Wzbogacenie natywnych cząstek lipoprotein w mikroRNA, a następnie określenie ich bezwzględnej/względnej zawartości mikroRNA i szybkości transferu komórkowego

Cząsteczki lipoprotein są natywnymi nośnikami transportowymi. Wzbogacenie w substancje obce ułatwia ich wykorzystanie jako nośnika torów. Specyficzne znakowanie cząsteczek lub całych cząstek umożliwia pomiar wychwytu komórkowego.

Obie metody wzbogacania są szybkie i łatwe w użyciu i można je dostosować do szerokiej gamy substancji. Procedurę zademonstrują Markus Axmann i Andreas Karner, dwaj doktoranci z mojego laboratorium. Aby rozpocząć odlipidowywanie w dygestorium, wymieszaj jeden do dwóch mililitrów przygotowanego roztworu HDL zawierającego pięć miligramów cząstek HDL z 50 mililitrami wstępnie schłodzonej mieszaniny trzech do dwóch etanolu i eteru dietylowego w stożkowej probówce wirowej.

Inkubować przez dwie godziny w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Wirować w temperaturze 2500 razy g przez 10 minut w temperaturze ujemnej 10 stopni Celsjusza. Wyrzuć supernatant, ponownie zawieś osad w 50 mililitrach wstępnie schłodzonej mieszaniny eteru dietylowego etanolu i krótko zwiruj.

Inkubować po raz drugi przez dwie godziny w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Ponownie odwirować w temperaturze 2500 razy g przez 10 minut w temperaturze ujemnej 10 stopni Celsjusza. Następnie włóż rurki doprowadzające przepływ azotu w celu wysuszenia granulatu.

I ponownie zawiesić go w 250 mikrolitrach buforu A. Określ stężenie białka za pomocą testu białkowego Bradforda lub innego odpowiedniego. Bardzo ważne jest usunięcie wszelkich pozostałości mieszaniny etanolu i eteru dietylowego, ponieważ rozpuszczalniki te hamowałyby relipidację apolipoprotein. Następnie rozcieńczyć do końcowego stężenia jednego miligrama białka na 250 mikrolitrów buforu A. Włożyć rurkę doprowadzającą gaz obojętny do części roztworu w probówce.

W razie potrzeby przechowywać roztwór przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w atmosferze gazu obojętnego. Aby rozpocząć rozpuszczenie, w czystej szklanej probówce wymieszaj 100 mikrolitrów CO, 13,5 mikrolitrów C i 500 mikrolitrów PC. Następnie obróć szklaną rurkę, jednocześnie przepłukując gazowy azot wewnątrz probówki, aby wysuszyć mieszaninę w celu uzyskania jednorodnej warstwy powierzchniowej. W 0,5-mililitrowej probówce reakcyjnej przygotuj świeży 30-milimolowy roztwór sperminy w buforze A. Następnie wymieszaj 100 mikrolitrów 10-mikromolowego syntetycznego mikroRNA ze 100 mikrolitrami roztworu sperminy w dwumililitrowej probówce reakcyjnej.

I inkubować przez 30 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Następnie przenieś inkubowany roztwór o pojemności 200 mikrolitrów do szklanej probówki, aby ponownie nawodnić przygotowaną warstwę powierzchniową PC-CO-C mastermix. A następnie dodaj 50 mikrolitrów 30 miligramów na mililitr roztworu deoksycholanu sodu.

Mieszaj w czterech stopniach Celsjusza przez dwie godziny. Następnie dodaj 250 mikrolitrów odlipidowanego roztworu HDL do szklanej probówki. I mieszaj w czterech stopniach Celsjusza przez noc.

Aby rozpocząć dializę, najpierw dodaj 50 gramów kulek adsorbcyjnych do 800 mililitrów podwójnie destylowanej wody. I użyj mieszadła magnetycznego, aby mieszać przez minutę. Odczekaj 15 minut, aż kulki opadną i zdekantuj supernatant.

Powtórz procedurę ze wstępnie schłodzonym PBS. Wstępnie zwilżone kasety dializacyjne w PBS. Za pomocą strzykawki dodaj wcześniej przygotowaną mieszaninę do kaset zgodnie z instrukcjami producenta.

Dodaj kulki adsorbujące poddane działaniu PBS do trzech litrów PBS i umieść kasety w PBS, aby dializować w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Kulki utrzymują stały gradient gęstości wzdłuż membrany dializy. Wymień bufor i koraliki po jednej godzinie i dwóch godzinach.

Po 24 godzinach za pomocą strzykawki wyekstrahuj roztwór z kasety do 1,5-mililitrowej probówki reakcyjnej, aby odzyskać odtworzony roztwór cząstek HDL. Określ stężenie białka za pomocą testu Bradforda. Dostarczyć gaz obojętny do rurki reakcyjnej, uszczelnić ją i przechowywać odtworzony roztwór cząstek HDL w atmosferze gazu obojętnego w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Najpierw przygotuj świeży 30-milimolowy roztwór sperminy w wodzie wolnej od RNAzy. Wymieszaj 100 mikrolitrów 10 mikromolowych syntetycznego mikroRNA ze 100 mikrolitrami roztworu sperminy w dwumililitrowej probówce reakcyjnej. I inkubować przez 30 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Następnie do przygotowanego roztworu sperminy mikroRNA dodać 100 mikrolitrów DMSO i 1,2 mililitra buforu 1X LDL. Rozcieńczyć wcześniej przygotowany roztwór cząstek LDL PBS do końcowego stężenia około czterech miligramów na mililitr. Następnie pobrać 450 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu do 1,5-mililitrowej probówki reakcyjnej i wymieszać z 50 mikrolitrami 10-krotnego buforu LDL.

Inkubuj go przez 10 minut na lodzie. Po inkubacji połącz 500-mikrolitrowy roztwór cząstek LDL i 1,5-mililitrowy roztwór mikroRNA-spermina-DMSO i inkubuj go przez dwie godziny w temperaturze 40 stopni Celsjusza. Przeprowadzić dializę podobną do opisanej wcześniej i przechowywać oznakowany roztwór cząstek LDL w atmosferze gazu obojętnego w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Na początek rozcieńczyć roztwór cząstek HDL lub LDL w PBS w proporcjach od 1 do 100 do 1 000. Rozszczep mikę, dociskając taśmę klejącą do podłoża miki i odciągając taśmę, aby usunąć górne warstwy miki. Za pomocą pipety umieść dwa mikrolitry na świeżo rozciętej mice w celu inkubacji przez pięć minut.

Cząsteczki lipoprotein mają tendencję do tworzenia ciągłych błon wiążących na powierzchniach. W związku z tym ważne jest, aby dostosować stężenie cząstek na powierzchni miki, aby uzyskać pojedyncze. Po inkubacji przepłukać próbkę PBS.

Napełnij szybką komórkę cieczową AFM PBS i zamontuj skaner przenoszący mikę na szybkim stoliku AFM. W oprogramowaniu sterującym rozpocznij proces zbliżania się wspornika do powierzchni miki. Używaj skanerów o rozmiarach mniejszych niż jeden mikrometr kwadratowy i utrzymuj siły obrazowania na jak najniższym poziomie.

Zobrazuj próbkę w trybie gwintowania. Załaduj dane do Gwyddion i wykryj cząstki za pomocą funkcji oznaczania ziaren według progu. Dostosuj wartość progu wysokości, aby zamaskować poszczególne cząstki.

Zazwyczaj poziom około 50% jest dobrym punktem wyjścia. Usuń tło wielomianowe, aby spłaszczyć obraz, i aktywuj opcję wykluczania zamaskowanego regionu. Wyeksportuj maksymalne wartości wysokości wykrytych cząstek, korzystając z funkcji rozkładu różnych charakterystyk ziaren i powtórz te kroki dla wszystkich zarejestrowanych obrazów.

W tym eksperymencie odtworzenie cząstek HDL przeprowadzono poprzez delipidację cząstek HDL, a następnie relipidację i dializę. Można osiągnąć wydajność 50% odtworzonych cząstek HDL. Jednak to samo znakowanie mikroRNA nie było możliwe do znakowania cząstek LDL ze względu na hydrofobowość białka apolipoproteiny B100.

W ten sposób DMSO został użyty do penetracji monowarstwy lipidowej cząstek LDL, z wydajnością bliską 100%Podczas kontroli jakości rozcieńczenie ma kluczowe znaczenie dla analizy. Górny obraz pokazuje zbyt dużą gęstość cząstek. Dolny obraz nadaje się do analizy.

Funkcje gęstości prawdopodobieństwa wysokości cząstek obliczono w celu porównania rozkładów wielkości natywnych, znakowanych i znakowanych kontrolnych cząstek lipoprotein. Względna zmiana przed i po procedurze etykietowania jest pomijalna. Podczas obchodzenia się z oligonukleotydami RNA pracuj bez RNAzy.

Używaj świeżych jednorazowych plastikowych materiałów eksploatacyjnych i zawsze noś rękawice. Używaj tylko roztworów wolnych od nukleaz. Szybkie AFM to tylko jedna z metod określania ogólnego kształtu lipoprotein.

Alternatywną metodą może być mikroskopia elektronowa. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i pracować pod wyciągiem podczas pracy z eterem dietylowym.