Izolacja miocytów przedsionkowych od dorosłych myszy
July 25th, 2019
Ten protokół jest używany do izolowania pojedynczych kardiomiocytów przedsionkowych z serca dorosłej myszy za pomocą metody trawienia fragmentów. Podejście to stosuje się do izolacji miocytów prawego lub lewego przedsionka, które można wykorzystać do scharakteryzowania elektrofizjologii miocytów przedsionków w badaniach typu patch-clamp.
Wyizolowanie miocytów przedsionków do wykorzystania w eksperymentach z klamrą znacznie poszerzyło naszą wiedzę i zrozumienie elektrofizjologii przedsionków zarówno na poziomie komórkowym, jak i molekularnym. Stosowane przez nas podejście pozwala skutecznie uzyskać dużą liczbę izolowanych miocytów przedsionkowych, które można wykorzystać do badania elektrofizjologii komórkowej przedsionków i arytmogenezy w szerokim zakresie modeli i warunków eksperymentalnych. Przyjęliśmy podejście polegające na trawieniu tułowia w celu wyizolowania miocytów przedsionkowych.
Zaletą tego podejścia jest to, że pozwala badaczowi wybrać konkretny region, który chce zbadać. Procedurę tę należy rozpocząć od przygotowania sprzętu i roztworów zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Rozłóż płytkę preparacyjną, narzędzia do preparacji, pipetę Pasteura i wypolerowane ogniowo pipety.
Protokół ten można przeprowadzić na samcach lub samicach myszy typu dzikiego, myszach przenoszących mutacje genetyczne i mysich modelach choroby. Po eutanazji myszy zgodnie z opisem w protokole tekstowym, umieść mysz na ręczniku papierowym lub tablicy korkowej i przyklej łapy taśmą, aby utrzymać mysz na miejscu. Zwilż klatkę piersiową myszy 70% etanolem.
Usuń futro i skórę pokrywającą klatkę piersiową za pomocą zakrzywionych nożyczek. Następnie użyj kleszczyków do zębów szczura, aby podnieść mostek, a następnie przetnij przeponę wzdłuż krawędzi żeber. Usuń całą klatkę piersiową za pomocą zakrzywionych nożyczek, aby odsłonić serce.
Aby usunąć przyrostek przedsionkowy, delikatnie unieś wyrostek za pomocą cienkich kleszczy preparacyjnych i wytnij go nożyczkami sprężynowymi. Natychmiast przenieś przydatek przedsionka do pokrytego silikonem naczynia preparacyjnego zawierającego 20 mililitrów podgrzanego, zmodyfikowanego roztworu Tyrode'a o pH 7,4. Umieść jedną szpilkę preparacyjną u góry i jedną szpilkę u dołu otworu uszka przedsionkowego.
Za pomocą pipety Pasteura przepłucz przedsionki podgrzanym zmodyfikowanym roztworem Tyrode'a o pH 7,4, aby usunąć krew. Otwórz wyrostek przedsionka, przecinając go wzdłuż jego górnej i dolnej krawędzi. Następnie przypnij rogi wyrostka przedsionkowego, aby utworzyć płaski prostokątny kawałek tkanki.
Pokrój wyrostek przedsionka na około osiem do 10 pasków o równej wielkości za pomocą nożyczek sprężynowych i cienkich kleszczyków. Zwróć uwagę, że paski kurczą się po odcięciu od głównego kawałka tkanki. Za pomocą wypolerowanej pipety o małym otworze przenieś paski tkanek do pierwszej probówki zawierającej podgrzany zmodyfikowany roztwór Tyrode'a o pH 6,9.
Poczekaj pięć minut. Teraz użyj polerowanej pipety o średnim otworze, aby przenieść paski tkanki do drugiej okrągłej probówki z dnem zawierającej zmodyfikowany roztwór Tyrode'a o pH 6,9. Aby umyć paski chusteczek, zakryj pięciomililitrową rurkę z okrągłym dnem i delikatnie odwróć rurkę trzy razy.
Pozwól, aby paski tkanek osiadły na dnie probówki przed przeniesieniem pasków tkanki do trzeciej probówki za pomocą polerowanej pipety o średnim otworze. Ponownie umyj paski przez odwrócenie. Następnie przenieś paski tkanek do roztworu enzymu za pomocą polerowanej pipety o średnim otworze i inkubuj przez 30 minut.
Obracaj probówkę co trzy do pięciu minut, aby zapobiec przyleganiu pasków tkanki do siebie. Na początku trawienia enzymatycznego paski tkanek szybko osiadają po zawirowaniu. Po około 20 minutach trawienia paski tkanek zaczynają unosić się w roztworze enzymatycznym po zawirowaniu.
W tym czasie paski tkanki przedsionkowej również zmieniają swój wygląd z bladoróżowego na biały podczas trawienia. Po roztrawieniu enzymatycznym wykonaj trzy płukania przy użyciu 2,5 mililitra roztworu KB w przygotowanych pięciomililitrowych probówkach z okrągłym dnem. Przy każdym myciu delikatnie odwróć probówkę trzy razy przed przeniesieniem chusteczki do następnej probówki za pomocą polerowanej pipety o średnim otworze.
Po ostatnim umyciu przenieś paski do 14-mililitrowej rurki z okrągłym dnem zawierającej 2,5 mililitra roztworu KB. Poczekaj pięć minut. Delikatnie rozcieraj tkankę przez 7,5 minuty za pomocą polerowanej pipety o szerokim otworze.
Spowoduje to mechaniczną dysocjację pasków tkankowych i uzyskanie mętnego roztworu wypełnionego pojedynczymi miocytami przedsionków. Pierwsza z rozcierania musi być dostosowana do uzyskania dużej liczby komórek bez uszkodzenia komórek. Weź pod uwagę takie czynniki, jak wiek myszy i stan chorobowy.
Dostosuj siłę rozcierania do indywidualnej izolacji, zmieniając zarówno częstotliwość, jak i prędkość wyrzucania pasków tkankowych z polerowanej pipety o szerokim otworze. Delikatne rozcieranie powoduje niską wydajność komórek, podczas gdy ostre rozcieranie daje wiele martwych komórek. Napełnij 14-mililitrową probówkę z okrągłym dnem zawierającą rozdrobnione paski tkankowe roztworem KB do końcowej objętości od siedmiu do 10 mililitrów, w zależności od pożądanej gęstości komórek do użytku eksperymentalnego.
Umieść tę probówkę w temperaturze pokojowej na godzinę. Po tym okresie inkubacji komórki mogą być wykorzystywane do różnych eksperymentów przez okres do siedmiu godzin. Pokazano tutaj przykłady izolowanych miocytów przedsionkowych od normalnych myszy.
Izolowane miocyty przedsionkowe mają zwykle około 100 mikronów długości i 10 mikronów szerokości z wyraźnymi prążkami. Pojemność izolowanych miocytów przedsionkowych wynosi zwykle od 40 do 70 pikofaradów. Przedstawiono przykład potencjału czynnościowego miocytów przedsionków zarejestrowanego przy użyciu techniki perforowanego patch-clamp w obecnym trybie zaciskowym.
Reprezentatywna rodzina prądów sodowych została zarejestrowana w całej konfiguracji ogniw techniki patch-clamp. Prądy te rejestrowano przy użyciu 50-milisekundowych kroków cęgowych napięcia między ujemnymi 100 a dodatnimi 10 miliwoltami przy potencjale podtrzymania ujemnym 120 miliwoltów. Poniżej przedstawiono sumaryczną zależność napięcia prądu sodu.
Reprezentatywną rodzinę prądów wapniowych zarejestrowano przy użyciu 250 milisekundowych stopni cęgowych napięcia między ujemnymi 60 a dodatnimi 80 miliwoltami przy potencjale podtrzymania ujemnym 70 miliwoltów. W tym miejscu wyświetlana jest sumaryczna zależność napięcia prądu wapniowego. Reprezentatywną rodzinę prądów potasowych zarejestrowano z potencjałem podtrzymania ujemnym 80 miliwoltów przy użyciu 500-milisekundowych kroków cęgowych między ujemnymi 120 miliwoltami a dodatnimi 80 miliwoltami.
Tutaj pokazana jest sumaryczna zależność napięcia prądu dla całkowitego prądu potasu. Należy pamiętać, że skuteczna izolacja miocytów przedsionków zależy zarówno od odpowiedniego trawienia enzymatycznego, jak i mechanicznej dysocjacji komórek podczas trituracji. Po wyizolowaniu miocyty przedsionkowe mogą być wykorzystywane w eksperymentach typu patch-clamp do pomiarów morfologii potencjału czynnościowego i prądów jonowych, takich jak prądy sodowe, prądy wapniowe i prądy potasowe.
Badanie zmian w elektrofizjologii miocytów przedsionków miało zasadnicze znaczenie dla określenia komórkowych i molekularnych podstaw zagrażających życiu arytmii przedsionków oraz dla opracowania i testowania związków antyarytmicznych w arytmii przedsionkowej.
Przegląd
Ten protokół opisuje izolację pojedynczych komórek mięśniowych przedsionków z serca dorosłego myszy za pomocą metody trawienia fragmentów. Ta metoda umożliwia charakteryzację elektrofizjologii komórek przedsionkowych w badaniach patch-clamp.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Fizjologia układu krążenia
- Elektrofizjologia
- Biologia komórki
Tło
- Komórki przedsionkowe odgrywają kluczową rolę w rozumieniu funkcji serca.
- Techniki izolacji są niezbędne do badania elektrofizjologii komórkowej.
- Metoda trawienia fragmentów umożliwia ukierunkowane badanie określonych regionów przedsionków.
- Ta metoda może być stosowana w różnych modelach mysich, w tym w tych z mutacjami genetycznymi.
Cel badania
- Izolowanie komórek przedsionkowych do eksperymentów patch-clamp.
- Poszerzenie wiedzy na temat elektrofizjologii przedsionków i arytmogenzezy.
- Zapewnić niezawodną metodę uzyskania dużej liczby żywych komórek.
Zastosowanie metod
- Przygotowanie sprzętu i roztworów do dysekcji.
- Dysekcja serca myszy i izolacja wypustek przedsionkowych.
- Enzymatyczne trawienie pasków tkanki w celu uzyskania pojedynczych komórek mięśniowych.
- Tryturacja tkanki w celu mechanicznego rozdzielenia komórek.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja komórek przedsionkowych z wyraźnymi prążkami.
- Charakteryzacja prądów sodu, wapnia i potasu za pomocą technik patch-clamp.
- Demonstracja żywotności izolowanych komórek przez maksymalnie siedem godzin.
- Wydajność izolowanych komórek dostosowana poprzez modyfikację technik tryturacji.
Wnioski
- Metoda trawienia fragmentów jest skuteczna w izolowaniu komórek przedsionkowych.
- Ta metoda poprawia badanie elektrofizjologii przedsionków.
- Izolowane komórki mogą być wykorzystywane do różnych zastosowań eksperymentalnych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Isolation of atrial myocytes enables mechanistic de-risking of arrhythmogenic targets by providing a disease-relevant system for electrophysiological profiling. This approach supports target validation and assay development in cardiovascular discovery programs by yielding quantifiable ionic current data. The method enhances predictive confidence in lead identification through direct measurement of drug effects on atrial excitability and conduction.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring action potential morphology and ionic currents in genetically defined models.
- Operational Value: Provides a reproducible source of primary atrial cardiomyocytes for consistent pharmacological screening.
- Scientific Value: Supports biological de-risking of targets involved in atrial fibrillation pathophysiology through direct electrophysiological readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative dependent variable measurements (e.g., current density, activation kinetics) essential for assay standardization.
- Operational Value: Yields scalable numbers of isolated myocytes compatible with automated patch-clamp platforms.
- Scientific Value: Enables preparation of validated biological systems for downstream compound evaluation under controlled experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates translational biomarker alignment by linking ion channel modulation to arrhythmia susceptibility in disease models.
- Operational Value: Supports continuity from discovery through preclinical validation using consistent cellular phenotypes.
- Scientific Value: Contributes to mechanistic de-risking by isolating variables that influence pro-arrhythmic substrate formation.
Pipeline & Workflow Integration
The isolated atrial myocyte preparation integrates into the discovery continuum from target engagement to functional validation in cardiovascular programs.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of ion channel targets via direct measurement of sodium, calcium, and potassium currents.
- Screening: Delivers assay-ready cells with reproducible electrophysiological phenotypes for compound library screening.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable outputs (current-voltage relationships, action potential duration) for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling electrophysiological assessment in genetic and disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation workflow applicable across wild-type, mutant, and disease-model mouse cohorts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target selection by reducing mechanistic ambiguity in atrial electrophysiology.
- Operational Value: Standardizes tissue dissociation and trituration parameters to ensure lot-to-lot consistency in cell yield and viability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early functional data on compound effects on atrial excitability.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of ion channel modulators based on atrial-specific safety and efficacy profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cardiac dissection, enzymatic digestion optimization, and patch-clamp electrophysiology.
- Depends on access to temperature-controlled solutions, fire-polished pipettes, and inverted microscopes with perfusion capability.
- Necessitates standardization of trituration force and duration across operators to maintain cellular integrity.
- Involves adaptation considerations for varying mouse age, strain, and disease status affecting tissue fragility.
- Includes practical limitations such as the 7-hour post-isolation viability window requiring same-day experimental planning.
