Name: Wzbogacenie natywnych cząstek lipoprotein w mikroRNA, a następnie określenie ich bezwzględnej/względnej zawartości mikroRNA i szybkości transferu komórkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Poznaj metodę wzbogacania cząstek lipoprotein w mikroRNA oraz określania ich zawartości i szybkości transferu komórkowego. Protokół obejmuje delipidację, rekonstrukcję z spermine i dializę HDL.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Projekt Austriackiego Funduszu Naukowego P29110-B21, projekt "Hochschuljubiläumsstiftung der Stadt Wien zur Förderung der Wissenschaft" H-3065/2011, Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego (EFRE, IWB2020), kraj związkowy Górna Austria oraz "Land OÖ Basisfinanzierung".

<ol><li>Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+are+transported+in+plasma+and+delivered+to+recipient+cells+by+high-density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins.</a> Nature Cell Biology. 13 (4), 423-435 (2011).</li>
<li>Tabet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL-transferred+microRNA-223+regulates+ICAM-1+expression+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li>
<li>Wahid, F., Shehzad, A., Khan, T., Kim, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+Synthesis%2C+mechanism%2C+function%2C+and+recent+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: Synthesis, mechanism, function, and recent clinical trials.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1803 (11), 1231-1243 (2010).</li>
<li>Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+Mechanisms+of+miRNAs+and+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs.</a> Cell. 136 (4), 642-655 (2009).</li>
<li>Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+Translation+and+Stability+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA Translation and Stability by microRNAs.</a> Annual Review of Biochemistry. 79 (1), 351-379 (2010).</li>
<li>Filipowicz, W., Bhattacharyya, S. N., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+post-transcriptional+regulation+by+microRNAs%3A+Are+the+answers+in+sight%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: Are the answers in sight?</a> Nature Reviews Genetics. 9 (2), 102-114 (2008).</li>
<li>Jonas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+High-Density+Lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of High-Density Lipoproteins.</a> Methods in Enzymology. , 553-582 (1986).</li>
<li>Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Speed+AFM+and+Applications+to+Biomolecular+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">High-Speed AFM and Applications to Biomolecular Systems.</a> Annual Review of Biophysics. 42 (1), 393-414 (2013).</li>
<li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+Guidelines%3A+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Real-Time+PCR+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Patsch, J. R., Patsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zonal+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Zonal ultracentrifugation.</a> Methods in Enzymology. 129 (1966), 3-26 (1986).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
<li>Yamamoto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+Techniques+for+Observing+Dynamic+Biomolecular+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">High-Speed Atomic Force Microscopy Techniques for Observing Dynamic Biomolecular Processes.</a> Methods in Enzymology. 475, 541-564 (2010).</li>
<li>Stangl, H., Cao, G., Wyne, K. L., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scavenger+receptor%2C+class+B%2C+type+I-dependent+stimulation+of+cholesterol+esterification+by+high+density+lipoproteins%2C+low+density+lipoproteins%2C+and+nonlipoprotein+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Scavenger receptor, class B, type I-dependent stimulation of cholesterol esterification by high density lipoproteins, low density lipoproteins, and nonlipoprotein cholesterol.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (47), 31002-31008 (1998).</li>
<li>Hochberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+False+Discovery+Rate%3A+a+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Statistical+Society%22%5BJournal%5D)">Controlling the False Discovery Rate: a Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society. 57 (1), 289-300 (1995).</li>
<li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+and+universal+method+for+microRNA+RT-qPCR+data+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization.</a> Genome Biology. 10 (6), (2009).</li>
<li>Schumaker, V. N., Puppione, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((6%5D+Sequential+Flotation+Ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">6] Sequential Flotation Ultracentrifugation.</a> Methods in Enzymology. 128 (C), 155-170 (1986).</li>
<li>Wagner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+levels+and+cellular+transfer+of+circulating+lipoprotein-bound+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (6), 1392-1400 (2013).</li>
<li>Meier, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+chronic+kidney+disease+on+macrophage+cholesterol+efflux%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effect of chronic kidney disease on macrophage cholesterol efflux.</a> Life Sciences. 136, 1-6 (2015).</li>
<li>Axmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+and+Lipoprotein+Particle+miRNA+Profile+in+Uremia+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Serum and Lipoprotein Particle miRNA Profile in Uremia Patients.</a> Genes. 9 (11), 533(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj krok po kroku opisano izolację frakcji cząstek lipoprotein z ludzkiej krwi i określenie ich indywidualnej zawartości miRNA. Bardzo ważne jest, aby pracować w środowisku wolnym od RNaz podczas pracy z izolowanym i zsyntetyzowanym miRNA - miRNA osadzone w cząstkach jest oczywiście chronione przed degradacją enzymatyczną. Ponieważ stosunek miRNA do cząstek natywnych cząstek lipoprotein jest raczej niski, konieczne jest sztuczne wzbogacenie miRNA w celu zbadania wychwytu cząstek holologicznych przez komórki. W ten sposób rekonstytucja cząstek HDL, jakopisano wcześniej7 , jest modyfikowana w celu włączenia nici miRNA. Dodatkowo, oddzielenie frakcji lipidowej i białkowej podczas tej procedury pozwala naukowcom na zbadanie składników związanych z lipidami i białkami cząsteczki lipoproteiny19. W podobny sposób dostosowana jest procedura znakowania cząstek LDL. Co ciekawe, dodanie sperminy – naturalnego stabilizatora nukleotydów – nie wpłynęło na stosunek miRNA do cząstek. Należy zauważyć, że w zasadzie metoda pozwala na fałdowanie innych substancji niż miRNA w cząsteczce lipoproteiny. Oczywiście istnieje ograniczenie dotyczące fizycznej wielkości substancji w oparciu o całkowitą wielkość cząstek HDL (średnica: 5-12 nm) i LDL (średnica: 18-25 nm).
Jeśli chodzi o kontrolę jakości odtworzonych/znakowanych cząstek lipoprotein, HS-AFM jest odpowiednią metodą do charakteryzowania cząstek HDL/LDL na poziomie pojedynczych cząstek. W porównaniu do EM pozwala na krótszy czas przygotowania i warunki zbliżone do fizjologicznych (mokra, temperatura pokojowa).
Ze względu na swoją nieodłączną czułość i amplifikację, qPCR jest metodą z wyboru do wykrywania niskich stężeń miRNA. Alternatywnie, mikroskopia fluorescencyjna czuła na pojedyncze cząsteczki, która jest w stanie wykryć nawet pojedyncze cząsteczki, nie byłaby odpowiednia ze względu na niskie stężenia, na przykład, znakowanych fluorescencyjnie nici miRNA na cząsteczkę. W związku z tym stwierdzono, że stosunek nici miRNA na natywną cząstkę lipoproteiny wynosi 10-8. Sztuczne wzbogacenie zwiększa współczynnik 10 000, co ułatwia oszacowanie szybkości wychwytu lipoprotein komórkowych (nie wykrywa się znaczącej różnicy przy użyciu natywnych cząstek lipoprotein 19). Wysoka czułość qPCR umożliwia określenie tej szybkości wychwytu poprzez pomiar liczby nici miRNA po czasie inkubacji oraz stosunku miRNA do cząstek. Należy zauważyć, że obliczona wartość ignoruje komórkową degradację i uwalnianie miRNA, a zatem stanowi co najmniej dolną granicę współczynnika wychwytu cząstek lipoprotein.
W przyszłości metoda może zostać dostosowana do przenoszenia substancji farmaceutycznych (w szczególności również lipofilowych) w komórkach i korelowania ich efektu biologicznego ze stężeniem wewnątrzkomórkowym (określonym na podstawie szybkości wychwytu cząstek lipoprotein).

Cząsteczki lipoprotein składają się z monowarstwy amfifilowych lipidów i cholesterolu, otaczającej rdzeń z estrów cholesterolu i tłuszczów trójglicerydowych. Cała cząstka jest stabilizowana przez apolipoproteiny osadzone w błonie, które definiują biologiczną funkcjonalność cząstki. Cząsteczki lipoprotein można rozróżnić ze względu na ich rosnącą gęstość, a tym samym zmniejszający się rozmiar, a mianowicie jako lipoproteiny o bardzo niskiej gęstości (VLDL), lipoproteiny o średniej gęstości (IDL), LDL i HDL. Pomimo transportu składników nierozpuszczalnych w wodzie w krwiobiegu, wykazano, że cząsteczki HDL przenoszą niekodujące nici miRNA1,2. Mikro-RNA to klasa krótkich (zwykle dwa tuziny nukleotydów) nici RNA, które degradują wewnątrzkomórkowo komplementarne nici mRNA, a tym samym zmieniają profil ekspresji niektórych białek3,4,5,6. Ponadto zmiany profilu miRNA stwierdzono w różnych chorobach, a zatem profil ten ma zastosowanie jako biomarker do diagnozy i rokowania. Zewnątrzkomórkowy transport miRNA między komórkami za pośrednictwem cząstek lipoprotein może służyć jako dodatkowy mechanizm międzykomórkowej modulacji poziomu mRNA. Aby ilościowo oszacować efekt biologiczny, potrzebna jest wiedza dotycząca bezwzględnej i względnej zawartości miRNA w cząsteczkach lipoprotein.
Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym jest odpowiednią i stosunkowo szybką metodą uzyskania tych informacji. W związku z tym można obliczyć względną wartość kwantyfikacji (RQ), a względne różnice między różnymi próbkami i frakcjami lipoprotein są możliwe do oszacowania. Wielodołkowe karty macierzy mikroprzepływowej to szybka i łatwa w użyciu metoda określania względnej obecności (równej wartości RQ) miRNA w próbce. Wielodołkowe karty macierzy mikroprzepływowej składają się z 96 lub 384 indywidualnych komór reakcyjnych do indywidualnych reakcji qPCR osadzonych w urządzeniu mikroprzepływowym. Każda komora zawiera wymaganą sondę hydrolizy i specyficzne startery qPCR dla jednego pojedynczego miRNA. Zaletami są krótki czas obsługi wynikający ze standaryzacji, prosty przepływ pracy i zmniejszona liczba etapów pipetowania. Ponadto minimalizowana jest wymagana objętość próbki. W przeciwieństwie do względnej kwantyfikacji, bezwzględna zawartość miRNA wymaga porównania wyników próbki qPCR ze standardowymi krzywymi znanych liczb bezwzględnych nici miRNA. Należy zauważyć, że ze względu na ich stosunkowo niską zawartość miRNA, standardowe, a ponadto nawet czułe na pojedyncze cząsteczki techniki obrazowania nie są wykonalne - sztuczne wzbogacanie cząstek lipoprotein w miRNA jest nieuniknione w celu zbadania interakcji komórkowych cząstek lipoprotein i transferu miRNA. W związku z tym delipidacja cząsteczki HDL, a następnie relipidacja7 umożliwia inkorporację, a tym samym wzbogacenie w nici miRNA. Podobne wzbogacenie cząsteczek LDL w miRNA nie jest możliwe ze względu na hydrofobowość białka apoB-100, które jest głównym składnikiem cząsteczki LDL. Jednak poprzez dodanie polarnego rozpuszczalnika dimetylosulfotlenku (DMSO), który jest w stanie przenikać przez błony lipidowe, cząsteczki LDL mogą być również sztucznie ładowane niciami miRNA.
Szybka mikroskopia sił atomowych (HS-AFM) to potężne narzędzie do charakteryzacji próbek biologicznych, oferujące subnanometrową rozdzielczość przestrzenną i subsekundową czasową8. W związku z tym jest to dobrze dopasowana technika do kontroli jakości zmodyfikowanych cząstek lipoprotein, ponieważ natywne / odtworzone / znakowane cząsteczki lipoprotein mogą być obrazowane w środowisku zbliżonym do fizjologicznego.
Tutaj krok po kroku prezentowany jest protokół oparty na qPCR, który pozwala określić bezwzględną/względną zawartość miRNA w cząsteczkach lipoprotein i próbkach komórek, co pozwala na oszacowanie szybkości pobierania cząsteczek lipoprotein komórkowych. Ponadto przedstawiono metodę wzbogacania cząstek lipoprotein w miRNA. Metoda ta może być dostosowana do ogólnej manipulacji zawartością lipoprotein, a tym samym wykazuje możliwość zastosowania cząsteczek lipoprotein jako celów dostarczania leków.

<table><tbody><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman</td><td>Optima L-100 XP</td><td>Izolacja lipoprotein</td></tr><tr><td>Wirnik ultrawirówki</td><td>Beckman</td><td>TI 55.2</td><td>Izolacja lipoprotein</td></tr><tr><td>Vacutainer (EDTA)</td><td>Becton Dickinson</td><td>366643</td><td>Izolacja lipoprotein</td></tr><tr><td>Kaliumbromid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2110</td><td>Izolacja lipoprotein</td></tr><tr><td>Probówki</td> <td>ultrawirówkoweBeckman</td><td>342414</td><td>Izolacja lipoprotein</td></tr><tr><td>Zgrzewarka do probówek ultrawirówek</td><td>Beckman</td><td>342428</td><td>Izolacja lipoprotein</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P029.2</td><td>Izolacja lipoprotein</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>D/0650/50</td><td>Izolacja lipoprotein</td></tr><tr><td>Rurki do dializy, MWCO 12 - 14k</td><td>Spectra</td><td>132700</td><td>Izolacja lipoprotein</td></tr><tr><td>syntetyczny miRNA</td><td></td> <td>microSynth-syntetyczny</td> bufor <td>miRNA</td></tr><tr><td>TRIS pH 7</td><td>Ambion</td><td>AM9850G</td><td>syntetyczny miRNA</td></tr><tr><td>TRIS bufor pH 8</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>syntetyczne sterylne probówki</td><td>miRNA Carl Roth GmbH</td><td>ENE8.1</td><td>syntetyczny fotometr miRNA</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>Biofotometr Eppendorf</td><td>Test Bradforda</td></tr><tr><td>Kuweta</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>XK20</td><td>Test Bradford</td></tr><tr><td>Coomassie G-250 Stain</td><td>BioRad GmbH</td><td>161-0786</td><td>Test Bradford</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3957.1</td><td>Delipitacja</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fluka Analytical</td><td>03690-100ML</td><td>Delipitation</td></tr><tr><td>TRIS Bufor pH 8,0</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td>Delipitation</td></tr><tr><td>Etanol 100%</td><td>AustrAlco</td><td>Etanol Absolut 99.9%</td><td>Delipitacja</td></tr><tr><td>Eter dietylowy</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3942.1</td><td>Wirówka do odcieńczania</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>Multifuge X3R</td><td>Odcieńczanie</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3313.1</td><td>Rekonstytucja</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4627.1</td><td>Rekonstytucja</td></tr><tr><td>Fosfatydylocholina</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>P3556-25mg</td><td>Rekonstytucja</td></tr><tr><td>Oleinian cholesterolu</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>C-9253-250mg</td><td>Rekonstytucja</td></tr><tr><td>cholesterolu</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>C8667-500mg</td><td></td></tr><tr><td>Szklane probówki</td> do rekonstytucji <td>Carl Roth GmbH</td><td>K226.1</td><td>Rekonstytucja</td></tr><tr><td>sperminy</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>S3256-1G</td><td>Rekonstytucji</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer comfort</td><td>Rekonstytucja</td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>3097-25G</td><td>Rekonstytucja</td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>0955.2</td><td>Rekonstytucja</td></tr><tr><td>100&micro; L Mikropipety</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>A762.1</td><td>Rekonstytucja</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9143.2</td> Koraliki <td>do dializy</td></tr><tr><td>Amberlite XAD-2</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>10357</td> Kaseta <td>do dializy</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer (odcięcie 20 kDa)</td><td>Thermo Scientific</td><td>66003</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td> do dializy <td>Braun</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka do dializy igła</td><td>Braun</td><td>465 76 83</td><td>Dializa</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3054.2</td><td>Znakowanie cząstek LDL</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>life technologies</td><td>D12345</td><td>Znakowanie cząstek LDL</td></tr><tr><td>Mikroskop sił atomowych</td><td>RIBM</td><td>SS-NEX</td><td>Kontrola jakości odtwarzanych/znakowanych cząstek lipoprotein</td></tr><tr><td>Mika moskiewska (klasa V-1)</td><td>Christine Gr&ouml; pl</td><td>G250-1/V1</td><td>Kontrola jakości odtwarzanych/znakowanych cząstek lipoprotein</td></tr><tr><td>AFM Cantilever</td><td>Nanoworld</td><td>USC-F1.2-k0.15</td><td>Kontrola jakości odtwarzanych/znakowanych cząstek lipoprotein</td></tr><tr><td>Gwyddion 2.49</td><td>Czeski Instytut Metrologii</td><td>http://gwyddion.net</td><td>Kontrola jakości odtwarzanych/znakowanych cząstek lipoprotein</td></tr><tr><td>Szkiełka komorowe, Nunc Lab-Tek</td><td>VWR</td><td>734-2122</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9117.1</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Licznik komórek</td><td>Omni Life Science GmbH</td><td>Casy Hodowla</td><td>komórkowa</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>217004</td><td>ekstrakcja miRNA</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td> ekstrakcja <td>miRNA</td></tr><tr><td>20G Igła</td><td>Braun</td><td>Sterican 465 75 19</td><td>miRNA ekstrakcja</td></tr><tr><td>strzykawka 5 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>309050</td><td>Ekstrakcja miRNA</td></tr><tr><td>Szafka PCR</td><td>Esco</td><td>PCR-3A1</td><td>Odwrotna transkrypcja</td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji TaqMan</td><td>Thermo Scientific</td><td>4366596</td><td>Odwrotna transkrypcja</td></tr><tr><td>Woda bez rnazy</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>T143</td><td>Odwrotna</td></tr><tr><td>transkrypcja 0,2 ml probówki Marka</td><td></td><td>781305</td><td>Wirówka z odwrotną transkrypcją</td></tr><tr><td></td><td>Carl Roth GmbH</td><td>Mikrowirówka AL</td><td>Termocykler z odwrotną transkrypcją</td></tr><tr><td></td><td>Sensoquest</td><td>Labcycler</td><td>Odwrotna transkrypcja</td></tr><tr><td>TaqMan Primer</td><td>Thermo</td><td></td> <td>Scientific-qPCR</td></tr><tr><td>iTaq Uniwersalna sonda supermix</td><td>BioRad GmbH</td><td>1725131</td><td>Maszyna</td></tr> <tr><td></td><td>qPCR PCRCorbett</td><td>Rotor-Gene RG-6000</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji TaqMan MicroRNA</td><td>Applied Biosystems</td><td>4366596</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1</td><td>Applied Biosystems</td><td>4399966</td><td>TaqMan</td></tr><tr><td>Array TaqMan PreAmp Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4391128</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>Megaplex PreAmp Prirs, Human Pool A v2.1</td><td>Zastosowane Biosystems</td><td>4399933</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, bez UNG</td><td>Applied Biosystems</td><td>4440040</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>TaqMan Advanced miRNA Human A Cards</td><td>Applied Biosystems</td><td>A31805</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0581</td><td>TaqMan</td></tr><tr><td>Array MgCl2 (25mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0971</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>TE, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9849</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>7900HT Szybki system PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Applied Biosystems</td><td>4351405</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>TaqMan Array Uszczelniacz</td> kart <td>Applied Biosystems-TaqMan</td><td></td> <td>Array</td></tr></tbody></table>

wzbogacenie natywnych cząstek lipoprotein w mikrorna, a następnie określenie ich bezwzględnej/względnej zawartości mikrorna i szybkości transferu komórkowego

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Cząsteczki lipoprotein są głównie transporterami lipidów i cholesterolu w krwiobiegu. Ponadto zawierają niewielkie ilości nici niekodującego mikroRNA (miRNA). Ogólnie rzecz biorąc, miRNA zmienia profil ekspresji białka w wyniku interakcji z informacyjnym RNA (mRNA). W związku z tym wiedza na temat względnej i bezwzględnej zawartości miRNA w cząsteczkach lipoprotein jest niezbędna do oszacowania biologicznego efektu wychwytu cząstek komórkowych. W tym miejscu przedstawiono ilościowy protokół oparty na reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) w celu określenia bezwzględnej zawartości miRNA w cząstkach lipoprotein - przykład pokazany dla natywnych i wzbogaconych w miRNA cząstek lipoprotein. Względna zawartość miRNA jest oznaczana ilościowo za pomocą wielodołkowych kart z matrycą mikroprzepływową. Co więcej, protokół ten pozwala naukowcom oszacować komórkowe miRNA, a tym samym tempo wychwytu cząstek lipoproteiny. Znaczny wzrost poziomu komórkowego miRNA można zaobserwować przy użyciu cząstek lipoprotein o dużej gęstości (HDL) sztucznie załadowanych miRNA, podczas gdy inkubacja z natywnymi cząstkami HDL nie daje znaczącego efektu ze względu na ich raczej niską zawartość miRNA. W przeciwieństwie do tego, wychwyt komórkowy cząstek lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) - ani z natywnym miRNA, ani sztucznie nim załadowany - nie zmienił poziomu komórkowego miRNA.

Tutaj przedstawiono ilościowy protokół oparty na reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym do określania natywnej zawartości mikro-RNA (bezwzględnej/względnej) w cząsteczkach lipoprotein. Ponadto przedstawiono metodę zwiększania poziomu mikro-RNA, a także metodę określania szybkości wychwytu komórkowego cząstek lipoprotein.

Wzbogacenie natywnych cząstek lipoprotein w mikroRNA, a następnie określenie ich bezwzględnej/względnej zawartości mikroRNA i szybkości transferu komórkowego

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Cząsteczki lipoprotein są natywnymi nośnikami transportowymi. Wzbogacenie w substancje obce ułatwia ich wykorzystanie jako nośnika torów. Specyficzne znakowanie cząsteczek lub całych cząstek umożliwia pomiar wychwytu komórkowego.Obie metody wzbogacania są szybkie i łatwe w użyciu i można je dostosować do szerokiej gamy substancji. Procedurę zademonstrują Markus Axmann i Andreas Karner, dwaj doktoranci z mojego laboratorium. Aby rozpocząć odlipidowywanie w dygestorium, wymieszaj jeden do dwóch mililitrów przygotowanego roztworu HDL zawierającego pięć miligramów cząstek HDL z 50 mililitrami wstępnie schłodzonej mieszaniny trzech do dwóch etanolu i eteru dietylowego w stożkowej probówce wirowej.Inkubować przez dwie godziny w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Wirować w temperaturze 2500 razy g przez 10 minut w temperaturze ujemnej 10 stopni Celsjusza. Wyrzuć supernatant, ponownie zawieś osad w 50 mililitrach wstępnie schłodzonej mieszaniny eteru dietylowego etanolu i krótko zwiruj.Inkubować po raz drugi przez dwie godziny w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Ponownie odwirować w temperaturze 2500 razy g przez 10 minut w temperaturze ujemnej 10 stopni Celsjusza. Następnie włóż rurki doprowadzające przepływ azotu w celu wysuszenia granulatu.I ponownie zawiesić go w 250 mikrolitrach buforu A. Określ stężenie białka za pomocą testu białkowego Bradforda lub innego odpowiedniego. Bardzo ważne jest usunięcie wszelkich pozostałości mieszaniny etanolu i eteru dietylowego, ponieważ rozpuszczalniki te hamowałyby relipidację apolipoprotein. Następnie rozcieńczyć do końcowego stężenia jednego miligrama białka na 250 mikrolitrów buforu A. Włożyć rurkę doprowadzającą gaz obojętny do części roztworu w probówce.W razie potrzeby przechowywać roztwór przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w atmosferze gazu obojętnego. Aby rozpocząć rozpuszczenie, w czystej szklanej probówce wymieszaj 100 mikrolitrów CO, 13,5 mikrolitrów C i 500 mikrolitrów PC. Następnie obróć szklaną rurkę, jednocześnie przepłukując gazowy azot wewnątrz probówki, aby wysuszyć mieszaninę w celu uzyskania jednorodnej warstwy powierzchniowej. W 0,5-mililitrowej probówce reakcyjnej przygotuj świeży 30-milimolowy roztwór sperminy w buforze A. Następnie wymieszaj 100 mikrolitrów 10-mikromolowego syntetycznego mikroRNA ze 100 mikrolitrami roztworu sperminy w dwumililitrowej probówce reakcyjnej.I inkubować przez 30 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Następnie przenieś inkubowany roztwór o pojemności 200 mikrolitrów do szklanej probówki, aby ponownie nawodnić przygotowaną warstwę powierzchniową PC-CO-C mastermix. A następnie dodaj 50 mikrolitrów 30 miligramów na mililitr roztworu deoksycholanu sodu.Mieszaj w czterech stopniach Celsjusza przez dwie godziny. Następnie dodaj 250 mikrolitrów odlipidowanego roztworu HDL do szklanej probówki. I mieszaj w czterech stopniach Celsjusza przez noc.Aby rozpocząć dializę, najpierw dodaj 50 gramów kulek adsorbcyjnych do 800 mililitrów podwójnie destylowanej wody. I użyj mieszadła magnetycznego, aby mieszać przez minutę. Odczekaj 15 minut, aż kulki opadną i zdekantuj supernatant.Powtórz procedurę ze wstępnie schłodzonym PBS. Wstępnie zwilżone kasety dializacyjne w PBS. Za pomocą strzykawki dodaj wcześniej przygotowaną mieszaninę do kaset zgodnie z instrukcjami producenta.Dodaj kulki adsorbujące poddane działaniu PBS do trzech litrów PBS i umieść kasety w PBS, aby dializować w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Kulki utrzymują stały gradient gęstości wzdłuż membrany dializy. Wymień bufor i koraliki po jednej godzinie i dwóch godzinach.Po 24 godzinach za pomocą strzykawki wyekstrahuj roztwór z kasety do 1,5-mililitrowej probówki reakcyjnej, aby odzyskać odtworzony roztwór cząstek HDL. Określ stężenie białka za pomocą testu Bradforda. Dostarczyć gaz obojętny do rurki reakcyjnej, uszczelnić ją i przechowywać odtworzony roztwór cząstek HDL w atmosferze gazu obojętnego w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Najpierw przygotuj świeży 30-milimolowy roztwór sperminy w wodzie wolnej od RNAzy. Wymieszaj 100 mikrolitrów 10 mikromolowych syntetycznego mikroRNA ze 100 mikrolitrami roztworu sperminy w dwumililitrowej probówce reakcyjnej. I inkubować przez 30 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza.Następnie do przygotowanego roztworu sperminy mikroRNA dodać 100 mikrolitrów DMSO i 1,2 mililitra buforu 1X LDL. Rozcieńczyć wcześniej przygotowany roztwór cząstek LDL PBS do końcowego stężenia około czterech miligramów na mililitr. Następnie pobrać 450 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu do 1,5-mililitrowej probówki reakcyjnej i wymieszać z 50 mikrolitrami 10-krotnego buforu LDL.Inkubuj go przez 10 minut na lodzie. Po inkubacji połącz 500-mikrolitrowy roztwór cząstek LDL i 1,5-mililitrowy roztwór mikroRNA-spermina-DMSO i inkubuj go przez dwie godziny w temperaturze 40 stopni Celsjusza. Przeprowadzić dializę podobną do opisanej wcześniej i przechowywać oznakowany roztwór cząstek LDL w atmosferze gazu obojętnego w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Na początek rozcieńczyć roztwór cząstek HDL lub LDL w PBS w proporcjach od 1 do 100 do 1 000. Rozszczep mikę, dociskając taśmę klejącą do podłoża miki i odciągając taśmę, aby usunąć górne warstwy miki. Za pomocą pipety umieść dwa mikrolitry na świeżo rozciętej mice w celu inkubacji przez pięć minut.Cząsteczki lipoprotein mają tendencję do tworzenia ciągłych błon wiążących na powierzchniach. W związku z tym ważne jest, aby dostosować stężenie cząstek na powierzchni miki, aby uzyskać pojedyncze. Po inkubacji przepłukać próbkę PBS.Napełnij szybką komórkę cieczową AFM PBS i zamontuj skaner przenoszący mikę na szybkim stoliku AFM. W oprogramowaniu sterującym rozpocznij proces zbliżania się wspornika do powierzchni miki. Używaj skanerów o rozmiarach mniejszych niż jeden mikrometr kwadratowy i utrzymuj siły obrazowania na jak najniższym poziomie.Zobrazuj próbkę w trybie gwintowania. Załaduj dane do Gwyddion i wykryj cząstki za pomocą funkcji oznaczania ziaren według progu. Dostosuj wartość progu wysokości, aby zamaskować poszczególne cząstki.Zazwyczaj poziom około 50% jest dobrym punktem wyjścia. Usuń tło wielomianowe, aby spłaszczyć obraz, i aktywuj opcję wykluczania zamaskowanego regionu. Wyeksportuj maksymalne wartości wysokości wykrytych cząstek, korzystając z funkcji rozkładu różnych charakterystyk ziaren i powtórz te kroki dla wszystkich zarejestrowanych obrazów.W tym eksperymencie odtworzenie cząstek HDL przeprowadzono poprzez delipidację cząstek HDL, a następnie relipidację i dializę. Można osiągnąć wydajność 50% odtworzonych cząstek HDL. Jednak to samo znakowanie mikroRNA nie było możliwe do znakowania cząstek LDL ze względu na hydrofobowość białka apolipoproteiny B100.W ten sposób DMSO został użyty do penetracji monowarstwy lipidowej cząstek LDL, z wydajnością bliską 100%Podczas kontroli jakości rozcieńczenie ma kluczowe znaczenie dla analizy. Górny obraz pokazuje zbyt dużą gęstość cząstek. Dolny obraz nadaje się do analizy.Funkcje gęstości prawdopodobieństwa wysokości cząstek obliczono w celu porównania rozkładów wielkości natywnych, znakowanych i znakowanych kontrolnych cząstek lipoprotein. Względna zmiana przed i po procedurze etykietowania jest pomijalna. Podczas obchodzenia się z oligonukleotydami RNA pracuj bez RNAzy.Używaj świeżych jednorazowych plastikowych materiałów eksploatacyjnych i zawsze noś rękawice. Używaj tylko roztworów wolnych od nukleaz. Szybkie AFM to tylko jedna z metod określania ogólnego kształtu lipoprotein.Alternatywną metodą może być mikroskopia elektronowa. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i pracować pod wyciągiem podczas pracy z eterem dietylowym.

enrichment-native-lipoprotein-particles-with-microrna-subsequent

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

MikroRNA odgrywają ważną rolę regulacyjną i stają się nowymi celami terapeutycznymi dla różnych chorób ludzkich. Wykazano, że miRNA są przenoszone w lipoproteinach o dużej gęstości. Opracowaliśmy uproszczoną metodę szybkiego izolowania oczyszczonego HDL nadającego się do analizy miRNA z ludzkiego osocza.

Szybka i uproszczona metoda wysokoprzepustowej izolacji miRNA z wysoko oczyszczonej lipoproteiny o wysokiej gęstości

Ten protokół opisuje izolację i kwantyfikację małych RNA lipoprotein o dużej gęstości.

Izolacja lipoprotein o dużej gęstości do niekodującej kwantyfikacji małego RNA

Kropelki lipidów są ważnymi organellami do replikacji kilku patogenów, w tym wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). Opisujemy metodę izolowania kropelek lipidów do ilościowej spektrometrii mas powiązanych białek; Może być stosowany w różnych warunkach, takich jak infekcja wirusowa, stres środowiskowy lub leczenie farmakologiczne.

Izolacja kropelek lipidów do ilościowej analizy spektrometrii mas

Wzbogacanie lipoprotein bakteryjnych za pomocą metody podziału fazy niejonowego środka powierzchniowo czynnego jest opisane do bezpośredniego użycia w testach TLR lub innych zastosowaniach. Dalsze kroki są szczegółowo opisane w celu przygotowania N-końcowych lipopeptydów tryptycznych do charakterystyki strukturalnej za pomocą spektrometrii mas.

Wzbogacanie lipoprotein bakteryjnych i otrzymywanie N-końcowych lipopeptydów do oznaczania strukturalnego metodą spektrometrii mas

Ten raport opisuje protokół pomiaru bezwzględnych poziomów miRNA w osoczu, przy użyciu ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym z lub bez wstępnej amplifikacji. Protokół ten pozwala lepiej zrozumieć ilość miRNA w osoczu i umożliwia jakościową ocenę odpowiednich danych z różnych badań lub laboratoriów.

Bezwzględna kwantyfikacja poziomów mikroRNA w osoczu u małp Cynomolgus przy użyciu ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym

Ten raport opisuje szybką i niezawodną metodę walidacji celów mRNA komórkowych miRNA. Metoda wykorzystuje syntetyczne biotynylowane miRNA oparte na zablokowanych kwasach nukleinowych (LNA) do wychwytywania docelowego mRNA. Następnie kulki magnetyczne pokryte streptawidyną są wykorzystywane do ściągania docelowego mRNA w celu ilościowego oznaczania w reakcji łańcuchowej polimerazy qPCR.

Test pulldown na bazie biotyny do walidacji celów mRNA komórkowych miRNA

Ten protokół opisuje wytwarzanie liposomów oraz sposób, w jaki można je unieruchomić na powierzchni i zobrazować indywidualnie w masowy równoległy sposób za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Pozwala to na ilościowe określenie wielkości i niejednorodności składu między pojedynczymi liposomami populacji.

Ilościowy test pojedynczego liposomu oparty na mikroskopii fluorescencyjnej do wykrywania niejednorodności składu między poszczególnymi liposomami

Nanocząsteczki lipidowe są opracowywane przy użyciu mikroprzepływowej platformy mieszania do enkapsulacji mRNA i DNA.

Formułowanie i charakteryzowanie nanocząstek lipidowych do dostarczania genów przy użyciu platformy mieszania mikroprzepływowego

Opracowaliśmy test reporterowy biogenezy mikroRNA do wykorzystania w komórkach in vitro z czterema plazmidami: jeden z miRNA intronicznym, jeden z celem, jeden do nadekspresji białka regulatorowego i jeden dla lucyferazy Renilla. MiRNA zostało przetworzone i mogło kontrolować ekspresję lucyferazy poprzez wiązanie się z sekwencją docelową.

Test reporterowy do analizy dojrzewania intronowego mikroRNA w komórkach ssaków

Tutaj opisujemy prosty protokół, który umożliwia in vitro ocenę obfitości znakowanych fluorescencyjnie mikroRNA w celu zbadania dynamiki pakowania mikroRNA i eksportu do pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV).

Śledzenie uwalniania miRNA do pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą cytometrii przepływowej

Poznaj metodę wzbogacania cząstek lipoprotein w mikroRNA oraz określania ich zawartości i szybkości transferu komórkowego. Protokół obejmuje delipidację, rekonstrukcję z spermine i dializę HDL.

Wzbogacenie natywnych cząstek lipoprotein w mikroRNA, a następnie określenie ich bezwzględnej/względnej zawartości mikroRNA i szybkości transferu komórkowego (Wideo) | JoVE Journal

Wzbogacenie natywnych cząstek lipoprotein w mikroRNA, a następnie określenie ich bezwzględnej/względnej zawartości mikroRNA i szybkości transferu komórkowego

Przeglądaj więcej filmów