Stosowanie znakowania radioaktywnego mikromiareczkowego do wielokrotnych pomiarów in vivo Escherichia coli (p)ppGpp, a następnie chromatografii cienkowarstwowej
June 4th, 2019
Wzrost kultur bakterii znakowanych radioaktywnie w mikromiareczkowych szalkach ułatwia pobieranie próbek o wysokiej przepustowości, co pozwala na wiele technicznych i biologicznych testów replikacji obfitości puli nukleotydów, w tym (p)ppGpp. Można monitorować skutki przemian wzrostowych wywołanych przez źródła stresu fizjologicznego, a także powrót do zdrowia po stresie.
Metoda ta mierzy poziomy globalnego regulatora ppGpp w różnych warunkach wzrostu i sytuacjach stresowych. PpGpp można znaleźć w bakteriach Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, a także w chloroplastach. PpGpp ma szybki początek w ciągu kilku sekund, co prowadzi do szybkiej drugiej relacji po wytworzeniu stresu.
Jednocześnie, ma krótki okres półtrwania, do 30 sekund. W związku z tym istnieje potrzeba monitorowania wielu kultur w odstępach czasu, które mogą wahać się od 10 sekund do godzin, w tym przejść stresowych. Znakujemy również radioizotopowo kultury bakterii w szalkach mikromiareczkowych, co ułatwia pobieranie próbek o wysokiej przepustowości, co pozwala na wielokrotne powtórzenia techniczne i biologiczne.
Upewnij się, że przestrzegasz odpowiednich środków bezpieczeństwa podczas pracy z materiałami radioaktywnymi. Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj wszystkie nośniki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Hoduj kultury nocne w pożywkach MOPS z trzema milimolowymi fosforanami sodu.
Dodać 550 mikrolitrów pożywki MOPS, kontynuując 0,2 mikromolowy nośnik fosforanu sodu i 30 mikrolitrów każdego inokulum bakteryjnego do dołków 24-dołkowej płytki. Spowoduje to początkowe inokulum z OD600 0,1. Dodaj świeże podłoże do jednego dołka jako kontrolę sterylności.
Umieść płytkę w inkubatorze do wytrząsania w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością 900 obr./min przez 30 minut. Wzrost można monitorować za pomocą czytnika płytek z powtórzoną płytką równolegle w pożywkach pozbawionych p32 za pomocą czytnika płytek podczas inkubacji w tych samych warunkach. Następnie dodaj 100 mikrokiurów orthfosforanu p32 do każdego dołka płytki.
Hoduj kultury w inkubatorze z wytrząsaniem przez jedno do dwóch podwojeń, aby umożliwić zewnętrznemu znakowaniu dużą równowagę z międzykomórkowymi pulami nukleotydów. Aby zapewnić prawidłową wizualizację, w tym filmie nie wykorzystano żadnego z aktywnych materiałów. W prawdziwym eksperymencie wymagane jest odpowiednie ekranowanie, a także stałe monitorowanie zanieczyszczeń za pomocą miernika pomiarowego.
Po pierwsze, wywołaj stres za pomocą metody odpowiedniej do rodzaju badanego stresu. Następnie dodaj 20 mikrolitrów każdej znakowanej próbki komórki do oddzielnej 0,2 mililitrowej probówki do PCR, zawierającej 20 mikrolitrów lodowatego sześciomolowego kwasu mrówkowego. Natychmiast umieścić próbki na suchym lodzie.
Zwiększ wydajność ekstrakcji komórkowej dzięki trzem cyklom zamrażania i rozmrażania. Tuż przed wykryciem chromatogramów cienkowarstwowych z celulozy PEI, należy odwirować próbki przez jedną minutę z maksymalną prędkością, aby osadzać resztki komórek. Najpierw ułóż płytkę TLC z celulozy PEI o wymiarach 20 na 20 centymetrów.
Użyj nożyczek, aby usunąć górne pięć centymetrów. I użyj miękkiego ołówka, aby zaznaczyć linię początkową w odległości jednego centymetra od krawędzi. Nanieś pięciolitrową kroplę każdej próbki na powierzchnię PEI.
Zanim plamka będzie mogła wyschnąć, przenieś płytkę do zbiornika zawierającego warstwę 1,5 molowego fosforanu monopotasowego, która jest wystarczająco płytka, aby nie dotykać miejsca początkowego próbki. Przykryj zbiornik hermetycznym uszczelnieniem i pozwól, aby płyn dostał się do górnej części 15-centymetrowego przyciętego arkusza. Następnie usunąć w pełni rozwinięty chromatogram i wysuszyć go na powietrzu w temperaturze pokojowej.
Odciąć i wyrzucić górną część chromatogramu zawierającą wolny P32 do odpadów radioaktywnych. Za pomocą ekranu luminoforowego należy naświetlić filmy audioradiograficzne przez noc. Następnego dnia wywołaj film i użyj luminoforimagera, aby uchwycić i określić ilościowo zielony sygnał luminoforu.
Następnie użyj oprogramowania ImageJ, aby określić ilościowo plamy radioaktywne. Po sprowokowaniu stresu lub głodu przez czas wystarczający do akumulacji ppGpp, należy zastosować odpowiednią metodę odwrócenia stresu. Próbki pobiera się co 20–30 sekund przez okres do dwóch minut i przetwarza próbki zgodnie z wcześniejszym opisem.
Po opracowaniu TLC i uzyskaniu poziomów ppGpp w przebiegu czasu, wykreśl resztkową zawartość ppGpp na wykresie półlogarytmicznym w funkcji czasu. W tym badaniu komórki wyhodowane w MOPS zawierające wszystkie aminokwasy z wyjątkiem ILV są znakowane P32. Po oznakowaniu dodaje się L-walinę, aby wywołać głód izoleucyny.
Po pięciu minutach nastąpił dwu i dwuipółletni wzrost poziomu tetra i pentafosforanu guanozyny. Kontrola negatywna próbki znakowanej bez komórek służy do wykrycia możliwych związków, które nie są ortofosforanem w źródle P32. Odwrócenie głodu izoleucyny można osiągnąć za pomocą chloramfenikolu, inhibitora syntezy białek, który zmniejsza zużycie naładowanego tRNA izoleucyny, a co za tym idzie, przywraca wysokie proporcje naładowanego do nienaładowanego tRNA.
Aktywacja silnej syntetazy ppGpp za pośrednictwem relacji zostaje zniesiona, co pozwala na pomiar degradacji ppGpp niezakłóconej przez syntezę resztkową. W tym przypadku ppGpp rozpada się z okresem półtrwania wynoszącym około 64 sekundy. Ważne jest, aby pozwolić komórkom rosnąć przez kilka pokoleń, aby uzyskać jednolite oznakowanie przed wywołaniem stresu lub głodu.
Ponieważ ppGpp jest szeroko rozpowszechniony wśród bakterii, metodę tę można zastosować do innych organizmów. Modyfikacja metody rozwoju TLC może pozwolić na prawidłowe rozdzielenie wszystkich nukleotydów regulatorowych, takich jak ppApp. P52 jest lepszym izotopem emitującym, dlatego ważne jest, aby stosować odpowiednie ekranowanie i prawidłowo usunąć wszelkie pozostałości.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie szczegółowo opisuje metodę pomiaru poziomów globalnego regulatora ppGpp w hodowlach bakteryjnych w różnych warunkach wzrostu i sytuacjach stresowych. Zastosowanie radioaktywnie oznaczonych kultur bakteryjnych w łączkach mikrotytrach umożliwia analizę wysokiego przepływu, dając wgląd w obfitość puli nukleotydów podczas stresu fizjologicznego i regeneracji.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Biologia molekularna
- Fizjologia stresu u bakterii
- Regulacja nukleotydów
Tło
- PpGpp jest kluczowym globalnym regulatorem występującym zarówno w bakteriach gram-dodatnich i gram-ujemnych, jak i w chloroplastach.
- Ma szybki odpowiedź na stres i krótki okres półtrwania, co wymaga precyzyjnego monitorowania.
- Badanie podkreśla bezpieczne postępowanie z materiałami radioaktywnymi podczas eksperymentów.
Zastosowane metody
- Wysoki przepływ próbek przy użyciu radioaktywnie oznaczonych kultur bakteryjnych w łączkach mikrotytrach
- Monitorowanie poziomów ppGpp w warunkach stresu i regeneracji
- Chromatografia na warstwie cieńkiej do analizy poziomów nukleotydów
Główne wyniki
- Wykazano wzrost poziomów ppGpp podczas głodu izoleucyny.
- Wykazano, że ppGpp rozpada się z okresem półtrwania około 64 sekund po złagodzeniu stresu.
- Zdokumentowano możliwość dostosowania metodologii dla różnorodnych organizmów.
Wnioski
- Badanie dostarcza wartościowej metody do badania regulacji nukleotydów w warunkach stresu fizjologicznego.
- Podkreśla zastosowanie tej metody w różnych gatunkach bakterii w badaniach biologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative measurement of (p)ppGpp dynamics in Escherichia coli under stress and recovery provides critical insight into bacterial adaptation mechanisms. This capability enables high-resolution interrogation of nucleotide pool changes, supporting mechanistic de-risking and target validation in antimicrobial discovery. The approach enhances predictive confidence at the interface of early discovery and translational research for bacterial stress response pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise quantification of (p)ppGpp as a functional biomarker for stress response.
- Supports mechanistic de-risking by resolving rapid nucleotide turnover during stress transitions.
- Facilitates target validation for regulators of bacterial adaptation and persistence.
Screening & Assay Development
- Delivers high-throughput, parallel monitoring of radiolabeled cultures for robust assay development.
- Ensures reproducibility and quantitative output through standardized microtiter and TLC workflows.
- Prepares validated biological systems for downstream screening of modulators affecting (p)ppGpp metabolism.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling time-resolved measurement of stress-induced nucleotide changes.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation in bacterial stress and persistence models.
- Provides predictive value for risk-adjusted advancement of antibacterial candidates targeting stress pathways.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the early discovery and lead identification stages, bridging mechanistic studies with quantitative assay development for bacterial stress response research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of stress adaptation mechanisms via real-time (p)ppGpp quantification.
- Screening: Provides reproducible, scalable assay platforms for evaluating compound effects on nucleotide pools.
- Analytics: Delivers quantitative, time-resolved readouts for comparative analysis of stress and recovery conditions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and continuity into preclinical bacterial models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow adaptable to diverse bacterial species and stress paradigms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in bacterial stress pathway studies.
- Operational Value: Standardizes high-throughput, parallelized measurements for robust data generation.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for antibacterial target prioritization and resource allocation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of discovery and preclinical programs targeting bacterial adaptation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in radiolabeling, bacterial culture, and thin-layer chromatography.
- Demands access to temperature- and shaker-controlled microtiter incubators and phosphorimaging infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for sample handling and data analysis.
- Adaptable across gram-negative and gram-positive bacterial models with protocol modifications.
- Strict adherence to radioactive safety protocols is essential for operational compliance.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:47
Labeling with 32P
2:11
Induction of Stress or Starvation and Sample and ppGpp Extraction
2:54
Thin-layer Chromatography and Quantitation of (p)ppGpp
4:13
Measurement of the Rate of ppGpp Decay
4:46
Results: In Vivo Measurements of Escherichia coli
5:51
Conclusion
