Wysokoprzepustowe multipleksowanie i transfekcja plazmidu DNA przy użyciu technologii akustycznego nanodozowania
8 sierpnia 2019
Ten protokół opisuje wysokoprzepustową transfekcję plazmidową komórek ssaków na płytce 384-dołkowej przy użyciu technologii akustycznego wyrzucania kropel. Czasochłonne, podatne na błędy dozowanie i multipleksowanie DNA, ale także dozowanie odczynników do transfekcji, są sterowane programowo i wykonywane przez urządzenie nanodozujące. Komórki są następnie wysiewane w tych wstępnie wypełnionych studzienkach.
Protokół transfekcji oparty na NanoDispenser, opracowany w celu opisania w tym filmie, stanowi pierwszą przyjazną dla użytkownika, wysokowydajną metodę transfekcji, która pozwala odnieść sukces nawet początkującym w tej dziedzinie. Jest to łatwe w użyciu technika o wysokiej przepustowości, która umożliwia transfekcję komórki z niezależnym warunkiem 384. Obecnie metoda jest tania ze względu na potrzebną nanoobjętość odczynnika.
Aby określić najlepsze parametry transfekcji dla wszystkich typów komórek, sugerujemy utrzymanie stałego stężenia źródłowego DNA i stosowanie różnych ilości transfekowanego DNA, odczynnika do transfekcji i liczby komórek. Aby dozować zawiesinę komórkową o pojemności 40 mikrolitrów, należy zamontować kasetę o pojemności 10 mikrolitrów na urządzeniu do obsługi cieczy perystaltycznej i przygotować odpowiedni program. Po pierwsze, dostosuj parametr natężenia przepływu do niskiego, aby dozować ogniwa z niską prędkością, aby uniknąć potencjalnego uszkodzenia komórek przez zwykłe naprężenia i duży wpływ na dno studni.
Następnie dostosuj wysokość dozowania do 11,43 milimetra. Wysokość musi być wystarczająco wysoka, aby zmniejszyć wpływ komórek na dno studzienek podczas procesu dozowania, ale wystarczająco niska, aby uniknąć zatrzymywania kropel na głowicy dozującej. Następnie wyreguluj wysokość wolnej płytki do 16 milimetrów, aby umożliwić swobodne przemieszczenie głowicy dozującej nad płytą po dozowaniu każdego rzędu.
Kontroluj wizualnie prawidłowe ustawienia wysokości głowicy urządzenia do obsługi cieczy perystaltycznej. Upewnij się, że podczas dozowania żadne krople nie są zatrzymywane na końcówkach dozujących. Sprawdź również, czy głowica jest wystarczająco wysoka, aby umożliwić przemieszczenie głowicy po dozowaniu każdego rzędu.
Aby wygenerować listy wyboru do sterowania dyspensacją ADE, opracowano przyjazne dla użytkownika makro arkusza kalkulacyjnego do zarządzania ilościami DNA i mieszania do czterech plazmidów w formacie płytki 384-dołkowej. Optymalne woluminy są wstępnie wypełnione w niektórych komórkach arkusza kalkulacyjnego, ale można je zmienić. W różowych polach odczynnik do transfekcji lub wartość mieszaniny TR jest ustawiony na 500 nanolitrów.
Minimalna wartość objętości w studzienkach płytki źródłowej jest ustawiona na cztery mikrolitry, a maksymalna objętość w studzienkach płytki źródłowej na 11,25 mikrolitrów. Wprowadź początkowe stężenia 100 nanogramów na mikrolitr DNA w niebieskich polach odpowiadających leżącemu poniżej DNA. Następnie wprowadź żądaną ilość DNA w szarych i zielonych polach odpowiadających 384 dołkom płytki.
Wprowadź ilości i nazwy plazmidów i upewnij się, że ta sama pisownia jest używana, jeśli ten sam plazmid musi zostać transfekowany w kilku studzienkach. Kliknij na generuj listy wyboru, aby zweryfikować wprowadzone wartości, a w razie potrzeby popraw wypełnione na pomarańczowo komórki wskazujące błędy lub objętości, których nie może obsłużyć NanoDispenser. Jeśli nie zostaną wykryte, makro wygeneruje przewodnik dozowania 384 dołków, plik listy wyboru DNA i plik listy wyboru TR na podstawie danych zebranych na odpowiednich arkuszach.
Wydrukuj szablon z arkusza płyty źródłowej, aby zobrazować studzienki, które należy napełnić przed dozowaniem. Wskazane są nazwy plazmidów i minimalne objętości wypełnienia. Objętości mieszaniny odczynników do transfekcji, które zostaną wypełnione w następujących studzienkach, są oznaczone jako TR i podświetlone na zielono.
Aby przygotować płytkę źródłową DNA, rozcieńczyć przechowywany plazmid DNA do 100 nanogramów na mikrolitr za pomocą wody destylowanej. Teraz skalibruj siatkę 384 dołków do wymiarów płytki. Otwórz aplikację 384 Well Pipetting Guide na tablecie.
Umieść miejsce źródłowe na siatce na dolnym ekranie. W lewym górnym menu kalibracji kliknij plus lub minus, aby zwiększyć lub zmniejszyć rozmiar siatki i dołków, aby dostosować zielone dołki do czterech narożnych dołków płytki. Za pomocą taśmy dwustronnej zamontuj adapter płyty drukowanej w 3D na ekranie, aby uniknąć ruchów płyty źródłowej podczas dozowania.
W razie potrzeby przesuń skalibrowaną siatkę za pomocą strzałek obrotu oraz przycisków w górę, w dół, w prawo i w lewo, aby dostosować siatkę do pozycji płyty. Gdy rozmiary siatki i studni zostaną prawidłowo skalibrowane i zlokalizowane, zaznacz pole kalibracji zamka. Kliknij plik i otwórz 384-Wells-Pipetting-Guide.
Plik csv. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby ręcznie dozować wskazaną objętość plazmidu o określonym stężeniu do podświetlonej na biało studzienki, która odpowiada właściwemu miejscu docelowemu oczekiwanej płytki. Użyj strzałek minus lub plus, aby cofnąć się lub przejść dalej w procesie dozowania DNA.
Przerwij dozowanie po dotarciu do pierwszego roztworu odczynnika do transfekcji, który ma zostać załadowany. Po zakończeniu dozowania DNA wyjmij płytkę źródłową z adaptera. Jeśli ma zostać napełnionych kilka płytek źródłowych, umieść nową płytkę źródłową na adapterze i postępuj zgodnie z instrukcjami dozowania.
Odwirować płytki źródłowe wypełnione DNA, aby zapewnić prawidłowe wyrównanie cieczy i usunąć pęcherzyki prowadzące do niedokładności w przenoszeniu zasad ADE. Teraz przeprowadź ankietę, aby kontrolować ręcznie dozowane objętości. Na komputerze NanoDispenser uruchom program NanoDispenser.
Przejdź do zakładki diagnostyki, zaznacz skrzynkę nadawczą płyty źródłowej, załaduj płytkę źródłową do uchwytu płytki i zaznacz w, aby wprowadzić tabliczkę. Po wyświetleniu monitu wybierz opcję 384LDV_AQ_B2, aby ustawić dozownik NanoDispenser w trybie dozowania buforu wodnego i naciśnij przycisk OK. Wybierz ankietę z menu różne. I kliknij uruchom.
Wybierz wstępnie wypełnione studnie do analizy i kliknij przycisk przejdź. Sprawdź, czy zmierzone objętości są zgodne z oczekiwanymi i upewnij się, że żadne studzienki nie zostały załadowane objętościami większymi niż 12 mikrolitrów. Zalać rurkę pożywką wolną od surowicy, wypełniając nowe sterylne naczynie 10 mililitrami wstępnie podgrzanego podłoża wolnego od surowicy i zanurzając w nim organizer probówki.
Naciśnij przycisk główny na urządzeniu do obsługi cieczy perystaltycznej przez około 10 sekund. Upewnij się, że końcówka nie jest zatkana, sprawdzając wzrokowo przepływ z głowicy dozującej. Umieścić sterylną płytkę do hodowli 384 dołków na nośniku płytki do obchodzenia się z płynami perystaltycznymi i zdjąć jej pokrywkę.
Uruchom wstępnie skalibrowany program, aby dozować jeden mikrolitr do każdego dołka płytki 384-dołkowej. Czas dozowania wynosi około ośmiu sekund. Następnie załóż pokrywę płytki 384-dołkowej.
Aby skonfigurować dozowanie DNA sterowane przez ADE, uruchom oprogramowanie listy wyboru. Ustaw 384 studnie pochodzące z 384LDV. Ustaw urządzenie w trybie dozowania buforu wodnego, wybierając 384LDV_AQ_B2.
I typy płyt docelowych do Greiner_384PS_781096. Odznacz zoptymalizowaną przepustowość transferu. Wybierz zakładkę listy wyboru.
Kliknij import. I wybierz plik DNA_Picklist_CSV. Następnie kliknij przycisk odtwarzania i zapisz protokół.
Kliknij przycisk symuluj, aby przeprowadzić symulację dyspens programu i upewnić się, że lista wyboru jest zgodna z oczekiwanym projektem eksperymentalnym. Kliknij przycisk uruchamiania i uruchom program dozowania. Po wyświetleniu monitu włóż żądaną płytę źródłową.
A następnie tabliczka docelowa w NanoDispenserze. Aby skonfigurować dozowanie odczynnika do transfekcji, pracuj w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby rozcieńczyć odczynnik do transfekcji lipopolyplex w pożywce wolnej od surowicy do stężenia końcowego jeden x i przekręć probówkę. Natychmiast dozować mieszaninę TR zgodnie z predefiniowaną tabliczką źródłową opisaną przez makro i za pomocą wstępnie skalibrowanej aplikacji do pipetowania 384-dołkowego.
Po dozowaniu TR należy przeprowadzić badanie w celu sprawdzenia objętości załadowanych TR, tak jak to miało miejsce wcześniej dla załadowanego DNA. Wybierz wstępnie napełnione studzienki mieszaniny reakcji transfekcji do analizy. I kliknij przycisk Idź.
Sprawdź, czy zmierzone objętości są zgodne z oczekiwanymi. I upewnij się, że żadne studnie nie zostały załadowane o objętości większej niż 12 mikrolitrów. Teraz wykonaj reset listy wyboru DNA w oprogramowaniu listy wyboru.
Sprawdź, czy parametry urządzenia są nadal ustawione na wodne. Wprowadź poprawne typy tablic źródłowych i docelowych. Na karcie listy wyboru kliknij przycisk resetuj, aby wyczyścić przykładową listę.
Następnie kliknij importuj i wybierz TR_Picklist. Plik CSV. Kliknij przycisk odtwarzania.
Zapisz protokół, jeśli zostaniesz o to poproszony, i przeprowadź symulację dozowania mieszaniny odczynników do transfekcji programu, aby zapewnić prawidłowe zaprojektowanie, klikając przycisk symulacji. Tak jak poprzednio, po kliknięciu przycisku uruchamiania i uruchomieniu programu dozowania, umieść płytkę źródłową, a następnie płytkę docelową w NanoDipsenser zgodnie z życzeniem. Aby dozować komórki, napełnij nowe sterylne naczynie przygotowaną zawiesiną komórek i wymieszaj, aby uniknąć sedymentacji prowadzącej do niedokładności i gęstości komórek.
Włóż organizer probówki do roztworu. Następnie naciśnij przycisk zalewania, aż zawiesina ogniw zacznie się spłukiwać z głowicy dozującej. Upewnij się, że końcówka nie jest zatkana, sprawdzając wzrokowo przepływ z głowicy dozującej podczas płukania i upewnij się, że każda rurka jest załadowana zawiesiną komórek.
Teraz załaduj wypełnioną DNA i TR płytkę docelową 384 dołka na płytkę nośnika perystaltycznego do obsługi cieczy i zdejmij jej pokrywę. Uruchom wstępnie skalibrowany program, aby dozować 40 mikrolitrów zawiesiny komórek na kompletną płytkę 384-dołkową. Czas dozowania wynosi około 45 sekund.
Na koniec załóż pokrywę płytki 384-dołkowej. Transfekcja komórek HeLa przy użyciu odczynnika lipopolyplex zakończyła się sukcesem. Ilości DNA w zakresie od pięciu do 30 nanogramów wykazały taką samą skuteczność i do 90% transfekcji komórek przy jednej objętości rozcieńczalnika mikrolitra.
Natomiast większe ilości powodowały nagły spadek odsetka transfekowanych komórek. Przetestowano różne objętości rozcieńczalnika w zakresie od 15 nanolitrów do czterech mikrolitrów i jeden mikrolitr został określony jako najlepszy stan. Aby jeszcze bardziej zwiększyć wydajność tego protokołu, przetestowano dwie skuteczne metody przechowywania DNA, a mianowicie przechowywanie płytki na sucho lub przechowywanie w stanie zamrożonym.
Obie metody przechowywania nie prowadziły do istotnie różniących się wyników niż świeżo wydany roztwór DNA przechowywany przez okres do siedmiu dni. Ponieważ transfekcja osocza zwykle wykorzystuje co najmniej dwa różne plazmidy, zdolność tego protokołu do multipleksowania DNA została zbadana przy użyciu najlepiej zidentyfikowanych warunków. Wcześniej używany plazmid eksprymujący czerwone białko fluorescencyjne tdTomato został zmodyfikowany w celu ekspresji mVenus, jasnożółtego białka fluorescencyjnego, a następnie oba zostały wykorzystane w próbach kotransfekcji.
Analiza komórek z dodatnim wynikiem czerwonej lub zielonej fluorescencji wykazała, że skuteczność transfekcji wynosi około 80%Jednak prawie 100% krwinek czerwonych było również kotransfekowanych z plazmidem eksprymującym mVenus, jak można zobaczyć w reprezentatywnej analizie obrazu opartej na oprogramowaniu. Po dozowaniu DNA na płytce źródłowej. Wykonaj ankietę, aby upewnić się, że oczekiwane objętości zostały załadowane i nie przekraczają 12 mikrolitrów.
Podczas dozowania odczynnika do transfekcji na płytce źródłowej należy unikać pęcherzyków powietrza, ponieważ odwirowanie płytek podrzędnych spowoduje całkowitą utratę skuteczności transfekcji. Metoda ta może być stosowana do eksperymentów biologicznych, przestępstw i transfekcji i jest odpowiednia w większości przypadków, które można wykonać w formacie płytki 384-dołkowej. W pełni odporna transfekcja toruje drogę dla nowych zastosowań, takich jak oparte na plazmidach, znane z bardziej wyrazistych metod odlewanych bez badań przesiewowych, umożliwiających monitorowanie przerywanych afektów, których obecnie nie można posortować w złych strategiach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje przyjazną dla użytkownika, metodę o wysokiej wydajności do transfekcji komórek ssaków za pomocą technologii akustycznego wyrzucania kropel. Umożliwia transfekcję komórek w 384 niezależnych warunkach, co sprawia, że jest odpowiedni zarówno dla początkujących, jak i doświadczonych badaczy.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Techniki transfekcji
- Wysoko-wydajne przesiewowe badania
Tło
- Tradycyjne metody rozdzielania DNA mogą być czasochłonne i podatne na błędy.
- Technologia akustycznego wyrzucania kropel upraszcza proces transfekcji.
- Ta metoda zmniejsza koszty reagentów ze względu na wymaganą nano objętość.
- Jest zaprojektowana tak, aby być dostępna dla początkujących w tej dziedzinie.
Cel badania
- Opracowanie protokołu transfekcji o wysokiej wydajności, który jest łatwy w użyciu.
- Optymalizacja parametrów transfekcji dla różnych typów komórek.
- Ułatwienie wydajnego rozdzielania DNA i obsługi reagentów transfekcyjnych.
Stosowane metody
- Wykorzystanie NanoDispensera do precyzyjnego rozdzielania DNA i reagentów.
- Dostosowanie szybkości przepływu, aby zminimalizować uszkodzenia komórek podczas rozdzielania.
- Testowanie różnych ilości DNA i reagentów transfekcyjnych.
- Zasiewanie komórek w formacie płytki 384-dołkowej.
Główne wyniki
- Protokół umożliwia pomyślną transfekcję w wielu warunkach.
- Tani dostęp do reagentów jest skuteczny ze względu na stosowaną nano objętość.
- Dostosowanie parametrów rozdzielania poprawia żywotność komórek.
- Początkujący mogą osiągnąć wiarygodne wyniki za pomocą tej metody.
Wnioski
- Ta metoda transfekcji o wysokiej wydajności jest wydajna i przyjazna dla użytkownika.
- Dostawia wiarygodną opcję dla badaczy pracujących z komórkami ssaków.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tym protokole, aby zbadać różne warunki transfekcji.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-throughput plasmid transfection using acoustic nanodispensing addresses the bottleneck of low-throughput, error-prone transfection workflows in early discovery. By enabling precise, multiplexed delivery of up to four plasmids per well in a 384-well format, the method supports rapid parameter optimization and cotransfection efficiency near 100%, directly accelerating target validation and mechanistic de-risking in plasmid-based screening campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through multiplexed plasmid delivery for pathway clarification and functional target validation.
- Operational Value: Supports biological de-risking by allowing systematic testing of DNA amounts, transfection reagent, and cell density across 384 conditions to identify optimal transfection settings.
- Predictive Confidence: Facilitates portfolio triage by generating reproducible, quantitative transfection efficiency data to prioritize constructs for downstream applications such as ORF expression or CRISPR-Cas9 gene function validation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by ensuring consistent plasmid and transfection reagent dispensing via user-friendly spreadsheet macro and tablet-based pipetting guide.
- Reproducibility & Scalability: Enables assay standardization through precise nanovolume control (e.g., 500 nL transfection reagent, 100 ng/µL DNA) and automated picklist generation, supporting reliable compound or genetic screening in nonpooled formats.
- Platform Reuse: The method’s compatibility with 384-well plate formats allows transposition to higher-scale manual approaches and reuse across diverse cell types and plasmid libraries (up to 1,536 plasmids).
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports seamless transition from discovery to preclinical validation by enabling consistent, high-efficiency transfection (up to 90%) in mammalian cells, critical for modeling gene function and protein expression in disease-relevant systems.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in cotransfection experiments by achieving nearly 100% cotransfection efficiency, ensuring that observed phenotypes reflect combined plasmid effects rather than variable delivery.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides quantitative, threshold-based outputs (e.g., transfection efficiency, cotransfection rates) that inform go/no-go decisions in lead identification pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification, enabling high-throughput screening of genetic constructs in a format compatible with downstream analytics and preclinical follow-up.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling multiplexed plasmid delivery and precise titration of genetic variables across hundreds of conditions.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized, reproducible dispensing of DNA and transfection reagent, ensuring consistent transfection efficiency for reliable compound or genetic screening.
- Analytics: Generates quantitative readouts (transfection efficiency, cotransfection rates) via fluorescence-based analysis, enabling statistical comparison of conditions and construct performance.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical work by providing a scalable, reliable transfection platform suitable for validating gene function and protein expression in disease models.
- Enterprise Reuse: Positions the method as a reusable capability across projects, reducing redundancy in transfection protocol development and enabling platform-wide standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in cotransfection, and enhanced functional genomics screening.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of transfection workflows through nanovolume precision and spreadsheet-driven automation.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency via reduced reagent consumption, and decreased late-stage biological risk from better early-phase de-risking.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic constructs based on transfection performance and cotransfection fidelity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, transfection principles, and liquid handling instrumentation.
- Dependent on NanoDispenser hardware, peristaltic liquid handler, and compatible software (spreadsheet macro, tablet application).
- Necessitates cross-team standardization of plate formats, reagent concentrations, and dispensing parameters for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when transferring protocols across different cell types, plasmid libraries, or endpoint assays (e.g., fluorescence, luminescence).
- Practical limitations include the need for manual source plate preparation (dilution, dispensing) and dependency on accurate calibration of dispensing hardware to avoid volume inaccuracies.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:47
Preparation of the Peristaltic Liquid Handler Programs
1:53
Experimental Design and Generation of the Picklists to Drive the Acoustic Droplet Ejection (ADE)-Based Dispenses
3:34
DNA Source Plate Preparation Using the 384-well Pipetting Guide Application and Survey Performance to Control the Manually Dispensed Volumes
6:18
Peristaltic Liquid Handler-Based 1 μL Diluent Dispensation in the Destination Plate
7:03
ADE-driven DNA Dispensing into the Destination Plate and ADE-driven Transfection Reagent Dispensing
9:54
Peristaltic Liquid Handler-Based Cell Dispensation
10:51
Results: Defining the Key Parameters to Reach Highly Efficient and High Thoughput Cells (Co-) Transfections
12:26
Conclusion
