Name: Stosowanie znakowania radioaktywnego mikromiareczkowego do wielokrotnych pomiarów in vivo Escherichia coli (p)ppGpp, a następnie chromatografii cienkowarstwowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Poznaj metodę pomiaru poziomów regulatora globalnego ppGpp w bakteriach Escherichia coli przy użyciu znakowania radioaktywnego i chromatografii cienkowarstwowej. Technika umożliwia analizę wysokoprzepustową regulacji nukleotydowej podczas stresu fizjologicznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Intramural Research Program, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, NIH.

1. Przygotowanie mediów
<ol>
	<li>W przypadku pożywki MOPS (kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy)25, należy użyć 1/10 objętości 10x soli MOPS, 1/100 objętości 100x roztworu mikroelementów, 3 mM fosforanu sodu do hodowli nocnych lub 0,2 mM fosforanu sodu do jednolitego znakowania 32P, 0,2% glukozy i 1 μg/ml tiaminy (witaminy B1). W razie potrzeby dodać aminokwasy w ilości 40 μg/ml.
	<ol>
		<li>W przypadku soli MOPS użyj 400 mM MOPS, 40 mM Tricine, 0,1 mM FeSO4, 95 mM NH4Cl, 2,6 mM K2SO4, 5 μM CaCl2, 10,56 mM MgCl2 i 500 mM NaCl. Dodaj różne składniki w podanej kolejności, aby uniknąć opadów. Dostosuj do pH 7,4 za pomocą KOH i sterylizuj przez filtrację.</li>
		<li>Dla 100x roztworu mikroelementów użyj 3 μM (NH4)6(MO7)24, 0,4 mM H3BO4, 30 μM CoCl2, 10 μM CuSO4, 80 μM MnCl2 i 10 μM ZnSO4. Sterylizuj w autoklawie.</li>
		<li>W przypadku roztworów glukozy (20%) i fosforanu sodu (300 mM) sterylizować jako oddzielne 100-krotne zapasy przez autoklawowanie. Wysterylizuj 100x zapasy mieszanin tiaminy i aminokwasów przez filtrację. Do każdego eksperymentu należy przygotować świeże podłoża ze sterylnych roztworów podstawowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Etykietowanie za pomocą 32P
<ol>
	<li>Hoduj nocne kultury w pożywkach MOPS z 3 mM fosforanem sodu.</li>
	<li>Na płytkę 24-dołkową dodać 550 μl pożywki MOPS zawierającej 0,2 mM nośnika fosforanu sodu i 30 μl każdego inokulum bakteryjnego (rozcieńczenie 1:20). W ten sposób powstanie początkowe inokulum o średnicy zewnętrznej600 nm 0,1. Użyj jednego dołka ze świeżą pożywką jako kontrolę sterylności.</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze do wytrząsania w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 900 obr./min przez 30 min. Kultury są podgrzewane od dołu, a wstrząsanie zapewnia napowietrzenie. Przymocuj płytkę mocno taśmą, aby uniknąć przechylenia lub rozlania. Wzrost można monitorować za pomocą replikowanej płytki równolegle w pożywkach pozbawionych 32P za pomocą czytnika płytek i inkubować w tych samych warunkach.</li>
	<li>Dodać 100 μCi do każdej studzienki 32ortofosforanu P (20 μL z 5 mCi/ml bulionu). 
	nuta: Ilość promieniotwórczości może być również dostosowana do potrzeb eksperymentalnych. W przypadku niskich poziomów podstawowych 100 μCi z 0,2 mM fosforanu nośnika działa dobrze, ale do pomiaru poziomów (p)ppGpp, które mają stać się równoważne pulom GTP, etykietę można obniżyć do 25 lub 50 μCi. Nie zaleca się obniżania fosforanu nośnika poniżej 0,2 mM, aby uniknąć sytuacji, w której poziom fosforanów staje się ograniczający wzrost. 
	UWAGA: 32P jest izotopem emitującym β, dlatego należy stosować odpowiednie ekranowanie określone dla bezpieczeństwa. Wszystkie materiały radioaktywne muszą być odpowiednio zutylizowane, z zachowaniem wszelkich możliwych środków ostrożności.</li>
	<li>Hoduj w inkubatorze z wytrząsaniem przez 1 do 2 podwojeń (1 godzina lub dłużej), aby umożliwić zewnętrznemu znacznikowi dużą równowagę z wewnątrzkomórkowymi pulami nukleotydów przed wywołaniem stresu.</li>
</ol>
3. Indukcja stresu lub głodu
<ol>
	<li>Wywołaj stres za pomocą wybranej przez siebie metody, w zależności od rodzaju badanego stresu, np. dodanie inhibitorów szlaku metabolicznego, zmiana temperatury, wyczerpanie wymaganych składników odżywczych, przesunięcie zmian osmolarności, wywołanie stresu oksydacyjnego, dodanie toksyn itp.
	<ol>
		<li>Na przykład dodaj 100 μg/ml L-waliny, aby wywołać głód izoleucyny w szczepach E. coli K-12. Podwyższony poziom ppGpp będzie obserwowany po 5 minutach indukcji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Pobieranie próbek i ekstrakcja ppGpp
<ol>
	<li>Dodać 20 μl każdej znakowanej próbki komórek do 0,2 ml probówki PCR zawierającej 20 μl lodowatego 6 M kwasu mrówkowego.</li>
	<li>Natychmiast umieścić próbki w suchym lodzie.</li>
	<li>Zwiększ wydajność ekstrakcji komórkowej poprzez 3 cykle zamrażania i rozmrażania.</li>
	<li>Tuż przed wykryciem chromatogramów cienkowarstwowych z celulozy PEI, należy odwirować próbki przez 1 minutę z maksymalną prędkością, aby osadzać resztki komórek, aby uniknąć plam na chromatogramach.</li>
</ol>
5. Chromatografia cienkowarstwowa
<ol>
	<li>Miękkim ołówkiem zaznacz linię początkową w odległości 1 cm od krawędzi płytki TLC PEI-Celulozy o wymiarach 20 cm x 20 cm, która została usunięta nożyczkami z góry o 5 cm. Na każdą próbkę nanieść 5 μl jako kroplę na powierzchnię PEI. Rozpocznij wznoszący się rozwój, nie dopuszczając do wyschnięcia tego miejsca, co poprawia rozdzielczość, minimalizując smugi.</li>
	<li>Wykonać rozwój rosnący w zbiorniku z warstwą 1,5 M roztworu KH2PO4 (pH 3,4) na tyle płytko, aby ciecz nie dotykała miejsca początkowego próbki. Przykryj zbiornik hermetyczną uszczelką i pozwól, aby płyn dostał się na górę przyciętego arkusza, 15 cm. Aby osiągnąć pH 3,4 dla 1,5 M roztworu KH2PO4, konieczne jest dostosowanie pH przez dodanieH3PO4.</li>
	<li>Usunąć całkowicie rozwinięty chromatogram i wysuszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odciąć i wyrzucić górną część chromatogramu zawierającą wolne 32P i wyrzucić do odpadów promieniotwórczych. Ta część jest przedstawiona w kolorze żółtym na rysunku 2 i łatwa do wizualizacji w świetle UV. W przypadku pomiaru tylko nukleotydów (p)ppGpp, które migrują wolniej niż GTP, zaleca się uruchomienie wzorca GTP widocznego w promieniowaniu UV, a następnie wycięcie i odrzucenie większej górnej części (wszystko powyżej GTP, jak pokazano na rysunku 2).</li>
	<li>Naświetlić filmy autoradiograficzne przez noc za pomocą ekranu luminoforowego.</li>
	<li>Wywołaj film. Uchwyć i określ ilościowo sygnał ekranu luminoforowego za pomocą luminofoimagera.</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja (p)ppGpp
<ol>
	<li>Określ ilościowo miejsca radioaktywne za pomocą obrazu J26,27. 
	nuta: Ilość (p)ppGpp można znormalizować do całkowitej ilości nukleotydów G obserwowanych w każdej próbce (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Jeśli ilość tła jest jednorodna, pojedyncze puste miejsce (pole 4 z Rysunek 2) można odjąć, aby skorygować tło. Suma G jest sumą wykrytych GTP + ppGpp + pppGpp. Ta normalizacja zakłada, że poziomy GMP i PKB są znikome, co jest prawdą w przypadku E. coli. Stosunek danego nukleotydu do całkowitego G stanowi ważny sposób korygowania zmian objętości zastosowanej próbki.</li>
</ol>
7. Pomiar szybkości spadku ppGpp
UWAGA: Modyfikacja tego protokołu pozwala na pomiary szybkości zaniku ppGpp.
<ol>
	<li>Po sprowokowaniu stresu lub głodu przez czas wystarczający do akumulacji ppGpp (krok 3), odwróć stres, aby zablokować dalszą syntezę ppGpp, co pozwala na wykrycie szybkości hydrolitycznej. Procedura odwrócenia będzie zależeć od naprężenia. Na przykład dodaj 200 μg/ml chloramfenikolu, aby odwrócić głód aminokwasów.</li>
	<li>Tempo rozpadu jest zwykle szybkie, ale może się różnić, dlatego próbki należy pobierać co 20-30 s do 2 minut. Przetwarzaj próbki jak w kroku 4.</li>
	<li>Po opracowaniu TLC (jak w kroku 5) i uzyskaniu poziomów ppGpp w ciągu czasu, wykreśl resztkową zawartość ppGpp na wykresie półlogarytmicznym w funkcji czasu, aby umożliwić wizualizację zerowego tempa rozpadu, jako linię prostą, i oszacowanie okresu półtrwania ppGpp.</li>
</ol>

<ol><li>Cashel, M., Gentry, D., Hernandez, V., Vinella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stringent+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Escherichia+coli+and+Salmonella%3A+Cellular+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The stringent Response.</a> Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. , 1458-1489 (1996).</li>
<li>Magnusson, L. U., Farewell, A., Nyström, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ppGpp%3A+a+global+regulator+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">ppGpp: a global regulator in Escherichia coli.</a> Trends in Microbiology. 13 (5), 236-242 (2005).</li>
<li>Cashel, M., Gallant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+Compounds+implicated+in+the+Function+of+the+RC+Gene+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Two Compounds implicated in the Function of the RC Gene of Escherichia coli.</a> Nature. 221 (5183), 838-841 (1969).</li>
<li>Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+horizons+for+%28p%29ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).</li>
<li>Atkinson, G. C., Tenson, T., Hauryliuk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RelA%2FSpoT+homolog+%28RSH%29+superfamily%3A+distribution+and+functional+evolution+of+ppGpp+synthetases+and+hydrolases+across+the+tree+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">The RelA/SpoT homolog (RSH) superfamily: distribution and functional evolution of ppGpp synthetases and hydrolases across the tree of life.</a> PloS One. 6 (8), e23479(2011).</li>
<li>Mechold, U., Potrykus, K., Murphy, H., Murakami, K. S., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+by+ppGpp+versus+pppGpp+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Differential regulation by ppGpp versus pppGpp in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 41 (12), 6175-6189 (2013).</li>
<li>Molodtsov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+Effector+ppGpp+Potentiates+the+Inhibition+of+Transcript+Initiation+by+DksA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Allosteric Effector ppGpp Potentiates the Inhibition of Transcript Initiation by DksA.</a> Molecular Cell. 69 (5), 828-839 (2018).</li>
<li>Ross, W., Sanchez-Vazquez, P., Chen, A. Y. Y., Lee, J. -H. H., Burgos, H. L. L., Gourse, R. L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ppGpp+Binding+to+a+Site+at+the+RNAP-DksA+Interface+Accounts+for+Its+Dramatic+Effects+on+Transcription+Initiation+during+the+Stringent+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">ppGpp Binding to a Site at the RNAP-DksA Interface Accounts for Its Dramatic Effects on Transcription Initiation during the Stringent Response.</a> Molecular Cell. 62 (6), 811-823 (2016).</li>
<li>Kriel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Regulation+of+GTP+Homeostasis+by+%28p%29ppGpp%3A+A+Critical+Component+of+Viability+and+Stress+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct Regulation of GTP Homeostasis by (p)ppGpp: A Critical Component of Viability and Stress Resistance.</a> Molecular Cell. 48 (2), 231-241 (2012).</li>
<li>Kriel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP+dysregulation+in+Bacillus+subtilis+cells+lacking+%28p%29ppGpp+results+in+phenotypic+amino+acid+auxotrophy+and+failure+to+adapt+to+nutrient+downshift+and+regulate+biosynthesis+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">GTP dysregulation in Bacillus subtilis cells lacking (p)ppGpp results in phenotypic amino acid auxotrophy and failure to adapt to nutrient downshift and regulate biosynthesis genes.</a> Journal of Bacteriology. 196 (1), 189-201 (2014).</li>
<li>Potrykus, K., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p%29ppGpp%3A+still+magical%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">p)ppGpp: still magical.</a> Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).</li>
<li>Hauryliuk, V., Atkinson, G. C., Murakami, K. S., Tenson, T., Gerdes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+functional+insights+into+the+role+of+%28p%29ppGpp+in+bacterial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Recent functional insights into the role of (p)ppGpp in bacterial physiology.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 298-309 (2015).</li>
<li>Arenz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stringent+factor+RelA+adopts+an+open+conformation+on+the+ribosome+to+stimulate+ppGpp+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The stringent factor RelA adopts an open conformation on the ribosome to stimulate ppGpp synthesis.</a> Nucleic Acids Research. 44 (13), 6471-6481 (2016).</li>
<li>Loveland, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome%E2%80%A2RelA+structures+reveal+the+mechanism+of+stringent+response+activation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Ribosome•RelA structures reveal the mechanism of stringent response activation.</a> eLife. 5, e17029(2016).</li>
<li>Brown, A., Fernández, I. S., Gordiyenko, Y., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome-dependent+activation+of+stringent+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ribosome-dependent activation of stringent control.</a> Nature. 534 (7606), 277-280 (2016).</li>
<li>Battesti, A., Bouveret, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acyl+carrier+protein%2FSpoT+interaction%2C+the+switch+linking+SpoT-dependent+stress+response+to+fatty+acid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Acyl carrier protein/SpoT interaction, the switch linking SpoT-dependent stress response to fatty acid metabolism.</a> Molecular Microbiology. 62 (4), 1048-1063 (2006).</li>
<li>Lee, J. -W., Park, Y. -H., Seok, Y. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rsd+balances+%28p%29ppGpp+level+by+stimulating+the+hydrolase+activity+of+SpoT+during+carbon+source+downshift+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rsd balances (p)ppGpp level by stimulating the hydrolase activity of SpoT during carbon source downshift in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), E6845-E6854 (2018).</li>
<li>Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+%28p%29ppGpp+Accumulation+Patterns+in+Escherichia+coli+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology+Techniques%22%5BJournal%5D)">Detection of (p)ppGpp Accumulation Patterns in Escherichia coli mutants.</a> Molecular Microbiology Techniques. 3, 341-356 (1994).</li>
<li>Fernández-Coll, L., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+SpoT+Hydrolase%2C+SpoT+Synthetase%2C+and+RelA+Synthetase+to+Carbon+Source+Diauxic+Growth+Transitions+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Contributions of SpoT Hydrolase, SpoT Synthetase, and RelA Synthetase to Carbon Source Diauxic Growth Transitions in Escherichia coli.</a> Frontiers in Microbiology. , (2018).</li>
<li>Varik, V., Oliveira, S. R. A., Hauryliuk, V., Tenson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPLC-based+quantification+of+bacterial+housekeeping+nucleotides+and+alarmone+messengers+ppGpp+and+pppGpp%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">HPLC-based quantification of bacterial housekeeping nucleotides and alarmone messengers ppGpp and pppGpp.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11022(2017).</li>
<li>Rhee, H. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Fluorescent+Chemosensor+for+the+Bacterial+Alarmone+%28p%29ppGpp%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Selective Fluorescent Chemosensor for the Bacterial Alarmone (p)ppGpp.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (3), 784-785 (2008).</li>
<li>Wang, J., Chen, W., Liu, X., Wesdemiotis, C., Pang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mononuclear+Zinc+Complex+for+Selective+Detection+of+Diphosphate+via+Fluorescence+ESIPT+Turn-On%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">A Mononuclear Zinc Complex for Selective Detection of Diphosphate via Fluorescence ESIPT Turn-On.</a> Journal of Materials Chemistry B. 2 (21), 3349-3354 (2014).</li>
<li>Pokhilko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+nutrient+limitation+in+growing+E.+coli%3A+a+mathematical+model+of+a+ppGpp-based+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Monitoring of nutrient limitation in growing E. coli: a mathematical model of a ppGpp-based biosensor.</a> BMC Systems Biology. 11 (1), 106(2017).</li>
<li>Funabashi, H., Mie, M., Yanagida, Y., Kobatake, E., Aizawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+monitoring+of+cellular+physiological+status+depending+on+the+accumulation+of+ppGpp%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Letters%22%5BJournal%5D)">Fluorescent monitoring of cellular physiological status depending on the accumulation of ppGpp.</a> Biotechnology Letters. 24 (4), 269-273 (2002).</li>
<li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+medium+for+enterobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Culture medium for enterobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Peselis, A., Serganov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ykkC+riboswitches+employ+an+add-on+helix+to+adjust+specificity+for+polyanionic+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">ykkC riboswitches employ an add-on helix to adjust specificity for polyanionic ligands.</a> Nature Chemical Biology. 14 (9), 887-894 (2018).</li>
<li>Oki, T., Yoshimoto, A., Sato, S., Takamatsu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purine+nucleotide+pyrophosphotransferase+from+Streptomyces+morookaensis%2C+capable+of+synthesizing+pppApp+and+pppGpp%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Purine nucleotide pyrophosphotransferase from Streptomyces morookaensis, capable of synthesizing pppApp and pppGpp.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 410 (2), 262-272 (1975).</li>
<li>Travers, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ppApp+alters+transcriptional+selectivity+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">ppApp alters transcriptional selectivity of Escherichia coli RNA polymerase.</a> FEBS Letters. 94 (2), 345-348 (1978).</li>
<li>Bruhn-Olszewska, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+comparisons+of+%28p%29ppApp+vs+%28p%29ppGpp+for+Escherichia+coli+RNA+polymerase+binding+sites+and+for+rrnB+P1+promoter+regulatory+responses+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Gene+Regulatory+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Structure-function comparisons of (p)ppApp vs (p)ppGpp for Escherichia coli RNA polymerase binding sites and for rrnB P1 promoter regulatory responses in vitro.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1861 (8), 731-742 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Osiągnięcie niemal jednolitego znakowania komórek jest kluczowym krokiem dla tego protokołu. W związku z tym stosowanie zdefiniowanych pożywek, takich jak pożywki MOPS lub Tris, ma kluczowe znaczenie dla umożliwienia zmiany stężeń fosforanów nośnikowych i określonej aktywności. Nie można używać pożywek buforowanych fosforanami, takich jak M9 lub pożywka A. Większość niezdefiniowanych pożywek zawiera zmienne ilości fosforanów, takich jak LB, trypton i casaminokwasy. Izotop fosforanu 33P jest słabszym emiterem, ...

Drugi posłaniec (p)ppGpp jest globalnym regulatorem, który moduluje ekspresję dużej liczby genów, w tym genów do syntezy rybosomów i aminokwasów1,2. Chociaż początkowo odkryto go w Escherichia coli3, (p)ppGpp można znaleźć zarówno w bakteriach Gram-dodatnich, jak i Gram-ujemnych, a także w chloroplastach roślinnych4,5. W przypadku E. coli i innych bakterii Gram-ujemnych (p)ppGpp oddziałuje bezpośrednio z polimerazą RNA w dwóch różnych miejscach6,7,8. W Gram-dodatnich (p)ppGpp hamuje obfitość GTP, co jest wyczuwane przez CodY, białko wiążące GTP z motywami rozpoznawania DNA specyficznymi dla genu, które prowadzą do regulacji9,10. (p)ppGpp gromadzi się w odpowiedzi na głód różnych składników odżywczych i warunków stresowych, co skutkuje powolnym wzrostem i dostosowaniem ekspresji genów, aby umożliwić adaptację do stresu11,12.
Ilość netto skumulowanych ppGpp odzwierciedla równowagę między aktywnością syntetazy i hydrolazy. U E. coli RelA jest silną syntetazą, a SpoT jest dwufunkcyjny, z silną hydrolazą i słabą syntetazą, z których każda może być regulowana inaczej w sposób zależny od stresu. Silna syntetaza RelA jest aktywowana, gdy dostępność naładowanego tRNA określonego w kodonie wiąże się z miejscem rybosomalnym A, gdy nie nadąża za wymaganiami syntezy białek13,14,15. Słaba syntetaza SpoT (p)ppGpp jest aktywowana, podczas gdy silna hydrolaza (p)ppGpp jest hamowana w odpowiedzi na inne warunki stresowe i poprzez inne mechanizmy. W pewnych warunkach białka, takie jak ACP lub Rsd, mogą wiązać się ze SpoT, co również zmienia równowagę między hydrolizą a syntezą16,17. W badaniach Gram-dodatnich synteza i hydroliza odzwierciedlają bardziej złożoną równowagę między pojedynczym białkiem homologu RelA SpoT (RSH) o silnej aktywności syntezy i hydrolizy, a także mniejszymi hydrolazami i / lub syntetazami12.
Nukleotydy (p)ppGpp zostały po raz pierwszy odkryte jako niezwykłe plamki znakowane 32P, które pojawiły się na autoradiogramach chromatogramów cienkowarstwowych (TLC) podczas rygorystycznej reakcji wywołanej głodem aminokwasów3. Bardziej szczegółowe protokoły etykietowania zostały przejrzane 18. Opisany tutaj protokół (Rysunek 1) jest modyfikacją tych protokołów, która umożliwia monitorowanie wzrostu wielu próbek na płytkach do mikromiareczkowania. Ułatwia to wiele biologicznych i technicznych oszacowań zmian liczebności (p)ppGpp i zostało początkowo opracowane do badań nad przesunięciami diauxic19. Znakowanie (p)ppGpp za pomocą 32P i wykrywanie przez TLC umożliwia również pomiary szybkości degradacji (p)ppGpp. Opracowano alternatywne metody określania poziomów (p)ppGpp, takie jak spektrometria mas, HPLC20, fluorescencyjne chemosensors21,22 oraz fuzje genów GFP z promotorami dotkniętymi ppGpp23,24. Fluorescencyjne chemosensory mają obecnie ograniczone zastosowanie ze względu na małe przesunięcia widmowe po związaniu ppGpp, a także problemy z rozróżnieniem ppGpp i pppGpp21. Ta metoda jest skuteczna w wykrywaniu (p)ppGpp in vitro, ale nie w ekstraktach komórkowych. Metody wykorzystujące HPLC zostały ulepszone20, ale wymagają drogiego sprzętu i nie są dobrze przystosowane do dużej przepustowości. Wreszcie, fuzje GFP mogą dać oszacowanie aktywacji lub zahamowania zależnego od ppGpp, ale nie mierzą samego ppGpp. Chociaż każda z tych alternatywnych metod jest cenna, wymagają one drogiego sprzętu lub znacznego czasu pracy praktycznej lub w inny sposób nie nadają się do wielokrotnego pobierania próbek kinetycznych i późniejszego przetwarzania. Dzięki opisanej tutaj metodzie 96 próbek można nałożyć na sześć płytek TLC w ciągu około 20 minut (18 próbek na płytkę), a następnie rozwiązać przez rozwój TLC w czasie krótszym niż kilka godzin, z danymi ilościowymi uzyskanymi po kilku godzinach lub w nocy, w zależności od intensywności znakowania.

<table><tbody><tr><td>(NH4)6(MO7)24</td><td>Fisher Scientifics</td><td>A-674</td><td></td></tr><tr><td>Film autoradiograficzny</td><td>Denville scientific inc.</td><td>E3218</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>J.T.Baker</td><td>1-1309</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>RPI</td><td>C61000-25.0</td><td></td></tr><tr><td>CoCl2</td><td>Fisher Scientifics</td><td>C-371</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>J.T.Baker</td><td>1843</td><td></td></tr><tr><td>FeSO4</td><td>Fisher Scientifics</td><td>I-146</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Fisher Biotech</td><td>BP1215-500</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Macron</td><td>4912-12</td><td></td></tr><tr><td>H3BO4</td><td>Macron</td><td>2549-04</td><td></td></tr><tr><td>H3PO4</td><td>J.T.Baker</td><td>0260-02</td><td></td></tr><tr><td>K2SO4</td><td>Sigma</td><td>P9458-250G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Biotech</td><td>BP362-500</td> L-walina Sigma V-6504 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientifics</td><td>FL-06-0303</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek Synergy HT</td><td>Biotek</td><td>Synergy HT</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Sigma</td><td>M-9522</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Mallinckrodt</td><td>7892</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T.Baker</td><td>3624-01</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Mallinckrodt</td><td>7917</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A0171-500G</td><td></td></tr><tr><td>P-32 radionuklid, kwas ortofosforowy w 1 ml wody (5 mCi)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEX053005MC</td><td></td></tr><tr><td>Przechowywanie ekranu fosforowego</td><td>Kodak</td><td>So230</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td>Tiamina</td><td>Sigma</td><td>T-4625</td><td></td></tr><tr><td>TLC PEI Celuloza F</td><td>Merk-Millipore</td><td>1.05579.0001</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>RPI</td><td>T2400-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Kamera Typhoon 9400</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4</td><td>Fisher Scientifics</td><td>Z-68</td><td></td></tr></tbody></table>

stosowanie znakowania radioaktywnego mikromiareczkowego do wielokrotnych pomiarów in vivo escherichia coli (p)ppgpp, a następnie chromatografii cienkowarstwowej

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli (p)ppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

Nukleotyd (p)ppGpp funkcjonuje jako globalny regulator u bakterii w odpowiedzi na różnorodne stresy fizyczne i żywieniowe. Ma szybki początek, w ciągu kilku sekund, co prowadzi do akumulacji poziomów, które zbliżają się lub przekraczają poziomy pul GTP. Odwrócenie stresu powoduje szybki zanik (p)ppGpp, często z okresem półtrwania krótszym niż minuta. Obecność (p)ppGpp powoduje zmiany w ekspresji genów komórkowych i metabolizmie, które przeciwdziałają szkodliwym skutkom stresu. Bakterie Gram-ujemne i Gram-dodatnie mają różne mechanizmy odpowiedzi, ale oba zależą od stężenia (p)ppGpp. W każdym razie istnieje potrzeba jednoczesnego monitorowania wielu kultur bakterii znakowanych radioaktywnie w odstępach czasu, które mogą wahać się od 10 sekund do godzin w krytycznych okresach przejściowych stresu. Ten protokół rozwiązuje to wyzwanie techniczne. Metoda wykorzystuje inkubatory z mikromiareczkowaniem sterowane temperaturą i wytrząsarką, które umożliwiają równoległe monitorowanie wzrostu (absorbancji) i szybkie pobieranie próbek jednorodnie znakowanych radioizotopem fosforanowym kultur w celu rozdzielenia i ilościowego określenia pul nukleotydów za pomocą chromatografii cienkowarstwowej na celulozie PEI. Do wielokrotnych powtórzeń analiz technicznych i biologicznych potrzebne są niewielkie ilości próbek. Za pomocą tej metody można ilościowo ocenić złożone przemiany wzrostu, takie jak wzrost diauxiczny i szybkie tempo rotacji (p)ppGpp.

W szczepach E. coli K-12 dodanie waliny wywołuje endogenny głód izoleucyny, co skutkuje wzrostem poziomu ppGpp po 5 min3. Komórki hodowane w pożywce MOPS zawierającej wszystkie aminokwasy z wyjątkiem ILV zostały znakowane 32P, zgodnie z Rysunkiem 1. Po znakowaniu dodano 6 µL L-waliny o stężeniu 10 mg/mL (stężenie końcowe 10 µg/mL), aby wywołać głód izoleucyny. Próbki pobrano w czasie 0 i 5 min po dodaniu waliny. Po 5 min (Rysunek 3A<...

Wzrost kultur bakterii znakowanych radioaktywnie w mikromiareczkowych szalkach ułatwia pobieranie próbek o wysokiej przepustowości, co pozwala na wiele technicznych i biologicznych testów replikacji obfitości puli nukleotydów, w tym (p)ppGpp. Można monitorować skutki przemian wzrostowych wywołanych przez źródła stresu fizjologicznego, a także powrót do zdrowia po stresie.

Stosowanie znakowania radioaktywnego mikromiareczkowego do wielokrotnych pomiarów in vivo Escherichia coli (p)ppGpp, a następnie chromatografii cienkowarstwowej

The (p)ppGpp nucleotide functions as a global regulator in bacteria in response to a variety of physical and nutritional stress. It has a rapid onset, in ...

Metoda ta mierzy poziomy globalnego regulatora ppGpp w różnych warunkach wzrostu i sytuacjach stresowych. PpGpp można znaleźć w bakteriach Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, a także w chloroplastach. PpGpp ma szybki początek w ciągu kilku sekund, co prowadzi do szybkiej drugiej relacji po wytworzeniu stresu.Jednocześnie, ma krótki okres półtrwania, do 30 sekund. W związku z tym istnieje potrzeba monitorowania wielu kultur w odstępach czasu, które mogą wahać się od 10 sekund do godzin, w tym przejść stresowych. Znakujemy również radioizotopowo kultury bakterii w szalkach mikromiareczkowych, co ułatwia pobieranie próbek o wysokiej przepustowości, co pozwala na wielokrotne powtórzenia techniczne i biologiczne.Upewnij się, że przestrzegasz odpowiednich środków bezpieczeństwa podczas pracy z materiałami radioaktywnymi. Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj wszystkie nośniki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Hoduj kultury nocne w pożywkach MOPS z trzema milimolowymi fosforanami sodu.Dodać 550 mikrolitrów pożywki MOPS, kontynuując 0,2 mikromolowy nośnik fosforanu sodu i 30 mikrolitrów każdego inokulum bakteryjnego do dołków 24-dołkowej płytki. Spowoduje to początkowe inokulum z OD600 0,1. Dodaj świeże podłoże do jednego dołka jako kontrolę sterylności.Umieść płytkę w inkubatorze do wytrząsania w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością 900 obr./min przez 30 minut. Wzrost można monitorować za pomocą czytnika płytek z powtórzoną płytką równolegle w pożywkach pozbawionych p32 za pomocą czytnika płytek podczas inkubacji w tych samych warunkach. Następnie dodaj 100 mikrokiurów orthfosforanu p32 do każdego dołka płytki.Hoduj kultury w inkubatorze z wytrząsaniem przez jedno do dwóch podwojeń, aby umożliwić zewnętrznemu znakowaniu dużą równowagę z międzykomórkowymi pulami nukleotydów. Aby zapewnić prawidłową wizualizację, w tym filmie nie wykorzystano żadnego z aktywnych materiałów. W prawdziwym eksperymencie wymagane jest odpowiednie ekranowanie, a także stałe monitorowanie zanieczyszczeń za pomocą miernika pomiarowego.Po pierwsze, wywołaj stres za pomocą metody odpowiedniej do rodzaju badanego stresu. Następnie dodaj 20 mikrolitrów każdej znakowanej próbki komórki do oddzielnej 0,2 mililitrowej probówki do PCR, zawierającej 20 mikrolitrów lodowatego sześciomolowego kwasu mrówkowego. Natychmiast umieścić próbki na suchym lodzie.Zwiększ wydajność ekstrakcji komórkowej dzięki trzem cyklom zamrażania i rozmrażania. Tuż przed wykryciem chromatogramów cienkowarstwowych z celulozy PEI, należy odwirować próbki przez jedną minutę z maksymalną prędkością, aby osadzać resztki komórek. Najpierw ułóż płytkę TLC z celulozy PEI o wymiarach 20 na 20 centymetrów.Użyj nożyczek, aby usunąć górne pięć centymetrów. I użyj miękkiego ołówka, aby zaznaczyć linię początkową w odległości jednego centymetra od krawędzi. Nanieś pięciolitrową kroplę każdej próbki na powierzchnię PEI.Zanim plamka będzie mogła wyschnąć, przenieś płytkę do zbiornika zawierającego warstwę 1,5 molowego fosforanu monopotasowego, która jest wystarczająco płytka, aby nie dotykać miejsca początkowego próbki. Przykryj zbiornik hermetycznym uszczelnieniem i pozwól, aby płyn dostał się do górnej części 15-centymetrowego przyciętego arkusza. Następnie usunąć w pełni rozwinięty chromatogram i wysuszyć go na powietrzu w temperaturze pokojowej.Odciąć i wyrzucić górną część chromatogramu zawierającą wolny P32 do odpadów radioaktywnych. Za pomocą ekranu luminoforowego należy naświetlić filmy audioradiograficzne przez noc. Następnego dnia wywołaj film i użyj luminoforimagera, aby uchwycić i określić ilościowo zielony sygnał luminoforu.Następnie użyj oprogramowania ImageJ, aby określić ilościowo plamy radioaktywne. Po sprowokowaniu stresu lub głodu przez czas wystarczający do akumulacji ppGpp, należy zastosować odpowiednią metodę odwrócenia stresu. Próbki pobiera się co 20–30 sekund przez okres do dwóch minut i przetwarza próbki zgodnie z wcześniejszym opisem.Po opracowaniu TLC i uzyskaniu poziomów ppGpp w przebiegu czasu, wykreśl resztkową zawartość ppGpp na wykresie półlogarytmicznym w funkcji czasu. W tym badaniu komórki wyhodowane w MOPS zawierające wszystkie aminokwasy z wyjątkiem ILV są znakowane P32. Po oznakowaniu dodaje się L-walinę, aby wywołać głód izoleucyny.Po pięciu minutach nastąpił dwu i dwuipółletni wzrost poziomu tetra i pentafosforanu guanozyny. Kontrola negatywna próbki znakowanej bez komórek służy do wykrycia możliwych związków, które nie są ortofosforanem w źródle P32. Odwrócenie głodu izoleucyny można osiągnąć za pomocą chloramfenikolu, inhibitora syntezy białek, który zmniejsza zużycie naładowanego tRNA izoleucyny, a co za tym idzie, przywraca wysokie proporcje naładowanego do nienaładowanego tRNA.Aktywacja silnej syntetazy ppGpp za pośrednictwem relacji zostaje zniesiona, co pozwala na pomiar degradacji ppGpp niezakłóconej przez syntezę resztkową. W tym przypadku ppGpp rozpada się z okresem półtrwania wynoszącym około 64 sekundy. Ważne jest, aby pozwolić komórkom rosnąć przez kilka pokoleń, aby uzyskać jednolite oznakowanie przed wywołaniem stresu lub głodu.Ponieważ ppGpp jest szeroko rozpowszechniony wśród bakterii, metodę tę można zastosować do innych organizmów. Modyfikacja metody rozwoju TLC może pozwolić na prawidłowe rozdzielenie wszystkich nukleotydów regulatorowych, takich jak ppApp. P52 jest lepszym izotopem emitującym, dlatego ważne jest, aby stosować odpowiednie ekranowanie i prawidłowo usunąć wszelkie pozostałości.

using-microtiter-dish-radiolabeling-for-multiple-vivo-measurements

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niedawno opisaliśmy nowatorskie podejście do generowania fluorogennych sond DNAzymowych, które mogą być wykorzystane do stworzenia prostego, fluorescencyjnego testu typu „wymieszaj i odczytaj” do wykrywania bakterii. Te specjalne sondy DNA katalizują rozszczepienie zmodyfikowanego chromoforem substratu chimerycznego DNA-RNA w obecności surowej mieszaniny zewnątrzkomórkowej (CEM) produkowanej przez konkretną bakterię, przekładając tym samym detekcję bakterii na generowanie sygnału...

Wykrywanie bakterii przy użyciu fluorogennych DNAzymów

Źródło: Fernández-Coll, L. i Cashel, M. Stosowanie znakowania radiologicznego za pomocą mikromiareczkowania do wielokrotnych pomiarów in vivo Escherichia coli (p) ppGpp, a następnie chromatografii cienkowarstwowej. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia wysokoprzepustowy protokół pomiaru poziomów i dynamiki bakteryjnych nukleotydów stresu-odpowiedzi ppGpp i pppGpp przy użyciu chromatografii cienkowarstwowej (TLC). Metoda ta zapewnia wydajne, szybkie i ekonomiczne podejście do ilościowego...

Separacja nukleotydów (p)ppGpp izolowanych od bakterii wywołanych stresem za pomocą chromatografii cienkowarstwowej

Ten film demonstruje test enzymatyczny oparty na chromatografii cienkowarstwowej do określenia aktywności pirofosfokinazy przy użyciu znakowanych radioaktywnie nukleotydów. Metoda dostarcza informacji na temat syntezy nukleotydów i reakcji fosfotransferu.

Test aktywności enzymatycznej oparty na chromatografii cienkowarstwowej: technika określania aktywności pirofosfokinazy in vitro za pomocą chromatografii cienkowarstwowej

Ten film demonstruje różnicowe promieniste działanie kapilarne testu ligandowego - techniki systematycznego, wysokoprzepustowego badania przesiewowego białek wiążących drugi przekaźnik nukleotydów wewnątrzkomórkowych. Technika ta pozwala na bezpośrednie wiązanie przekaźników z nadekspresyjnym białkiem docelowym w lizacie komórkowym - z pominięciem konieczności oczyszczania białka.

Różnicowe promieniste działanie kapilarne testu ligandowego: wysokoprzepustowa technika identyfikacji wewnątrzkomórkowych białek wiążących drugi przekaźnik nukleotydu bakteryjnego

Opisujemy metodę śledzenia pęknięcia błony wewnętrznej wywołanego przez wewnątrzkomórkowe bakterie Shigella flexneri i Mycobacterium tuberculosis po inwazji komórek gospodarza. Nasz test wykorzystuje CCF4, cytoplazmatyczną sondę FRET gospodarza w żywych lub utrwalonych komórkach. Ten reporter jest degradowany przez aktywność enzymatyczną obecną na powierzchni bakterii.

Pomiary pojedynczych komórek pęknięcia wakuolarnego spowodowanego przez patogeny wewnątrzkomórkowe

Protokół obejmujący zintegrowane zagęszczenie, wzbogacenie i kolorymetryczne wykrywanie patogenów przenoszonych przez żywność w dużych ilościach wody rolniczej jest tutaj przedstawiony.  Woda jest filtrowana przez zmodyfikowane waciki Moore'a (MMS), wzbogacone o selektywne lub nieselektywne media, a detekcja odbywa się za pomocą papierowych urządzeń analitycznych (μPAD) osadzonych w bakteryjno-orientacyjnych podłożach kolorymetrycznych.

Kolorymetryczne wykrywanie Escherichia coli, Salmonella spp. i Listeria monocytogenes na papierze w dużych ilościach wody rolniczej

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Ten manuskrypt opisuje metodę znakowania pojedynczych transkryptów informacyjnego RNA (mRNA) za pomocą fluorescencyjnie znakowanych sond DNA, do wykorzystania w eksperymentach z hybrydyzacją fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ (smFISH) u E. coli. smFISH to metoda wizualizacji, która pozwala na jednoczesne wykrywanie, lokalizację i kwantyfikację pojedynczych cząsteczek mRNA w utrwalonych pojedynczych komórkach.

Metoda znakowania transkryptów w poszczególnych komórkach Escherichia coli do eksperymentów hybrydyzacji fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ

Tutaj opisujemy metodę oczyszczania enzymów pirofosfokinazy znakowanych histydyną i wykorzystanie chromatografii cienkowarstwowej radioznakowanych substratów i produktów do badania aktywności enzymatycznej in vitro. Test aktywności enzymatycznej ma szerokie zastosowanie do dowolnej kinazy, cyklazy nukleotydowej lub reakcji przenoszenia fosforu, której mechanizm obejmuje hydrolizę trifosforanu nukleotydów.

Test oczyszczania i aktywności in vitro dla syntetazy (p)ppGpp z Clostridium difficile

Ten protokół szczegółowo opisuje kroki, koszty i sprzęt niezbędny do generowania ekstraktów komórkowych na bazie E. coli i przeprowadzania reakcji syntezy białek in vitro w ciągu 4 dni lub krócej. Aby wykorzystać elastyczny charakter tej platformy do szerokich zastosowań, omawiamy warunki reakcji, które można dostosować i zoptymalizować.

Bezkomórkowa synteza białek na bazie Escherichia coli: Protokoły dla solidnej, elastycznej i dostępnej technologii platformy

Różnicowe promieniste działanie kapilarne testu ligandowego (DRaCALA) może być wykorzystane do identyfikacji małych białek wiążących ligand organizmu za pomocą biblioteki ORFeome.

Identyfikacja białek wiążących małe ligandy za pomocą zróżnicowanego promieniowego działania kapilarnego testu ligandowego (DRaCALA)

Poznaj metodę pomiaru poziomów regulatora globalnego ppGpp w bakteriach Escherichia coli przy użyciu znakowania radioaktywnego i chromatografii cienkowarstwowej. Technika umożliwia analizę wysokoprzepustową regulacji nukleotydowej podczas stresu fizjologicznego.

Stosowanie znakowania radioaktywnego mikromiareczkowego do wielokrotnych pomiarów in vivo Escherichia coli (p)ppGpp, a następnie chromatografii cienkowarstwowej (Wideo) | JoVE Journal

Stosowanie znakowania radioaktywnego mikromiareczkowego do wielokrotnych pomiarów in vivo Escherichia coli (p)ppGpp, a następnie chromatografii cienkowarstwowej

Przeglądaj więcej filmów