Name: Wysokoprzepustowe multipleksowanie i transfekcja plazmidu DNA przy użyciu technologii akustycznego nanodozowania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 27 s
Description: Poznaj wysokoprzepustową metodę transfekcji DNA w komórkach ssaczych przy użyciu akustycznego nanodozowania. Technologia ta umożliwia testowanie 384 niezależnych warunków z niskimi kosztami reagentów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy ujawnili otrzymanie następującego wsparcia finansowego na badania, autorstwo i/lub publikację tego artykułu: Inserm, Uniwersytet w Lille, Instytut Pasteura w Lille, Conseil Régional du Nord, oraz PRIM-HCV1 i 2 (Pôle de Recherche Interdisciplinaire sur le Médicament), Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-EQPX-04-01), Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) i Wspólnota Europejska (ERC-STG INTRACELLTB n° 260901). Autorzy pragną podziękować dr S. Moureu, dr B. Villemagne, dr R. Ferru-Clémentowi i dr H. Groultowi za krytyczną recenzję i poprawki manuskryptu.

<ol><li>Colin, B., Deprez, B., Couturier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+DNA+Plasmid+Transfection+Using+Acoustic+Droplet+Ejection+Technology%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%3A+Advancing+Life+Sciences+R+%26+D%22%5BJournal%5D)">High-Throughput DNA Plasmid Transfection Using Acoustic Droplet Ejection Technology.</a> SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. , 2472555218803064(2018).</li>
<li>Mirus Bio. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Optimising+Transfection+Performance%22">Optimising Transfection Performance</a>. , (2019).</li>
<li>Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Factors+Influencing+Transfection+Efficiency+%7C+Thermo+Fisher+Scientific+-+FR%22">Factors Influencing Transfection Efficiency | Thermo Fisher Scientific - FR</a>. , https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/references/gibco-cell-culture-basics/transfection-basics/factors-influencing-transfection-efficiency.html (2019).</li>
<li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo%3A+polyethylenimine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).</li>
<li>Figueroa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanistic+investigation+exploring+the+differential+transfection+efficiencies+between+the+easy-to-transfect+SK-BR3+and+difficult-to-transfect+CT26+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">A mechanistic investigation exploring the differential transfection efficiencies between the easy-to-transfect SK-BR3 and difficult-to-transfect CT26 cell lines.</a> Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 36(2017).</li>
<li>Kirchenbuechler, I., Kirchenbuechler, D., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+cationic+lipid-based+transfection+and+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Correlation between cationic lipid-based transfection and cell division.</a> Experimental Cell Research. 345 (1), 1-5 (2016).</li>
<li>Zhang, Z., Qiu, S., Zhang, X., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+DNA+electroporation+for+primary+human+T+cell+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimized DNA electroporation for primary human T cell engineering.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), 4(2018).</li>
<li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+activity+and+the+mechanism+of+pDNA-complexes+based+on+the+hybrid+of+low-generation+PAMAM+and+branched+PEI-1.8k%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+bioSystems%22%5BJournal%5D)">Transfection activity and the mechanism of pDNA-complexes based on the hybrid of low-generation PAMAM and branched PEI-1.8k.</a> Molecular bioSystems. 9 (12), 3175-3186 (2013).</li>
<li>Bos, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+semi-automated+high+throughput+transient+transfection+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Development of a semi-automated high throughput transient transfection system.</a> Journal of Biotechnology. 180, 10-16 (2014).</li>
<li>Colosimo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+and+expression+of+foreign+genes+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Transfer and expression of foreign genes in mammalian cells.</a> BioTechniques. 29 (2), 314-318 (2000).</li>
<li>Villa-Diaz, L. G., Garcia-Perez, J. L., Krebsbach, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+transfection+efficiency+of+human+embryonic+stem+cells+by+the+incorporation+of+DNA+liposomes+in+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Enhanced transfection efficiency of human embryonic stem cells by the incorporation of DNA liposomes in extracellular matrix.</a> Stem Cells and Development. 19 (12), 1949-1957 (2010).</li>
<li>Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSabatini%2C+DM+%22Reverse+transfection+method%22">Reverse transfection method</a>. , WO2001020015A1(2001).</li>
<li>Raymond, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+polyethylenimine-mediated+transfection+process+for+large-scale+and+high-throughput+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+CA%29%22%5BJournal%5D)">A simplified polyethylenimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications.</a> Methods (San Diego, CA). 55 (1), 44-51 (2011).</li>
<li>Junquera, E., Aicart, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+gene+therapy+to+deliver+nucleic+acids+with+multivalent+cationic+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Recent progress in gene therapy to deliver nucleic acids with multivalent cationic vectors.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 233, 161-175 (2016).</li>
<li>Woodruff, K., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High-Throughput+Microfluidic+Platform+for+Mammalian+Cell+Transfection+and+Culturing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A High-Throughput Microfluidic Platform for Mammalian Cell Transfection and Culturing.</a> Scientific Reports. 6, 23937(2016).</li>
<li>Vasileiou, T., Foresti, D., Bayram, A., Poulikakos, D., Ferrari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+Contactless+Biology%3A+Acoustophoretic+DNA+Transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Toward Contactless Biology: Acoustophoretic DNA Transfection.</a> Scientific Reports. 6, 20023(2016).</li>
<li>Hadimioglu, B., Stearns, R., Ellson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+Liquids+with+Sound%3A+The+Physics+of+Acoustic+Droplet+Ejection+for+Robust+Laboratory+Automation+in+Life+Sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">Moving Liquids with Sound: The Physics of Acoustic Droplet Ejection for Robust Laboratory Automation in Life Sciences.</a> Journal of Laboratory Automation. 21 (1), 4-18 (2016).</li>
<li>Grant, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+accurate+compound+concentration+in+cell-based+screening%3A+validation+of+acoustic+droplet+ejection+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology.</a> Journal of Biomolecular Screening. 14 (5), 452-459 (2009).</li>
<li>Sackmann, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+That+Enable+Accurate+and+Precise+Nano-+to+Milliliter-Scale+Liquid+Dispensing+of+Aqueous+Reagents+Using+Acoustic+Droplet+Ejection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection.</a> Journal of Laboratory Automation. 21 (1), 166-177 (2016).</li>
<li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+protein+palette%3A+tools+for+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chemical Society Reviews. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li>
<li>Zielinski, D., Gordon, A., Zaks, B. L., Erlich, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPipet%3A+sample+handling+using+a+tablet%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">iPipet: sample handling using a tablet.</a> Nature Methods. 11 (8), 784-785 (2014).</li>
<li>Brunner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+dependence+of+gene+transfer+by+lipoplex%2C+polyplex+and+recombinant+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Cell cycle dependence of gene transfer by lipoplex, polyplex and recombinant adenovirus.</a> Gene Therapy. 7 (5), 401-407 (2000).</li>
<li>Nii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell-State+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Increases+Transfection+Efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22BioResearch+Open+Access%22%5BJournal%5D)">Single-Cell-State Culture of Human Pluripotent Stem Cells Increases Transfection Efficiency.</a> BioResearch Open Access. 5 (1), 127-136 (2016).</li>
<li>Noonan, D. J., Henry, K., Twaroski, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High-Throughput+Mammalian+Cell-Based+Transient+Transfection+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+Protocols%22%5BJournal%5D)">A High-Throughput Mammalian Cell-Based Transient Transfection Assay.</a> Signal Transduction Protocols. 284, 051-066 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Transfection+%7C+TransIT+Transfection+Reagents+%7C+Mirus+Bio%22">Transfection | TransIT Transfection Reagents | Mirus Bio</a>. , https://www.mirusbio.com/products/transfection (2015).</li>
<li>American Type Culture Collection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22General+protocol+for+transfection+of+stem+cells%2C+primary+cells%2C+and+continuous+cell+lines+with+ATCC+TransfeX+Transfection+Reagent%22">General protocol for transfection of stem cells, primary cells, and continuous cell lines with ATCC TransfeX Transfection Reagent</a>. , https://www.atcc.org/~/media/Transfection%20protocols/TransfeX/TransfeX%20General%20Protocol%20on%20letterhead.ashx (2017).</li>
<li>American Type Culture Collection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Transfection+Reagents+for+Nucleic+Acid+Transfer+into+ATCC+Cells%22">Transfection Reagents for Nucleic Acid Transfer into ATCC Cells</a>. , http://www.lgcstandards-atcc.org/~/media/PDFs/Marketing%20Material/Cell%20Biology/Transfection%20reagents%20for%20nucleic%20acid.ashx (2017).</li>
<li>de Los Milagros Bassani Molinas, M., Beer, C., Hesse, F., Wirth, M., Wagner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+transient+transfection+process+of+HEK-293+suspension+cells+for+protein+production+by+nucleotide+ratio+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimizing the transient transfection process of HEK-293 suspension cells for protein production by nucleotide ratio monitoring.</a> Cytotechnology. 66 (3), 493-514 (2014).</li>
<li>Promega. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22FuGENE%C2%AE+6+Transfection+Reagent%22">FuGENE® 6 Transfection Reagent</a>. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/fugene-6-transfection-reagent-protocol.pdf (2019).</li>
<li>Olden, B. R., Cheng, Y., Yu, J. L., Pun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+polymers+for+non-viral+gene+delivery+to+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%3A+Official+Journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Cationic polymers for non-viral gene delivery to human T cells.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 282, 140-147 (2018).</li>
<li>Park, E., Cho, H. B., Takimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+gene+delivery+into+adipose-derived+stem+cells%3A+transfection+of+cells+in+suspension+with+the+use+of+a+nuclear+localization+signal+peptide-conjugated+polyethylenimine%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Effective gene delivery into adipose-derived stem cells: transfection of cells in suspension with the use of a nuclear localization signal peptide-conjugated polyethylenimine.</a> Cytotherapy. 17 (5), 536-542 (2015).</li>
<li>Wood, R. W., Loomis, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physical+and+biological+effects+of+high-frequency+sound-waves+of+great+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22The+London%2C+Edinburgh%2C+and+Dublin+Philosophical+Magazine+and+Journal+of+Science%22%5BJournal%5D)">The physical and biological effects of high-frequency sound-waves of great intensity.</a> The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science. 4 (22), 417-436 (1927).</li>
<li>Eliminating Endotoxin at the Source - A Novel Competent Cell Line with Modified Lipopolysaccharide for Low-Endotoxin Plasmid Production. Mamat, U., et al. 28th Annual Symposium of the Protein Society, San Diego, CA, , (2014).</li>
<li>Ivanova, N. V., Kuzmina, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+dry+DNA+storage+and+shipment+at+room+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Resources%22%5BJournal%5D)">Protocols for dry DNA storage and shipment at room temperature.</a> Molecular Ecology Resources. 13 (5), 890-898 (2013).</li>
<li>Lesnick, J., Lejeune-Dodge, A., Ruppert, N., Jarman, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLesnick%2C+J+%22High-Precision+Cell+Dispensing+with+the+Labcyte+Echo%C2%AE+Liquid+Handler%22">High-Precision Cell Dispensing with the Labcyte Echo® Liquid Handler</a>. , https://www.labcyte.com/content/applications/high-precision-cell-dispensing-with-the-labcyte-echo-liquid-handler (2017).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+public+genome-scale+lentiviral+expression+library+of+human+ORFs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs.</a> Nature Methods. 8 (8), 659-661 (2011).</li>
<li>Peng, J., Zhou, Y., Zhu, S., Wei, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screens+in+mammalian+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+journal%22%5BJournal%5D)">High-throughput screens in mammalian cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> The FEBS journal. 282 (11), 2089-2096 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opracowanie i optymalizacja dokładnej, wysokoprzepustowej metody transfekcji dla danej linii komórkowej wymaga od naukowców przestrzegania kilku kluczowych parametrów opisanych w tej sekcji. Zdecydowanie zalecamy rozpoczęcie od zalecanych wartości w całym protokole, ponieważ te ustawienia zoptymalizowane pod kątem komórek HeLa okazały się również skuteczne w przypadku komórek HEK. Ponieważ jednak najlepsze parametry mogą zależeć od linii komórkowych i odczynników do transfekcji, optymalne warunki można określić, zmieniaj...

Metoda przedstawiona w niniejszym opracowaniu szczegółowo opisuje sposób przeprowadzania multipleksowania plazmidowego DNA oraz transfekcji w komórkach ssaków w wysokiej przepustowości przy użyciu akustycznego nanodozownika cieczy w płytce 384-dołkowej, dostępny nawet dla osób niebędących specjalistami w tej dziedzinie. Ta niedawno opublikowana metoda1 pozwala na przeprowadzenie do 384 niezależnych warunków multipleksowania i transfekcji plazmidowego DNA w jednym eksperymencie w czasie krótszym niż 1 h. Eksperymenty z transfekcją pojedynczą lub kotransfekcją zakończyły się sukcesem, osiągając niemal 10% kotransfekcji w populacji komórek transfekowanych. Niniejszy protokół ułatwia transfekcję, ponieważ większość żmudnych, czasochłonnych i podatnych na błędy etapów jest obecnie sterowana programowo (ogólny przegląd przedstawiono na Rysunku 1). Podjęto dalsze starania w celu opracowania dedykowanych narzędzi, które zwiększą łatwość obsługi, unikając błędów ludzkich podczas całego procesu i promując udaną transfekcję nawet w przypadku osób niebędących specjalistami w tej dziedzinie. Opisany protokół zawiera opracowany przez nas „przyjazny dla użytkownika” arkusz kalkulacyjny z makrem, który służy do zarządzania 384 niezależnymi warunkami transfekcji z możliwością multipleksowania do czterech plazmidów w każdym dołku. Makro automatycznie generuje szablony płytki (płytek) źródłowych w celu pobrania oczekiwanej objętości plazmidu DNA z roztworów stokowych oraz pliki niezbędne do sterowania oprogramowaniem nanodozownika na podstawie wprowadzonych założeń eksperymentalnych. Ponieważ ręczne dozowanie DNA do 384-dołkowej płytki źródłowej jest żmudne i podatne na błędy, opracowaliśmy również dedykowaną aplikację tabletową, która prowadzi użytkownika podczas dozowania roztworu DNA zgodnie z szablonem.
<img alt="Schemat procesu projektowania eksperymentu: generowanie list wyboru, przygotowanie płytek, etapy transfekcji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59570/59570fig1v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Schemat badawczy. Schematyczny przedstawienie optymalnego zautomatyzowanego protokołu wysokoprzepustowej transfekcji odwrotnej (od projektu eksperymentalnego do niestandardowego testu biologicznego). Kroki wykonywane ręcznie są oznaczone symbolem dłoni, a przybliżony czas każdego etapu zapisano w czerwonej ramce. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59570/59570fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Wiele eksperymentów opartych na komórkach rozpoczyna się od transfekcji plazmidowego DNA, a mimo że opracowano i wciąż opracowuje się wiele dedykowanych odczynników w celu zwiększenia wydajności transfekcji i/lub ułatwienia procedury, wiele kwestii pozostaje do rozwiązania2,3,4. Transfekcja komórek plazmidowym DNA składa się z kilku etapów niezbędnych do osiągnięcia wysokiej wydajności, takich jak początkowe pobranie kompleksu, ucieczka z endosomów oraz transport cytoplazmatyczny do jądra5,6. Oprócz wytrącania wapniowego lub technik fizycznych, takich jak elektroporacja czy mikroiniekcja przy użyciu specjalistycznych urządzeń7, nowoczesne metody chemiczne koncentrują się na zwiększeniu dostarczania DNA do komórek przy jednoczesnym obniżeniu cytotoksyczności8,9. Zastosowanie lipidów lub polimerów kationowych tworzących kompleksy przypominające liposomy, a w ostatnim czasie nie-liposomalnych polimerowych systemów chemicznych, uczyniło transfekcję łatwiejszą i bardziej wydajną10. Pomimo tych postępów, transfekcja komórek nadal wymaga specyficznych umiejętności, aby została przeprowadzona dokładnie, ponieważ większość tych fizycznych lub chemicznych protokołów transfekcji wymaga od naukowców ręcznego przygotowania każdego warunku reakcji transfekcji DNA, co ogranicza przepustowość. Aby rozwiązać ten problem, opracowano protokoły transfekcji odwróconej z wykorzystaniem chemicznych odczynników do transfekcji1,12,13, co pozwala użytkownikowi na szybsze testowanie lub łączenie kilku plazmidów. W protokołach tych kompleksy kwasów nukleinowych z odczynnikami do transfekcji są tworzone przed wysianiem komórek na te kompleksy. Jednak protokoły odwrócone są nadal ograniczone przez ręczne manipulowanie roztworami DNA oraz konieczność łączenia każdego z niezależnych warunków. Choć możliwe jest ich przeprowadzenie w formacie płytki 96-dołkowej, przygotowanie i dozowanie DNA jest żmudne i prawdopodobnie dojdzie do błędów. Gdy wymagane są różne ilości kilku plazmidów DNA i są one ze sobą multipleksowane, transfekcja komórek staje się jeszcze trudniejsza do osiągnięcia i bardziej czasochłonna, a błędy ludzkie stają się niemal nieuniknione. Skalowanie do formatu płytki 384-dołkowej w podejściu transfekcji odwróconej, mimo niewielkiej liczby multipleksowanych warunków transfekcji DNA, staje się wyzwaniem niemożliwym do pokonania z następujących powodów: i) ilości DNA, odczynnika do transfekcji lub objętości mieszaniny reakcyjnej do zarządzania są mniejsze niż 1 µL dla każdego dołka. ii) Multipleksowanie plazmidów dla 384 niezależnych warunków staje się niezwykle skomplikowane. Dostarczanie do każdego z 384 dołków jest również iii) bardzo czasochłonne i iv) podatne na błędy. W rzeczywistości dozowanie odpowiedniego roztworu do oczekiwanych dołków jest trudne do kontrolowania, ponieważ dozowane niskie objętości nie pozwalają na wizualne monitorowanie różnicy między dołkami pustymi a już wypełnionymi. v) Wreszcie, istnieje wysokie ryzyko wyschnięcia mieszaniny wskutek odparowania przed dodaniem komórek ze względu na czas potrzebny do wykonania niezbędnych kroków dozowania. Podsumowując, czynnikiem ograniczającym ustanowienie wysokoprzepustowych testów transfekcji plazmidowego DNA wydaje się być miniaturyzacja analizy, co wiąże się z multipleksowaniem niskich objętości, którego nie można już obsługiwać ręcznie, a które jest również trudne do wiarygodnego osiągnięcia za pomocą klasycznych perystaltycznych systemów dozowania cieczy.
Dowodem na trudności z automatyzacją takich testów i osiągnięciem wysokiej przepustowości jest fakt, że do tej pory opublikowano jedynie kilka prób automatyzacji transfekcji: format płytki 96-dołkowej z wykorzystaniem komercyjnego urządzenia do obsługi cieczy i wytrącania fosforanu wapnia14, a ostatnio odczynnika lipopleksowego oraz chipu mikroprzepływowego umożliwiającego 280 niezależnych transfekcji15, co jednak wymaga specjalistycznej wiedzy w tej dziedzinie. Inna metoda, akustoforeza, umożliwiająca lewitację cieczy i prowadząca do manipulacji oraz mieszania płynów, została wykorzystana do przeprowadzania transfekcji DNA w formatach płytek od 24 do 96 dołków16. Choć podejście to jest wykonalne, cechuje się ono niezwykle niską przepustowością, ponieważ mieszanie komórek z mieszaniną do transfekcji DNA wymaga 60 s inkubacji dla każdego pojedynczego punktu przed wysianiem. Oznacza to czas trwania wynoszący co najmniej 96 min dla pełnej płytki 96-dołkowej. Co więcej, protokół ten jest daleki od bycia dostępnym dla ogółu biologów, ponieważ prace te wykonano za pomocą urządzenia zaprojektowanego i wyprodukowanego wewnętrznie, które obecnie nie jest dostępne na rynku. Z drugiej strony w ciągu ostatnich kilku lat pojawiła się łatwa w użyciu, sterowana programowo technologia dozowania oparta na akustyce z urządzeniami do dozowania nanobioobjętości. Wykorzystując skupioną energię akustyczną, urządzenia te pozwalają na ściśle kontrolowany wyrzut małych objętości cieczy od 2,5 nL do 50 nL z płytki źródłowej do płytki docelowej17. Technologia ta, zwana akustycznym wyrzutem kropel (ADE), ma liczne zalety: jest w pełni zautomatyzowana, bezkontaktowa, nie wymaga końcówek, jest dokładna, precyzyjna, wysoce powtarzalna i charakteryzuje się wysoką przepustowością18. Pierwotnie przeznaczone do dostarczania roztworów dimetylosulfoksydu (DMSO), ustawienia zostały ulepszone, aby umożliwić dozowanie buforów wodnych19. Akustyczne nanodozowniki wydają się zatem odpowiednie dla protokołów odwrotnej transfekcji komórek i mogłyby ominąć większość wyżej wymienionych ograniczeń manualnych. Ponieważ wcześniej nie opisano prób transfekcji plazmidowej przy użyciu tej technologii, niedawno oceniliśmy przydatność systemu dozowania opartego na akustyce do przeprowadzania odwrotnej transfekcji komórek.
Wykorzystując wysoką wydajność i łatwość obsługi nanodozownika, zoptymalizowaliśmy protokół odwrotnej transfekcji dla komórek HeLa poprzez testowanie krzyżowe kilku parametrów, które mogą wpływać na transfekcję DNA na jednej płytce 384-dołkowej, a mianowicie: całkowitej ilości DNA i początkowego stężenia DNA źródłowego, objętości rozcieńczalnika, odczynnika do transfekcji oraz liczby rozsianych komórek. Opracowany protokół omija opisane powyżej ograniczenia manualnej transfekcji komórek i wykazuje kilka zalet w porównaniu z innymi próbami automatycznej transfekcji. Po pierwsze, jest on zminiaturyzowany, co pozwala na kosztową efektywność poprzez oszczędność preparatów plazmidów DNA i odczynników do transfekcji. Po drugie, charakteryzuje się znacznie większą przepustowością i powtarzalnością niż protokół manualny (nawet dla osób początkujących), ponieważ transfekcja całej płytki 384-dołkowej może zostać przeprowadzona w czasie krótszym niż 1 h. Wreszcie, proces jest sterowany programowo, co umożliwia kontrolę ilości dozowanego DNA oraz multipleksowanie kilku plazmidów. Rzeczywiście, dzięki oprogramowaniu nanodozownika (Tabela materiałów), użytkownik może opracować plan badania w celu kontrolowania objętości dozowanych z określonej płytki źródłowej do płytki docelowej.
Przedstawiony tutaj protokół jest przeznaczony przede wszystkim dla osób mających dostęp do nanodystrybutora i chcących przeprowadzić eksperymenty transfekcyjne wysokoprzepustowe, ale także dla tych, którzy chcą szybko zoptymalizować parametry transfekcji dla konkretnego typu komórek, stosując ten protokół do wysokoprzepustowego testowania krzyżowego kilku parametrów. Wykazaliśmy, że zoptymalizowane parametry zidentyfikowane za pomocą tego protokołu w nanoskali mogą być przeniesione do manualnych eksperymentów transfekcyjnych na większą skalę. Ponadto, ponieważ odczynnik do transfekcji użyty w niniejszym protokole umożliwia transfekcję DNA lub siRNA zgodnie z informacją producenta, protokół ten jest interesujący również dla osób dążących do zastosowania podejścia macierzowego w celu nadekspresji lub wyciszenia genów. Płytki docelowe wypełnione wcześniej DNA mogą być przechowywane do 7 dni przed użyciem w teście transfekcyjnym bez utraty skuteczności, co stanowi kolejną zaletę następującego protokołu w tego rodzaju zastosowaniach.

<table><tbody><tr><td>384LDV Microplate</td><td>Labcyte</td><td>LP-0200</td><td></td></tr><tr><td>384-dołkowa mikropłytka &mu; Przezroczysty</td><td>Greiner</td><td>781906</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Sigma</td><td>A9393-5G</td><td>Selection antybiotyk na bakterie transformowane za pomocą wektora ekspresji ampiciliny</td></tr><tr><td>Tablet z systemem Android Samsung</td><td></td><td>Galaxy Note 8</td><td>służy do prowadzenia użytkownika podczas ręcznego dozowania płytki źródłowej</td></tr><tr><td>Aniospray Surf 29</td><td>Anios</td><td>2421073</td><td>środek dezynfekujący do czyszczenia głowicy MicroFlo</td></tr><tr><td>Columbus oprogramowanie</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>oprogramowanie do analizy obrazu</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), wysoka zawartość glukozy, suplement GlutaMAX, pirogronian</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10566032</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Echo Cherry Pick 1.5.3</td><td>Oprogramowanie Labcyte</td><td></td><td>umożliwiające dozowanie oparte na ADE przez urządzenie Echo550 z pliku *.csv; oprogramowanie nanodozownika</td></tr><tr><td>Echo550</td><td>Labcyte</td><td></td><td>Dozownik na bazie ADE</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td><td>do dodawania do pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Roztwór formaliny, neutralnie buforowany, 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>do utrwalania</td></tr><tr><td>komórek HeLa</td><td>ATCC</td><td>HeLa (ATCC&reg; CCL-2&handel ;)</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, trichlorowodorek, trójwodny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>10 mg/ml roztwór w wodzie</td></tr><tr><td>INCell Analyzer 6000</td><td>GE Healthcare</td><td>29043323</td><td>zautomatyzowana laserowa platforma obrazowania konfokalnego</td></tr><tr><td>LB medium</td><td>Thermoischer Scientific LB Bulion Base (Lennox L Broth Base)&reg;, proszek</td><td>12780052</td><td>pożywka hodowlana do rozwoju</td></tr> <tr><td>bakteriiBufor do lizy (A2)&nbsp;</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740912.1</td><td>Bufor z zestawu NucleoSpin Plasmid służący do przygotowania plazmidu z hodowli bakteryjnej</td></tr><tr><td>MicroFlo 10&micro; Kaseta L</td><td>Biotek Instruments Inc</td><td>7170013</td><td>do użytku z dozownikiem Microflo</td></tr><tr><td>MicroFlo 1&mu; Kaseta L</td><td>Biotek Instruments Inc</td><td>7170012</td><td>do użytku z dozownikiem</td></tr><tr><td>Microflo Dozownik MicroFlo</td><td>Biotek Instruments Inc</td><td>7171000</td> urządzenie <td>do obsługi cieczy oparte na pompie perystaltycznej</td></tr><tr><td>Spektrofotometr mikroobjętościowy Spektrofotometr</td><td>Denovix</td><td>DS-11</td><td>Zmierz stężenie DNA w próbkach</td></tr><tr><td>plazmidu</td> <td>mVenuscDNA mVenus sklonowano przez enzymatyczne trawienie restrykcyjne i ligację w miejscach Age1/BsrG1 plazmidu tdTomato-N1</td><td>Typ wektora: Ekspresja ssaków, Białko fuzyjne:</td>Bufor neutralizacyjny mVenus (A3)&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td>Macherey-Nagel</td><td>740913.1</td><td>Bufor z zestawu plazmidowego NucleoSpin służący do przygotowania plazmidu z hodowli bakteryjnej</td></tr><tr><td>Zestaw plazmidu NucleoSpin</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740588.50</td><td>służy do przygotowania plazmidu z hodowli bakteryjnej</td></tr><tr><td>Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>opcjonalnie bufor do płukaniaBufor do płukania (A4)</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740914.1</td><td>Bufor z zestawu plazmidowego NucleoSpin służący do przygotowania plazmidu z wytrząsarki orbitalnej z hodowli bakteryjnej</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>inkubowana wytrząsarka o dużej pojemności</td><td>444-7084</td><td>Służy do hodowli bakterii pod delikatnym mieszaniem i 37&deg; C</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>10 000 U/ml</td></tr><tr><td>soli fizjologicznej buforowanej fosforanami</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010001</td><td></td></tr><tr><td>Minikolumny plazmidowe</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740499.250</td><td>Minikolumna membrany krzemionkowej do przygotowania plazmidu z kultury bakteryjnej</td></tr><tr><td>Bufor do ponownego zawieszania (A1)&nbsp;</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740911.1</td><td>Bufor z zestawu plazmidowego NucleoSpin służący do przygotowania plazmidu z kultury bakteryjnej</td></tr><tr><td>RNAzy A</td><td>Enzym Macherey-Nagel</td><td>740505</td><td>z zestawu plazmidowego NucleoSpin używany do przygotowania plazmidu z hodowli bakteryjnej</td></tr><tr><td>plazmid tdTomato-N1</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #54642</td><td>Typ wektora: Ekspresja ssaków, Białko fuzyjne: tdPomidor&nbsp;</td></tr><tr><td>TransIT-X2 Dynamic Delivery System</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 6000</td><td></td></tr><tr><td>Wash Buffer (AW)</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740916.1</td><td>Bufor z zestawu NucleoSpin Plasmid służący do przygotowania plazmidu z kultury bakteryjnej</td></tr><tr><td>Drukarka 3D</td><td>Creality</td><td>CR10S</td><td>służąca do drukowania adaptera płyty</td></tr><tr><td>Blender Software&nbsp;</td><td>&nbsp; https://www.blender.org/ Wolne oprogramowanie na licencji GNU General Public License (GPL).</td><td>Wersja 2.79b</td><td>służąca do projektowania adaptera płyty</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowe multipleksowanie i transfekcja plazmidu dna przy użyciu technologii akustycznego nanodozowania

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

Transfekcja komórek, niezbędna dla wielu badań biologicznych, wymaga kontrolowania wielu parametrów dla dokładnego i udanego osiągnięcia. Najczęściej wykonywana przy niskiej przepustowości, jest ponadto czasochłonna i podatna na błędy, tym bardziej w przypadku multipleksowania kilku plazmidów. Opracowaliśmy łatwą, szybką i dokładną metodę transfekcji komórek w układzie płytek 384-dołkowych przy użyciu technologii akustycznego wyrzucania kropel (ADE). Nanodozownik zastosowany w tym badaniu jest oparty na tej technologii i umożliwia precyzyjne dostarczanie nanoobjętości z dużą prędkością z płytki dołka źródłowego do płytki docelowej. Może dozować i multipleksować DNA i odczynnik do transfekcji zgodnie z wcześniej zaprojektowanym arkuszem kalkulacyjnym. Poniżej przedstawiamy optymalny protokół do wykonywania wysokoprzepustowej transfekcji plazmidowej opartej na ADE, który umożliwia osiągnięcie skuteczności do 90% i prawie 100% kotransfekcji w eksperymentach kotransfekcji. Rozszerzamy początkowe prace, proponując przyjazne dla użytkownika makro oparte na arkuszu kalkulacyjnym, które jest w stanie zarządzać maksymalnie czterema plazmidami/studzienkami z biblioteki zawierającej do 1536 różnych plazmidów, oraz aplikację do pipetowania opartą na tabletkach. Makro projektuje niezbędne szablony płytek źródłowych i generuje gotowe do użycia pliki dla nanodyspensera i aplikacji na tablety. Czteroetapowy protokół transfekcji obejmuje i) dozowanie rozcieńczalnika za pomocą klasycznego płynu, ii) dystrybucję plazmidu i multipleksowanie, iii) dozowanie odczynnika do transfekcji za pomocą nanodozownika oraz iv) posiewanie komórek na wstępnie napełnionych studzienkach. Opisana programowa kontrola multipleksowania i transfekcji plazmidów ADE pozwala nawet laikom w tej dziedzinie na wykonanie niezawodnej transfekcji komórek w szybki i bezpieczny sposób. Metoda ta umożliwia szybką identyfikację optymalnych ustawień dla danego typu ogniwa i może być transponowana do metod na większą skalę i ręcznych. Protokół ułatwia zastosowania, takie jak ekspresja ludzkiego białka ORFeome (zestaw otwartych ramek odczytu [ORF] w genomie) lub walidacja funkcji genów w oparciu o CRISPR-Cas9, w niezbiorczych strategiach przesiewowych.

Aby ustalić, czy technologia ADE może być wykorzystana w zautomatyzowanym protokole transfekcji odwrotnej, monitorowaliśmy wydajność transfekcji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, używając plazmidu ekspresującego czerwoną fluorescencyjną białkę tdTomato. W pierwszej kolejności, w celu wyznaczenia optymalnych parametrów transfekcji, przeprowadzono testy krzyżowe różnych objętości rozcieńczalnika oraz całkowitych ilości DNA. Zastosowano objętość rozcieńczalnika, aby krople DNA ...

Ten protokół opisuje wysokoprzepustową transfekcję plazmidową komórek ssaków na płytce 384-dołkowej przy użyciu technologii akustycznego wyrzucania kropel. Czasochłonne, podatne na błędy dozowanie i multipleksowanie DNA, ale także dozowanie odczynników do transfekcji, są sterowane programowo i wykonywane przez urządzenie nanodozujące. Komórki są następnie wysiewane w tych wstępnie wypełnionych studzienkach.

Wysokoprzepustowe multipleksowanie i transfekcja plazmidu DNA przy użyciu technologii akustycznego nanodozowania

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

Protokół transfekcji oparty na NanoDispenser, opracowany w celu opisania w tym filmie, stanowi pierwszą przyjazną dla użytkownika, wysokowydajną metodę transfekcji, która pozwala odnieść sukces nawet początkującym w tej dziedzinie. Jest to łatwe w użyciu technika o wysokiej przepustowości, która umożliwia transfekcję komórki z niezależnym warunkiem 384. Obecnie metoda jest tania ze względu na potrzebną nanoobjętość odczynnika.Aby określić najlepsze parametry transfekcji dla wszystkich typów komórek, sugerujemy utrzymanie stałego stężenia źródłowego DNA i stosowanie różnych ilości transfekowanego DNA, odczynnika do transfekcji i liczby komórek. Aby dozować zawiesinę komórkową o pojemności 40 mikrolitrów, należy zamontować kasetę o pojemności 10 mikrolitrów na urządzeniu do obsługi cieczy perystaltycznej i przygotować odpowiedni program. Po pierwsze, dostosuj parametr natężenia przepływu do niskiego, aby dozować ogniwa z niską prędkością, aby uniknąć potencjalnego uszkodzenia komórek przez zwykłe naprężenia i duży wpływ na dno studni.Następnie dostosuj wysokość dozowania do 11,43 milimetra. Wysokość musi być wystarczająco wysoka, aby zmniejszyć wpływ komórek na dno studzienek podczas

high-throughput-dna-plasmid-multiplexing-transfection-using-acoustic

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Przedstawiamy nowatorską i wydajną integrację nanofotoniki (QD-FRET) oraz mikrofluidyki w celu zbadania procesu tworzenia polipreksów polielektrolitowych, co w przyszłości powinno zapewnić lepszą kontrolę oraz syntezę jednorodnych i dostosowanych do potrzeb polipreksów stosowanych w terapiach opartych na kwasach nukleinowych.

Połączenie QD-FRET i mikroprzepływowości w celu monitorowania samoorganizacji nanokompleksów DNA w czasie rzeczywistym

Przedstawiamy podejście mikrofluidyczne do ekspresji macierzy białkowych. Urządzenie składa się z tysięcy komór reakcyjnych sterowanych za pomocą mikromechanicznych zaworów. Urządzenie mikrofluidyczne jest połączone z biblioteką genów naniesioną w formie mikromacierzy. Geny te są następnie transkrybowane i translacyjne bezpośrednio na chipie, co pozwala na otrzymanie macierzy białkowej gotowej do zastosowań eksperymentalnych.

Generator wysokoprzepustowej ekspresji białek z wykorzystaniem platformy mikroprzepływowej

Ten film demonstruje technikę dostarczania kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9-sgRNA do komórek docelowych w celu edycji genomu za pomocą nanoostrzy. Nanoostrza to cząsteczki wirusopodobne pozbawione zdolności do namnażania się i infekowania sąsiednich komórek, dlatego są bardzo przydatne do szybkiego i zależnego od dawki transportu bio- i nanomateriałów.

Dostarczanie kwasu nukleinowego w oparciu o nanoostrza: technika dostarczania kompleksu Cas9-sgRNA do komórek docelowych za pośrednictwem cząstek wirusopodobnych

Opisano protokół analizy śledzenia nanocząstek (NTA) i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej do oceny nanocząstek dostarczających geny polimerowe. NTA wykorzystuje się do scharakteryzowania rozkładu wielkości cząstek nanocząstek i rozkładu plazmidu na cząstkę. Wysokoprzepustowa cytometria przepływowa umożliwia ilościową ocenę skuteczności transfekcji dla biblioteki biomateriałów dostarczających geny.

Ocena nanocząstek dostarczających geny polimerowe za pomocą analizy śledzenia nanocząstek i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej

Platforma elektroporacji wspomagana wirami mikroprzepływowymi została opracowana do sekwencyjnego dostarczania wielu cząsteczek do identycznych populacji komórek z precyzyjną i niezależną kontrolą dawkowania. Etap oczyszczania komórek docelowych w oparciu o rozmiar, poprzedzający elektroporację, przyczynił się do zwiększenia wydajności dostarczania molekularnego i żywotności komórek przetworzonych.

Mikroskalowy elektroporator wspomagany wirami do sekwencyjnego dostarczania molekularnego

Opisujemy cyfrowy test końcowy do ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych za pomocą uproszczonego (analogowego) odczytu. Mierzymy fluorescencję masową kropelkowych testów cyfrowych za pomocą standardowej maszyny qPCR, a nie specjalistycznego oprzyrządowania, i potwierdzamy nasze wyniki za pomocą mikroskopii.

Prosty masowy odczyt cyfrowych testów ilościowych kwasów nukleinowych

Adsorpcja peptydów na plastikowych naczyniach podczas tradycyjnych seryjnych rozcieńczeń na bazie końcówek może znacząco wpłynąć na określenie siły działania i zakłócić zrozumienie zależności struktura-aktywność używanych do identyfikacji ołowiu i optymalizacji ołowiu w fazach odkrywania leków. W tym miejscu opisano metody automatycznego akustycznego bezkontaktowego seryjnego rozcieńczania próbek peptydów.

Zautomatyzowane dozowanie akustyczne do seryjnego rozcieńczania agonistów peptydów w testach oznaczania siły działania

Tutaj prezentowany jest zautomatyzowany przepływ pracy do wykonywania modułowego montażu "urządzenia" DNA przy użyciu modułowej metody klonowania DNA na robotach obsługujących ciecze. Protokół wykorzystuje intuicyjne narzędzie programowe do generowania list wyboru osób zajmujących się cieczami do kombinatorycznego generowania biblioteki urządzeń DNA, które demonstrujemy za pomocą dwóch platform do obsługi cieczy.

Zautomatyzowany zrobotyzowany montaż modułowych urządzeń DNA do obsługi cieczy

Sekwencjonowanie pojedynczych komórek ujawnia niejednorodność genotypową w systemach biologicznych, ale obecnym technologiom brakuje przepustowości niezbędnej do głębokiego profilowania składu i funkcji społeczności. W tym miejscu opisujemy mikroprzepływowy przepływ pracy do sekwencjonowania &gt;50 000 genomów jednokomórkowych z różnych populacji komórek.

Ultraprzepustowa platforma mikroprzepływowa do sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki

Ten protokół opisuje montaż i działanie taniego urządzenia akustofluidycznego do szybkiego dostarczania molekularnego do komórek poprzez sonoporację wywołaną przez ultradźwiękowe środki kontrastowe.

Montaż i eksploatacja urządzenia akustyczno-fluidycznego w celu lepszego dostarczania związków molekularnych do komórek

Ten protokół opisuje zminiaturyzowaną edycję genomu CRISPR–Cas9 receptora TCRα/β w pierwotnych ludzkich komórkach T za pomocą ‘DMF-ekcji’, platformy elektroporacji cyfrowych mikrofluidów (DMF). Metoda umożliwia równoległą edycję genów z małym zapotrzebowaniem na wysoką żywotność i jest ponadto przystosowana do dostarczania mRNA do wielowarstwowymi 3D kulistości.

Platforma elektroporacji cyfrowej mikrofluidycznej do edycji genomu CRISPR z niskim wejściem i transfekcji mRNA w zawiesinach limfocytów T oraz modelach komórkowych 3D

Poznaj wysokoprzepustową metodę transfekcji DNA w komórkach ssaczych przy użyciu akustycznego nanodozowania. Technologia ta umożliwia testowanie 384 niezależnych warunków z niskimi kosztami reagentów.

Wysokoprzepustowe multipleksowanie i transfekcja plazmidu DNA przy użyciu technologii akustycznego nanodozowania

Przeglądaj więcej filmów