Name: Precyzyjny system dostarczania i odzyskiwania patogenów dla mysich modeli wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 s
Description: Poznaj nieinwazyjną metodę inokulacji bakteryjnej w modelu mysim wtórnego zapalenia płuc. Technika umożliwia kontrolowane dostarczanie patogenów do dolnych dróg oddechowych oraz odzyskiwanie jednostek tworzących kolonie i RNA do analizy transkryptowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Nicole Meissner, M.D./Ph.D., Montana State University, za pomoc w ustaleniu metody wkraplania dotchawiczego. Prace te były wspierane przez amerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia (granty NIH-1R56AI135039-01A1, GM110732, R21AI128295, U54GM115371), a także fundusze z Montana University System Research Initiative (51040-MUSRI2015-03) i Montana State University Agriculture Experiment Station.

Wszystkie metody są zgodne z wytycznymi National Institutes of Health i zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na Uniwersytecie Stanowym Montana.
1. Wkraplanie dotchawicze
<ol>
	<li>Przygotuj miejsce do pracy zawierające następujące materiały: platformę do intubacji, sterylną strzykawkę o pojemności 1 ml, sterylne kleszcze z końcówką, sterylną igłę z końcówką w rozmiarze 21 oraz dwie stożkowe rurki do przechowywania strzykawki i kleszczyków. 
	UWAGA: Platformy do intubacji można zakupić komercyjnie lub zbudować we własnym zakresie. Zastosowana tu platforma do intubacji została wykonana z pleksi o średnicy 0,25 cala. Krótko mówiąc, pleksi została podgrzana, a płyta jest wygięta do wnętrza pod kątem około 65°. Po zewnętrznej stronie platformy intubacyjnej dwie maszynowe zostały wciśnięte w odległości 3 cali od siebie, a między nimi zawieszono gumową taśmę.</li>
	<li>Przygotować inokulum patogenu poprzez seryjne rozcieńczanie próbki, tak aby uzyskać pożądane stężenie końcowe w całkowitej objętości 50 μl. Przechowywać inokulum na lodzie.</li>
	<li>Zakładając sterylne rękawice, zegnij igłę o stępionej końcówce 21 G na około 35°. 
	UWAGA: Do każdej myszy potrzebna jest osobna igła.</li>
	<li>Przymocować wygiętą igłę o końcówce 21 G do strzykawki o pojemności 1 ml. Pobrać 100 μl poduszki powietrznej do strzykawki, a następnie 50 μl czynnika zakaźnego. Umieścić załadowaną igłę i strzykawkę w miejscu łatwo dostępnym dla ręki dominującej.</li>
	<li>Głęboko znieczulij mysz za pomocą 4% mieszaniny izofluranu i tlenu lub podobnej metody znieczulenia zatwierdzonej przez IACUC. Prawidłowa głębokość znieczulenia jest zwykle uzyskiwana, gdy częstość oddechów zwalnia do około 1 wdechu na 5-8 s i można ją potwierdzić, szczypiąc wyrostek i obserwując brak reakcji ze strony myszy. 
	UWAGA: Ta metoda znieczulenia zapewniała wystarczający czas znieczulenia wynoszący około 1,5 minuty. To wystarczyło, aby członkowie naszego laboratorium nauczyli się i przeprowadzili tę procedurę wkraplania; Można jednak zastosować inne metody znieczulenia zatwierdzone przez instytucję11,12,13.</li>
	<li>Wyjmij znieczuloną mysz z komory anestezjologicznej i zawieś mysz na platformie intubacyjnej od siekaczy szczęki.</li>
	<li>Aby otworzyć czyste przejście do tchawicy, użyj kleszczy z końcówką, aby delikatnie chwycić i wysunąć język na zewnątrz jamy ustnej. Przenieś język z kleszczy na kciuk i palec wskazujący ręki niedominującej.</li>
	<li>Trzymaj język w ręce niedominującej i podnieś fabrycznie załadowaną strzykawkę. Skieruj zgięty koniec igły od ciała i włóż igłę do jamy ustnej do podstawy języka.</li>
	<li>Trzymając igłę u podstawy języka, delikatnie pochyl nadgarstek, aby spowodować lekkie odsunięcie igły od ciała. Ten krok zapewnia, że igła zostanie wprowadzona do tchawicy, a nie do przełyku.</li>
	<li>Powoli prowadź igłę w dół do tchawicy; często wyczuwalne jest lekkie tykanie, gdy igła przechodzi przez fałd głosowy. Przełóż igłę przez tchawicę, aż poczujesz lekki opór, gdy igła napotka carinę.</li>
	<li>Lekko unieść igłę w kierunku proksymalnym, aby zawiesić igłę nad cariną. Umożliwia to dostarczanie do dwóch oskrzeli pierwotnych. Całkowicie wcisnąć tłok strzykawki, aby dostarczyć ładunek zakaźny. Usunąć igłę z tchawicy, podnosząc ją do góry i wyrzucić.</li>
	<li>Zdejmij mysz z platformy intubacyjnej, naciskając gumową opaskę, ale trzymaj mysz w pozycji pionowej. Zatkaj nosowe drogi oddechowe, kładąc palec bezpośrednio na nozdrzach. Utrzymaj tę pozycję przez około 1 minutę lub do momentu, gdy zaobserwujesz kilka głębokich oddechów. 
	UWAGA: Ten ostatni krok zapewnia, że całkowita objętość inokulum zostanie dostarczona do dolnych dróg oddechowych.</li>
	<li>Wróć mysz do klatki i obserwuj całkowite wyzdrowienie po znieczuleniu.</li>
</ol>
2. Wycięcie zakażonych płuc
<ol>
	<li>Pracując w okapie z przepływem laminarnym, aby utrzymać sterylność, przygotuj miejsce pracy z następującymi elementami: wagą i sterylną łodzią wagową, platformą preparacyjną, zestawem do preparacji zawierającym nożyczki i kleszcze, sterylnym PBS bez RNAzów i sterylną gazą.</li>
	<li>Poddać eutanazji zakażoną mysz za pomocą CO2 lub podobnej metody eutanazji zatwierdzonej przez IACUC.</li>
	<li>Umieść zainfekowaną mysz na platformie sekcyjnej i zabezpiecz ją za pomocą szpilek na końcu każdego wyrostka. Spryskaj mysz etanolem, aby pomóc utrzymać sterylność powierzchni roboczych.</li>
	<li>Zaczynając od pępka, użyj kleszczy, aby podnieść skórę i wykonać nacięcie aż do podstawy tchawicy. Chwytając skórę po obu stronach początkowego nacięcia, odciągnij skórę od ciała i przetnij połączenia tkankowe. 
	UWAGA: Pomocne może być wykonanie kilku bocznych nacięć w poprzek skóry, aby odsłonić więcej okolicy piersiowej.</li>
	<li>Zaczynając od podstawy wyrostka mieczykowatego, wykonaj małe nacięcie z zamiarem przebicia przepony. Powoduje to wzrost ciśnienia w klatce piersiowej, który powoduje cofanie się płuc. Gdy płuca są cofnięte, kontynuuj nacięcie, aby uwolnić przeponę.</li>
	<li>Usuń żebra, wykonując nacięcie po obu stronach klatki piersiowej. Spowoduje to pełne odsłonięcie klatki piersiowej i płuc.</li>
	<li>Aby wyciąć płuca, chwyć kleszczami podstawę serca i unieś do góry. Umieść nożyczki za płucami i zacznij wykonywać małe nacięcia przez połączenia tkankowe, kontynuując podnoszenie serca do góry.</li>
	<li>Po wycięciu płuc umieść je na sterylnej gazie i usuń serce. Serce można łatwo usunąć, podnosząc je z płuc za pomocą kleszczy i przecinając pozostałe połączenia tkankowe.</li>
	<li>Przenieś płuca do wstępnie obtarowanej łodzi wagowej i zapisz wagę.</li>
	<li>Po zważeniu płuc przenieś je do sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i tymczasowo przechowuj na lodzie, aż przejdziesz do etapów odzyskiwania i analizy patogenu.</li>
</ol>
3. Odzyskiwanie i analiza patogenów
<ol>
	<li>Kontynuując pracę w okapie z przepływem laminarnym, przygotuj miejsce do pracy z następującymi materiałami: maszynką do mielenia tkanek, sterylnym PBS bez RNAzy, buforem RLT uzupełnionym ß-merkaptoetanolem (1:100) i 1,5 ml probówek wirówkowych bez RNAzy. 
	UWAGA: ß-merkaptoetanol może być niebezpieczny w przypadku kontaktu ze skórą, spożycia, kontaktu z oczami lub wdychania. Rozcieńczanie ß-merkaptoetanolu do buforu RLT powinno odbywać się w dygestorium.</li>
	<li>Zacznij od dodania 1 ml sterylnego PBS wolnego od RNAzy do młynka do tkanek. Po napełnieniu przechowuj młynek do tkanek na lodzie.</li>
	<li>Przygotuj serię sterylnych probówek do seryjnego rozcieńczania bez RNAzy, które zostaną użyte do ilościowego określenia obciążenia bakteryjnego odzyskanego z zakażonych płuc. Najłatwiej to osiągnąć, dodając 900 μl sterylnej wody do każdej probówki mikrowirówkowej, a następnie seryjnie rozcieńczając inokulum patogenu. 
	UWAGA: Liczba probówek rozcieńczających niezbędnych do dokładnego zliczenia patogenów będzie się różnić w zależności od początkowego wprowadzenia patogenu i czasu trwania infekcji. Trzeba to ustalić empirycznie.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś płuca do przygotowanego młynka do tkanek i dokładnie zhomogenizuj tkankę, naciskając na cokół podczas obracania.</li>
	<li>Otworzyć młynek do tkanek i wlać 100 μl homogenizowanej próbki do pierwszej z przygotowanych seryjnie rozcieńczających probówek. Seryjnie rozcieńczyć próbki i oznaczyć jtk przez posiew na agarze odżywczym. CFU mogą być rejestrowane jako jtk/ml lub jtk/ml/mg tkanki płucnej. 
	UWAGA: Na tym etapie można pobrać dodatkowe 200 μl homogenizowanej próbki w celu oczyszczenia wirusowego RNA (patrz tabela materiałów) lub przechowywać w temperaturze -80°C do przyszłej analizy.</li>
	<li>Po usunięciu podwielokrotności w celu oznaczenia CFU i/lub izolacji wirusowego RNA, zastąpić cokół mielenia i zagnieździć homogenizowaną tkankę przez odwirowanie z prędkością 4 000 obr./min (3724 x g) przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Za pomocą pipety usunąć supernatant z granulowanej próbki i umieścić w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. 
	UWAGA: Supernatant jest wolny od bakterii i może być przechowywany w temperaturze -80 °C w celu analizy rozpuszczalnego gospodarza i wydzielanych czynników chorobotwórczych.</li>
	<li>Zawiesić homogenizowany osad tkankowy przez pipetowanie lub wirowanie w 700 μl buforu RLT-ß-merkaptoetanolu i przenieść próbkę do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml wolnej od RNAzy. 
	UWAGA: W tym momencie próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy.</li>
	<li>Oczyszczanie RNA przy użyciu niewielkich modyfikacji w protokole producenta zestawu do oczyszczania (patrz Tabela materiałów); patrz Voyich et al. 200814.
	<ol>
		<li>Przenieść homogenizowaną gnojowicę płuc do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej kulki krzemionkowe o średnicy 0,1 mm i przetwarzać za pomocą ubijaka do kulek przez 20 s z prędkością 6 m/s.</li>
		<li>Odwirować próbkę z prędkością 1 500 obr./min przez 3 minuty. Po odwirowaniu odpipetować supernatant do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Dodać 350 μl 96%–100% etanolu do próbki i dokładnie wymieszać przez pipetowanie lub odwrócenie.</li>
		<li>Przenieść 700 μl próbki do kolumny oczyszczającej umieszczonej w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Odwirować próbkę w temperaturze ≥ 8 000 x g przez 15 s i odrzucić przepływ. Nadmiar próbki należy przepuścić przez tę samą kolumnę, jak opisano powyżej.</li>
		<li>Przemyć kolumnę 700 μl buforu RW1 i odwirować próbkę w temperaturze ≥ 8 000 x g przez 15 s. Odrzucić przepływ i przenieść kolumnę z membraną krzemionkową do nowej probówki zbiorczej o pojemności 2 ml.</li>
		<li>Nanieść 500 μl buforu RPE na kolumnę. Przemyć kolumnę przez odwirowanie w temperaturze ≥ 8 000 x g przez 15 s. Odrzuć przepływ.</li>
		<li>Nanieść dodatkowe 500 μl buforu RPE do kolumny RNeasy i odwirować przy 8 000 x g przez 2 minuty. Odrzucić przepływ i odwirować kolumnę przy ≥10 000 x g przez 1 min.</li>
		<li>Aby wymyć oczyszczony RNA, zacznij od przeniesienia kolumny do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml bez RNAzy. Odpipetować 50 μl wody wolnej od RNaz bezpośrednio na membranę z żelu krzemionkowego kolumny i odwirować przy ≥8000 x g przez 1 min. 
		UWAGA: Uwolniony RNA można ponownie przeciągnąć przez tę samą kolumnę, aby zwiększyć wydajność RNA.</li>
		<li>Do oczyszczonego RNA dodać 50 μl wody wolnej od RNaz, aby uzyskać całkowitą objętość do 100 μl. Podwielokrotność 350 μl RLT-ß-merkaptoetanolu, a następnie 250 μl 96%–100% etanolu do próbki i dokładnie wymieszać przez pipetowanie lub inwersję.</li>
		<li>Umieścić próbkę w kolumnie oczyszczającej umieszczonej w probówce zbiorczej i odwirować przy ≥8000 x g przez 15 s. Wyrzucić przepływowy płyn i wymienić probówkę zbiorczą.</li>
		<li>Przemyć kolumnę, dodając 350 μl buforu RW1, a następnie odwirować w temperaturze ≥8000 x g przez 15 s.</li>
		<li>Przygotować roztwór DNazy zawierający około 27 jednostek Kunitza, dodając 10 μl zapasu DNazy (750 jednostek Kunitza/ml) do 70 μl buforu RDD. Dodać 80 μl roztworu DNazy bezpośrednio na membranę z żelu krzemionkowego i inkubować próbkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przemyć kolumnę 350 μl buforu RW1 i odwirować przy ≥8000 x g przez 15 s i odrzucić przepływ.</li>
		<li>Powtórz kroki 3.9.6–3.9.8, aby oczyścić RNA. 
		UWAGA: Zaleca się powtórzenie procedury oczyszczania RNA, wykonując kroki 3.9.9–3.9.10 i 3.9.6–3.9.8 (pomiń kroki DNazy 3.9.11–3.9.13). To dodatkowe oczyszczanie skutkuje bardzo wysokiej jakości RNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wydajność RNA można określić ilościowo za pomocą spektrofotometru z odczytami na poziomie 260 nM w celu określenia stężenia i 260:280 nM w celu określenia czystości. Po uzyskaniu wydajności RNA standaryzować stężenie każdej próbki RNA do 50 ng/μL. 
	UWAGA: Zaleca się wykonanie wielu porcji w stężeniu 50 ng/μl, aby uniknąć cykli zamrażania/rozmrażania, które mogą prowadzić do degradacji RNA.</li>
	<li>Oczyszczony RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C lub natychmiast użyć do analizy transkryptu. 
	UWAGA: W poprzednich publikacjach RNA od 3-5 myszy połączono w celu analizy transkryptu. Dzięki optymalizacji powyższej techniki, RNA od 1 myszy zostało empirycznie określone jako wystarczające do analizy transkryptu (80–120 ng / μL).</li>
</ol>

<ol><li>Xu, J., Murphy, S. L., Kochanek, K. D., Bastian, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+Vital+Statistics+Reports+Deaths%3A+Final+Data+for+2013%5BTitle%5D)+AND+%22National+Center+for+Health+Statistics%22%5BJournal%5D)">National Vital Statistics Reports Deaths: Final Data for 2013.</a> National Center for Health Statistics. 64 (2), at http://www.cdc.gov/nchs/data/nvsr64/nvsr64_02.pdf 1(2013).</li>
<li>Morris, D. E., Cleary, D. W., Clarke, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+Bacterial+Infections+Associated+with+Influenza+Pandemics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Secondary Bacterial Infections Associated with Influenza Pandemics.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1041(2017).</li>
<li>Lee, M., Arrecubieta, C., Martin, F. J., Prince, A., Borczuk, A. C., Lowy, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Postinfluenza+Model+of+Staphylococcus+aureus+Pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A Postinfluenza Model of Staphylococcus aureus Pneumonia.</a> The Journal of Infectious Diseases. 201 (4), 508-515 (2010).</li>
<li>Shepardson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Type+I+Interferon+Signaling+Is+a+Master+Regulator+of+Susceptibility+to+Postinfluenza+Bacterial+Superinfection%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Differential Type I Interferon Signaling Is a Master Regulator of Susceptibility to Postinfluenza Bacterial Superinfection.</a> mBio. , (2016).</li>
<li>Miller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Murine+Intranasal+Dosing+Efficiency+Using+Luminescent+Francisella+tularensis%3A+Effect+of+Instillation+Volume+and+Form+of+Anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Visualization of Murine Intranasal Dosing Efficiency Using Luminescent Francisella tularensis: Effect of Instillation Volume and Form of Anesthesia.</a> PLOS ONE. 7 (2), 31359(2012).</li>
<li>Robinson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+a+virus+exacerbates+staphylococcus+aureus+pneumonia+in+mice+by+attenuating+antimicrobial+peptide+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Influenza a virus exacerbates staphylococcus aureus pneumonia in mice by attenuating antimicrobial peptide production.</a> Journal of Infectious Diseases. 209 (6), 865-875 (2014).</li>
<li>Reddinger, R. M., Luke-Marshall, N. R., Hakansson, A. P., Campagnari, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+physiologic+changes+induced+by+influenza+a+virus+lead+to+Staphylococcus+aureus+biofilm+dispersion+and+transition+from+asymptomatic+colonization+to+invasive+disease%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Host physiologic changes induced by influenza a virus lead to Staphylococcus aureus biofilm dispersion and transition from asymptomatic colonization to invasive disease.</a> mBio. 7 (4), (2016).</li>
<li>Borgogna, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+Bacterial+Pneumonia+by+Staphylococcus+aureus+Following+Influenza+A+Infection+Is+SaeR%2FS+Dependent%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Secondary Bacterial Pneumonia by Staphylococcus aureus Following Influenza A Infection Is SaeR/S Dependent.</a> The Journal of Infectious Diseases. 218 (5), 809-813 (2018).</li>
<li>Shahangian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+IFNs+mediate+development+of+postinfluenza+bacterial+pneumonia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Type I IFNs mediate development of postinfluenza bacterial pneumonia in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 119 (7), 1910-1920 (2009).</li>
<li>McAuley, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+1918+Influenza+A+Virus+PB1-F2+Enhances+the+Pathogenesis+of+Viral+and+Secondary+Bacterial+Pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Expression of the 1918 Influenza A Virus PB1-F2 Enhances the Pathogenesis of Viral and Secondary Bacterial Pneumonia.</a> Cell Host and Microbe. 2 (4), 240-249 (2007).</li>
<li>Hamacher, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+wire+guide-based+orotracheal+mouse+intubation%3A+Description%2C+evaluation+and+comparison+with+transillumination%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: Description, evaluation and comparison with transillumination.</a> Laboratory Animals. 42 (2), 222-230 (2008).</li>
<li>Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intubation-mediated+Intratracheal+%28IMIT%29+Instillation%3A+A+Noninvasive%2C+Lung-specific+Delivery+System%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52261(2014).</li>
<li>Cai, Y., Kimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+Intratracheal+Intubation+to+Study+the+Pathology+and+Physiology+of+Mouse+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50601(2013).</li>
<li>Voyich, J. M., Sturdevant, D. E., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Staphylococcus+aureus+gene+expression+during+PMN+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Staphylococcus aureus gene expression during PMN phagocytosis.</a> Methods in molecular biology. 431, Clifton, N.J. 109-122 (2008).</li>
<li>Dyer, K., Rosenberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNase+a+superfamily%3A+Generation+of+diversity+and+innate+host+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Diversity%22%5BJournal%5D)">The RNase a superfamily: Generation of diversity and innate host defense.</a> Molecular Diversity. 10 (4), 585-597 (2006).</li>
<li>Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+Lavage+of+Murine+Lungs+to+Analyze+Inflammatory+Cell+Infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55398(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zastosowanie tego modelu zapewnia wysoce wydajną i powtarzalną metodę badania wtórnych infekcji bakteryjnych. Możliwość ścisłej kontroli dostarczania inokulum patogenu umożliwia bardziej precyzyjne obserwacje indywidualnych i kombinatorycznych efektów każdego patogenu. Nieskuteczność bardziej powszechnej drogi wkraplania donosowego prawdopodobnie przyczyniła się do rozbieżności w objętościach i stężeniach dawek obecnych w literaturze. Uzasadnione jest, że brak precyzyjnego mysiego systemu do badania wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc opóźnił wyniki identyfikujące specyficzne odpowiedzi bakteryjne, które przyczyniają się do nasilenia koinfekcji płucnych. Opracowanie powtarzalnego modelu do badania ekspresji wirulencji podczas wtórnych zakażeń bakteryjnych może doprowadzić do zidentyfikowania celów szczepionek lub leków w celu złagodzenia tych zakażeń.
Etap wkraplania dotchawiczego ma kluczowe znaczenie dla skutecznego wykrycia infekcji dolnych dróg oddechowych i dalszej analizy patogenów. Podczas nauki tej techniki pomocne może być ćwiczenie używania barwnika (zgodnie z opisem w metodach) przed podaniem materiału zakaźnego. Użycie barwnika pozwala na bezpośrednią wizualizację inokulum do dróg oddechowych. Częstym błędem, który może wystąpić, jest wprowadzenie igły do przełyku, a nie do tchawicy. Spowoduje to dostarczenie inokulum do żołądka, a nie do płuc. Aby skorygować ten błąd, odchyl igłę dalej od ciała i przełóż ją w dół do tchawicy. Po opanowaniu procedura ta jest bardzo skuteczna i może być stosowana do przeprowadzania eksperymentów na dużej liczbie myszy. Pracując partiami w celu znieczulenia myszy, wkraplanie dotchawicze można zakończyć w około 30 sekund na mysz. Ponadto wycięcie płuc można wykonać w ciągu 2 do 3 minut na mysz.
Odzyskanie żywotnego i czystego bakteryjnego RNA z zakażonych tkanek ma kluczowe znaczenie dla analizy transkryptów. RNazy są wszechobecne i mogą szybko zrujnować eksperyment15. Niektóre metody obejmują stosowanie inhibitorów RNazy; jednak stwierdziliśmy, że zamrożenie próbki w temperaturze -80 °C w RLT-ß-merkaptoetanolu lub natychmiastowe przetworzenie próbki w celu izolacji RNA przy użyciu wszystkich probówek i odczynników wolnych od RNaz jest skuteczne w zmniejszaniu zanieczyszczenia RNazą. Ponadto zalecamy oczyszczanie maksymalnie sześciu próbek jednocześnie. Uwzględnienie więcej niż sześciu próbek może spowodować wydłużenie opóźnień między etapami protokołu, które mogą doprowadzić do degradacji RNA. Po oczyszczeniu należy również zachować ostrożność, aby uniknąć niepotrzebnych cykli zamrażania i rozmrażania. W związku z tym, jeżeli na jednej próbce zostanie przeprowadzonych wiele analiz, zaleca się porcjowanie oczyszczonego RNA do przechowywania w temperaturze -80 °C.
Oprócz technik omówionych w niniejszym dokumencie, metoda ta może być uzupełniona poprzez wykonanie płukania pęcherzyków oskrzelowych przed wycięciem i homogenacją płuc16. Można to osiągnąć poprzez płukanie całych dolnych dróg oddechowych lub za pomocą nici do szwów w celu ograniczenia jednego rozgałęzionego ramienia drzewa oskrzelowego, a następnie płukania przez pozostałą gałąź. Często prowadzi to do zmniejszenia odzyskiwania ładunku patogenu, ale zapewnia próbkę, na podstawie której można uzyskać informacje, takie jak aktywność dehydrogenazy mleczanowej, tożsamość populacji komórkowej i profile cytokin16. Razem dane te mogą przyczynić się do pełniejszego zrozumienia interakcji gospodarz-patogen zachodzących podczas wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc.
Chociaż omawiane metody dotyczyły wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc, można je rozszerzyć na dowolny mysi model infekcji dolnych dróg oddechowych; W szczególności te, które skorzystałyby na ściśle kontrolowanym dostarczaniu i odzyskiwaniu zainstalowanego inokulum. Ponadto, podobnie jak wiele innych dróg zakażenia, wkraplanie dotchawicze może być wykorzystywane w zastosowaniach niezakaźnych, takich jak podawanie leków i związków środowiskowych12.

Wtórne bakteryjne zapalenie płuc po zakażeniu grypą jest główną przyczyną zgonów w Stanach Zjednoczonych i aktywnym obszarem badań1,2. Pomimo licznych badań z wykorzystaniem mysich modeli wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc, nadal istnieją niespójności dotyczące wkraplania patogenów i przesłuchań3,4,5. Ponadto, podczas gdy wiele wcześniejszych wysiłków koncentrowało się na immunomodulujących efektach grypy, które prowadzą do zwiększonej podatności na wtórne infekcje bakteryjne, nowsze dane sugerują, że regulacja wirulencji patogenu bakteryjnego jest równym czynnikiem przyczyniającym się do powstania choroby6,7,8,9. Te nowe dane wymagają bardziej precyzyjnej metody badania wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc w mysich modelach koinfekcji, które ułatwiają badanie odpowiedzi patogenu.
Unikalne dla modeli jednoczesnych infekcji grypy, organizmy gospodarzy są celowo osłabione immunologicznie przez pierwotną infekcję grypą przed podaniem wtórnego czynnika bakteryjnego. W celu jak najlepszego odtworzenia patogenezy choroby obserwowanej u ludzkich gospodarzy, konieczne jest kontrolowanie obciążenia patogenem zarówno czynników pierwotnych, jak i wtórnych, tak aby można było obserwować indywidualne i skojarzone skutki każdego czynnika zakaźnego. Najczęściej infekcje dróg oddechowych u myszy zostały stwierdzone poprzez podanie donosowe3,4,5,6,10. Ze względu na to, że droga ta jest technicznie prosta i może być odpowiednia w niektórych zastosowaniach infekcji pojedynczym czynnikiem, nie nadaje się do modeli koinfekcji, ponieważ procedury wkraplania, objętości dawek i skuteczność są bardzo zmienne w opublikowanej literaturze3,4,5,6.
Aby uzyskać pełniejsze zrozumienie patogenezy wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc, należy wziąć pod uwagę wkład zarówno gospodarza, jak i patogenu. W tym celu opracowaliśmy proste i powtarzalne podejście do odzyskiwania żywych bakterii i patogenów RNA z zakażonych płuc. Metoda ta wykorzystuje uproszczoną, nieinwazyjną procedurę wkraplania dotchawiczego, a następnie izolację bakteryjnego RNA. Opisana w niniejszym dokumencie procedura wkraplania dotchawiczego jest podobna do wcześniej opisanych metod i nie ogranicza się do dostarczania patogenów11,12,13. Korzystanie z tej konkretnej procedury ma swoją zaletę tego, że jest tanie i nie wymaga użycia specjalistycznego sprzętu, takiego jak kaniule, druty doprowadzające czy światłowodowy; Ponadto, ponieważ procedura ta jest nieinwazyjna, zapewnia minimalny stres u mysich osób, minimalizuje reakcję zapalną wynikającą z mechaniki inokulacji i zapewnia wydajną drogę dostarczania infekcji wielu podmiotom. Krótko mówiąc, myszy znieczulone izofluranem są zawieszone na siekaczach. Kleszcze służą do delikatnego chwytania języka, a następnie wkładania do tchawicy wstępnie załadowanej, wygiętej, końcówki igły o rozmiarze 21 i dostarczania ładunku patogenu. Walidacja tej procedury jest wykazana poprzez wizualne potwierdzenie równomiernego rozprowadzenia barwnika w przedziale płucnym i odzyskanie ładunku bakteryjnego. Następnie pokazujemy, jak odzyskać żywotnego Staphylococcus aureus (S. aureus) z zakażonych płuc i opisujemy powtarzalną metodę izolowania wysokiej jakości RNA patogenu.

<table><tbody><tr><td>Lysing Matrix B</td><td>MP Biomedicals</td><td>6911100</td><td>Określany w tekście jako "kulki krzemionkowe 0,1 mm"</td></tr><tr>Zalecana <td>jest igła o rozmiarze 21</td><td>SAI</td><td>B21-150</td><td>1,5".</td></tr><tr><td>Zestaw DNaz wolnych od RNaz</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>DNaza użyta w załączonym tekście.</td></tr><tr><td>FastPrep-24 Classic Instrument</td><td>MP Biomedicals</td><td>116004500</td><td>FastPrep FP120 nie jest już dostępny. Określany w tekście jako "Bead Beater"</td></tr><tr><td>TaqMan AIV-Matrix Reagents</td><td>Applied Biosystems</td><td>4405543</td><td>Influenza A segment qRT-PCR kit.</td></tr><tr><td>Stanowisko do intubacji</td><td>Kent Scientific</td><td>ETI-MES-01</td><td>Określane w tekście jako "platforma do intubacji". Platforma do intubacji użyta w załączonym filmie została wykonana we własnym zakresie.</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>Zestaw do oczyszczania RNA; zawiera kolumny RNeasy, bufor RLT, bufor RW1 i bufor RPE</td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52904</td><td>Zestaw do oczyszczania wirusowego RNA.</td></tr><tr><td>Młynki</td><td>do tkanek Thermo Fisher Scientific</td><td>02-542-08</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol (&beta;-merkaptoetanol)</td><td>Calbiochem</td><td>UN2966</td><td></td></tr></tbody></table>

precyzyjny system dostarczania i odzyskiwania patogenów dla mysich modeli wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc

A Precise Pathogen Delivery and Recovery System for Murine Models of Secondary Bacterial Pneumonia

Wtórne bakteryjne zapalenie płuc następujące po zakażeniu grypą niezmiennie plasuje się w pierwszej dziesiątce głównych przyczyn zgonów w Stanach Zjednoczonych. Do tej pory mysie modele koinfekcji były podstawowym narzędziem opracowanym do badania patologii zarówno infekcji pierwotnych, jak i wtórnych. Pomimo rozpowszechnienia tego modelu, w badaniach przeważają znaczne rozbieżności dotyczące procedur wkraplania, objętości dawek i skuteczności. Co więcej, wysiłki te były w dużej mierze niekompletne, jeśli chodzi o ustalenie, w jaki sposób patogen może bezpośrednio wpływać na postęp choroby po zakażeniu. W tym miejscu przedstawiamy precyzyjną metodę dostarczania, odzyskiwania i analizy patogenów, która może być stosowana w mysich modelach wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc. Wykazaliśmy, że wkraplanie dotchawicze umożliwia wydajne i dokładne dostarczanie kontrolowanych objętości bezpośrednio i równomiernie do dolnych dróg oddechowych. Płuca można wyciąć w celu odzyskania i ilościowego określenia obciążenia patogenami. Po wycięciu zakażonych płuc opisujemy metodę ekstrakcji wysokiej jakości RNA patogenu do późniejszej analizy transkrypcyjnej. Procedura ta ma tę zaletę, że jest niechirurgiczną metodą dostarczania bez użycia specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego i zapewnia powtarzalną strategię badania udziału patogenów we wtórnym bakteryjnym zapaleniu płuc.

Rysunek 1 wykorzystuje 0,1% (masa/objętość) roztwór Coomassie brilliant blue, aby wykazać, że instylacja wewnątrzeoddechowa dostarcza inokulum bezpośrednio i równomiernie do dolnych dróg oddechowych. Rysunek 2 przedstawia liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) bakterii (S. aureus) odzyskanych bezpośrednio z homogenizatu tkanki płucnej. Rysunek 3 demonstruje zastosowanie tego systemu do precyzyjnego dostarczania i odzyskiwania inokulum z dolnych dróg oddechowych poprzez zestawienie wartości CFU wprowadzonych i odzyskanych od poszczególnych myszy. Rysunek 4 przedstawia krzywą amplifikacji qRT-PCR bakteryjnego genu konstytutywnego gyrB, aby wykazać, że bakteryjne RNA można wyekstrahować bezpośrednio z zainfekowanej tkanki płucnej przy minimalnym zanieczyszczeniu DNA. Rysunek 5 przedstawia konstrukcję krzywej standardowej przy użyciu amplifikacji qRT-PCR segmentu M wirusa grypy A, co dowodzi, że wirusowe RNA można wyekstrahować bezpośrednio z zainfekowanej tkanki płucnej.
<img alt="Porównanie płuc, grzbietowa vs brzuszna, niezakażone vs barwione Coomassie, wynik wizualny, badanie biologiczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59566/59566fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Instylacja wewnątrz tchawiczną umożliwia równomierny rozprzestrzenienie substancji w dolnych drogach oddechowych. (A, B) Niezakażone płuca wycięto ze zdrowej myszy po wewnątrztchawicznym podaniu sterylnego PBS i sfotografowano z perspektywy (A) grzbietowej oraz (B) brzusznej. (C, D) 50 µL 0,1% roztworu Coomassie brilliant blue podano znieczulonej myszy drogą wewnątrztchawiczną. (C) Widok grzbietowy. (D) Widok brzuszny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59566/59566fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wzrost kolonii bakteryjnych na płytce agarowej, seria rozcieńczeń, eksperyment mikrobiologiczny, liczenie kolonii." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59566/59566fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Reprezentatywne odzyskanie jednostek tworzących kolonie (CFU) bakterii z homogenatu zainfekowanych płuc. Płuca wycięto jeden dzień po zakażeniu S. aureus. Po homogenizacji 100 µL zawiesiny płucnej poddano rozcieńczeniom seryjnym do 10-6. Aby policzyć odzyskane CFU, krople o objętości 10 µL z rozcieńczeń 10-5 oraz 10-6 wysiano na agar sojowy z tryptonem (TSA) i inkubowano przez noc w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% C02. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59566/59566fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie CFU/mL bakterii; wartość wprowadzona vs. odzyskana, analiza wykresu punktowego, warunki niskie i wysokie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59566/59566fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Precyzyjne podanie i odzysk inokulum patogenu po administracji dotchawiczej. Myszy podzielono na dwie grupy po trzy zwierzęta w każdej. Myszy poddano instylacji dotchawiczej S. aureus w stężeniach 1 x 108 (niskim) i 2 x 108 (wysokim) CFU/mL. Godzinę po infekcji myszy uśmiercono, a płuca wycięto w celu wykazania precyzji instylacji i odzysku. Inokulum bakteryjne oraz bakterie odzyskane z homogenatu płuc wysiano na podłoże TSA (agar sojowy tryptyczny). Nie odnotowano istotnych różnic między liczbą bakterii wprowadzonych a odzyskanymi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59566/59566fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="wyniki qPCR detekcji transkryptu gyrB; krzywe amplifikacji względem numeru cyklu; analiza ekspresji genów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59566/59566fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Reprezentatywny odzysk i czystość bakteryjnego RNA. Sześć godzin po intratrachealnej instylacji 1 x 108 CFU/50 µL z S. aureusmyszy zostały uśmiercone. Płuca wycięto i poddano homogenizacji, a następnie zawiesinę płucną resuspendowano w buforze RLT-ß-merkaptoetanol. RNA oczyszczono zgodnie z opisem w kroku 3.9.14Do wykrycia transkryptów bakteryjnego genu gospodarczego wykorzystano metodę qRT-PCR. gyrB. Włączono kontrolę bez odwrotnej transkryptazy (nRT), aby wykazać czystość odzyskanego RNA. Przy progu 0,1, gyrB Wykryto transkrypty przy średnich cyklach wynoszących odpowiednio 21,1, 20,3 i 20,5. Kontrole nRT nie zostały wykryte aż do średnich cykli 35,9, 35,5 i 35,0. n = 3 powtórzenia biologiczne, zawierające 3 powtórzenia techniczne na każde powtórzenie biologiczne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59566/59566fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki qPCR z detekcją segmentu M wirusa IAV; krzywe amplifikacji; wykres krzywej standardowej; analiza danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59566/59566fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Reprezentatywne odzyskanie wirusowego RNA. Sześć dni po podaniu dotraszealnym 100 PFU/50 µL wirusa grypy A/PR/8/1934(H1N1) myszy zostały poddane eutanazji. Płuca wycięto i zhomogenizowano, a następnie 200 µL zhomogenizowanej zawiesiny zebrano i przepuszczono przez sito komórkowe 70 µm przed puryfikacją wirusowego RNA. Oczyszczone RNA poddano rozcieńczeniom szeregowym (10-1-10-4), po czym przeprowadzono amplifikację segmentu M wirusa grypy A. (A) Wykres amplifikacji RNA wirusa grypy A odzyskanego z zakażonego płuca i rozcieńczonego 10-1–10-4. (B) Krzywa standardowa segmentu M wirusa grypy A. Próg (Threshold) = 0.2, R2 = 0.994, nachylenie (slope) = -3.46. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59566/59566fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Tutaj prezentujemy metody poprawy badań nad wtórnym bakteryjnym zapaleniem płuc poprzez zapewnienie nieinwazyjnej drogi wkraplania do dolnych dróg oddechowych, po której następuje odzyskiwanie patogenów i analiza transkryptów. Zabiegi te są powtarzalne i mogą być wykonywane bez specjalistycznego sprzętu, takiego jak kaniule, druty doprowadzające czy światłowodowe.

Precyzyjny system dostarczania i odzyskiwania patogenów dla mysich modeli wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc

Secondary bacterial pneumonias following influenza infections consistently rank within the top ten leading causes of death in the United States. To date, ...

Ogólnym celem tej procedury jest wzmocnienie badań nad wtórnym bakteryjnym zapaleniem płuc poprzez zapewnienie prostej i nieinwazyjnej drogi inokulacji bakteryjnej do dolnych dróg oddechowych, a następnie odzyskania bakteryjnego i oczyszczenia RNA do analizy transkryptu. Zostanie to osiągnięte poprzez najpierw głębokie znieczulenie myszy i włożenie wstępnie załadowanej, wygiętej igły z końcówką do tchawicy myszy, która została pionowo zawieszona na siekaczach szczęki. Po drugie, po udanej infekcji, jednostki tworzące kolonie bakteryjne są odzyskiwane przez wycięcie i homogenizację płuc.Otrzymany homogenat płuc jest seryjnie rozcieńczany i rozsiewany na agarze odżywczym w celu wyliczenia jednostek tworzących kolonie. Na koniec RNA jest oczyszczane z homogenatu płuc. Zaletą tego zabiegu jest to, że umożliwia on kontrolowany poród bezpośrednio do dolnych dróg oddechowych.To pozwala nam przyjrzeć się zarówno kombinatorycznemu, jak i indywidualnemu wkładowi patogenu w wynik choroby. Ostatnie postępy w tej dziedzinie wykazały, że bakteryjna regulacja genów może odgrywać dużą rolę w określaniu wyników infekcji. Technika ta korzysta ze zdolności do odzyskiwania zarówno bakteryjnych CFU, jak i RNA.Po wyizolowaniu RNA możemy ocenić udział określonych genów wirulencji w zakażeniu. Ponadto technika ta ma zaletę tego, że nie jest chirurgiczna. Pozwala to na zminimalizowanie stresu u zwierząt wykorzystywanych w tej procedurze i umożliwia im natychmiastową rekonwalescencję.Procedura ta korzysta z użycia zwykłego sprzętu laboratoryjnego bez użycia wszelkiego rodzaju kaniul, przewodów doprowadzających lub światłowodowych. Osoby, które są nowicjuszami w tej technice, mogą na początku mieć problemy z faktyczną instalacją przez tchawicę. Po skonceptualizowaniu tej techniki staje się ona prostą i skuteczną procedurą badania wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc u mysiego gospodarza.Przed rozpoczęciem zabiegu przygotuj miejsce pracy z następującymi materiałami: platformą do intubacji, sterylną strzykawką o pojemności jednego ml, sterylnymi kleszczami z końcówką, sterylną igłą z końcówką w rozmiarze 21 oraz dwiema stożkowymi rurkami do przechowywania strzykawki i kleszczy. Procedurę należy rozpocząć od przygotowania inokulów patogenu tak, aby uzyskać pożądane stężenie końcowe w objętości 50 mikrolitrów. Następnie, używając sterylnych rękawiczek, przygotuj igłę o końcówce o średnicy od jednego do 1,5 cala i rozmiarze 21, zginając ją pod kątem około 35 stopni.Po przymocowaniu igły do strzykawki narysuj poduszkę powietrzną o pojemności 100 mikrolitrów, a następnie 50 mikrolitrów czynnika zakaźnego. Poduszka powietrzna o pojemności 100 mikrolitrów zapewnia pełne dostarczenie ładunku patogenu po wciśnięciu strzykawki. Umieścić załadowaną igłę i strzykawkę w miejscu łatwo dostępnym dla ręki dominującej.Wyjmij i znieczul mysz z komory anestezjologicznej i zawieś mysz na platformie intubacyjnej z siekaczy szczęki. Za pomocą kleszczy z końcówką delikatnie chwyć i rozciągnij język. Przenieś język z kleszczy na kciuk i palec wskazujący ręki niedominującej.Trzymać język w ręce niedominującej i podnieść fabrycznie załadowaną strzykawkę. Skieruj zgięty koniec igły od ciała. Wbić igłę do jamy ustnej.U nasady języka delikatnie odchyl nadgarstek, aby spowodować lekkie odsunięcie igły od ciała. Takie działanie zapewnia, że igła zostanie wprowadzona do tchawicy, a nie do przełyku. Powoli wprowadzić igłę w dół do tchawicy.Często wyczuwalne jest lekkie tykanie, gdy igła przechodzi przez fałd głosowy. Przełóż igłę przez tchawicę, aż poczujesz lekki opór, gdy igła napotka carinę. Lekko unieść igłę w górę, aby zawiesić igłę nad cariną.Umożliwia to dostarczanie do oskrzeli pierwotnych. Całkowicie wcisnąć tłok strzykawki, aby dostarczyć ładunek zakaźny. Wyjąć igłę z tchawicy i wyrzucić.Zdejmij mysz z platformy intubacyjnej, naciskając gumową opaskę, ale trzymaj mysz w pozycji pionowej. Zatkaj nosowe drogi oddechowe, kładąc palec bezpośrednio na nozdrzach. Utrzymaj tę pozycję przez około minutę lub do momentu, gdy zaobserwujesz kilka głębokich oddechów.Ten ostatni krok zapewnia, że całkowita objętość inokulum zostanie dostarczona do dolnych dróg oddechowych. Umieść zwierzę z powrotem w klatce i upewnij się, że nastąpiło szybkie wyzdrowienie ze znieczulenia. W wybranych punktach czasowych po zakażeniu zakażone płuca mogą zostać wycięte w celu ilościowego określenia i oceny udziału bakterii w zwiększonej zachorowalności związanej z wtórnym bakteryjnym zapaleniem płuc.Przygotuj miejsce do pracy z następującymi elementami: wagą i sterylną łodzią wagową, platformą preparacyjną, zestawem preparacyjnym zawierającym nożyczki i kleszcze oraz sterylną gazą. Na potrzeby tej demonstracji wycięcie płuc zostanie przeprowadzone na blacie stołu. Jednakże, aby zachować sterylność podczas tej procedury, zaleca się, aby wycięcie płuc było wykonane w kapturze z przepływem laminarnym.Poddaj zakażoną mysz eutanazji CO2 lub podobnej metodzie eutanazji zatwierdzonej przez IACUC. Umieść i zabezpiecz zainfekowaną mysz na platformie sekcyjnej. Spryskaj mysz etanolem, aby utrzymać sterylność na powierzchniach roboczych.Zaczynając od pępka, użyj kleszczy, aby podnieść skórę i wykonać nacięcie w kierunku krtani. Chwytając skórę po obu stronach początkowego nacięcia, odciągnij skórę od ciała i przetnij połączenia tkankowe. Pomocne może być wykonanie bocznych nacięć w poprzek skóry, aby odsłonić większą część klatki piersiowej.Zaczynając od podstawy wyrostka mieczykowatego, wykonaj małe nacięcie z zamiarem przebicia przepony. Powoduje to wzrost ciśnienia w klatce piersiowej, powodując cofanie się płuc. Po cofnięciu płuc kontynuuj nacięcie, aby uwolnić przeponę.Usuń żebra, wykonując nacięcie po obu stronach. Spowoduje to odsłonięcie klatki piersiowej i płuc. Aby wyciąć płuca, chwyć kleszczem podstawę serca i unieś do góry.Umieść nożyczki za płucami i zacznij wykonywać małe nacięcia w połączeniach tkankowych, kontynuując unoszenie serca do góry. Po wycięciu płuc umieść je na sterylnej gazie i usuń serce, odrywając je od płuc i przecinając pozostałe połączenia tkankowe. Przenieść płuca do wstępnie obtarowanej łodzi wagowej i zapisać masę.Po zważeniu płuc przenieś płuca do sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i tymczasowo przechowuj je na lodzie. Teraz, gdy płuca zostały wycięte i zważone, bakterie można odzyskać, aby określić ich rolę w patogenezie. W ramach przygotowań do regeneracji bakterii potrzebne będą następujące materiały: młynek do tkanek, sterylny PBS wolny od RNaz, bufor RLT uzupełniony beta-merkaptoetanolem oraz 1,5 ml probówek wirówkowych bez RNaz.Zacznij od dodania jednego ml sterylnego PBS wolnego od RNaz do młynka do tkanek. Po napełnieniu przechowuj młynek do tkanek na lodzie. Następnie przygotuj serię sterylnych probówek do seryjnego rozcieńczania bez RNaz, aby określić ilościowo ładunek bakteryjny odzyskany z zakażonych płuc.Przenieś płuca do przygotowanego młynka do tkanek i dokładnie zhomogenizuj tkankę, naciskając na cokół podczas obracania. Otworzyć młynek do tkanek i wlać 100 mikrolitrów homogenizowanej próbki do pierwszej z przygotowanych seryjnie probówek do rozcieńczania. Seryjnie rozcieńczyć próbki i płytkę na agarze odżywczym, aby wyliczyć jednostki tworzące kolonie.CFU mogą być rejestrowane jako CFU na ml lub CFU na ml, na miligram tkanki płucnej. Po usunięciu podwielokrotności o pojemności 100 mikrolitrów należy wymienić cokół mielący i odwirować próbkę z prędkością 4 000 obr./min przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zakończeniu wirowania usunąć supernatant z granulowanej próbki.Supernatant można zapisać i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszej analizy w późniejszym terminie. Ponownie zawiesić homogenizowany osad tkankowy w 700 mikrolitrach beta-merkaptoetanolu RLT i przenieść próbkę do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml wolnej od RNaz. W tym momencie próbka może być przechowywana w temperaturze minus 80 stopni.RNA można oczyścić z zawiesiny homogenatu płuc RLT, ładując próbkę do probówki mikrowirówkowej o pojemności dwóch ml zawierającej 1 milimetr kulek krzemionki i przetwarzając za pomocą ubijaka do kulek przez 20 sekund z prędkością sześciu metrów na sekundę. RNA jest następnie natychmiast oczyszczane przy użyciu adaptacji metody RNeasy, jak opisano w Voyich i wsp. Methods in Molecular Biology" 2008 i opisane w rękopisie dołączonym do tego filmu.Po oczyszczeniu wydajność RNA można określić ilościowo za pomocą spektrofotometru. Po ilościowym określeniu korzystne jest rozcieńczenie powstałego RNA do kilku porcji po 50 nanogramów na mikrolitr. Dzięki temu RNA z próbki może być wykorzystane do wielu analiz bez poddawania go wielu cyklom zamrażania i rozmrażania.Zastosowanie tej techniki umożliwia zainstalowanie kontrolowanego ładunku patogenu bezpośrednio w dolnych drogach oddechowych. Skuteczność tego systemu dostarczania można wykazać poprzez instalację 1% roztworu Coomassie w kolorze brylantowo-niebieskim. W górnym rzędzie znajduje się para niezainfekowanych płuc, które mają służyć jako kontrola, podczas gdy w dolnym rzędzie znajduje się para płuc, które otrzymały 50 mikrolitrów 1% jaskrawoniebieskiego barwnika Coomassie przez instalację dotchawiczą.Zastosowanie tego barwnika pokazuje, w jaki sposób instalacja dotchawicza zapewnia równomierne rozprowadzenie ładunku patogenu do i przez lewe i prawe płuco. Po zakażeniu ładunek patogenu może zostać odzyskany i przeanalizowany w różnych punktach czasowych po instalacji dotchawiczej poprzez wycięcie i homogenizację tkanki płucnej. Aby zademonstrować skuteczność tej techniki odzyskiwania, dwie grupy zawierające po trzy myszy każda zostały zakażone niską i wysoką dawką Staphylococcus aureus.Wkład bakteryjny został posiany na agarze odżywczym w celu wyliczenia CFU. Godzinę po instalacji dotchawiczej myszy poddano eutanazji, płuca wycięto i zhomogenizowano w maszynce do mielenia tkanek. Homogenizowaną tkankę seryjnie rozcieńczano i posiewano na agarze odżywczym w celu wyliczenia CFU.RNA wyizolowane z homogenizowanej tkanki płucnej można zbadać metodą PCR z odwrotną transkryptazą i wykorzystać do ilościowego określenia względnej obfitości transkryptów docelowych genów. Aby zapewnić minimalne zanieczyszczenie DNA w tle, zaleca się, aby reakcja PCR, bez dodatku odwrotnej transkryptazy, była przeprowadzana równolegle z jakimikolwiek reakcjami qRT-PCR. Oprócz wiremii bakteryjnych technikę tę można rozszerzyć na instalację i izolację wiremii.Po homogenizacji tkanki płucnej wirusowe RNA można wyizolować i wykorzystać do pomiaru obfitości transkryptów genów wirusa lub skonstruowania standardowej krzywej do kwantyfikacji wirusa. Zastosowanie tego systemu zapewnia wysoce wydajny i powtarzalny system do badania wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc. Po opanowaniu procedura ta może być stosowana w eksperymentach na dużą skalę.Pracując partiami w celu eutanazji myszy, instalacja dotchawicza może nastąpić w ciągu 30 sekund na mysz. Po zakończeniu tego, przechodząc do wycięcia płuc, można to zrobić w około dwie do trzech minut na mysz. Chociaż omawiane tutaj metody dotyczyły wtórnej infekcji bakteryjnej, można je rozszerzyć na każdą procedurę, w której konieczne jest kontrolowane dostarczenie i odzyskanie inokulum.Oprócz opisanych tutaj metod, procedura ta może być uzupełniona o dodanie płukania oskrzelowo-pęcherzykowego przed wycięciem płuc. Chociaż często powoduje to zmniejszenie odzysku ładunku patogenu, korzystne jest uzyskanie danych, takich jak analiza cytokin, aktywność dehydrogenazy mleczanowej i identyfikacja różnych populacji komórkowych. Aby uzyskać pełniejsze zrozumienie patogenezy choroby, ważne staje się zbadanie zarówno udziału gospodarza, jak i patogenu w chorobie.Celem tego filmu było przedstawienie prostej i skutecznej metody badania wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc u mysiego gospodarza.

a-precise-pathogen-delivery-recovery-system-for-murine-models

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Lenhard, A. i in. Model myszy przedstawiający przejście Streptococcus pneumoniae z kolonizatora do patogena po współinfekcji wirusowej powtarza chorobę zaostrzoną przez wiek. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje model współinfekcji myszy, w którym wirus grypy wywołuje przejście Streptococcus pneumoniae z kolonizatora do patogenu. Opisuje etapy związane z kolonizacją bakteryjną, infekcją wirusową i postępem choroby.

Model myszy do badania patogennej przejścia paciorkowca pneumoniae po współinfekcji wirusowej

W tym filmie opisujemy protokół testowania skuteczności bezkomórkowej szczepionki przeciw krztuścowi przeciwko zakażeniu Bordetella pertussis u myszy. Po szczepieniu myszy poddano infekcji, a ich homogenat tkankowy poddano hodowli w celu analizy kolonii bakteryjnych jako odczytu odporności ochronnej wywołanej szczepionką.

Ocena odporności indukowanej szczepionką przeciwko infekcji bakteryjnej w modelu mysim

Śledzenie w czasie rzeczywistym wpływu czynników wirulencji pneumokoków w modelu ostrego mysiego zapalenia płuc z wykorzystaniem bakterii bioluminescencyjnych

Opracowaliśmy model uszkodzenia płuc myszy poprzez wstrzyknięcie do tchawicy bakterii Pseudomonas aeruginosa. Model ten naśladuje uszkodzenie płuc podczas zapalenia płuc i ma znaczenie kliniczne.

Pseudomonas aeruginosa Model indukowanego uszkodzenia płuc

W literaturze opisano kilka metod modelowania bakteryjnego zapalenia płuc u myszy. W niniejszym artykule opisano nieinwazyjną, niedrogą i szybką metodę wywoływania zapalenia płuc poprzez aspirację (tj. wdychanie) inokulum bakteryjnego pipetowanego do jamy ustnej i gardła. Szczegółowo opisano również dalsze metody oceny wrodzonej odpowiedzi immunologicznej płuc.

Nieinwazyjna i technicznie nieintensywna metoda indukcji i fenotypowania eksperymentalnego bakteryjnego zapalenia płuc u myszy

Opisano metodę wykrywania infekcji płuc u gryzoni immunokompetentnych. Przy wprawdzie metodę tę można szybko i łatwo przeprowadzić w celu wywołania stabilnego zakażenia wieloma izolatami S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae i A. baumannii.

Solidny model zapalenia płuc u immunokompetentnych gryzoni w celu oceny skuteczności przeciwbakteryjnej przeciwko S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa lub A. baumannii

Zakaźne zapalenie płuc jest jedną z najczęstszych infekcji u ludzi. Odpowiedni model in vivo ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia patogenezy choroby i testowania skuteczności nowych terapii. Dzięki temu mysiemu modelowi aspiracyjnego zapalenia płuc w jamie ustnej i gardle można zbadać patogenezę i nowe metody leczenia tych śmiertelnych infekcji.

Mysi model aspiracji jamy ustnej i gardła bakteryjnego zapalenia płuc związanego z respiratorem i nabytego w szpitalu

Ten protokół opisuje techniki pomiaru wyników infekcji leżących u podstaw wtórnych zakażeń szpitalnych w stanie immunosupresyjnym, najpierw poprzez ustalenie podwiązania/nakłucia jelita ślepego, a następnie prowokację ich infekcją donosową, aby stworzyć klinicznie istotny model sepsy immunosupresyjnej.

Projektowanie podwiązania i nakłucia jelita ślepego oraz podwójnego modelu infekcji donosowej immunosupresji wywołanej sepsą

Ten manuskrypt opisuje stworzenie zakaźnego modelu zapalenia płuc u myszy i odpowiednią charakterystykę leczenia urazów wraz z metodami hodowli bakterii i wkraplania dotchawiczego. Opisano również nowatorskie podejście wykorzystujące wysokowymiarową cytometrię przepływową do oceny krajobrazu immunologicznego.

Eksperymentalny model do oceny ustąpienia zapalenia płuc

Myszy są ogólnie odporne na infekcje Mycobacterium abscessus, co komplikuje odkrycie i opracowanie bardzo potrzebnych antybiotyków przeciwko infekcjom płuc. W tym miejscu opisujemy metodę przygotowania inokulum i zakażenia dotchawiczego, która, jak wykazano, zapewnia trwałą infekcję u myszy immunokompetentnych.

Przygotowanie Mycobacterium abscessus osadzonego w paciorkach agarowych w celu śródtchawiczego inokulacji myszy immunokompetentnych

Poznaj nieinwazyjną metodę inokulacji bakteryjnej w modelu mysim wtórnego zapalenia płuc. Technika umożliwia kontrolowane dostarczanie patogenów do dolnych dróg oddechowych oraz odzyskiwanie jednostek tworzących kolonie i RNA do analizy transkryptowej.

Precyzyjny system dostarczania i odzyskiwania patogenów dla mysich modeli wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc

Przeglądaj więcej filmów