Precyzyjny system dostarczania i odzyskiwania patogenów dla mysich modeli wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc

Ogólnym celem tej procedury jest wzmocnienie badań nad wtórnym bakteryjnym zapaleniem płuc poprzez zapewnienie prostej i nieinwazyjnej drogi inokulacji bakteryjnej do dolnych dróg oddechowych, a następnie odzyskania bakteryjnego i oczyszczenia RNA do analizy transkryptu. Zostanie to osiągnięte poprzez najpierw głębokie znieczulenie myszy i włożenie wstępnie załadowanej, wygiętej igły z końcówką do tchawicy myszy, która została pionowo zawieszona na siekaczach szczęki. Po drugie, po udanej infekcji, jednostki tworzące kolonie bakteryjne są odzyskiwane przez wycięcie i homogenizację płuc.

Otrzymany homogenat płuc jest seryjnie rozcieńczany i rozsiewany na agarze odżywczym w celu wyliczenia jednostek tworzących kolonie. Na koniec RNA jest oczyszczane z homogenatu płuc. Zaletą tego zabiegu jest to, że umożliwia on kontrolowany poród bezpośrednio do dolnych dróg oddechowych.

To pozwala nam przyjrzeć się zarówno kombinatorycznemu, jak i indywidualnemu wkładowi patogenu w wynik choroby. Ostatnie postępy w tej dziedzinie wykazały, że bakteryjna regulacja genów może odgrywać dużą rolę w określaniu wyników infekcji. Technika ta korzysta ze zdolności do odzyskiwania zarówno bakteryjnych CFU, jak i RNA.

Po wyizolowaniu RNA możemy ocenić udział określonych genów wirulencji w zakażeniu. Ponadto technika ta ma zaletę tego, że nie jest chirurgiczna. Pozwala to na zminimalizowanie stresu u zwierząt wykorzystywanych w tej procedurze i umożliwia im natychmiastową rekonwalescencję.

Procedura ta korzysta z użycia zwykłego sprzętu laboratoryjnego bez użycia wszelkiego rodzaju kaniul, przewodów doprowadzających lub światłowodowych. Osoby, które są nowicjuszami w tej technice, mogą na początku mieć problemy z faktyczną instalacją przez tchawicę. Po skonceptualizowaniu tej techniki staje się ona prostą i skuteczną procedurą badania wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc u mysiego gospodarza.

Przed rozpoczęciem zabiegu przygotuj miejsce pracy z następującymi materiałami: platformą do intubacji, sterylną strzykawką o pojemności jednego ml, sterylnymi kleszczami z końcówką, sterylną igłą z końcówką w rozmiarze 21 oraz dwiema stożkowymi rurkami do przechowywania strzykawki i kleszczy. Procedurę należy rozpocząć od przygotowania inokulów patogenu tak, aby uzyskać pożądane stężenie końcowe w objętości 50 mikrolitrów. Następnie, używając sterylnych rękawiczek, przygotuj igłę o końcówce o średnicy od jednego do 1,5 cala i rozmiarze 21, zginając ją pod kątem około 35 stopni.

Po przymocowaniu igły do strzykawki narysuj poduszkę powietrzną o pojemności 100 mikrolitrów, a następnie 50 mikrolitrów czynnika zakaźnego. Poduszka powietrzna o pojemności 100 mikrolitrów zapewnia pełne dostarczenie ładunku patogenu po wciśnięciu strzykawki. Umieścić załadowaną igłę i strzykawkę w miejscu łatwo dostępnym dla ręki dominującej.

Wyjmij i znieczul mysz z komory anestezjologicznej i zawieś mysz na platformie intubacyjnej z siekaczy szczęki. Za pomocą kleszczy z końcówką delikatnie chwyć i rozciągnij język. Przenieś język z kleszczy na kciuk i palec wskazujący ręki niedominującej.

Trzymać język w ręce niedominującej i podnieść fabrycznie załadowaną strzykawkę. Skieruj zgięty koniec igły od ciała. Wbić igłę do jamy ustnej.

U nasady języka delikatnie odchyl nadgarstek, aby spowodować lekkie odsunięcie igły od ciała. Takie działanie zapewnia, że igła zostanie wprowadzona do tchawicy, a nie do przełyku. Powoli wprowadzić igłę w dół do tchawicy.

Często wyczuwalne jest lekkie tykanie, gdy igła przechodzi przez fałd głosowy. Przełóż igłę przez tchawicę, aż poczujesz lekki opór, gdy igła napotka carinę. Lekko unieść igłę w górę, aby zawiesić igłę nad cariną.

Umożliwia to dostarczanie do oskrzeli pierwotnych. Całkowicie wcisnąć tłok strzykawki, aby dostarczyć ładunek zakaźny. Wyjąć igłę z tchawicy i wyrzucić.

Zdejmij mysz z platformy intubacyjnej, naciskając gumową opaskę, ale trzymaj mysz w pozycji pionowej. Zatkaj nosowe drogi oddechowe, kładąc palec bezpośrednio na nozdrzach. Utrzymaj tę pozycję przez około minutę lub do momentu, gdy zaobserwujesz kilka głębokich oddechów.

Ten ostatni krok zapewnia, że całkowita objętość inokulum zostanie dostarczona do dolnych dróg oddechowych. Umieść zwierzę z powrotem w klatce i upewnij się, że nastąpiło szybkie wyzdrowienie ze znieczulenia. W wybranych punktach czasowych po zakażeniu zakażone płuca mogą zostać wycięte w celu ilościowego określenia i oceny udziału bakterii w zwiększonej zachorowalności związanej z wtórnym bakteryjnym zapaleniem płuc.

Przygotuj miejsce do pracy z następującymi elementami: wagą i sterylną łodzią wagową, platformą preparacyjną, zestawem preparacyjnym zawierającym nożyczki i kleszcze oraz sterylną gazą. Na potrzeby tej demonstracji wycięcie płuc zostanie przeprowadzone na blacie stołu. Jednakże, aby zachować sterylność podczas tej procedury, zaleca się, aby wycięcie płuc było wykonane w kapturze z przepływem laminarnym.

Poddaj zakażoną mysz eutanazji CO2 lub podobnej metodzie eutanazji zatwierdzonej przez IACUC. Umieść i zabezpiecz zainfekowaną mysz na platformie sekcyjnej. Spryskaj mysz etanolem, aby utrzymać sterylność na powierzchniach roboczych.

Zaczynając od pępka, użyj kleszczy, aby podnieść skórę i wykonać nacięcie w kierunku krtani. Chwytając skórę po obu stronach początkowego nacięcia, odciągnij skórę od ciała i przetnij połączenia tkankowe. Pomocne może być wykonanie bocznych nacięć w poprzek skóry, aby odsłonić większą część klatki piersiowej.

Zaczynając od podstawy wyrostka mieczykowatego, wykonaj małe nacięcie z zamiarem przebicia przepony. Powoduje to wzrost ciśnienia w klatce piersiowej, powodując cofanie się płuc. Po cofnięciu płuc kontynuuj nacięcie, aby uwolnić przeponę.

Usuń żebra, wykonując nacięcie po obu stronach. Spowoduje to odsłonięcie klatki piersiowej i płuc. Aby wyciąć płuca, chwyć kleszczem podstawę serca i unieś do góry.

Umieść nożyczki za płucami i zacznij wykonywać małe nacięcia w połączeniach tkankowych, kontynuując unoszenie serca do góry. Po wycięciu płuc umieść je na sterylnej gazie i usuń serce, odrywając je od płuc i przecinając pozostałe połączenia tkankowe. Przenieść płuca do wstępnie obtarowanej łodzi wagowej i zapisać masę.

Po zważeniu płuc przenieś płuca do sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i tymczasowo przechowuj je na lodzie. Teraz, gdy płuca zostały wycięte i zważone, bakterie można odzyskać, aby określić ich rolę w patogenezie. W ramach przygotowań do regeneracji bakterii potrzebne będą następujące materiały: młynek do tkanek, sterylny PBS wolny od RNaz, bufor RLT uzupełniony beta-merkaptoetanolem oraz 1,5 ml probówek wirówkowych bez RNaz.

Zacznij od dodania jednego ml sterylnego PBS wolnego od RNaz do młynka do tkanek. Po napełnieniu przechowuj młynek do tkanek na lodzie. Następnie przygotuj serię sterylnych probówek do seryjnego rozcieńczania bez RNaz, aby określić ilościowo ładunek bakteryjny odzyskany z zakażonych płuc.

Przenieś płuca do przygotowanego młynka do tkanek i dokładnie zhomogenizuj tkankę, naciskając na cokół podczas obracania. Otworzyć młynek do tkanek i wlać 100 mikrolitrów homogenizowanej próbki do pierwszej z przygotowanych seryjnie probówek do rozcieńczania. Seryjnie rozcieńczyć próbki i płytkę na agarze odżywczym, aby wyliczyć jednostki tworzące kolonie.

CFU mogą być rejestrowane jako CFU na ml lub CFU na ml, na miligram tkanki płucnej. Po usunięciu podwielokrotności o pojemności 100 mikrolitrów należy wymienić cokół mielący i odwirować próbkę z prędkością 4 000 obr./min przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zakończeniu wirowania usunąć supernatant z granulowanej próbki.

Supernatant można zapisać i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszej analizy w późniejszym terminie. Ponownie zawiesić homogenizowany osad tkankowy w 700 mikrolitrach beta-merkaptoetanolu RLT i przenieść próbkę do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml wolnej od RNaz. W tym momencie próbka może być przechowywana w temperaturze minus 80 stopni.

RNA można oczyścić z zawiesiny homogenatu płuc RLT, ładując próbkę do probówki mikrowirówkowej o pojemności dwóch ml zawierającej 1 milimetr kulek krzemionki i przetwarzając za pomocą ubijaka do kulek przez 20 sekund z prędkością sześciu metrów na sekundę. RNA jest następnie natychmiast oczyszczane przy użyciu adaptacji metody RNeasy, jak opisano w Voyich i wsp. Methods in Molecular Biology" 2008 i opisane w rękopisie dołączonym do tego filmu.

Po oczyszczeniu wydajność RNA można określić ilościowo za pomocą spektrofotometru. Po ilościowym określeniu korzystne jest rozcieńczenie powstałego RNA do kilku porcji po 50 nanogramów na mikrolitr. Dzięki temu RNA z próbki może być wykorzystane do wielu analiz bez poddawania go wielu cyklom zamrażania i rozmrażania.

Zastosowanie tej techniki umożliwia zainstalowanie kontrolowanego ładunku patogenu bezpośrednio w dolnych drogach oddechowych. Skuteczność tego systemu dostarczania można wykazać poprzez instalację 1% roztworu Coomassie w kolorze brylantowo-niebieskim. W górnym rzędzie znajduje się para niezainfekowanych płuc, które mają służyć jako kontrola, podczas gdy w dolnym rzędzie znajduje się para płuc, które otrzymały 50 mikrolitrów 1% jaskrawoniebieskiego barwnika Coomassie przez instalację dotchawiczą.

Zastosowanie tego barwnika pokazuje, w jaki sposób instalacja dotchawicza zapewnia równomierne rozprowadzenie ładunku patogenu do i przez lewe i prawe płuco. Po zakażeniu ładunek patogenu może zostać odzyskany i przeanalizowany w różnych punktach czasowych po instalacji dotchawiczej poprzez wycięcie i homogenizację tkanki płucnej. Aby zademonstrować skuteczność tej techniki odzyskiwania, dwie grupy zawierające po trzy myszy każda zostały zakażone niską i wysoką dawką Staphylococcus aureus.

Wkład bakteryjny został posiany na agarze odżywczym w celu wyliczenia CFU. Godzinę po instalacji dotchawiczej myszy poddano eutanazji, płuca wycięto i zhomogenizowano w maszynce do mielenia tkanek. Homogenizowaną tkankę seryjnie rozcieńczano i posiewano na agarze odżywczym w celu wyliczenia CFU.

RNA wyizolowane z homogenizowanej tkanki płucnej można zbadać metodą PCR z odwrotną transkryptazą i wykorzystać do ilościowego określenia względnej obfitości transkryptów docelowych genów. Aby zapewnić minimalne zanieczyszczenie DNA w tle, zaleca się, aby reakcja PCR, bez dodatku odwrotnej transkryptazy, była przeprowadzana równolegle z jakimikolwiek reakcjami qRT-PCR. Oprócz wiremii bakteryjnych technikę tę można rozszerzyć na instalację i izolację wiremii.

Po homogenizacji tkanki płucnej wirusowe RNA można wyizolować i wykorzystać do pomiaru obfitości transkryptów genów wirusa lub skonstruowania standardowej krzywej do kwantyfikacji wirusa. Zastosowanie tego systemu zapewnia wysoce wydajny i powtarzalny system do badania wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc. Po opanowaniu procedura ta może być stosowana w eksperymentach na dużą skalę.

Pracując partiami w celu eutanazji myszy, instalacja dotchawicza może nastąpić w ciągu 30 sekund na mysz. Po zakończeniu tego, przechodząc do wycięcia płuc, można to zrobić w około dwie do trzech minut na mysz. Chociaż omawiane tutaj metody dotyczyły wtórnej infekcji bakteryjnej, można je rozszerzyć na każdą procedurę, w której konieczne jest kontrolowane dostarczenie i odzyskanie inokulum.

Oprócz opisanych tutaj metod, procedura ta może być uzupełniona o dodanie płukania oskrzelowo-pęcherzykowego przed wycięciem płuc. Chociaż często powoduje to zmniejszenie odzysku ładunku patogenu, korzystne jest uzyskanie danych, takich jak analiza cytokin, aktywność dehydrogenazy mleczanowej i identyfikacja różnych populacji komórkowych. Aby uzyskać pełniejsze zrozumienie patogenezy choroby, ważne staje się zbadanie zarówno udziału gospodarza, jak i patogenu w chorobie.

Celem tego filmu było przedstawienie prostej i skutecznej metody badania wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc u mysiego gospodarza.