Name: Ekspresja i oczyszczanie 3,4-dioksygenazy protokatechuatu 3,4-dioksygenazy bez nukleaz (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Poznaj metodę ekspresji i oczyszczania 3,4-dioksygenazy protokatechuatu w E. coli bez zanieczyszczeń nukleazami. Protokół zapewnia wysoce aktywny enzym do usuwania tlenu z roztworów wodnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH GM121284 i AI126742 do KEY.

1. Wywołanie ekspresji PCD u E. coli
<ol>
	<li>Połącz 1 μl plazmidu ekspresyjnego PCD pVP91A-pcaHG (20 ng / μL, <klasa silna = "xfig" >Rysunek 1A) i 20 μl E. coli BL21 (20 μl dostępnych na rynku komórek, > 2 x 106 jtk / μg plazmidu) w probówce. Przesuń rurkę, aby wymieszać. Umieść probówkę na lodzie na 5 minut.</li>
	<li>Umieść przemianę w temperaturze 42 °C na 30 s. Następnie lód 2 min.</li>
	<li>Dodaj 80 μL pożywki SOC (super optymalny bulion z tłumieniem katabolitu: 2,5 mM KCl, 10 mM NaCl, 2% trypton, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 10 mM MgSO4, 10 mM MgCl2, 20 mM glukozy). Wytrząsać przy 225 obrotach na minutę (obr./min) 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Umieść reakcję przemiany na agarze LB Amp (1L agaru Luria Bulith: 10 g NaCl, 10 g bakto-tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego, 15 g agaru, 50 μg/ml ampicyliny; 25 ml na szalkę Petriego o średnicy 10 cm).</li>
	<li>Inkubować płytkę pokrywką skierowaną w dół w temperaturze 37 °C przez 16-18 godzin.</li>
	<li>Zaszczepić 50 ml LB Amp (1L LB: 10 g bakto-tryptonu, 10 g NaCl, 5 g ekstraktu drożdżowego, 50 μg/ml ampicyliny) w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml z jedną kolonią. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 16-18 godzin, wytrząsając z prędkością 225 obr./min.</li>
	<li>Przenieść 20 ml kultury do 4-litrowej kolby z 1 l LB Amp. Wstrząsnąć z prędkością 225 obr./min w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Co godzinę mierzy się kulturę OD600 (gęstość optyczna przy 600 nm). Gdy OD600 w kulturze zbliża się do 0,5, zwiększ częstotliwość pomiarów do co 15 minut. Pożądana gęstość kultury wynosi 0,5 OD600.</li>
	<li>Przenieść kolbę o pojemności 4 l do pojemnika z lodem. Zamieszać kolbę w łaźni lodowej, aby obniżyć temperaturę hodowli. 
	nuta: Czas spędzony na lodzie powinien być ograniczony do minimum, aby komórki pozostały aktywne metabolicznie. Idealnie byłoby, gdyby komórki znajdowały się na lodzie krócej niż 10 minut.</li>
	<li>Pomyślną indukcję PCD można zaobserwować poprzez analizę elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE). Zbierz 1 ml nieindukowanej kultury do probówki. Odwirować próbkę przez 1 minutę w temperaturze 14 000 x g w mikrofugach w temperaturze otoczenia. Zdekantować supernatant.
	<ol>
		<li>Rozpuść granulowane komórki w 150 μl PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami).</li>
		<li>Dodaj równą objętość 2X barwnika ładującego (1,2% SDS, 30% glicerolu, 150 mM Tris-HCl, pH 6,8, 0,0018% błękitu bromofenolowego, 15% β-merkaptoetanolu). Skręć próbkę, aby dokładnie wymieszać.</li>
		<li>Gotować próbkę przez 3 minuty i przenieść do lodu. Próbka może być przechowywana w zamrażarce o temperaturze -20 °C do przyszłej analizy. 
		nuta: PBS jest dostępny w handlu z lub bez CaCl2 i MgCl2. Wiele laboratoriów będzie miało PBS bez CaCl2 i MgCl2 dla metod hodowli komórkowych. Nie znaleźliśmy żadnej różnicy w PBS z lub bez CaCl2 i MgCl2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść 4-litrową kolbę do inkubatora w temperaturze 17 °C z wytrząsaniem 180 obr./min. Kontynuuj monitorowanie OD600 co 20 minut.</li>
	<li>Przy 0,7 OD600 dodać izopropylo-beta-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG) do 0,5 mM końcowego stężenia (0,25 M roztworu podstawowego) i 10 mg/l sześciowodnego siarczanu amonu żelaza (II) (Fe(NH4)2(SO4)2, 10 mg/ml roztworu podstawowego). Geny PCD pcaH i pcaG są indukowane z promotora T5 przez dodanie IPTG (<silna klasa = "xfig" >Figura 1A). Siarczan żelaza jest wiązany przez PCD i jest niezbędny do aktywności katalitycznej poprzez koordynację tlenu podczas otwierania katecholu.</li>
	<li>Wstrząsać kulturą przy 180 obr./min w temperaturze 17 °C przez 18 godzin.</li>
	<li>Umieścić kolbę hodowlaną w lodzie, jak w ppkt 1.2. Pobrać 1 ml indukowanych komórek dla SDS-PAGE, jak w ppkt 1.3.</li>
	<li>Wlać kulturę bakteryjną do butelek odpowiednich do odwirowania. Kulturę o pojemności 1 l można odwirować w 4 butelkach o stożkowym dnie, o pojemności 1 250 ml. Osadzać kulturę w temperaturze 4 °C przez 20 minut w temperaturze 3000 x g. Zdekantować supernatanty. Utylizować odpowiednio bakteryjne odpady płynne.</li>
	<li>Pipetować w celu ponownego zaparcia granulek w 25 ml zimnego PBS (CaCl2 i MgCl2 są opcjonalne) na 1 l kultury.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę do probówek stożkowych o pojemności 50 ml (1 probówka o pojemności 50 ml na 1 l kultury). Osadzać komórki w roztworze 3000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant i odpowiednio zutylizować.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 10 ml buforu do lizy (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 20 mM imidazolu, 10% glicerolu, 800 ng/ml pepstatyny, 1 μg/ml leupeptyny i 87,1 μg/ml fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF)) przez pipetowanie. Zamrozić zawiesinę za pomocą ciekłego azotu w kolbie Dewara. Probówki z próbkami należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Oczyściliśmy PCD z granulek przechowywanych w temperaturze -80 °C przez rok bez widocznej utraty aktywności.</li>
	<li>Porównaj komórki nieindukowane i indukowane za pomocą SDS-PAGE. 
	nuta: Nie mieliśmy żadnych trudności z indukcją heterodimeru PCD. Zalecamy jednak przetestowanie indukcji przed kontynuowaniem oczyszczania w przypadku, gdy którykolwiek z odczynników nieoczekiwanie wygasł.
	<ol>
		<li>Zmontuj tabliczki do SDS-PAGE (wymiary: 7,3 cm x 8,3 cm x 0,75 mm grubości). Żel do układania w stosy to 1,5 ml 6% poliakrylamidu (6% akrylamidu, 125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 0,1% SDS, 0,1% nadsiarczanu amonu, 0,001% TEMED). Żel rozdzielczy to 3,5 ml 12% poliakrylamidu (12% akrylamidu, 375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 0,1% SDS, 0,1% nadsiarczanu amonu, 0,001% TEMED). Włóż 10-dołkowy grzebień do warstwy układania.</li>
		<li>Załadować 10 μl nieindukowanych i indukowanych próbek bakteryjnych. Załaduj 4 μl wstępnie wybarwionych markerów masy cząsteczkowej dla białek (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
		<li>Elektroforezę żelu pod napięciem 16,5 V/cm około 1 godziny. Błękit bromofenolowy powinien dotrzeć do dna żelu.</li>
		<li>Umieść żel w plamie Coomassie Blue (10% kwasu octowego, 40% metanolu, 0,1% barwnika Coomassie Blue) w plastikowej wannie. Plama powinna całkowicie zanurzyć żel. Bejcować w temperaturze otoczenia przez 20 min. Delikatny obrót podczas barwienia jest opcjonalny.</li>
		<li>Zastąp roztwór barwnikiem (10% kwas octowy, 40% metanol). Inkubować w temperaturze otoczenia z opcjonalnym delikatnym obracaniem, aż pasma białkowe będą łatwo widoczne.</li>
		<li>Zastąp odplamienie wodą dejonizowaną. Wśród białek bakteryjnych indukowane podjednostki PCD powinny być widoczne w indukowanych komórkach. Podjednostka PCD znakowana heksahistydyną pcaH ma masę cząsteczkową 28,3 kDa, a podjednostka pcaG wynosi 22,4 kDa. Jeśli podjednostki PCD nie są widoczne, należy przeprowadzić nową indukcję pochodzącą z nowej kolonii.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Oczyszczanie PCD metodą chromatografii powinowactwa niklowego
<ol>
	<li>Rozmrozić na lodzie jedną probówkę o pojemności 50 ml indukowanych komórek. Całkowite rozmrożenie próbki może zająć 2-3 godziny.</li>
	<li>Trzymając probówkę na lodzie, sonikuj próbkę o amplitudzie 30% przez 1 minutę, włączając i wyłączając co 1 s. Użyj stożkowego mikrokońcówki (średnica 0,125 cala). Maksymalna moc wynosi 400 W, a częstotliwość 20 kHz i przypada na 1 L osadu hodowlanego.</li>
	<li>Po sonikacji dodać lizozym do końcowego stężenia 0,2 mg/ml (10 mg/ml roztworu podstawowego) i trzymać na lodzie przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wlej lizat bakteryjny do wstępnie schłodzonej butelki z poliwęglanu (wymiary: 25 mm x 89 mm). Butelka powinna być kompatybilna z wirnikiem ultrawirówki o stałym kącie. Inne rurki i/lub wirniki mogą być zastąpione, ale końcowa siła grawitacji powinna być zachowana.</li>
	<li>Wirować przez 60 minut w temperaturze 120 000 x g w temperaturze 4 °C. Szczątki komórkowe utworzą osad. Supernatant może mieć postać żółtą.
	<ol>
		<li>Osad może być włączony do późniejszej analizy SDS-PAGE w celu określenia rozpuszczalności PCD (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B). Rozpuścić osad przez wirowanie w 10 ml PBS. Przenieść 150 μl do probówki o pojemności 1,5 ml. Przygotuj próbkę dla SDS-PAGE jak w 1.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wlać supernatant do zimnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Zwróć uwagę na głośność. Zanieczyszczenie supernatantu bakteryjnym DNA może prowadzić do uzyskania lepkiej próbki. Genomowe DNA bakterii może blokować przepływ w kolumnie. Etap ultrawirowania 2.2 należy powtórzyć w celu osadzenia DNA bakterii. Kulka z tego drugiego obrotu może nie być dobrze widoczna lub może być przezroczysta.</li>
	<li>Przygotować 500 ml buforu Ni A (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 i 10% glicerolu, 800 ng / ml pepstatyny, 1 μg / ml Leupeptyny i 87,1 μg / ml PMSF) i 500 ml buforu Ni B (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10% glicerolu, 800 ng / ml pepstatyny, 1 μg / ml Leupeptyny, i 87,1 μg/ml PMSF, 250 mM imidazolu, pH 8,0). Przepuść oba Ni przez filtry porowe 0,2 μm.</li>
	<li>Próbka, i system FPLC (szybka chromatografia cieczowa białek) znajdują się w chłodzonym pomieszczeniu w temperaturze 4 °C. Przemyć pompę A buforem Ni A i pompę B buforem Ni B. Przemyć układ 20 mM imidazolem (8% bufor Ni B, 92% bufor Ni A) do momentu ustabilizowania się UV i przewodności. Rutynowo przepływamy z prędkością 5 ml/min z limitem ciśnienia 1,0 MPa. Natężenie przepływu i limit ciśnienia powinny być określone przez specyfikacje zastosowanego przyrządu FPLC.</li>
	<li>Przygotuj kolumnę z 1,5 ml żywicy naładowanej niklem (wymiary: 110 mm długości x 5 mm). Zdolność wiązania żywicy wynosi 50 mg/ml i toleruje ciśnienie 1 MPa. Kolumnę można przelać i przechowywać w temperaturze 4 °C przed oczyszczeniem. 
	nuta: Rozmiar kolumny może być proporcjonalnie zwiększony, aby pomieścić więcej niż jedną probówkę o pojemności 50 ml indukowanych komórek, jeśli wymagana jest większa ilość białka. Preferujemy świeżą kolumnę dla każdego preparatu, aby upewnić się, że żadne resztki białka nie zanieczyszczają pożądanego przez nas białka. Jednak żywice niklowe mogą być poddawane recyklingowi zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Przymocuj kolumnę z żywicą naładowaną niklem do FPLC. Przepuścić przez kolumnę 20 ml 92% buforu Ni A i 8% buforu Ni B (20 mM imidazolu) przy 0,5 ml/min z ograniczeniem ciśnienia 0,5 MPa przez kolumnę w celu zrównoważenia. W czasie rzeczywistym FPLC powinien mierzyć A280 (absorbancja UV 280 nm), a także przewodność. Jeśli wartości te nie ustabilizują się po przejściu 20 ml objętości przez kolumnę, należy przepłynąć, aż się ustabilizują.</li>
	<li>Załadować próbkę do kolumny (~10 ml) z prędkością 0,15 ml/min. Ustawić limit ciśnienia na 0,5 MPa. Zbierz przepływ.</li>
	<li>Przemyć kolumnę 20 ml buforu Ni o stężeniu 20 mM imidazolu (92% buforu Ni A i 8% buforu Ni B). Zachowaj popłucz w probówce o pojemności 50 ml do analizy. Przemyć kolumnę 15 ml 50% buforu Ni A i 50% buforu Ni B (125 mM imidazolu). Zebrać elucję w 19 frakcjach o objętości 0,8 ml. Przemyć kolumnę 15 ml 100% buforu Ni B. Zebrać dodatkowe 75 frakcji po 0,2 ml. Niektóre heterodimery PCD będą eluować w płukaniu 50% buforem Ni B, ale większość heterodimeru będzie eluować w płukaniu 100% buforem Ni B.</li>
	<li>Przeanalizuj zebrane frakcje na 12% żelach SDS-PAGE, aby potwierdzić obecność PCD. Dodaj równe objętości barwnika 2X ładującego do frakcji przepływu, mycia i piku A280. Gotować przez 3 minuty. Przełóż na lód. Wlej dwa 12% żele SDS-PAGE (jak w kroku 1.7). Powtórzyć metodę żelową zgodnie z opisem w ppkt 1.7.</li>
</ol>
3. Test aktywności nukleazy
<ol>
	<li>Na podstawie analizy SDS-PAGE zidentyfikuj frakcje powinowactwa do niklu, które zawierają prawie czystą PCD. Połączyć 5 μl frakcji chromatograficznej i 500 ng 3 kb superskręconego plazmidu pXba+ w buforze reakcyjnym (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,1 mM DTT) o końcowej objętości 50 μL.
	<ol>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Obejmują kontrolę ujemną (bez dodatku białka) i kontrolę pozytywną (dostępną w handlu PCD). Zatrzymaj reakcję za pomocą 10 μl roztworu zatrzymującego (150 mM EDTA, pH 8,0, 0,6% SDS, 18% glicerol, 0,15% Orange G).</li>
		<li>Próbki mogą być przechowywane w zamrażarce o temperaturze -20 °C w celu późniejszej analizy. Każdy superskręcony plazmid może być użyty w teście nukleazy, o ile produkty reakcji superskręconego i zrelaksowanego koła mogą być rozwiązane przez elektroforezę w żelu agarozowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wlej 120 ml 1% żelu agarozowego do 1X buforu etydynowego TAE (40 mM octanu tris, 1 mM EDTA, 0,5 μg/ml bromku etydyny) w odlewie żelowym (wymiary: 15 x 10 cm). Użyj grzebienia z 15 dołkami (wymiary studzienki: 5 mm x 1,5 mm). Gdy żel stwardnieje, zanurz go w 1X buforze etydyny TAE.</li>
	<li>Przeanalizować 30 μl reakcji za pomocą żelu agarozowego. Elektroforeza przy 10 V/cm w temperaturze otoczenia przez około 1 godzinę. Przód barwnika Orange G powinien znajdować się na końcu żelu.</li>
	<li>Użyj skanera fluorescencyjnego, aby natychmiast zobrazować sygnał bromku etydyny żelu. Jeśli użyto plazmidu o wielkości 3 kb, najwolniejszym pasmem będą zrelaksowane okręgi o długości ~3,5 kb, liniowe DNA będzie przebiegać przy 3 kb, a plazmid superskręcony będzie miał najszybszą ruchliwość przy ~2 kb.
	<ol>
		<li>Oblicz całkowitą objętość pikseli każdego pasa ruchu za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.</li>
		<li>Określ objętość pikseli różnych gatunków DNA, takich jak superskręcone, liniowe i nacięte okręgi. Użyj tych wartości, aby określić procentowy udział każdego gatunku DNA. Na przykład zwiększona obecność wyszczerbionych kółek związanych z frakcją w porównaniu z kontrolą ujemną wskazuje na obecność nukleazy. Objętość pikseli wyciętych okręgów w pasie jest dzielona przez wartość piksela całkowitego DNA. Określ wartość procentową, mnożąc tę liczbę przez 100.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Połącz frakcje z drugiego piku elucji, które zawierają prawie czysty heterodimer PCD na podstawie analizy SDS-PAGE i mają minimalną lub niewykrywalną aktywność nukleazy. Nasza typowa łączna objętość to ~2 mL.</li>
	<li>Załadować próbkę do filtra odśrodkowego z odcięciem masy cząsteczkowej 10 kDa. Wirować w obrotowym wiadrze, wirować przy 4000 x g przez 40 minut w temperaturze 4 °C. Alternatywnie można użyć wirnika o stałym kącie nachylenia 35° przy 7500 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
	<ol>
		<li>Powtarzać wirowanie, aż końcowa objętość retentatu wyniesie 100-200 μl.</li>
		<li>Odwrócić jednostkę filtrującą i odzyskać retentat przez odwirowanie przy 1000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Oczyszczanie PCD metodą chromatografii wykluczającej rozmiar
<ol>
	<li>Przygotować bufor do chromatografii wykluczającej (SEC) o objętości 250 ml (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10% glicerolu, 0,1 mM EDTA, 800 ng/ml pepstatyny, 1 μg/ml leupeptyny i 87,1 μg/ml PMSF). Przepuścić bufor przez filtr porowy 0,2 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C. 
	nuta: Wszystkie czynności należy wykonać w pomieszczeniu chłodniczym w temperaturze 4 °C. Oczyszczanie SEC jest opcjonalne, ale białko powinno być przechowywane w buforze działającym SEC. W przypadku pominięcia oczyszczania SEC, retentat zebrany w ppkt 3.6.2. należy dializować w 1 l buforu SEC w rurkach dializacyjnych MWCO (odcięta masa cząsteczkowa) o masie cząsteczkowej 10 kDa w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Zrównoważyć usieciowaną kolumnę agarozową SEC (chromatografia wykluczania wielkości) (wymiary: 10 mm x 300 mm; objętość złoża 24 ml; objętość próbki 25 - 500 μl; limit ciśnienia 1,5 MPa; 2 x 10 Limit wykluczenia6 Da; separacja od 1 do 300 kDa) z buforem do pracy SEC przy 0,5 ml/min. 
	nuta: W razie potrzeby można użyć kolumn SEC o alternatywnym rozmiarze.</li>
	<li>Załadować skoncentrowane frakcje do pętli iniekcyjnej o objętości 200 μl. Załadować próbkę z prędkością 0,5 ml/min do kolumny. Rozdzielczość SEC wzrasta wraz ze zmniejszaniem objętości ładunku. Eluować za pomocą 23 ml buforu SEC i zebrać 94 frakcje po 250 μl. Chromatogram SEC powinien rozdzielić pojedynczy pik A280, który jest heterodimerem PCD. Okazuje się, że PCD eluuje 8,9 ml. Czas elucji zmieni się w zależności od alternatywnych kolumn SEC.</li>
</ol>
5. Testy utleniania PCA i aktywności nukleazy
<ol>
	<li>Reakcje do oznaczania zarówno utleniania PCA, jak i aktywności nukleazy przeprowadza się w 96-dołkowej płytce o płaskim dnie. Zebrać reakcje na 96-dołkowej płytce na lodzie w chłodni o temperaturze 4 °C, aby zapobiec przedwczesnej katalizie. Połączyć w końcowej objętości 50 μL: 130 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 0,1 mM DTT, 5 mM PCA, 10 ng/ml superskręconego plazmidu pXba+ i 10 μL poszczególnych frakcji PCD SEC. 
	nuta: Frakcje PCD SEC powinny być dodawane jako ostatnie i bezpośrednio przed analizą, ponieważ białko rozpocznie katalizę w momencie dodawania.</li>
	<li>Utlenianie PCA metodą PCD powoduje zmniejszenie absorbancji PCA przy długości fali 290 nm (A290). Przenieść 96-dołkową płytkę do uchwytu czytnika płytek ustawionego na temperaturę wewnętrzną 37 °C. Wsunąć uchwyt płytki do przyrządu i mierzyć A290 w odstępach 20 s przez 1 godzinę. Niech przyrząd potrząśnie płytką 5 s przed każdym odczytem.</li>
	<li>Po 1 godzinie zakończ reakcje, dodając 10 μl roztworu zatrzymującego (150 mM EDTA, pH 8,0, 0,6% SDS, 18% glicerol, 0,15% Orange G).</li>
	<li>Przygotuj, załaduj i uruchom żel agarozowy jak w kroku 3.2.</li>
	<li>Zobrazuj i przeanalizuj żel agarozowy jak w kroku 3.3.</li>
	<li>Wybrać frakcje o największej aktywności utleniania PCA i braku zaobserwowanego zanieczyszczenia nukleazą do długotrwałego przechowywania w temperaturze -80 °C. Zmierzyć A280.</li>
	<li>Obliczyć całkowite stężenie PCD przy użyciu A280 i współczynnika ekstynkcji (ε280) wynoszącego 734 700 M-1 cm-1.</li>
	<li>Szybkie zamrażanie poszczególnych frakcji w ciekłym azocie. Przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C. Alternatywnie połącz aktywne, wolne od nukleaz frakcje, podwielokrotność i zamroź w ten sam sposób. Nasza typowa wydajność to 1-2 mg PCD na l hodowli. Typowe zastosowanie w eksperymencie SM to 3 μg PCD. Stosowaliśmy PCD przechowywany w temperaturze -80 °C przez okres do 1 roku bez spadku aktywności.</li>
</ol>

<ol><li>Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+single+fluorescent+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Detection of single fluorescent molecules.</a> Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).</li>
<li>Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+reactive+oxygen+species+to+the+photobleaching+of+organic+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores.</a> Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).</li>
<li>Ha, T., Tinnefeld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photophysics+of+fluorescent+probes+for+single-molecule+biophysics+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).</li>
<li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy%3A+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%3A+for+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).</li>
<li>Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+species+formed+on+proteins+exposed+to+singlet+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+%26+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen.</a> Photochemical & Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).</li>
<li>Sies, H., Menck, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Singlet+oxygen+induced+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Singlet oxygen induced DNA damage.</a> Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).</li>
<li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxygen+scavenging+system+for+improvement+of+dye+stability+in+single-molecule+fluorescence+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li>
<li>Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanochemical+coupling+in+actomyosin+energy+transduction+studied+by+in+vitro+movement+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay.</a> Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).</li>
<li>Shi, X., Lim, J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidification+of+the+oxygen+scavenging+system+in+single-molecule+fluorescence+studies%3A+in+situ+sensing+with+a+ratiometric+dual-emission+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe.</a> Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).</li>
<li>Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+analyses+of+designed+and+selected+mutants+of+protocatechuate+3%2C4-dioxygenase1%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1.</a> Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).</li>
<li>Senavirathne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+nuclease+contamination+in+commonly+used+oxygen-scavenging+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems.</a> Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).</li>
<li>Senavirathne, G., Lopez, M. A. Jr, Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+nuclease-free+protocatechuate+3%2C4-dioxygenase+for+prolonged+single-molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging.</a> Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).</li>
<li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nature Communications. 7, 11409(2016).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cascading+MutS+and+MutL+sliding+clamps+control+DNA+diffusion+to+activate+mismatch+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair.</a> Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Systemy oczyszczania tlenu są powszechnie stosowane w mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek w celu zmniejszenia fotobielenia 3,7,8. Te techniki mikroskopowe są często używane do obserwacji interakcji kwasów nukleinowych lub białek z kwasami nukleinowymi 1,13,14. Zanieczyszczenie OSS nukleazami może prowadzić do fałszywych...

Biofizyka pojedynczej cząsteczki (SM) to szybko rozwijająca się dziedzina, która zmienia sposób, w jaki patrzymy na zjawiska biologiczne. Dziedzina ta ma unikalną zdolność łączenia podstawowych praw fizyki i chemii z biologią. Mikroskopia fluorescencyjna jest jedną z metod biofizycznych, która pozwala osiągnąć czułość SM. Fluorescencja służy do wykrywania biomolekuł poprzez łączenie ich z małymi organicznymi fluoroforami lub kropkami kwantowymi1. Cząsteczki te mogą emitować fotony, gdy są wzbudzane przez lasery, a następnie nieodwracalnie fotowybielane2. Fotowybielanie występuje, gdy etykiety fluorescencyjne ulegają uszkodzeniom chemicznym, które niszczą ich zdolność do wzbudzania na pożądanej długości fali2,3. Obecność reaktywnych form tlenu (ROS) w buforze wodnym jest główną przyczyną fotowybielania2,4. Dodatkowo, ROS może uszkadzać biomolekuły i prowadzić do błędnych obserwacji w eksperymentach SM5,6. Aby zapobiec uszkodzeniom oksydacyjnym, można zastosować systemy oczyszczania tlenu (OSS)3,7,8. System oksydazy/katalazy glukozowej (GODCAT) jest skuteczny w usuwaniu tlenu8, ale wytwarza potencjalnie szkodliwe nadtlenki jako produkty pośrednie. Mogą one być szkodliwe dla biomolekuł będących przedmiotem zainteresowania w badaniach nad SM.
Alternatywnie, protokatechuat 3,4 dioksygenaza (PCD) skutecznie usunie O2 z roztworu wodnego za pomocą swojego substratu kwasu protokatechowego (PCA)7,9. PCD jest metaloenzymem, który wykorzystuje żelazo niehemowe do koordynowania PCA i katalizowania reakcji otwarcia pierścienia katecholowego za pomocą rozpuszczonego O210. Wykazano, że ta jednoetapowa reakcja jest ogólnie lepszym OSS poprawiającym stabilność fluoroforu w eksperymentach SM7. Niestety, wiele dostępnych na rynku enzymów OSS, w tym PCD, zawiera zanieczyszczające nukleazy11. Zanieczyszczenia te mogą prowadzić do uszkodzenia substratów na bazie kwasów nukleinowych stosowanych w eksperymentach SM. Prace te pozwolą na wyjaśnienie protokołu oczyszczania opartego na chromatografii do stosowania rekombinowanego PCD w systemach SM. PCD może być szeroko stosowany w każdym eksperymencie, w którym ROS uszkadzają podłoża potrzebne do akwizycji danych.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>&beta; ME</td></tr><tr><td>30% roztwór akrylamidu i bis-akrylamidu, 29:1</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0156</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy, Certyfikat lodowcowy ACS</td><td>Fisherl Chemical</td><td>A38C-212</td><td></td></tr><tr><td>Agar, granulowany</td><td>BD Biosciences</td><td>DF0145-17-0</td><td></td></tr><tr><td>System AKTA FPLC</td><td>Oczyszczacz AKTA do spraw nauk przyrodniczych GE Healthcare</td><td>: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900 i Frac-920</td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-2 EMD</td><td>Millipore</td><td>UFC201024</td><td>10 kDa MWCO</td></tr><tr><td>Sześciowodny siarczan amonu żelaza(II)</td><td>Sigma</td><td>F-2262</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki nadsiarczanu amonu (APS)</td><td>Amresco</td><td>K833-100TABS</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Amresco</td><td>0339-25G</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Tryptone</td><td>BD Biosciences</td><td>DF0123173</td><td></td></tr><tr><td>Dodatek do odwodnionych pożywek hodowlanych BD Bacto: Ekstrakt drożdżowy z butelki</td><td>VWR</td><td>90004-092</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS propan, >=99,0% (miareczkowanie)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6755-500G</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue</td><td>Amresco</td><td>0472-50G</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96&ndash; Dobrze płaskie&ndash; Dolna płyta EIA</td><td>Bio-Rad</td><td>2240096EDU</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>P212121</td><td>SV-DTT</td><td></td></tr> Sól fizjologiczna <tr><td>buforowana fosforanem Dulbecco 500ML</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G37-20</td><td></td></tr><tr><td>Granulowany bulion LB Miller</td><td>EMD Biosciences</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Res Standard Agaroza</td><td>AGTC Bioproducts</td><td>AG500D1</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0250-250G</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Goldbio</td><td>I2481C25</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Roche</td><td>11017128001</td><td></td></tr><tr><td>Lizozym z Białka Jaja Kurzego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876-1G</td><td></td></tr><tr>Sześciowodny spektrofotometr <td>mikroobjętościowy chlorku magnezu</td><td>Amresco</td><td>0288-1KG</td><td></td></tr>, <tr><td>z możliwością kuwetowania</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>P212121</td><td>RP-S23020</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow (100 ml)</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>Novagen BL21 Competent Cells</td><td>EMD Millipore</td><td>69-449-3</td><td>W zestawie</td></tr> <tr>nośnik SOC<td>Orange G</td><td>Fisher Scientific</td><td>0-267</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>P-020-25</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Amresco</td><td>0754-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas protokatechowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN15642110</td><td>PCA</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>P212121</td><td>CI-00270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek SpectraMax M2</td><td>Urządzenia molekularne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylne jednorazowe jednostki filtrujące z membraną PES > 250 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-741-04</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne jednorazowe jednostki filtrujące z membraną PES > 500 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-741-02</td><td></td></tr><tr><td>Superose 12 10/300 GL</td><td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>17517301</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Amresco</td><td>0761-25ML</td><td></td></tr><tr>Kamera fluorescencyjna <td>Tris Ultra Pure</td><td>Gojira Fine Chemicals</td><td>UTS1003</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9410 w trybie zmiennym</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr></tbody></table>

ekspresja i oczyszczanie 3,4-dioksygenazy protokatechuatu 3,4-dioksygenazy bez nukleaz

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Mikroskopia pojedynczej cząsteczki (SM) jest używana do badania dynamicznych oddziaływań molekularnych biomolekuł znakowanych fluoroforem w czasie rzeczywistym. Jednak fluorofory są podatne na utratę sygnału w wyniku fotowybielania przez rozpuszczony tlen (O2). Aby zapobiec fotowybielaniu i przedłużyć żywotność fluoroforu, stosuje się systemy oczyszczania tlenu (OSS) w celu redukcjiO2. Komercyjnie dostępny OSS może być zanieczyszczony nukleazami, które uszkadzają lub rozkładają kwasy nukleinowe, co zakłóca interpretację wyników eksperymentalnych. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół ekspresji i oczyszczania wysoce aktywnej protokatechuaty-3,4-dioksygenazy Pseudomonas putida (PCD) bez wykrywalnego zanieczyszczenia nukleazą. PCD może skutecznie usuwać reaktywne formyO2 poprzez konwersję substratu kwasu protokatechowego (PCA) do kwasu 3-karboksylowego, cis-mukonowego. Metoda ta może być stosowana w każdym układzie wodnym, w którymO2 odgrywa szkodliwą rolę w pozyskiwaniu danych. Metoda ta jest skuteczna w wytwarzaniu wysoce aktywnego, wolnego od nukleaz PCD w porównaniu z dostępnym na rynku PCD.

Dostępny komercyjnie pochłaniacz tlenu PCD jest często zanieczyszczony nukleazą DNA. Obecność zanieczyszczającej nukleazy może prowadzić do błędnych wyników w badaniach fluorescencyjnych, szczególnie w tych analizujących DNA lub białka oddziałujące z DNA. Stwierdziliśmy, że rekombinowany PCD, będący heterodimerem białek pcaH i pcaG z tagiem heksahistydynowym, może być ekspresowany w E. coli (Rycina 1). Heterodimer jest najpierw oczyszczany za pomocą chromatog...

Protokatechuatowa 3,4-dioksygenaza (PCD) może enzymatycznie usuwać wolny dwuatomowy tlen z układu wodnego za pomocą swojego substratu kwasu protokatechowego (PCA). Protokół ten opisuje ekspresję, oczyszczanie i analizę aktywności tego enzymu pochłaniającego tlen.

Ekspresja i oczyszczanie 3,4-dioksygenazy protokatechuatu 3,4-dioksygenazy bez nukleaz

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Nasz protokół daje wysoce aktywny PCD wolny od wykrywalnej nukleazy, który może być stosowany w każdym roztworze, w którym zanieczyszczeniem jest wodny tlen. Stosowane przez nas techniki są łatwe do odtworzenia i zapewniają, że w produkcie nie ma zanieczyszczeń nukleazowych. Na początek połącz jeden mikrolitr plazmidu ekspresyjnego PCD pVP91A-pcaHG i 20 mikrolitrów dostępnego w handlu E.coli BL21 w probówce.Przesuń probówkę, aby wymieszać i umieść probówkę na lodzie na pięć minut. Aby kontynuować reakcję przemiany, umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza na 30 sekund, a następnie na lodzie na dwie minuty. Dodaj 80 mikrolitrów pożywki SOC i wstrząsaj z prędkością 225 obr./min i 37 stopni Celsjusza przez godzinę.Następnie wlać mieszaninę z reakcji przemiany na agar LB-ampicyliny i użyć rozprowadzacza płytkowego do rozprowadzenia mieszaniny. Przykryj płytkę pokrywką i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 do 18 godzin. Następnie wybierz jedną kolonię z płytki i zaszczep 50 mikrolitrów LB-ampicyliny w 250-mililitrowej kolbie Erlenmeyera.Umieścić kolbę na wytrząsarce z prędkością 225 obr./min, aby inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusz

expression-purification-nuclease-free-oxygen-scavenger

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Procedury znakowania izotopami stabilnymi z wykorzystaniem wody wzbogaconej w 18O (procedury LeO) są wszechstronnymi narzędziami w ilościowych i jakościowych badaniach proteomicznych. W procedurach wspomaganych proteazami (PALeO) atomy 18O są wprowadzane poprzez proteolityczne rozszczepienie oraz reakcje wymiany tlenu karboksylowego katalizowane przez proteazy. W procedurze katalizowanej kwasowo (ALeO) atomy 18O są wprowadzane poprzez wymianę tlenu karboksylowego przy niskim pH.

Procedury znakowania katalizowane przez proteazy i kwasy z wykorzystaniem wody wzbogaconej w 18O

Opisujemy protokół katalizowanego światłem wytwarzania nadtlenku wodoru — kofaktora przemian oksydacyjnych.

Dekarboksylacja enzymatyczna sterowana światłem

Przedstawiamy szczegółowy protokół do konstruowania i sprawdzania bibliotek mutantów dla kampanii ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae.

Metoda ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae: tworzenie i badanie przesiewowe biblioteki mutantów

Przedstawiono protokół produkcji, oczyszczania i stosowania pęcherzyków z zewnętrzną błoną upakowaną enzymem (OMV), zapewniający zwiększoną stabilność enzymów do zastosowania w różnych zastosowaniach.

Ukierunkowane pakowanie białka w pęcherzykach błony zewnętrznej z Escherichia coli: projektowanie, produkcja i oczyszczanie

Tutaj prezentujemy protokół skutecznego jednoetapowego oczyszczania aktywnej, nieoznakowanej, ludzkiej translokacji 10-jedenaście (TET2) 5-metylocytozynowej dioksygenazy za pomocą chromatografii jonowymiennej i jej testu opartego na chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas (LC-MS/MS).

Skuteczne oczyszczanie i opracowywanie testów opartych na LC-MS/MS dla dioksygenazy 5-metylocytozynowej translokacji Ten-Eleven-2

Tutaj prezentujemy protokół beztlenowego oczyszczania białek, koncentracji białka beztlenowego i późniejszej charakterystyki kinetycznej za pomocą systemu elektrod tlenowych. Metodę zilustrowano przy użyciu enzymu DesB, enzymu dioksygenazy, który jest bardziej stabilny i aktywny, gdy jest oczyszczany i przechowywany w środowisku beztlenowym.

Oczyszczanie białek beztlenowych i analiza kinetyczna za pomocą elektrody tlenowej do badania aktywności i inhibicji dioksygenazy DesB

Tutaj prezentujemy protokół syntezy i charakterystyki nanocząstek tlenku ceru (nanocerii) do oczyszczania ROS (reaktywnych form tlenu) in vivo, obrazowania nanocerii w tkankach roślinnych za pomocą mikroskopii konfokalnej oraz monitorowania in vivo nanocerii ROS za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Katalityczne oczyszczanie roślinnych reaktywnych form tlenu in vivo za pomocą anionowych nanocząstek tlenku ceru

Opisujemy strategię, jak używać próbek RNA z niepotwierdzonych próbek ostryg pacyficznych i oceniamy materiał genetyczny przez porównanie z publicznie dostępnymi danymi genomu w celu wygenerowania wirtualnie zsekwencjonowanej biblioteki cDNA.

Zbieżna strategia generowania wirtualnie zsekwencjonowanej biblioteki cDNA z niereferencyjnych ostryg pacyficznych

Prezentowany tutaj jest protokół do wykonywania transferu energii rezonansu Förstera dla pojedynczej cząsteczki w celu zbadania rozdzielczości HJ. Dwukolorowe wzbudzenie przemienne służy do wyznaczania stałych dysocjacji. Jednokolorowy smFRET poklatkowy jest następnie stosowany w testach rozszczepienia w czasie rzeczywistym w celu uzyskania rozkładu czasu przebywania przed rozdzielczością HJ.

Metody transferu energii rezonansu Förstera w pojedynczych cząsteczkach do badania w czasie rzeczywistym rozdzielczości złącza Hollidaya przez GEN1

Tutaj prezentujemy protokół koniugacji monomeru białkowego za pomocą enzymów tworzących polimer białkowy o kontrolowanej sekwencji i unieruchamiania go na powierzchni w celu badań spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek.

Synteza enzymatyczna i immobilizacja spolimeryzowanego białka za pośrednictwem OaAEP1 do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek

W artykule opisano metodologię nadekspresji rekombinowanej Nsp15, toksycznej nukleazy, w systemie ekspresji C41(DE3), a następnie oczyszczania znakowanego białka za pomocą chromatografii wykluczania powinowactwa i wielkości. Protokoły te można dostosować do innych trudnych toksycznych białek.

Nadekspresja i oczyszczanie toksycznej nukleazy z Escherichia coli

Poznaj metodę ekspresji i oczyszczania 3,4-dioksygenazy protokatechuatu w E. coli bez zanieczyszczeń nukleazami. Protokół zapewnia wysoce aktywny enzym do usuwania tlenu z roztworów wodnych.

Ekspresja i oczyszczanie 3,4-dioksygenazy protokatechuatu 3,4-dioksygenazy bez nukleaz

Przeglądaj więcej filmów