia opisane w materiale źródłowym, w tym konieczność precyzyjnej sekcji w celu uniknięcia zanieczyszczenia powięzią i zachowania integralności próbki podczas ekspozycji.
