Nowatorski i translacyjny szczurzy model wstrząsu mózgu łączący siłę i rotację z mikrodializą mózgową in vivo

Metoda ta tworzy paradygmat dla przyszłych badań, zapewniając naukowcom wiarygodny i translacyjny model wstrząsu mózgu, który umożliwia podłużną charakterystykę molekularnych skutków wstrząsu mózgu. Ten model szczurzy łączy w sobie mikrodializę umożliwiającą ciągłą kwantyfikację analitu z techniką owijania klinowego, wywierającą gwałtowne przyspieszanie i zwalnianie głowy i tułowia, która naśladuje istotną cechę ludzkiego urazu czaszkowo-mózgowego. Implikacje tej techniki rozciągają się na badania terapeutyczne wstrząsu mózgu, ponieważ oferuje cenną okazję do zbadania mechanizmu i skuteczności środków farmakologicznych in vivo i nieprzerwanie.

Zdecydowanie zaleca się pracę w dwuosobowych zespołach podczas etapów wstrząsu mózgu i pozorowanej indukcji tej metody, aby ograniczyć błędy manipulacji i zmaksymalizować wydajność podczas eksperymentu. Procedurę zademonstruje Chloe Provost, technik z naszego laboratorium. Aby rozpocząć procedurę, ogol głowę zwierzęcia za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia.

Oczyść ogolony obszar roztworem 2% alkoholu izopropylowego i 2% glukonianu chlorheksydyny trzy razy. Następnie nałóż smarującą maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Następnie umieść szczura w aparacie stereotaktycznym.

Bardzo ostrożnie włóż paski douszne do kanałów słuchowych i dokręć zacisk nosowy. Następnie przymocuj kaniulę prowadzącą ze stali nierdzewnej o rozmiarze 26 do ramienia uchwytu w aparacie stereotaktycznym. Wykonaj trzycentymetrowe nacięcie w linii środkowej na skórze głowy.

Pozostaw czaszkę czystą, instalując cztery zaciski wokół nacięcia. Mocno zeskrob okostną z czaszki ostrzem chirurgicznym, aż widoczne będą szwy bregma i lambda. Jeśli wystąpi krwawienie, utrzymuj silny nacisk na czaszkę za pomocą gazika lub aplikatora z bawełnianą końcówką.

Potwierdź, czy czaszka jest prawidłowo ustawiona na aparacie stereotaktycznym, porównując współrzędne grzbietowo-brzuszne szwów bregma i lambda. Zidentyfikuj współrzędne przednio-tylne, przyśrodkowo-boczne i grzbietowo-brzuszne szwu bregma jako punkty odniesienia dla współrzędnych kaniuli prowadzącej. Następnie, biorąc współrzędne szwu bregma jako odniesienia, oblicz współrzędne miejsca implantacji kaniuli prowadzącej w hipokampie.

Zaznacz dokładne miejsce implantacji za pomocą markera. Następnie wywierć otwór o średnicy 0,5 milimetra przez czaszkę w miejscu docelowym kaniuli prowadzącej. Wywierć trzy inne otwory około pięciu milimetrów wokół tego punktu, aby wkręcić w czaszkę trzy kotwiące, które zestalą kaniulę po nałożeniu akrylowego cementu dentystycznego.

Następnie włóż kaniulę do hipokampa i przymocuj ją cementem dentystycznym. Uważaj, aby nie rozlać nadmiaru cementu dentystycznego wokół miejsca, w którym zostanie upuszczony ciężar. Pozostaw cement do wyschnięcia na dwie minuty, a następnie wyjmij ramię uchwytu z kaniuli.

Włóż zdejmowany zasłon ze stali nierdzewnej do kaniuli, aby uniknąć przesiąkania płynu mózgowo-rdzeniowego i ryzyka infekcji. Następnie zdejmij cztery zaciski, odciągnij cofniętą skórę i zszyj ją chirurgiczną nicią do szwów. Następnie należy wyjąć szczura z aparatu i wstrzyknąć podskórnie buprenorfinę w celu leczenia bólu.

Umieść gryzonia z powrotem w klatce z poduszką grzewczą pod spodem, aż odzyska przytomność. Następnie zwróć go do placówki opieki nad zwierzętami na okres rekonwalescencji wynoszący siedem dni pod ścisłym nadzorem. W tej procedurze należy wyjąć zasłonę z kaniuli i powoli włożyć sondę do mikrodializy.

Następnie przymocuj zespół sondy do sprężyny ze stali nierdzewnej przymocowanej do ramienia dźwigni obrotowej i przeciwwagi z płynnym stojakiem pierścieniowym i zaciskami, aby zwierzę mogło swobodnie poruszać się w klatce. Szczury na uwięzi mają dostęp ad libitum do pożywienia i wody podczas całej procedury mikrodializy. Za pomocą pompy do mikroinfuzji dostarczyć perfuzat do sondy i pobrać dialilat z przewodu wylotowego stopionej krzemionki.

Co najmniej godzinę i 30 minut przed rozpoczęciem zabiegu należy zwiększyć ciśnienie sondy do roboczego natężenia przepływu na poziomie jednego mikrolitra na minutę. Sprawdź, czy natężenie przepływu sondy jest stałe, mierząc objętość w czasie za pomocą pipety. Następnie zbierz każdą próbkę dializatu do fiolki z frakcją wstępnie załadowaną jednym mikrolitrem 0,25 mola na litr kwasu nadchlorowego, aby zapobiec degradacji analitu.

Przechowywać próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza do późniejszej analizy. Po pobraniu ostatniej próbki wyjmij sondę do mikrodializy z kaniuli i ponownie włóż zasłonę przed powrotem szczura do placówki opieki nad zwierzętami. Aby zainstalować aparat wstrząsowy, przyklej mocno blachę aluminiową do ramy z pleksiglasu w kształcie litery U, która zawiera piankową poduszkę.

Użyj ostrej żyletki, aby zrobić nacięcia w blasze aluminiowej. Przyklej taśmą szczelinową blachę aluminiową. Następnie umieść ramkę z pleksi pod rurką prowadzącą z PVC.

Przytrzymaj rurkę prowadzącą z PVC na miejscu za pomocą clamp stojak na 3-1/2 centymetra nad szczelinowym aluminium. Przymocuj nylonową żyłkę muchową przez metalową pętlę tak, aby spód ciężarka znajdował się na wysokości 2-1/2 centymetra nad szczelinowym aluminium, aby zapobiec wielokrotnym uderzeniom, gdy szczur upada na piankową poduszkę po uderzeniu. Następnie przymocuj nylonową żyłkę muchową do stojaka zaciskowego.

Przeciągnij ciężar przez rurkę PVC za pomocą nylonowej żyłki muchowej. Przytrzymaj go na miejscu, wkładając klucz imbusowy przez wstępnie wywiercone otwory na wysokości jednego metra nad szczelinową folią aluminiową. Aby wywołać wstrząs mózgu, połóż zwierzę na klatce piersiowej na szczelinowej blasze aluminiowej tak, aby jego głowa znajdowała się bezpośrednio na ścieżce mosiężnego ciężarka.

Zdejmij stożek nosowy i pociągnij klucz imbusowy. Ciężar spadnie pionowo przez rurkę PVC i uderzy w głowę szczura. W rezultacie szczur przejdzie szybki obrót o 180 stopni i wyląduje na plecach.

Wyjmij szczura z piankowej poduszki i połóż go na plecach w klatce. Użyj zegara cyfrowego, aby zmierzyć czas odruchu prostującego jako znak powrotu do zdrowia i ciężkości urazu. Czas odruchu prostowania to całkowity czas od uderzenia do momentu, gdy szczur się obudzi i spontanicznie wróci do pozycji leżącej lub zacznie chodzić.

Zwróć uwagę na wszelkie oznaki śmierci, złamania lub krwawienia. W celu pozorowanej indukcji umieść zwierzę na klatce piersiowej na szczelinowej blasze aluminiowej tak, aby jego głowa leżała bezpośrednio na ścieżce mosiężnego ciężarka. Usuń stożek nosowy, a następnie usuń zwierzę z blachy aluminiowej bez ciągnięcia klucza imbusowego.

Następnie połóż szczura na plecach w klatce. Użyj cyfrowego timera, aby zmierzyć czas prawowania jako wskaźnik odbudowy neurologicznej. Zwierzęta z grupy rannej miały znacznie wydłużony czas prostowania średnio w porównaniu z przypadkami pozorowanymi i wydawały się oszołomione po odzyskaniu przytomności.

Spośród 10 przypadków z grupy wstrząśnienia mózgu tylko jedno zwierzę wykazywało niewielkie oznaki krwawienia pod miejscem uderzenia po spadku masy ciała. Znaczny wzrost stężenia glutaminianu zewnątrzkomórkowego zaobserwowano w regionie CA1 hipokampa w ciągu pierwszych 10 minut po indukcji urazu w porównaniu z urazem pozorowanym. Należy pamiętać, że podczas indukcji wstrząsu mózgu należy unikać uderzania ciężarkiem w kaniulę, ponieważ spowodowałoby to obrażenia rdzenia szczura, które są znacznie poważniejsze niż wstrząśnienie mózgu.

Metodę tę można zastosować do badania powtarzających się wstrząśnień mózgu, ponieważ procedura jest bliskim urazem głowy, który można powtórzyć u tych samych zwierząt w różnych punktach czasowych.