Określanie gęstości dróg żółciowych w wątrobie myszy

Protokół ten umożliwia badaczowi ilościowe określenie rozwoju dróg żółciowych w mysich modelach choroby wątroby. Pozwala również na ocenę wpływu modyfikatorów genetycznych na rozwój dróg żółciowych. Zaletą tej techniki jest to, że jest to prosta, czuła i ilościowa metoda bezpośredniej oceny rozwoju dróg żółciowych.

Na początek, gdy skóra jest napięta kleszczami, użyj małych nożyczek, aby wykonać poprzeczne nacięcie około jednego cala poniżej klatki piersiowej myszy poddanej eutanazji. Odsłoń całą brzuszną powierzchnię wątroby. Użyj małych nożyczek, aby ostrożnie przeciąć więzadła łączące wątrobę z innymi narządami w jamie brzusznej.

Następnie przeciąć wspólny przewód żółciowy, aby odłączyć wątrobę od jelita. Trzymaj się pęcherzyka żółciowego i ostrożnie usuń wątrobę. Natychmiast umieść go w 50-mililitrowej tubce wypełnionej w trzech czwartych 4% paraformaldehydem.

Aby utrwalić tkankę wątroby, inkubuj ją w 4% PFA w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 48 godzin. Po serii płukań etanolem przemyj wątrobę środkiem czyszczącym trzy razy przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Aby rozpocząć zatapianie, umyj kasetę z chusteczkami w formie do chusteczek higienicznych trzy razy przez 30 minut w wosku parafinowym podgrzanym do 60 stopni Celsjusza.

Następnie wypełnij formę bibułkową woskiem parafinowym do wysokości trzech czwartych i trzymaj ją na bloku grzewczym w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Umieść wątrobę w formie brzuszną stroną skierowaną do góry. Po ostrożnym wyjęciu formy z bloku grzewczego należy położyć górną część kasety na formie.

Uzupełnij gorącą parafiną w płynie i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej przez noc. Po wyjęciu bloku wątroby z formy, za pomocą mikrotomu rozpocznij cięcie przez powierzchowną grzbietową stronę wątroby, wykonując pięć mikrometrów sekcji. Sprawdź powierzchowne skrawki pod mikroskopem preparacyjnym, aby upewnić się, że nie są ścięte ani złożone.

Aby przetworzyć szkiełka do immunohistochemii, wybierz jedno szkiełko na genotyp do analizy i myj je przez 15 minut w ksylenie, 100% etanolu, 95% etanolu i na końcu 70% etanolu. Po umyciu szkiełka w zjonizowanej wodzie zanurz je w roztworze do pobierania antygenu o wysokim pH na bazie Tris. Następnie podgrzej go pod ciśnieniem w szybkowarze przez trzy minuty w temperaturze 10 funtów na cal kwadratowy.

Po pozostawieniu szkiełka do ostygnięcia do temperatury pokojowej, użyj pisaka PAP, aby obrysować sekcje na szkiełku. Po umyciu PBS Tween, zablokuj skrawki tkanki, dodając 100 mikrolitrów roztworu blokującego na sekcję i inkubuj pod przykryciem w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę. Nałożyć 100 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu przeciwciała zawierającego wszystkie trzy przeciwciała pierwszorzędowe na każdą sekcję i inkubować je w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Po umyciu szkiełek dodać 100 mikrolitrów roztworu przeciwciała drugorzędowego zawierającego oba przeciwciała drugorzędowe i inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej. Na koniec nałóż podłoże montażowe i szkiełko nakrywkowe na szkiełka. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby wykonać 20-krotne zdjęcia z 1-krotnym zoomem każdej sekcji.

Upewnij się, że każda żyła wrotna w wątrobie jest zobrazowana. Utwórz arkusz kalkulacyjny z następującymi kolumnami: Liczba zwierzęcia/próbki, Numer obrazu, liczba żył wrotnych i liczba dróg żółciowych. Zidentyfikuj i zapisz liczbę żył wrotnych na obrazie dla każdego obrazu.

Następnie zidentyfikuj drożne drogi żółciowe na każdym obrazie na podstawie obecności cholangiocytów otaczających definiowalne światło. Struktury te powinny być odrębne i oddzielone mezenchymą od innych komórek cytokeratyno-dodatnich o szerokim spektrum. Jednym z głównych wyzwań związanych z tą techniką jest identyfikacja drożnych dróg żółciowych.

Określenie, co to jest kanał patentowy, wymaga analizy kształtu kanału i komórek otaczających światło. Policz każdy drożny przewód żółciowy i umieść go w tej samej kolumnie, co numer obrazu i powtórz dla każdego obrazu żyły wrotnej. Na koniec oblicz sumę wszystkich żył wrotnych i wszystkich dróg żółciowych w próbce wątroby i oblicz stosunek przewodu żółciowego do żyły wrotnej dla próbki wątroby.

Wątroby myszy P30 zostały pocięte i wybarwione pod kątem CK8 i CK19 wraz z markerem naczyniowym, alfa-SMA, w celu określenia stosunku BD do PV. Kiedy wszystkie żyły wrotne w każdym płacie wątroby są obrazowane, żyły wrotne zdefiniowano jako naczynia barwione alfa-SMA, które mają sąsiednie barwienie cytokeratyną o szerokim spektrum. Struktury barwnikowe alfa-SMA bez cytokeratyny o szerokim spektrum działania były żyłami centralnymi, które zostały wyłączone z analizy.

Kanaliki patentowe mają wyraźnie określone światło, które jest otoczone cytokeratynami o szerokim spektrum cytokeratyn-dodatnich i są zwykle oddzielone od pobliskich przewodów lub cholangiocytów mezenchymią. Komórki cytokeratyny o szerokim spektrum działania, które nie mają definiowalnego światła, nie są wliczane do całkowitej liczby dróg żółciowych. Wycinek wątroby zwierzęcia typu dzikiego pokazuje żyłę wrotną związaną z w pełni opatentowanym przewodem wraz z kilkoma nieinkorporowanymi komórkami.

Reprezentatywny wycinek wątroby od heterozygotycznego zwierzęcia JAG1 nie wykazuje obecności drożnych dróg żółciowych wokół trzech żył wrotnych. Wszystkie komórki cytokeratynowo-dodatnie o szerokim spektrum działania są niewłączone i dlatego nie powinny być liczone. Analiza stosunku BD do PV dla trzech zwierząt heterozygotycznych typu dzikiego i trzech heterozygotycznych JAG1 pokazuje, w jaki sposób te dwa genotypy można łatwo rozróżnić na podstawie liczby dróg żółciowych.

Ważne jest, aby ocenić wszystkie naczynia wrotne pod kątem dróg żółciowych. Jest to szczególnie ważne dla określenia gęstości dróg żółciowych, jeśli występuje zmienność fenotypowa w wątrobie. Technika ta została wykorzystana do identyfikacji genetycznego supresora fenotypu dróg żółciowych w mysim modelu Helgasona.

Dlatego może być przydatny w ocenie metod leczenia zwierzęcych modeli chorób dróg żółciowych.