Ekspresja i oczyszczanie 3,4-dioksygenazy protokatechuatu 3,4-dioksygenazy bez nukleaz

Nasz protokół daje wysoce aktywny PCD wolny od wykrywalnej nukleazy, który może być stosowany w każdym roztworze, w którym zanieczyszczeniem jest wodny tlen. Stosowane przez nas techniki są łatwe do odtworzenia i zapewniają, że w produkcie nie ma zanieczyszczeń nukleazowych. Na początek połącz jeden mikrolitr plazmidu ekspresyjnego PCD pVP91A-pcaHG i 20 mikrolitrów dostępnego w handlu E.coli BL21 w probówce.

Przesuń probówkę, aby wymieszać i umieść probówkę na lodzie na pięć minut. Aby kontynuować reakcję przemiany, umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza na 30 sekund, a następnie na lodzie na dwie minuty. Dodaj 80 mikrolitrów pożywki SOC i wstrząsaj z prędkością 225 obr./min i 37 stopni Celsjusza przez godzinę.

Następnie wlać mieszaninę z reakcji przemiany na agar LB-ampicyliny i użyć rozprowadzacza płytkowego do rozprowadzenia mieszaniny. Przykryj płytkę pokrywką i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 do 18 godzin. Następnie wybierz jedną kolonię z płytki i zaszczep 50 mikrolitrów LB-ampicyliny w 250-mililitrowej kolbie Erlenmeyera.

Umieścić kolbę na wytrząsarce z prędkością 225 obr./min, aby inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 do 18 godzin. Następnie przenieś 20 mililitrów inkubowanej kultury do czterolitrowej kolby wypełnionej jednym litrem LB-ampicyliny. Wstrząsać z prędkością 225 obr./min w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Co godzinę pobieraj jeden mililitr kultury do kuwety, aby zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nanometrach na fotometrze. Gdy gęstość optyczna kultury wzrasta w pobliżu 0,5, zwiększaj częstotliwość pomiarów do co 15 minut, aż OD600 osiągnie 0,5. Następnie przenieś czterolitrową kolbę do pojemnika z lodem.

Zamieszać kolbę w łaźni lodowej, aby obniżyć temperaturę hodowli. Przenieść czterolitrową kolbę do inkubatora w temperaturze 17 stopni Celsjusza i 180 obr./min. Kontynuuj monitorowanie OD600 co 20 minut.

Przy 0,7 OD600 dodaj IPTG i sześciowodne roztwory podstawowe siarczanu amonu żelaza, aby osiągnąć końcowe stężenie odpowiednio 0,5 milimola i 10 miligramów na litr. Wstrząsaj kulturą z prędkością 180 obr./min i 17 stopni Celsjusza przez 18 godzin. Po inkubacji umieścić kolbę hodowlaną w lodzie na dwie minuty.

Zbierz jeden mililitr indukowanych komórek do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej z polipropylenu do analizy SDS-PAGE. Następnie wlej kulturę bakteryjną do butelek po 500 mililitrów każda butelka w celu odwirowania. Osadzaj kulturę w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 3 000 razy g przez 20 minut.

Zdekantować supernatanty. Odpipetować do ponownego zawieszenia granulek, każdy w 12,5 mililitra zimnego PBS, i połączyć co dwie zawiesiny w 50-mililitrowej stożkowej probówce. Ponownie zagnieźdź ogniwa, tak jak poprzednio.

Następnie wyrzuć supernatanty i za pomocą pipety dodaj 10 mililitrów buforu do lizy w każdej probówce w celu ponownego zawieszenia komórek. Po sonikacji probówek z indukowanymi komórkami, wlej lizat bakteryjny do wstępnie schłodzonej butelki z poliwęglanu. Wirować przez 60 minut w temperaturze 120 000 razy g i w czterech stopniach Celsjusza, a następnie wlać supernatant do zimnej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów.

Po przygotowaniu przyrządu FPLC z kolumną z żywicy naładowanej niklem, załaduj próbkę do kolumny z prędkością 0,15 mililitra na minutę. Przemyć kolumnę 20 mililitrami buforu niklowego o stężeniu 20-milimolowym imidazolu. Zachowaj pranie w 50-mililitrowej probówce do analizy.

Następnie przemyć kolumnę 15 mililitrami buforu niklowego o stężeniu 125-milimolowym imidazolu. Zbierz elucję w 19 frakcjach po 0,8 mililitra każda. Ponownie umyj kolumnę 15 mililitrami 100% niklowego buforu B i zbierz dodatkowe 75 frakcji po 0,2 mililitra każda.

Kontynuuj analizę pobranych frakcji na żelach 12%SDS-PAGE w celu potwierdzenia obecności PCD. Najpierw dodaj 35 mikrolitrów buforu reakcyjnego do 1,5-mililitrowej probówki wirówki z polipropylenu. W probówce połącz pięć mikrolitrów pikowych frakcji chromatograficznych i 500 nanogramów superskręconego plazmidu pXba o trzykilo parach zasad.

Umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę. Po przygotowaniu żelu agarozowego zgodnie z rękopisem dodaj 30 mikrolitrów każdej reakcji do studzienek w żelu. Elektroforeza przy napięciu 10 woltów na centymetr w temperaturze otoczenia przez około godzinę.

Teraz pomarańczowy barwnik G dotarł do końca żelu. Natychmiast użyj skanera fluorescencyjnego, aby zobrazować sygnał bromku etydyny żelu. Za pomocą funkcji intensywności i rozmiaru piksela obrazu określ objętość pikseli różnych gatunków DNA, takich jak okręgi superskręcone, liniowe i nacięte.

Aby określić procent każdego gatunku DNA, podziel objętość pikseli pojedynczego gatunku DNA przez całkowitą objętość pikseli dla wszystkich poszczególnych gatunków. Analiza SDS-PAGE pokazuje, że drugi pik elucji zawiera minimalne zanieczyszczenie białkami, co stanowi prawie czysty heterodimer PCD i minimalną lub niewykrywalną aktywność nukleazy. W ten sposób połącz te 10 frakcji z drugiej elucji PCD w pięciomililitrowej stożkowej probówce do dalszej analizy.

Po oczyszczeniu PCD metodą chromatografii wykluczającej według wielkości, w chłodni o temperaturze czterech stopni Celsjusza, połączyć w probówce mikrowirówki odpowiednią objętość chlorku sodu, chlorowodorku trisu, chlorku magnezu, ditiotreitolu, PCA i superskręconego plazmidu pXba, aby uzyskać 5-krotny zapas. Umieść 96-dołkową płaską płytkę denną na lodzie i przenieś 10 mikrolitrów połączonego roztworu 5X do studzienek. Bezpośrednio przed analizą dodać do każdej studzienki 10 mikrolitrów poszczególnych frakcji PCD SEC.

Ustaw czytnik płytek na temperaturę wewnętrzną 37 stopni Celsjusza i przenieś 96-dołkową płytkę do uchwytu płytki. Wsuń uchwyt płytki do instrumentu i mierz absorbancję przy 290 nanometrach w odstępach 20-sekundowych przez godzinę. Ustaw przyrząd tak, aby potrząsał płytką na pięć sekund przed każdym odczytem.

Po godzinie dodaj 10 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do każdej studzienki, aby zakończyć reakcje. Wykonać elektroforezę żelową dla frakcji PCD SEC. Wybierz frakcje o największej aktywności utleniania PCA, na co wskazuje zmniejszona absorbancja i brak obserwowanego zanieczyszczenia nukleazą.

Zmierz absorbancję przy 280 nanometrach i oblicz całkowite stężenie PCD na podstawie absorbancji i współczynnika ekstynkcji. Wybrane frakcje przechowuj do długotrwałego przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. W tym eksperymencie stwierdzono, że rekombinowany PCD, heterodimer heksahistydyny znakowany pcaH i pcaG, ulegał ekspresji w E. coli.

Heterodimer został najpierw oczyszczony za pomocą chromatografii powinowactwa niklu. Absorbancja jest pokazana na niebiesko, a procentowe stężenie buforu niklowego B jest pokazane na czerwono. Przepływ pokazuje rozpuszczalne białka bakteryjne, które nie wiązały się z żywicą niklową.

Część PCD eluowała się w obecności 125-milimolowego imidazolu, ale większość białka eluowała się w 250-milimolowym imidazolu. Reprezentatywna analiza SDS-PAGE wskazuje, że frakcje z etapu elucji były wolne od zanieczyszczeń. Żel agarozowy do testu nukleazy ujawnia zanieczyszczenie poprzez porównanie z kontrolą ujemną bez dodatku białka i kontrolą pozytywną zanieczyszczoną nukleazą DNA.

Kwantyfikacja różnych gatunków DNA zaobserwowanych w teście nukleazy żelu agarozowego pokazuje, że frakcje od 29 do 38 miały niewielką aktywność nukleazy, które zostały wybrane do połączenia, zagęszczenia i dalszego oczyszczenia przez SEC. Dane z trzech reprezentatywnych frakcji SEC wykazały, że oczyszczony PCD zmniejszył absorbancję przy 290 nanometrach, co wskazuje na utlenianie PCA. Po tej procedurze oczyszczony PCD może być wykorzystany i zoptymalizowany w pożądanym systemie oczyszczania tlenu.

Pozwoli to określić dokładną ilość PCD wymaganą dla systemu. Technika ta została wykorzystana do przedłużenia żywotności fluoroforu w eksperymentach mikroskopowych z pojedynczymi cząsteczkami, co pozwoliło na dłuższe okresy gromadzenia danych. Stosowana ultrawirówka jest niebezpieczna.

Upewnij się, że wirówki są odpowiednio wyważone przed wirowaniem. Bromek etydyny jest niebezpiecznym odczynnikiem. Unikaj kontaktu, nosząc środki ochrony osobistej i zutylizuj je w odpowiedni sposób.