Patrząc na zewnątrz: izolacja polimerów i białek węglowodanowych uwalnianych przez sinice

Opracowane przez nas protokoły są ważne dla badania mechanizmów wydzielania cyjanobakterii i ich uwalnianych produktów, a mianowicie zewnątrzkomórkowych polimerów węglowodanowych i białek. Uzyskana wiedza pozwoli nam dostosować te produkty do kilku zastosowań, a mianowicie zastosowań biotechnologicznych i biomedycznych. Protokoły te są bardzo proste.

Mogą być one dostosowane do organizmu produkcyjnego, potrzeb użytkownika i końcowego zastosowania produktu. Główną zaletą tych protokołów jest to, że można je łatwo dostosować do innych żywych organizmów, w szczególności do innych bakterii. Te protokoły są łatwe.

Może być jednak konieczne wprowadzenie pewnych zmian w zależności od szczepu bakterii lub wymaganego stopnia czystości. Na początek uprawiaj szczep cyjanobakterii w standardowych warunkach. Mierz wzrost przy użyciu standardowych protokołów.

Następnie przenieś kulturę do membran dializacyjnych i dializ w co najmniej 10 objętościach wody dejonizowanej przez 24 godziny, ciągle mieszając. Odwirować kulturę w temperaturze 15 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut. Przenieść supernatant do nowej fiolki i wyrzucić osad.

Odwirować ponownie w temperaturze 20 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut, aby usunąć zanieczyszczenia, takie jak resztki ściany komórkowej lub lipopolisacharydy. Po odwirowaniu przenieść supernatant do szklanej zlewki i wyrzucić osad. Aby wytrącić polimer, dodaj dwie objętości 96% etanolu do supernatantu i inkubuj zawiesinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

W przypadku małych lub niewidocznych ilości wytrąconego polimeru należy odwirować zawiesinę w temperaturze 13 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 25 minut. Delikatnie wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad w jednym do dwóch mililitrów autoklawowanej wody dejonizowanej. Przenieść zawiesinę wodną do fiolki.

W przypadku widocznych, dużych ilości wytrąconego polimeru, wytrącony polimer należy zebrać za pomocą sterylnych metalowych kleszczyków do fiolki. Ściśnij polimer i wyrzuć nadmiar etanolu. Aby przeprowadzić proces liofilizacji zwany inaczej liofilizacją, należy przechowywać fiolki z wytrąconym polimerem w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez noc.

Liofilizuj polimer przez co najmniej 48 godzin. Następnie wysuszony polimer należy przechowywać w eksykatorze w temperaturze pokojowej do czasu dalszego użycia. Aby zagęścić podłoże, najpierw hoduj sinice w standardowych warunkach.

Monitoruj wzrost cyjanobakterii przy użyciu standardowych procedur. Następnie odwirować kultury 4 000 razy g w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Przenieść supernatant do kolby i wyrzucić osad z komórek.

Następnie przefiltruj zdekantowane podłoże przez filtr o wielkości porów 0,2 mikrona. Aby zagęścić pożywkę około 500 razy, należy użyć koncentratorów odśrodkowych z nominalną granicą masy cząsteczkowej wynoszącą trzy kilodaltony, aby odwirować 4 000 razy g i 15 stopni Celsjusza przez maksymalnie jedną godzinę na rundę wirowania. Po odwirowaniu przepłukać ścianki zbiornika próbki urządzenia filtrującego zagęszczoną próbką i przenieść zawartość do probówki mikrowirówkowej.

Wykonać dodatkowy etap mycia zbiornika próbki urządzenia filtrującego autoklawowaną pożywką hodowlaną, aby zapewnić maksymalny odzysk egzoproteomu. Następnie przechowuj próbki egzoproteomu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu dalszego użycia. Etanol musi być dodawany energicznie, aby zoptymalizować wytrącanie i wydajność polimeru.

Po odwirowaniu wytrąconego polimeru, należy ostrożnie usunąć supernatant, aby uniknąć ponownego zawieszenia osadu, który może być luźno przymocowany do ścianki kolby. Jeśli przeprowadzana jest filtracja ręczna, powinna być delikatna, aby uniknąć pęknięcia membrany filtracyjnej. Niektóre wytrącone polimery mogą być widoczne dopiero po odwirowaniu, głównie na ściankach kolb, tak jak w przypadku EPS firmy Synechocystis.

W innych przypadkach, takich jak polimer Cyanothece, można zobaczyć grudki polimeru unoszące się w szklanej zlewce tuż po wytrąceniu. Niektóre zanieczyszczenia można łatwo wykryć makroskopowo po liofilizacji polimeru, ponieważ zmieniają one pigmentację polimeru, zwykle białą lub jasnobrązową. Pomarańczowe polimery są zanieczyszczone karotenoidami lub strukturami zawierającymi te pigmenty.

Na przykład zielone polimery są zanieczyszczone szczątkami komórkowymi i chlorofilem. Egzoproteomy mogą się znacznie różnić w zależności od szczepu bakteryjnego. Zobacz na przykład egzoproteom z jednokomórkowego cyjanobakterii i ten z nitkowatego szczepu.

Duża ilość polisacharydów w próbkach skoncentrowanych w egzoproteomie może utrudniać analizę egzoproteomu. Na przykład może opóźnić separację białek i zamaskować mniej obfite białka. Użytkownik może scharakteryzować polimer pod względem składu, właściwości fizykochemicznych, badanej aktywności biologicznej polimeru, czy modyfikowanych składników polimerowych.

W celu identyfikacji białek można przeprowadzić separację białek w żelu i spektrometrię mas. A w celu oddzielenia pęcherzyków należy przeprowadzić ultrawirowanie egzoproteomu. W naszej grupie protokoły te już utorowały drogę do rozwikłania mechanizmów wydzielania cyjanobakterii lub zastosowań zewnątrzkomórkowych polimerów węglowodanowych w różnych dziedzinach, takich jak bioremediacja lub jako środki przeciwnowotworowe lub dostarczające leki.