Ocena angiogenezy terapeutycznej w mysim modelu niedokrwienia kończyn tylnych
8 czerwca 2019
Tutaj prezentowany jest krytyczny eksperymentalny model niedokrwienia kończyn tylnych, a następnie przeprowadzany jest zestaw testów funkcjonalnych, histologicznych i molekularnych w celu oceny skuteczności terapii angiogennych.
Ogólnym celem tego eksperymentu, naszego modelu niedokrwienia kończyn tylnych, jest rzucenie światła na eksperyment jako podstawę do kompleksowej oceny funkcjonalnych, histologicznych i molekularnych skutków przypuszczalnych czynników angiogennych. Protokół ten ustanawia standard testowania możliwych terapii angiogennych na małym modelu zwierzęcym, z potencjałem do przyszłych zastosowań w kontekście klinicznym. Ponieważ rewaskularyzacja nie jest odpowiednia u dwudziestu do trzydziestu procent pacjentów z krytycznym niedokrwieniem, angiogeneza terapeutyczna pojawiła się jako nowa strategia poprawy obfitości krwi w miejscu niedokrwienia.
Ten eksperymentalny protokół może zapewnić kompleksowe zrozumienie mechanizmów, za pomocą których terapie angiogenne wywierają swoje działanie w odniesieniu do ich skuteczności w każdym z ich wyników. Po potwierdzeniu braku reakcji na szczypanie palców u 22-tygodniowej czarnej sześcioosobowej myszy C57, ogol włosy z prawej kończyny tylnej i zabezpiecz zwierzę w pozycji grzbietowej do łokcia na podgrzewanej podkładce. Umieść zwierzę pod mikroskopem preparacyjnym.
I użyj ostrza skalpela chirurgicznego numer jedenaście, aby wykonać jednocentymetrowe nacięcie skóry nad udem prawej kończyny tylnej. Tępo wypreparuj podskórną tkankę tłuszczową, aby odsłonić pęczek nerwowo-naczyniowy. I użyj spiczastych kleszczy, nożyczek sprężynowych i uchwytu igły okulistycznej, aby otworzyć błonową osłonkę krętniczo-udową, aby odsłonić dystalne zewnętrzne naczynia biodrowe i udowe.
Po wypreparowaniu i oddzieleniu tętnicy i żyły od nerwu, użyj siedmiu niewchłanialnych szwów polipropylenowych O, aby podwiązać dystalną tętnicę i żyłę udową oraz dystalną tętnicę biodrową zewnętrzną i żyłę. Identyfikacja dystalnej tętnicy biodrowej zewnętrznej oraz podwiązanie i wycięcie dystalnej tętnicy biodrowej zewnętrznej i tętnicy udowej oraz żył mają kluczowe znaczenie dla powodzenia zabiegu. Użyj nożyczek sprężynowych, aby przeciąć odcinek tętnicy biodrowo-udowej i żyły między węzłami dystalnymi i proksymalnymi.
I zamknij nacięcie wchłanialnym szwem. Następnie podaj zwierzęciu roztwór przeciwuspokajający pod kątem międzyotrzewnowym i wróć do klatki domowej z monitorowaniem aż do pełnego wyzdrowienia. Aby zebrać mięśnie brzuchatego łydki, usuń skórę z obu tylnych kończyn.
I użyj bawełnianego wacika, aby oddzielić skórę od mięśni. Trzymając ścięgno Achillesa, użyj nożyczek sprężynowych, aby oddzielić mięsień od kości piszczelowej i strzałkowej aż do stawu kolanowego. I oddziel mięsień dwugłowy uda od mięśnia brzuchatego łydki.
Użyj nożyczek sprężynowych, aby przeciąć przyczepy mięśnia brzuchatego łydki na poziomie stawu kolanowego. I użyj 10% trigasanthu, aby ustawić zebrane mięśnie w orientacji poprzecznej na małym krążku korkowym. Następnie zatrzaskowo zamroź próbki w izopentanie chłodzonym ciekłym azotem do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
W przypadku laserowego wychwytywania mikrodypilar kapilarnych, po uzyskaniu 12 mikrometrowych odcinków próbek mięśni, przymocuj tkanki do szkiełek w 50 mililitrach schłodzonego czystego acetonu na pięć minut w temperaturze minus dwudziestu stopni Celsjusza. Po wysuszeniu na powietrzu i zakreśl każdą próbkę hydrofobowym pisakiem. I ponownie uwodnić próbki dwoma molowymi chlorkami sodu w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Pod koniec ponownego nawodnienia oznacz próbki odpowiednim przeciwciałem pierwszorzędowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnie dwa trzyminutowe płukania świeżym dwumolowym chlorkiem sodu w PBS na pranie. Po drugim przemyciu oznaczyć skrawki odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym przez trzydzieści minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie dwukrotnie przepłukać chlorkiem sodu w PBS, jak pokazano.
Następnie oznacz próbki kompleksem peroksydazy sprzężonej z awidyną przez trzydzieści minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie umyj i przez pięć minut etykietuj substratem peroksydazy DAB. Pod koniec inkubacji odwodnić tkanki w sekwencyjnych lodowatych emersjach 90% etanolu i 100% etanolu.
Następnie użyj późniejszego systemu mikrodysekcji, wyposażonego w impuls do lasera półprzewodnikowego o długości 355 nanometrów, aby wypreparować 10 000 naczyń włosowatych na mysz i katapultować naczynia włosowate do samoprzylepnej nasadki do mikrofuge. Jak pokazano, całkowitą utratę perfuzji kończyn tylnych obserwuje się natychmiast po indukcji niedokrwienia kończyn tylnych. Ilościowa ocena przepływu krwi, wyrażona jako stosunek ISC do NISC kończyny, wykazała znacznie zwiększoną perfuzję krwi kończyn u myszy narażonych na bodziec pro-angiogenny w dniach 15 i 45 po HLI.
Kwantyfikacja naczyń włosowatych CD31 dodatnich w odcinkach histologicznych skrawków tkanki mięśniowej brzuchatego łydki pokazuje, że gęstość naczyń włosowatych jest większa w kończynie niedokrwiennej w porównaniu z kończyną nieniedokrwienną. Zgodnie z oczekiwaniami. Ale efekt ten jest jeszcze bardziej wzmocniony po leczeniu środkiem proangiogennym.
Gęstość naczyń pobocznych również konsekwentnie wzrasta w kończynie niedokrwiennej i wzrost ten jest znacznie wyższy po ekspozycji na bodziec proangiogenny. Analiza reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą ekspresji genów pro-angiogennych w komórkach śródbłonka CD31 dodatnich wykazuje wyraźną różnicę w ekspresji genów między myszami narażonymi lub nie narażonymi na działanie czynnika proangiogennego. Ważne jest, aby użyć starszej igły okulistycznej, aby otworzyć błonową osłonkę biodrowo-udową, aby uniknąć rozerwania tętnicy i żyły podczas rozwarstwiania naczynia.
Naczynie reaguje na niedokrwienie kończyn tylnych w łatwo możliwych do oceny pomiarach perfuzji opartych na laserowym dopplerze, a histologiczna kwantyfikacja gęstości naczyń włosowatych pozwala nam ocenić angiogenezę.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia eksperymentalny model niedokrwienia kończyny dolnej, opracowany w celu oceny skuteczności terapii angiogennych za pomocą analiz funkcjonalnych, histologicznych i molekularnych. Protokół ma na celu stworzenie podstaw do testowania potencjalnych czynników angiogennych w modelu małych zwierząt.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Angiogeneza
- niedokrwienie
Wprowadzenie
- Rewaskularyzacja jest nieodpowiednia dla 20-30% pacjentów z krytycznym niedokrwieniem.
- Angiogeneza terapeutyczna stanowi nowatorską strategię poprawy perfuzji krwi.
- Celem badania jest zrozumienie mechanizmów terapii angiogennych.
- Model ten może znaleźć zastosowanie w przyszłej praktyce klinicznej.
Cel badania
- Ocena efektów funkcjonalnych terapii angiogennych.
- Ocena zmian histologicznych w odpowiedzi na leczenie.
- Analiza efektów molekularnych czynników angiogennych.
Zastosowane metody
- Utworzenie modelu niedokrwienia kończyny tylnej u myszy.
- Oceny funkcjonalne z wykorzystaniem reakcji na uciśnięcie palców.
- Analiza histologiczna po zastosowaniu leczenia.
- Badania molekularne w celu oceny skuteczności terapii.
Główne wyniki
- Wykazano skuteczność modelu w ocenie terapii angiogennych.
- Przedstawiono spostrzeżenia dotyczące wyników funkcjonalnych i histologicznych.
- Zidentyfikowano potencjalne mechanizmy działania czynników angiogennych.
- Wsparto przyszłe zastosowania kliniczne uzyskanych wyników.
Wnioski
- Model niedokrwienia kończyny tylnej jest cennym narzędziem badawczym.
- Terapie angiogenne wykazują potencjał w poprawie stanów niedokrwiennych.
- Konieczne są dalsze badania w celu zbadania implikacji klinicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół ustanawia odtwarzalny mysi model niedokrwienia kończyny dolnej w celu oceny terapii angiogennych w krytycznym niedokrwieniu kończyn, stanie, w którym 20-30% pacjentów nie kwalifikuje się do rewaskularyzacji. Umożliwiając funkcjonalną, histologiczną i molekularną ocenę regeneracji perfuzji, gęstości naczyń kapilarnych oraz ekspresji genów angiogennych, model ten wspiera walidację celów i ograniczanie ryzyka mechanistycznego w przedklinicznych programach badań nad angiogenezą. Zapewnia on ramy translacyjne pozwalające na priorytetyzację głównych kandydatów przed podjęciem inwestycji w badania kliniczne.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących angiogenezy terapeutycznej poprzez mierzalne wyniki perfuzji i gęstości naczyń włosowatych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowany model chirurgiczny pozwalający wyizolować wpływ bodźców proangiogennych na odpowiedź tkanki niedokrwiennej.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność co do wybranego celu poprzez powiązanie ekspresji genów angiogennych w komórkach śródbłonka z funkcjonalną regeneracją przepływu krwi.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Generuje ilościowe punkty końcowe, w tym współczynniki perfuzji dopplerowskiej laserowej, gęstość naczyń kapilarnych CD31-dodatnich oraz liczbę naczyń obocznych do przesiewu związków.
- Powtarzalność: Wykorzystuje zstandaryzowane procedury ligacji i wycięcia, aby zapewnić spójną indukcję niedokrwienia w kohortach badawczych.
- Skalowalność: Umożliwia mikrodysekcję laserową komórek śródbłonka w celu profilowania molekularnego w grupach terapeutycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modeluje patofizjologię krytycznego niedokrwienia kończyn w celu oceny mechanizmów terapii angiogennej w warunkach odzwierciedlających stan kliniczny.
- Ciągłość translacyjna: Łączy molekularne sygnatury angiogenne z wynikami histologicznymi i funkcjonalnymi w celu podejmowania decyzji w oparciu o biomarkery.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Umożliwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) na podstawie wielopoziomowej walidacji perfuzji, histologii i ekspresji genów.
Integracja potoków i procesów roboczych
Model ten wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczne testy skuteczności, zapewniając istotny z punktu widzenia choroby układ do oceny terapii antyangiogennych.
- Biologia odkryć: Wspiera testowanie hipotez dotyczących czynników angiogennych poprzez funkcjonalne pomiary perfuzji oraz histologiczne odczyty angiogenezy.
- Przesiewanie: Dostarcza ustandaryzowanych, ilościowych wyników w celu porównania odpowiedzi kończyn niedokrwiennych i leczonych.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie wskaźników perfuzji, gęstości naczyń kapilarnych oraz ekspresji genów metodą RT-PCR w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Koreluje ekspresję genów angiogennych w komórkach śródbłonka z przebudową naczyniową na poziomie tkankowym w celu uzyskania wglądu w mechanizmy działania.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do iteracyjnego testowania czynników angiogennych w wielu projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez korelację ekspresji genów angiogennych z funkcjonalną perfuzją i wzrostem naczyń włosowatych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanym procedurom chirurgicznym, histologicznym i molekularnym.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje przedkliniczne typu go/no-go poprzez integrację wieloparametrycznych danych o skuteczności.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów angiogennych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zwalidowane oddziaływanie na cel i modulację szlaków sygnałowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikrochirurgicznego podwiązania i wycięcia naczyń w modelach mysich.
- Zależność od infrastruktury do obrazowania perfuzji metodą laserowskiego Dopplera, barwienia histologicznego oraz laserowej mikrodysekcji uchwytem.
- Konieczność standaryzacji procesów histologicznych, znakowania przeciwciałami oraz procedur RT-PCR w celu uzyskania spójnych wyników analiz molekularnych.
- Uwzględnienie kwestii adaptacyjnych przy stosowaniu modelu w odniesieniu do różnych tuteł genetycznych lub metod terapeutycznych.
- Ograniczenie wynikające z niezdolności modelu mysiego do pełnego odtworzenia chorób współistniejących występujących przy krytycznym niedokrwieniu kończyn u ludzi.
